INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA
DR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL

LABORATORIO DE MTODOS DE ANLISIS

SEPARACIN DE UNA MEZCLA DE DOS AMINOCIDOS POR

CROMATOGRAFA POR INTERCAMBIADOR INICO

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SECCIN 03
 SEPARACIN DE UNA MEZCLA DE DOS AMINOCIDOS POR
CROMATOGRAFA POR INTERCAMBIADOR INICO

RESULTADOS

Tabla 1. Separacin de Prolina e Hisitidina.

Volumen de Volumen de
A400 A570 A400 A570
elucin (mL) elucin (mL)
3 0,033 0,038 63 2,1 0,591
6 0,042 0,056 66 1,922 0,485
9 0,008 0,021 69 1,374 1,54
12 0,113 0,006 72 1,71 1,795
15 0,645 0,084 75 1,581 2,526
18 0,963 0,115 78 2,174 1,647
21 0,973 0,165 81 1,724 1,793
24 0,639 0,058 84 1,504 1,399
27 0,577 0,126 87 0,539 1,888
30 0,412 0,083 90 0,579 2,438
33 0,335 0,077 93 0,336 0,009
36 0,315 0,103 96 0,103 0,01
39 0,309 0,091 99 0,063 0,028
42 0,282 0,076 102 0,09 0,06
45 0,233 0,155 105 0,041 0,035
48 0,296 0,087 108 0,028 0,007
51 0,527 0,395 111 0,052 0,087
54 0,591 0,517 114 0,018 0,062
57 0,673 0,612 117 0,018 0,092
60 0,844 0,792 120 0,024 0,31

Figura 2. Perfil de elucin Perfil de elucin, en el cual se observa, en el eje de las abscisas el
volumen de elucin y en un eje de ordenadas, a la izquierda el valor correspondiente de A400
La lnea violeta representa la elucin de la prolina y la lnea amarilla representa la elucin de
la histidina.

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CUESTIONARIO
a) Cul de los aminocidos eluy primero? Explique por qu.
El primero en eluir fue la prolina ya que este solo tendr un grupo cargado positivamente y la
histidina contara con dos por lo cual ser mas afn a ser intercambiado por el ion mvil del
intercambiador permitiendo que la prolina eluya primero.

b) Cul es la importancia de regular la velocidad de elucin, qu pasa a altas y a bajas

velocidades?
Esto es importante para que a la velocidad en que se eluya no sea demasiado alta para as permitir
que el ion pueda ser sustituido en su totalidad y no solo un parte de este, quedando retenido en el
intercambiador y a una velocidad baja el tiempo de la separacin sera demasiado. As que el
regular la velocidad nos permitir obtener una buena separacin.

c) Empleando las frmulas de los aminocidos y del grupo funcional del intercambiador,
haga un esquema de cmo se produjo la separacin. Considere el cambio del pH del medio.

pK 1=6.0
pK 2 = 9.17
pI = (pK 1 + pK 2)/2
pI = (6.0+9.17)/2= 7.585

pK C / pK 1 =1.99
pK N / pK 2=10.60
pI = (pK 1 + pK 2)/2
pI = (1.99+10.60)/2= 6.295

DISCUSIN

Como se sabe este tipo de cromatografa por intercambio inico se basa en la separacin de las
molculas en base a la carga con la que cuentan. Para la esta prctica de separacin de una mezcla
de dos aminocidos los cuales fueron prolina e histidina se utiliz un intercambiador catinico dbil
(amberlita IRC-50) que tiene como in fijo al COO- y como in mvil al H+, que al ser previamente
hinchada en buffer de citrato de sodio pH 5.25 se intercambi el H + por el ion Na+, ya que este se
encuentra en alta concentracin. Despus de esto se realizo el empaquetamiento de la columna con

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el intercambiador y se aplic la muestra que contena la mezcla de los aminocidos y se eluy
primero con regulador de citratos pH 5.25, a este pH ambos aminocidos tienen carga positiva con
la diferencia de que la histidina tendr 2 grupos cargados positivamente uno es el grupo amino y otro
es el de su cadena lateral imidazol, ya que el pka de la histidina para el grupo amino es de 6.0 y para
el grupo imidazol es de 9.17, estos valores nos indican que a pH por debajo de 9 .17 tendr el grupo
imidazol con carga positiva y a pH por debajo de 6 tendr al grupo imidazol y al amino cargado
positivamente, mientras que la prolina solo tiene uno que es el grupo amino del esqueleto del
aminocido cuyo pka es de aproximadamente 10.60, esta diferencia hace que la histidina sea ms
positiva por lo que quedara unida al ion fijo del intercambiador liberando al Na + que ocupaba ese
lugar, posteriormente al cambiar el pH a 2 significara que habr mayor cantidad de protones
aumentando as la concentracin de iones H+ que desplazaran a la histidina del intercambiador
permitiendo su elucin.

Una vez obtenidas las fracciones en tubos de ensaye, se realizo una reaccin colorida con ninhidrina
para comprobar si se haba llevado a cabo la separacin de los aminocidos empleados, el color que
se obtiene al reaccionar la ninhidrina con la prolina resulta de una tonalidad amarilla mientras que la
reaccin con la histidina da un color violeta, aplicando un mtodo espectrofotomtrico esto nos
permite realizar un perfil de elucin midiendo su absorbancia a distintas longitudes de onda 400 nm
para el tono violeta y 570 nm para el amarillo.

Hay que resaltar que durante el proceso de la separacin y en vista de los resultados obtenidos,
una mala separacin, lo cual se puede deber a que el momento de empaquetar la columna se
observ la formacin de estratos; as como la presencia de burbujas, que adems de ser una muestra
de un mal empaquetamiento nos interfieren con la elucin de los aminocidos ya que en estas
pueden quedarse atrapados y provocar distorsiones del cromatograma al salir despus. Este tipo
de factores, as como la incubacin, la cual pudo llevarse por ms del tiempo necesario con lo cual
se evaporo el diluyente de la ninhidrina que era etanol, produciendo la disminucin del volumen con
lo que se podra obtener una absorbancia diferente al estar hasta cierto punto ms concentrada la
muestra por la evaporacin.

Todos estos factores son los que pudiesen explicar el cromatograma que se mostr anteriormente.
Resultado en la presencia de varios picos y valles lo que nos indica tanto una mala resolucin, como
una mala separacin.

CONCLUSIONES

Empleando la tcnica de intercambio inico se separaron dos aminocidos de acuerdo a la

carga con la que cuentan y a sus grupos ionizable.
Mediante una reaccin con ninhidrina se realiz el perfil de elucin ya que estos absorben
a diferentes longitudes de onda.

PREGUNTAS EXTRA

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Mary K. Campbell,Shawn O. Farrell. Bioqumica (2003) Editorial Thomson, 4ta edicin.

Mxico. Pg. 118-123
Donald Voet,Judith G. Voet. Bioqumica (2004) Editorial medica Panamericana, 3ra
edicin. Montevideo, Uruguay. Pg. 142-143