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Anne: 2015/2016
Intitul du Master: Analyses Biochimiques
Semestre: 02
Contenu de la matire:
1) Solvants organiques.
2) Types dextraction (solvant, aqueuse, vapeur etc.).
3) Moyens de purification: filtration, centrifugation, chromatographie, lectrophorse.
4) Techniques de conservation: froid (cryoconservation), vaporation, lyophilisation.
Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation i
Sommaire
Chapitre I: Les solvants organiques
I) Dfinitions...... 1
II) Classification........ 1
1. Solvants hydrocarbures.. 1
1. 1. Hydrocarbures aliphatiques (alcanes, alcne). 1
1. 2. Hydrocarbures aromatiques (benzne, tolune, xylne). 2
1. 3. Mlanges ptroliers complexes... 4
2. Solvants oxygns... 5
3. Solvants halogns.. 6
III) Utilisations...... 7
IV) Proprits physico-chimiques 8
V) Toxicit des solvants.... 9
4. 5. 1. 3. La Presse de French 22
4. 5. 1. 4. La sonication (Ultrasons) 22
4. 5. 1. 5. La conglation-dconglation. 23
4. 5. 2. Les Techniques chimiques et enzymatiques... 23
4. 5. 2. 1. La lyse ou choc osmotique.. 23
4. 5. 2. 2. Modification de la force ionique ou du pH. 23
4. 5. 2. 3. Lyse enzymatique 23
4. 6. Extraction des acides nucliques. 23
Chapitre III: Moyens de purification
1. La filtration
I) Dfinition de la purification 25
II) Moyens de purification.. 25
2. 1. Filtration.. 25
2. 1. 1. Principe de la filtration 25
2. 1. 2. Matriel de filtration... 26
2. 1. 2. 1. Les filtres. 26
a) Les filtres dpaisseur (pais ou en profondeur) .. 26
b) Les filtres membranes (crans ou de surface) 27
2. 1. 2. 2. Les entonnoirs. 27
a) Les entonnoirs ordinaires 27
b) Les entonnoirs spciaux. 27
2. 1. 3. Mthode de filtration... 28
2. 1. 3. 1. Filtration gravimtrique (filtration par gravit) .. 28
2. 1. 3. 2. Filtration sous vide.. 29
2. 1. 3. 3. Filtration sous pression... 29
2. 1. 3. 4. Ultrafiltration .. 30
2. La centrifugation
2. 1. Introduction .... 31
2. 2. Dfinition ... 31
2. 3. Principe . 31
2. 4. Matriel de centrifugation... 31
2. 5. Type de centrifugeuses ... 32
2. 6. Types de centrifugation... 33
2. 6. 1. La centrifugation diffrentielle .. 33
Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation iii
I) Dfinitions
Un solvant est une substance qui a le pouvoir de former avec dautres substances une
solution homogne. Les solvants sont ainsi utiliss pour extraire (industrie chimique,
ptrochimique, pharmaceutique et alimentaire), dissoudre (dgraissage) et suspendre (peintures)
des substances gnralement insolubles dans leau ou pour modifier les proprits physiques
dun matriau (exp. Diluant).
II) Classification
1. Solvants hydrocarbures
Les hydrocarbures constituent la classe des solvants organiques la plus rpondue. Les
solvants de cette catgorie ne contiennent que du carbone et de lhydrogne dans leur structure
molculaire. On distingue les hydrocarbures aliphatiques, les hydrocarbures aromatiques ainsi
que les mlanges ptroliers complexes.
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composs saturs ont la formule CnH2n+2 mais seules les molcules avec cinq carbone ou plus
sont des solvants liquides la temprature normale. Les chanes carbones peuvent tre linaires
(n-hexane) ou ramifies (iso-pentane). Les composs insaturs (les alcnes) sont moins rpondus
comme solvants sauf pour certains produits naturels comme les terpnes. Les solvants
aliphatiques sont utiliss notamment dans les adhsifs (exp. Lhexane).
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2. Solvants oxygns
Ils regroupent plusieurs classes:
Les alcools: Sont des composs organiques dont lun des carbones est li un groupe
hydroxyle. Ce sont des solvants oxygns de synthse (exp. mthanol, thanol, etc.). Ils
rsultent de la substitution de lhydrogne sur un hydrocarbure R-H par la fonction OH
pour donner R-OH. Un alcool monohydrique est un alcool qui contient une seule fonction
hydroxyle par molcule.
Les alcools de faible masse molculaire se prsentent temprature ambiante comme des
liquides incolores; les alcools plus lourds comme des solides blanchtres. Ils sont solubles
dans leau. La solubilit diminue cependant en fonction de la masse molculaire de lalcool.
Les alcools ont des densits et des tensions superficielles semblables plusieurs ctones
aliphatiques. Ils possdent une large gamme de taux dvaporation et un excellent pouvoir
solvant pour divers polymres et rsines. Les alcools sont utiliss dans la formulation de
dtergent, de produits de soins personnels, de revtements, adhsifs et encres.
Les glycols: Sont appels aussi polyols ou polyalcools. Ce sont des composs organiques
caractriss par un certain nombre de groupes hydroxyle (au moins deux groupes). Par
rapport aux alcools simples, laugmentation du nombre de groupes hydroxyle entraine une
augmentation trs importante de leur point dbullition et de leur viscosit ainsi quune
solubilit accrue dans leau. Ils sont peu volatils. Lthylne glycol est le plus simple des
diols. Cest un liquide incolore, inodore et peu volatil avec une faible viscosit. Il est utilis
notamment comme antigel dans les radiateurs dautomobile et dans les peintures en phase
aqueuse. Un autre diol cest le propylne glycol, il est moins toxique, et employ dans
lindustrie alimentaire et pharmaceutique.
Les ctones: Sont caractrises par le groupement fonctionnel carbonyle -C=O, o un atome
de carbone est reli un atome doxygne par une double liaison. Les ctones de faibles
poids molculaires sont solubles dans leau. A partir de C5, cette solubilit est presque nulle.
Ce sont des solvants de haut pouvoir de dissolution, de faibles viscosits et sont miscibles
avec les hydrocarbures. Elles ont gnralement des densits plus faibles que celles des autres
solvants oxygns. Elles ont aussi de faibles tensions superficielles et offrent une large
gamme du taux dvaporation. Ces solvants sont trs volatils et inflammables. Ils sont
employs dans les nettoyants et les dgraissants industriels. Les principaux sont lactone
(CH3-C(=O)-CH3), la mthylthylctone. Il existe galement des ctones aromatiques
comme la cyclohexanone ou les quinones qui comportent deux fonctions ctone.
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Les esters organiques: Sont une famille de solvants oxygns caractriss par la prsence
dun groupement carboxyle au sein dune chane de carbone et dhydrogne plus au moins
longue. Ils sont obtenus par raction dun acide organique avec un alcool. Les esters ont de
faibles tensions superficielles et se prsentent dans une large gamme de taux dvaporation.
Ce sont des liquides incolores. Ceux de faibles poids molculaires sont partiellement
solubles dans leau. Les actates sont les esters les plus utiliss comme solvant. Ils sont
volatils temprature ambiante. Il existe galement des actates complexes ou mlange
produits partir de fractions ptrolires. Ils sont utiliss notamment dans la formulation des
peintures, de laques, dadhsifs et dencres.
Les thers: Sont une famille de substances oxygnes. Ils sont caractrise par la liaison
ther, forme dun atome doxygne -O- situ entre deux groupements R et R. Ils rsultant
de la dshydratation de deux alcools pour former la liaison R-O-R o R et R sont des
chanes plus au moins complexes et ramifies qui peuvent se rejoindre pour former un cycle.
Les thers aliphatiques sont peu solubles dans leau alors que les thers alicycliques le sont
plus. Les thers utiliss comme solvants sont des liquides volatils temprature ambiante.
Ils sont incolores et dodeur caractristique. Ils sont utiliss comme solvants ractionnels.
Les thers sont plus au moins solubles dans leau et dans les hydrocarbures. Ils sont tous
inflammables. Les thers ont tendance former des peroxydes et des hydroperoxydes qui
posent des problmes de scurit en raison de leur potentiel explosif.
Les thers de glycol: Constituent un groupe de solvants oxygns drivs de lthylne
glycol ou du propylne glycol. Aux conditions normales dutilisation, sont des liquides
incolores odeur lgrement thre, modrment volatils et de viscosit moyenne. Leur
large utilisation tient leur caractre amphiphile qui leur confre une affinit la fois pour
les composs polaires (eau, alcool, ctone) et les composs apolaires (hydrocarbures). Les
thers de glycol sont donc de bons solvants pour de nombreuses substances et peuvent tre
utiliss pour rendre miscibles des solvants autrement non-miscibles. On les trouve aussi
comme principaux composants dans les colles, les encres, les peintures, les vernis, les
diluants, les cosmtiques notamment les teintures pour cheveux, les produits dentretien
comme les lave vitres, les produits pour la mcanique et la mtallurgie (dgraissants).
3. Solvants halogns
Les solvants halogns sont des hydrocarbures o lon a remplac un ou plusieurs atomes
dhydrogne par des atomes dhalognes (brome, chlore, fluor, iode).
Les solvants chlors sont les plus rpondus suivis des fluors. La plus grande partie des
solvants halogns est issue des hydrocarbures aliphatiques. A part les plus petites molcules qui
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Selon leur structure molculaire, les solvants sont classs aussi en:
Solvants protiques polaires (solvants protognes): possdant un ou plusieurs atomes
dhydrogne susceptible(s) de former des liaisons hydrogne. Par exemple, leau, le
mthanol, lthanol, etc.
Solvants aprotiques polaires: possdant un moment dipolaire non nul et dnus
datomes dhydrogne susceptibles de former des liaisons hydrogne. Par exemple,
lactonitrile (CH3CN), le dimthylsulfoxyde (DMSO, (CH3)2SO), le ttrahydrofurane
(THF, C4H8O), etc.
Solvants aprotiques apolaires: possdant un moment dipolaire permanent nul. Par
exemple, le benzne, les hydrocarbures: alcanes linaires ou ramifis, alcanes cycliques,
alcnes, etc.
III) Utilisations
Un solvant organique dsigne tout compos organique utilis seul ou en association avec
dautres agents, sans subir de modification chimique, pour dissoudre des matires premires, des
produits ou des dchets, ou utilis comme agent dextraction (extraction des principe actifs
base de plantes) et de sparation analytique ou prparative.
Au XIXe sicle, lindustrie a dvelopp de nouveaux solvants. Avec eux, les chercheurs
ont isol des espces chimiques de certaines plantes pour en faire le principe actif de
mdicaments (un anti-inflammatoire venant de la reine des prs, un anticancreux venant de
lif,).
Les solvants servent comme milieux ractionnels, agents de nettoyage pour dissoudre des
salissures, ou comme dissolvant, disperseur, correcteur de viscosit, correcteur de tension
superficielle, plastifiant ou agent protecteur, adjuvants et diluants (peinture, vernis, encres,
colles, pesticides), dgraissants (le perchlorothylne qui est utilis pour le nettoyage sec),
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purifiants (parfums, mdicaments), dcapants (limination des peintures, vernis, colles), support
pour le conditionnement, le transport et la mise en uvre de cosmtiques, peintures et encres.
CH3-CH2-CH2-
Hexane 69 C 2,0 0,655 gml-1
CH2-CH2-CH3
CH3CH2-O-CH2-
ther dithylique 35 C 4,3 0,713 gml-1
CH3
CH3-C(=O)-O-
Actate dthyle 77 C 6,0 0,894 gml-1
CH2-CH3
1,4-Dioxane /-CH2-CH2-O-
101 C 2,3 1,033 gml-1
CH2-CH2-O-\
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Ttrahydrofurane /-CH2-CH2-O-
66 C 7,5 0,886 gml-1
(THF) CH2-CH2-\
Dichloromthane
CH2Cl2 40 C 9,1 1,326 gml-1
(DCM)
Dimthylformamide
H-C(=O)N(CH3)2 153 C 38 0,944 gml-1
(DMF)
Dimthylsulfoxyde
CH3-S(=O)-CH3 189 C 47 1,092 gml-1
(DMSO)
CH3-CH2-CH2-
n-Butanol 118 C 18 0,810 gml-1
CH2-OH
CH3-CH(-OH)-
Isopropanol (IPA) 82 C 18 0,785 gml-1
CH3
0,7 gml-1 -
Ammoniac NH3 -33,35 C 22
33 C
et la sant humaine. Les solvants peuvent pntrer dans lorganisme de trois manires: voie
respiratoire (grce leur volatilit), voie cutane (quel que soit ltat de la peau), voie digestive
(absorption accidentelle). Ils sont alors soit limins sous forme inchange dans lair expir, soit
fixs dans les tissus, soit mtaboliss par le foie puis limins dans les selles, les urines et lair
expir. Le foie a notamment pour rle de transformer les substances trangres telles que les
solvants, en produits liminables. Certaines tapes de cette transformation peuvent aboutir des
drivs hautement toxiques. Les solvants peuvent provoquer des maladies de la peau, des lsions
chroniques du cerveau et le cancer.
Les homologues suprieurs du benzne (tolune, xylne) ont t incrimins dans la survenue
dun syndrome psycho-organique. Le tolune, le xylne et le styrne sont des narcotiques et
des irritants cutans et respiratoires. Le benzne est particulirement toxique vis vis de la
moelle osseuse, do linterdiction de son utilisation des concentrations suprieures 1%.
Les hydrocarbures chlors sont potentiellement hpato- et nphrotoxiques et ont une action
dprimante sur le systme nerveux central. Certains dentre eux sont aussi toxiques pour le
systme nerveux priphrique. Certains drivs des hydrocarbures aliphatiques (donnants
naissance dans lorganisme des poxydes) sont mutagnes et cancrignes.
Les alcools exercent une action narcotique et irritante. Leur inhalation peut provoquer des
vertiges et des cphales. Les vapeurs de butanol peuvent lser la corne (membrane de
lil).
Bien que les ctones soient modrment toxiques, elles ont une action narcotique. Le
mthyl-n-butylctone provoque des neuropathies priphriques.
Les thers ont des proprits anesthsiques et narcotiques. Certains sont hpatotoxiques. Les
drivs chlors du mthylther sont cancrignes.
Des contacts rpts avec des solvants peuvent en outre avoir des effets sur le systme
nerveux, le sang (hmatoxicit, cancer), le foie ou les reins (insuffisances rnales ou hpatiques,
cancers), le systme de la reproduction (fertilit, grossesse), le systme endocrinien et
cardiovasculaire. Certains solvants peuvent aussi avoir des effets mutagnes, tratognes et
cancrignes. Ces effets toxiques ou ces pathologies apparaissent parfois plusieurs annes aprs
lexposition.
a) Effets sur le systme nerveux central
Le systme nerveux est lorgane le plus sensible et le premier montrer des effets dus
une exposition aux solvants. La majorit des solvants tant liposolubles altrent la couche
lipidique de la membrane de la cellule nerveuse et de la myline (une action dmylinisante sur
le tissu nerveux). A forte concentration et lors dexposition aigu, les solvants dpriment le
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systme nerveux. A faible concentration, ils provoquent des troubles du comportement et des
perturbations psychomotrices telles que: asthnies, cphales, troubles de la mmoire et de la
vigilance, vertiges et troubles de lhumeur. Ces manifestations sont en gnral rversibles
larrt de lexposition.
Dans le cas de mlange de solvants, des effets neurocomportementaux ont t dcel
alors que lintensit dexposition de chaque solvant considr isolment est faible. Lexposition
chronique aux vapeurs de divers solvants peut engendrer un syndrome psycho-organique,
caractris par un dficit intellectuel et des troubles motionnels.
b) Effets sur le systme nerveux priphrique
Lexposition chronique certains solvants (n-hexane, mthylbutylctone, mlange de
solvants) pourrait favoriser le dveloppement dune neuropathie priphrique. Des
polyneuropathies priphriques sont caractrises par une dgnrescence anoxale, et se
manifestent principalement par des symptmes de crampes musculaires, de faiblesse,
dengourdissements, de picotements et de douleur, surtout au niveau des membres infrieurs.
c) Effets sur la peau
Etant donn les proprits lipophiles de la plupart des solvants, ils exercent une action
dgraissante, do scheresse, crevasses (dchirure) et irritation de la peau. Dans certains cas, les
solvants peuvent mme dclencher des processus allergiques conduisant linstallation de
vritables eczmas (exma: maladie de la peau).
d) Effets sur les voies respiratoires
Les symptmes dirritation des voies respiratoires chez les travailleurs exposs aux
manations (odeur) des solvants ne sont pas exceptionnels.
e) Effets sur les reins
Il ne fait pas de doute quune exposition massive des solvants puisse provoquer des
lsions rnales. Plusieurs enqutes pidmiologiques semblent confirmer lhypothse quune
glomrulonphrite chronique (ventuellement auto- immune) pourrait tre induite par
lexposition aux solvants. Latteinte rnale auto-immune pourrait aussi bien tre induite par une
exposition aigu ou chronique aux solvants. Certains solvants (notamment les halogns)
exercent une action toxique directe sur le rein.
f) Effets sur le foie
Lexposition aigu certains solvants comme le ttrachlorure de carbone, le 1,2-
dichlorothane, le dimthylformamide peut engendrer une hpatite aigu cytolytique, plus
rarement une atteinte cytolytique et cholestasique suite lexposition des solvants comme le
ttrachlorthane.
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I) Introduction
Lextraction est utilise pour extraire slectivement un ou plusieurs composs dun
mlange initial, sur la base de proprits chimiques ou physiques.
Lhomme utilise des colorants, des parfums, des armes, et des extraits de produits
naturels depuis la haute Antiquit, par diffrentes techniques:
La filtration: Depuis les temps prhistoriques, lhomme utilise un lit de sable ou de mousse
pour rendre une eau boueuse (pleine de boue) limpide (claire et transparente).
Le pressage: Consiste exercer une pression sur une orange pour obtenir le jus, ou craser
des fleurs pour extraire les armes.
Lenfleurage: Est une forme dextraction utilise en parfumerie. Il repose sur le pouvoir
dabsorption dune huile essentielle par les corps gras. Par exemple, les fleurs fragiles sont
poses sur des cadres enduits de graisse animale trs pure et inodore qui absorbe le parfum des
fleurs au contact; en fin de schage, les graisses sont imprgnes de substances odorantes.
La dcoction: Cette mthode est trs ancienne. Elle consiste chauffer la racine ou lcorce
dune plante avec de leau; jusqu ce que cette dernire soit bouillante et les constituants se
dissolvent.
Linfusion: Elle consiste verser de leau bouillante sur des plantes (les feuilles ou les fleurs)
finement broyes puis les laisser tremper pour dissoudre leurs principes actifs.
La macration: Consiste laisser sjourner froid un solide dans un liquide pour en extraire
les constituants solubles dans ce liquide.
Lextraction par solvant: Cest un procd qui permet dextraire des composs qui ne peuvent
pas ltre avec de leau.
Lentranement la vapeur ou lhydrodistillation: Cette technique date de lEgypte
ancienne. Elle consiste extraire les parfums des plantes (huiles parfumes ou huiles
essentielles) par de la vapeur deau.
Nous ne pourrons appliquer que les mthodes dextraction par hydrodistillation ou bien
par solvants, lenfleurage tant trop long et coteux en matire premire (pour un litre dabsolu
de jasmin, il faut compter un tonne de fleurs).
II) Dfinitions
Lextraction consiste transfrer un compos dune phase une autre:
Dune phase liquide une autre phase liquide.
Dune phase solide une phase liquide.
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Cest une opration qui consiste sparer certains composs dun organisme (animal ou
vgtal) selon diverses techniques.
4. 1. Enfleurage
Il consiste extraire naturellement le parfum des fleurs grce labsorption effectue par
les corps gras. Il existe deux types denfleurage: chaud et froid selon la rsistance de
la plante la chaleur. Cette mthode est particulirement employe lorsque lhydrodistillation
dnature les molcules extraire.
Enfleurage chaud (macration): consiste faire infuser les fleurs ou autres lments
odorants dans des matires grasses, huiles ou graisses, pralablement chauffes. Les
mlanges obtenus sont ensuite filtrs travers des tissus afin dobtenir des onguents
parfums.
Enfleurage froid: Les fleurs les plus fragiles qui ne supportent pas la chaleur sont
disposes sur des chssis de verre enduit de graisse et renouveles tous les 3 7 jours
selon les espces. Lorsque le parfumeur considre que la graisse est sature, elle est
gratte et mlange un peu dalcool pour obtenir des pommades ou bien puise par de
lalcool. On obtient alors un liquide nomm labsolu (Fig. 1).
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Les molcules odorantes tant des composs volatils, au lieu de les laissez schapper
dans lair, elles sont captes par la graisse qui a la proprit de les dissoudre. Lors de lajout de
lalcool les molcules organiques passent dans ce solvant.
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La densit du solvant: Il est ncessaire de connatre ce paramtre car cest lui qui dtermine
si la phase organique, contenant le compos extraire, se trouve au dessus ou en dessous de
la phase aqueuse dans lampoule dcanter.
Les solvants dextraction doivent tre aussi:
Facilement limins aprs extraction et donc avoir un point dbullition bas. Leur point
dbullition doit tre le plus loign possible de celui des produits extraire.
Inertes chimiquement vis--vis de la solution extraire.
Peu toxiques que possible.
Tableau 1: Avantages et inconvnients de quelques solvants dextraction.
Solvants Temprature Densit Avantages Inconvnients
dbullition (C)
Cyclohexane 81 0,78 Peu toxique Facilement inflammable
Dichloro-1,2-thane 83 1,26 Peu inflammable Modrment toxique, vapeurs
irritantes
Dichloromthane 40 1,34 Facile liminer Forme des mulsions, nocif
Ether thylique 35 0,71 Facile liminer Trs inflammable
Hexane 69 0,66 Facile liminer Trs inflammable
Pentane 36 0,63 Facile liminer Trs inflammable
Tolune 111 0,87 Peu toxique Inflammable
Tricholorothylne 87 1,46 Ininflammable Modrment toxique
4. 3. 1. Extraction directe
Lespce chimique est extraite dun produit naturel par macration puis filtration (par
exemple lextraction des armes des zestes dorange).
4. 3. 2. Extraction liquide-liquide
Lextraction liquide-liquide est lune des techniques de prparation dchantillons les
plus anciennes. Cest une opration fondamentale de transfert de matire entre deux phases
liquides non miscibles, sans transfert de chaleur. Cette technique permet dextraire une substance
dissoute dans un solvant, laide dun autre solvant, appel solvant dextraction, dans lequel elle
est plus soluble. Le solvant initial et le solvant dextraction ne doivent pas tre miscibles.
Lextraction liquide-liquide est ralise par le contact intime du solvant avec la solution
dans des appareils destins mlanger les deux phases (ampoules, colonnes, mlangeurs). La
sparation des phases sobtient par dcantation gravimtrique ou centrifuge.
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4. 3. 2. 1. Principe
Du fait que leau ne svapore pas facilement, lespce chimique est difficilement
rcuprable si elle est en solution dans leau. Dans ce cas, il faut utiliser un solvant organique
dans lequel la substance est trs soluble (beaucoup plus que dans leau), celle-ci va passer de
leau au solvant organique. Il faut que leau et le solvant organique ne soient pas miscibles.
Lextraction liquide-liquide est lune des oprations les plus pratiques dans un
laboratoire de chimie organique. Elle consiste transfrer un compos dune phase aqueuse
une phase organique ou inversement, en utilisant pour cela deux solvants (lun aqueux et lautre
organique), non miscibles, mis en contact intime.
En pratique, cette extraction est une tape de prparation dchantillons trs utilise
prsentant de multiples inconvnients lorsquelle est pratique avec une ampoule dcanter:
Multiplication des tapes dextraction pour obtenir un rendement optimum.
Utilisation dimportants volumes de solvants organiques dont les cots de recyclage
deviennent de plus en plus chers.
Difficult dmulsion qui ne permet pas la rcupration de 100% de lextrait.
Traces dluant dans le raffinat qui ncessite un traitement supplmentaire de lchantillon
avant ltape dvaporation.
4. 3. 3. Extraction solide-liquide
Lextraction solide-liquide est un phnomne lent qui permet dextraire une substance
prsente dans un solide pour la faire passer dans un solvant liquide. On peut utiliser
successivement des liquides dont le pouvoir solvant vis--vis des constituants de la phase solide
est diffrent (dissolution fractionne). La macration, linfusion et la dcoction sont des
mthodes dextraction solide-liquide.
Pratiquement, il est impossible de dissoudre un seul compos, dautres constituants de la
phase solide ont t entranes avec lui, quelque soit le solvant utilis. En laboratoire de chimie
organique, on utilise parfois des appareils plus efficaces, les extracteurs de Soxhlet et de
Kumagawa, qui fonctionnent en continu (Fig. 3).
A) Techniques de dissolution
Il faut avant tout rduire le prlvement en fines particules ce qui favorise laction du
solvant en augmentant la surface de contact.
Il est possible de procder en continu ou effectuer des phases successives dextractions
suivies de filtration ou de centrifugation.
Extracteur de Soxhlet Extracteur de Kumagawa
Rfrigrant
Extracteur
Siphon dvacuation de lextrait
Solvant (s)
Source de chaleur
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Le Soxhlet permet:
Le lavage dun compos solide par un solvant dans lequel il est totalement insoluble. Les
impurets sont extraites vers le ballon et le solide pur est rcupr dans la cartouche.
La recristallisation dun compos par un solvant dans lequel il est modrment soluble. Les
impurets insolubles restent dans la cartouche tandis que le compos cristallise dans le
ballon rcepteur par refroidissement lorsque la solution est assez concentre.
D) Mode opratoire
Il est important de rajouter quelques grains de carborundum (cristal de carbure de silicium
SiC) ou de pierre ponce dans le mlange pour viter une lvation de la temprature sans
bullition.
Le bon fonctionnement du siphon ncessite un volume suffisant du solvant dans le ballon.
Le solide est plac dans la cartouche, elle-mme insre dans lextracteur.
Le systme de chauffage est mis en marche et rgl de faon ce que les cycles
remplissage/vidange de la cartouche se fassent de faon rapproche.
Le systme peu tre laiss sans surveillance particulire si la vidange est rgulire.
4. 5. 1. 4. La sonication (Ultrasons)
Elle consiste dtruire les cellules par les ultrasons qui sont des ondes de mme nature
que le son mais dont la gamme de frquence se situe entre 20 kHz et plusieurs centaines de
mgahertz. Cette gamme est trop leve pour que loreille humaine puisse la percevoir.
La sonication est ralise grce un appareil appel sonicateur qui permet de transformer
lnergie lectrique en vibration mcanique longitudinale le long dune sonde. Cette dernire
permet de casser les cellules biologiques en suspension. Il est indispensable de travailler basse
temprature et deffectuer des pauses entre les cycles de sonication afin dviter la surchauffe de
lchantillon.
4. 5. 1. 5. La conglation-dconglation
Des cycles de conglation (-20C) et de dconglation (37C) permettent de dtruire les
membranes plasmiques des cellules surtout lorsquil sagit dune protine ou dune enzyme
bactrienne. Durant la conglation des cristaux de glace se forment, ce qui provoque la
dsintgration de la membrane cellulaire.
4. 5. 2. Les Techniques chimiques et enzymatiques
Ces techniques regroupent la lyse ou choc osmotique, la modification de la force ionique
ou du pH et la lyse enzymatique.
4. 5. 2. 1. La lyse ou choc osmotique
Le choc osmotique consiste incuber les cellules fragiles dans une solution hypo-
osmotique, ce qui permet leau dentrer dans la cellule la fait gonfler jusqu ce que les
membranes lipidiques se rompent et laissent passer leur contenu dans le milieu. Lclatement des
organites est linconvnient de cette technique.
4. 5. 2. 2. Modification de la force ionique ou du pH
La modification de la force ionique du milieu par addition des ions ou la modification du
pH entrainent la rupture des membranes plasmiques de certains types cellulaires. Ces traitements
peuvent rendre les membranes plus permables aux constituants du milieu.
4. 5. 2. 3. Lyse enzymatique
Pour lyser la paroi cellulaire qui protge la membrane plasmique de plusieurs types de
cellules (les levures, les plantes et les bactries), diffrentes enzymes comme le lysozyme du
blanc duf de poule ou la lyticase de S. aureus peuvent tre utilises.
4. 6. Extraction des acides nucliques
Lextraction de lADN consiste isoler lADN partir dune cellule en quantit et en
qualit suffisante pour permettre son analyse. Les principales tapes de lextraction de lADN
sont:
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La lyse cellulaire par des mthodes physiques ou chimiques permet daccder lADN.
Llimination ou la sparation des lipides membranaires et des dbris cellulaires se fait
gnralement laide de dtergents comme le sodium dodecyl sulfate et par centrifugation.
Llimination ou la dnaturation des protines de lextrait cellulaire est effectue laide
dune protase.
Llimination de lARN est effectue par addition de RNase qui dgrade rapidement lARN
en ribonuclotides.
La prcipitation/agrgation/lution de lADN.
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I) Dfinition de la purification
En chimie, la purification est la sparation de substances chimiques dans le but de
dcontaminer des substances.
2. 1. Filtration
La filtration est une mthode mcanique utilise pour sparer un solide dun liquide ou
dun gaz en faisant passer le mlange par une membrane ou un chiffon fin, par laide dun
entonnoir.
La filtration est un procd de sparation permettant de sparer les constituants dun
mlange qui possde une phase liquide et une phase solide au travers dun milieu poreux. Cest
une technique trs utilise que ce soit dans le domaine de lagro-alimentaire ou de la pharmacie
ou par de nombreuses espces animales, principalement aquatique. Lutilisation dun filtre
permet de retenir les particules du mlange htrogne qui sont plus grosses que les trous du
filtre (porosit). Le liquide ayant subi la filtration se nomme filtrat, et ce que le filtre retient se
nomme un rsidu (aussi communment appel "gteau" ou rtentat).
La microfiltration est une sparation de particules de lordre de micromtre.
La filtration strilisante est un cas particulier, les particules tant des microorganismes.
Les applications de la filtration courante rsultent de la sparation dun solide dispers
dans un liquide pour obtenir:
Un liquide clarifi, dbarrass des particules solides.
Un solide essor de lexcs de liquide.
2. 1. 1. Principe de la filtration
La filtration est une sparation selon le diamtre des particules solides de diffrentes
tailles, qui sont disperses dans un liquide. La diffrence de pression force le liquide passer
travers le filtre alors que les particules solides restent la surface.
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2. 1. 2. Matriel de filtration
Le matriel de filtration regroupe les filtres et les entonnoirs.
2. 1. 2. 1. Les filtres
Il existe deux types de filtre, les filtres dpaisseur et les filtres membranes. Lutilisation
de lun de ces deux types dpend du but de lexprience, de la qualit et la quantit du matriel
filtrer. Ils peuvent tre utiliss sparment ou ensemble, selon les besoins. Les filtres doivent tre
inerte chimiquement et physiquement vis--vis du liquide filtrer; insolubles et ne subissent
aucun changement dtat physique (gonflement, rtrcissement, distorsion).
a) Les filtres dpaisseur (pais ou en profondeur)
Ils retiennent les particules dans un rseau de fibres (papier, amiante, cellulose, coton,
fibre de verre, etc.) ou de canalicules (verre fritt, sable, charbon, etc.). Lefficacit dun filtre en
profondeur augmente avec son paisseur par contre elle diminue lorsque la pression applique
sur le filtre augmente.
Les matriaux utiliss dans les filtres dpaisseur sont:
Les papiers filtres classiques, qui diffrent par leur formes (en feuilles rectangulaires,
circulaires, plisses, etc.), leur texture (lche, fine), leur porosit, leur puret (brut, purifi,
sans cendre, etc.). Il existe des papiers filtre sans cendres, dminraliss par lavage aux
acides, dune trs grande puret et qui, aprs combustion, najoutent aucun lment tranger
au prcipit. Il existe un code de couleur ou de numrotation dfinissant la porosit du
papier.
Le matriel fritt: le verre fritt est obtenu par compression temprature contrle de
microbilles de verre. Des porosits diffrentes sont obtenues selon le diamtre de ces grains
et la temprature de frittage. Les porosits sont codes de 0 (larges pores) 4 (pores troits).
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2. 1. 2. 2. Les entonnoirs
Ce sont des instruments en forme de cne, termins par un tube et destins recevoir un
matriel filtrant. Deux types dentonnoirs sont distingus:
a) Les entonnoirs ordinaires: peuvent tre en verre, en porcelaine ou en polycarbonate (Fig. 2).
b) Les entonnoirs spciaux: Sont des entonnoirs dont la partie plate est perfore et sur laquelle
on place de papier filtre (Fig. 3). Ils peuvent tre en verre ou en porcelaine. Deux types
dentonnoirs se distinguent dans cette catgorie:
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2. 1. 3. Mthodes de filtration
La filtration consiste sparer les constituants dun mlange liquide -solide par passage
travers un milieu filtrant. Elle est beaucoup plus rapide que la sdimentation. Il existe plusieurs
procds de filtration.
La difficult de rcupration de la phase solide isole, surtout lorsquelle est peu abondante.
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La sparation est incomplte: le solide retient une quantit non ngligeable de liquide.
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2. 1. 3. 4. Ultrafiltration
Cest une sparation de macromolcules en solution dans une phase dispersante. Il sagit
dune membrane avec une porosit trs faible (25 nm) qui peut retenir les protines et les acides
nucliques. Elle permet la concentration des solutions de macromolcules et llimination de la
plupart des contaminants de petite masse molculaire (sels, glucides).
Les applications de lultrafiltration et de la microfiltration sont plus analytiques, outre la
clarification et les filtrations striles, on cite galement:
Les analyses microbiologiques et tests de strilit.
Les analyses gravimtriques.
Les isolements des cellules dun liquide cphalo-rachidien.
Les analyses de poussires.
Les isolements de virus.
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2. 1. Introduction
La sdimentation est une technique danalyse permettant de sparer une dispersion dun
solide au sein dun liquide ou une dispersion dun liquide au sein dun autre liquide non miscible
et de densit diffrente. Cette sparation peut se faire delle-mme sous laction de la pesanteur
lorsque la dispersion est forme dune substance plus dense que le liquide (dcantation). La
centrifugation permet de remplacer lacclration de la pesanteur (g) par une acclration
centrifuge dveloppe par un rotor tournant grande vitesse (6 10000 tours par minute).
2. 2. Dfinition
La centrifugation est une technique qui permet la sparation des composs dun mlange
en fonction de leur densit sous laction dune force centrifuge. Elle permet de rcuprer un
prcipit (culot) et un surnageant. Le mlange sparer peut tre constitu de deux phases
liquides ou de particules solides en suspension dans un liquide.
Lultracentrifugation utilise des vitesses de rotation encore plus grandes (allant jusqu
75000 tours par minute) et permet la sdimentation de particules ultramicroscopiques.
2. 3. Principe
La centrifugation permet de sparer des constituants de taille et de masse trs diffrentes
contenus dans un liquide. Les constituants contenus dans un chantillon sont soumis deux
forces:
La gravit: Cest la force qui sexerce du haut vers le bas.
La pousse dArchimde: Cest la force qui sexerce du bas vers le haut.
Pour une vitesse de rotation donne, chaque rotor a une force relative de centrifugation en
x.g (force de gravit relative ou acclration) qui peut tre exprime en vitesse de rotation en
rotations par minute selon la formule mathmatique de conversion. Celle-ci est:
g = 1.119 10-5 r N2
o g est la force relative de centrifugation, r est le rayon de rotation du rotor (en cm) et N
(rotations par minute: rpm) exprime la vitesse de rotation.
2. 4. Matriel de centrifugation
La centrifugeuse est lappareil utilis pour la centrifugation. La centrifugeuse est
constitue dun axe de rotation enferm dans une chambre de centrifugation. A lexception des
centrifugeuses de paillasse dont la vitesse de rotation et le temps dutilisation sont relativement
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limits, il est ncessaire dempcher lchauffement des chantillons. Pour cela, la chambre de la
centrifugeuse doit tre rfrigre (Fig. 1).
Les chantillons centrifuger doivent tre quilibrs deux deux. Chaque couple doit
tre plac symtriquement par rapport laxe de rotation.
Figure 1. Centrifugeuse.
2. 5. Type de centrifugeuses
La force du moteur qui le fait tourner constitue la principale limite qui dtermine la
vitesse de rotation du rotor. Plus le rotor est lourd et volumineux, plus leffort que doit fournir le
moteur est grand. Selon les besoins exprimentaux (acclrations, volume du matriel
centrifuger, la temprature de travail), plusieurs types de centrifugeuse ont t dvelopps.
Centrifugeuses de table (ou cliniques): Constituent les modles les plus simples et sont
caractrises par de faibles acclrations (1000 3000 g). Elles peuvent tre rfrigres.
Centrifugeuses au sol: Ces appareils sont un peu plus complexes et caractriss par des
acclrations de lordre de 20000 g. Ces centrifugeuses permettent de centrifuger des
volumes relativement gros. Certains rotors peuvent mme contenir quatre ou six bouteilles
de 250 ml. Tous les modles sont rfrigrs.
Ultracentrifugeuses: Comme leur nom indique, ce sont des appareils qui permettent
datteindre des acclrations trs leves (jusqu 300000 g). Tous les modles sont
rfrigrs. Les rotors ne peuvent contenir quune dizaine de tubes de 40 ml.
Micro-centrifugeuses: Ce sont des centrifugeuses spcialement conues pour les micro-
volumes. Elles peuvent tre rfrigres et atteindre des acclrations de lordre de 12
15000 g.
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2. 6. Types de centrifugation
Il existe deux principaux types de centrifugation.
2. 6. 1. La centrifugation diffrentielle
Elle se base sur les diffrences de vitesse de sdimentation entre particules qui diffrent
par densit et dimensions. Le principe de ce type de centrifugation est de sparer les diffrents
constituants laide de plusieurs cycles de centrifugation acclration croissante. Dans une
centrifugation faible acclration, les lments les plus massifs vont sdimenter et former un
culot au fond du tube. Les lments dont lacclration est trop faible pour contrebalancer les
effets de lagitation molculaire, ou le temps de centrifugation est trop court vont rester dans le
surnageant. Cette mthode est utilise, par exemple, pour rcuprer les lments (les cellules) du
sang qui sdimentent pour des acclrations trs faibles.
Exemple: Isolement des organites cellulaires. Tout dabord au cours dune premire
centrifugation, les constituants les plus lourds sont isols. Puis, en augmentant la vitesse de
sdimentation les constituants de densit croissante seront spars (Tab. Fig. 2).
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Si la densit de la particule est plus grande que celle du milieu, elle sdimentera. Plus la
diffrence de densit est grande plus la sdimentation est rapide.
Sil ny a aucune diffrence de densit, il ny aura aucune sdimentation, quelle que soit
lacclration.
Si la particule est moins dense que le milieu, celle-ci slvera dans le tube jusqu atteindre
un niveau de densit gal la sienne ou, le cas chant, jusqu flotter la surface.
Pour obtenir des solutions de densits diffrentes, deux gradients peuvent tre utiliss, un
gradient de saccharose form pralablement la centrifugation, et un gradient de chlorure de
csium (CsCl).
Il existe deux types de gradients:
A) Les gradients discontinus
Le gradient est prform par des dpts successifs de solution de CsCl de densit
croissante (Fig. 3). Les diffrents lments saccumulent aux interfaces entre les solutions de
densit diffrentes. Au dessus, leur densit tant plus leve, ils migrent vers le bas, et au
dessous, leur densit tant plus faible ils migrent vers le haut. Il arrive de limiter le gradient
deux densits seulement avec une solution infrieure trs dense.
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3. 1. Historique
La chromatographie (du grec chroma: couleur et graphein: crire) a t invente par le
botaniste Mikhail Tswett dans les annes 1900. La premire chromatographie a t ralise par
ce botaniste en 1905. Il a ralis la sparation de pigments vgtaux de la chlorophylle sur une
colonne remplie de carbonate de calcium avec de lther de ptrole. Des bandes colores qui se
dplacent le long de la colonne des vitesses propres sont obtenues.
Le prix Nobel de chimie est attribu en 1952 aux biochimistes Martin et Synge pour leur
contribution au dveloppement de la chromatographie moderne.
3. 2. Dfinition
La chromatographie est une mthode de sparation des constituants prsents dans des
mlanges varis. Elle sert en analyse pour purifier, identifier et quantifier des composs au sein
dchantillons divers. Le principe de base repose sur les quilibres de concentration qui
apparaissent lorsquun compos est mis en prsence de deux phases non miscibles, lune dite
stationnaire, est emprisonne dans une colonne ou fixe sur un support et lautre, dite mobile, se
dplace au contact de la premire. Si plusieurs composs sont prsents, ils se trouvent entrans
des vitesses diffrentes, provoquant leur sparation.
3. 3. Principe
La chromatographie est une mthode physique de sparation base sur les diffrentes
affinits dun (des) compos(s) lgard de deux phases (stationnaire et mobile). Le principe de
cette technique est bas sur la migration diffrentielle des divers soluts contenus dans un
chantillon analys. Lchantillon est entrain par la phase mobile au travers de la phase
stationnaire qui a tendance retenir plus ou moins les composs de lchantillon laide
dinteractions comme les forces de Van der Waals ou les liaisons hydrogne. Une fois la phase
stationnaire traverse, les composs sont lus. Les diffrents composants de lchantillon ont
gnralement une affinit diffrente pour lune et lautre des deux phases. Il en rsulte une
diffrence de vitesse de progression des produits et donc dlution. Ceci permet de les sparer les
uns des autres voire de les identifier. Cette vitesse de sparation est fortement indpendante de la
nature des phases mobile et stationnaire.
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3. 4. Types de chromatographie
Les mthodes chromatographiques peuvent tre classes selon le support de la phase
stationnaire en:
- Chromatographie sur colonne (HPLC, CPG, et les colonnes de silice).
- Chromatographie sur surface (chromatographie sur couches minces ou CCM,
chromatographie sur papier).
Elles peuvent tre classes aussi selon la nature de la phase mobile en:
- Chromatographie en phase gazeuse (CPG).
- Chromatographie en phase liquide (CPL):
Chromatographie sur couche mince (CCM).
Chromatographie de partage centrifuge (CPC).
Chromatographie liquide haute pression (ou performance) (HPLC).
Suivant le type de chromatographie, elle peut servir identifier (CCM, HPLC, CPG),
sparer ou purifier les composs dune raction (chromatographie sur colonne, HPLC). Cette
technique peut galement, grce un tmoin, permettre de quantifier un produit (CPG, HPLC).
Le choix de lune ou lautre de ces techniques dpend de la nature des composs
sparer et en fonction de celle-ci, le choix de ladsorbant utilis (Tab. 1).
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Tableau 2: Les diffrents types de granules en fonction des diffrents types de chromatographie.
Type de chromatographie Type de granules
Chromatographie dexclusion strique Poreuses (rticules)
Chromatographie changeuse dion Portent une charge ionique positive ou
ngative
Chromatographie daffinit Portent un site daffinit
Figure 2. La pompe.
Le dtecteur: Il value la quantit de chacun des composs spars et envoie un signal
lectronique vers lenregistreur (Fig. 3). Par exemple, les protines sont dtectes grce un
dtecteur UV-visible.
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Figure 3. Le dtecteur.
Lenregistreur: Il dessine les pics en fonction de leur intensit (Fig. 4).
Figure 4. Lenregistreur.
Le collecteur de fractions: permet de collecter les fractions de lchantillon (Fig. 5).
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La consistance: Elle varie selon la nature et le degr de rticulation des gels. On distingue:
- Les xrogels: Sont des gels semi-rigides qui ne gardent pas leur forme initiale lorsque la
phase dispersante est limine.
- Les aerogels: Sont des gels rigides intressants lorsquon travaille avec des dbits levs ou
sous forte pression.
Les diffrentes tapes de la chromatographie dexclusion strique regroupent:
Le choix du gel: Il dpend du poids molculaire des composs sparer (Tab. 3).
Le choix de la phase mobile: Le pH et la force ionique de la phase mobile dpendent de
la nature des composs de lchantillon. La phase mobile ne doit pas interagir avec la
phase stationnaire.
La prparation du gel: Il existe des gels prts lemploi et des gels qui ncessitent un
gonflement par leau.
Le remplissage de la colonne avec la phase stationnaire.
Lquilibration de la colonne: Cest le lavage de la colonne avec la phase mobile (3 fois).
Linjection de lchantillon.
Llution: Elle se fait avec la phase mobile qui se dplace le long de la phase stationnaire
avec un dbit bien dtermin selon le poids molculaire des composs de lchantillon.
La collection des fractions et lanalyse du chromatogramme.
Tableau 3: Les diffrents types de gel et leur capacit de rtention.
Type de gel Capacit de rtention (Da)
Dextran
Sephadex G-10 700
Sephadex G-25 1000-5000
Sephadex G-75 3000-70000
Sephadex G-200 5000-800000
Polyacrylamide
Bio-gel P2 200-2000
Bio-gel P6 1000-6000
Bio-gel P-150 15000-150000
Bio-gel P-300 60000-400000
Agarose
Sepharose 2B 2 000000-25000000
Sepharose 4B 300000-3000000
Bio-gel A-0,5M 30000-500000
Bio-gel A-15M 30000-15000000
Bio-gel A-150M 5000000-150000000
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La rgnration du gel: Pour liminer les contaminants, le gel est lav par une solution
saline. Le gel est conserv 2-4C aprs addition dun agent antimicrobien et de
conservation (azide de sodium).
Applications de la chromatographie dexclusion strique
Le domaine dapplication de ce type de chromatographie est celui de la sparation des
macromolcules de masses molaires leves.
Sparation de petites molcules et de macromolcules: Comme llimination des ions
dune solution de macromolcules (exemple le facteur VIII antihmophilique) et la
purification dune protine aprs marquage liode 131.
Analyse dun mlange de macromolcules: Cest la purification de fractions plasmatiques
(immunoglobulines M) pour la prparation de mdicaments ou de ractifs de diagnostic.
Fractionnement de petites molcules: Il regroupe lanalyse de peptides (en analyse
alimentaire dans les fromages), lanalyse denzymes et lanalyse de colorants dans les
produits alimentaires.
Sparation de cellules: La chromatographie sur gel de dextran permet disoler les
lymphocytes des monocytes.
Dtermination des poids molculaires: La meilleure mthode est ltalonnage direct des
colonnes de chromatographie dexclusion strique avec des talons de poids molculaires
connus tels que le cytochrome C (12600), la myoglobine (17500), lalbumine (68000),
lovalbumine (45000) et la -globuline (160000).
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- +
Support ou matrice G X
Contre-ion changeable
+ - - +
+ - - +
- +
- +
+ - - +
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B) Mode opratoire
Il consiste :
- Choisir le gel.
- Choisir la phase mobile.
- Remplir la colonne.
- Equilibrer la colonne (fixation des contres ions).
- Injecter lchantillon (ltape de fixation ou adsorption des protines).
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3. 4. 1. 3. Chromatographie daffinit
Elle est base sur des interactions spcifiques et rversibles entre des composs
spcifiques (ligands), li par covalence un support inerte qui constitue la phase fixe et son
partenaire daffinit en solution (substance analyser ou affinant) (Tab. 4; Fig. 9). Le ligand est
fix sur une matrice (rsine) directement ou indirectement laide dun bras fixateur (espaceur).
Dans le complexe de nature biologique, dont la formation est la base de la chromatographie
daffinit, lun des partenaires au moins est une protine ; cette protine peut constituer le ligand
fixe ou le partenaire daffinit en solution.
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Matrice (rsine)
Ligand
Partenaire daffinit
Contaminants
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Des haptnes.
Des antignes.
Des anticorps.
- Pour ltude des protines rceptrices:
Des hormones.
A) Mode opratoire
Il consiste :
- Choisir la phase mobile.
- Remplir la colonne.
- Equilibrer la colonne.
- Injecter lchantillon.
- Laver la colonne pour liminer les substances non adsorbes.
- Eluer les substances adsorbe ou fixe.
- Rcuprer les fractions.
- Analyser le chromatogramme.
- Rgnrer le gel.
La premire opration consiste prparer le gel daffinit, en fixant le ligand sur le
support. Une colonne est remplie de ce gel daffinit. On y fait passer la solution aqueuse
contenant la substance purifier. Celle-ci est retenue, alors que les contaminants en solution
passent librement. Des lavages successifs permettent dliminer toute trace de produits
indsirables. Enfin, on lue la substance retenue en dcomposant le complexe (Fig. 10).
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B) Elution
Pour luer les substances adsorbes, il est ncessaire de modifier certains paramtres:
Le pH: Le substrat voit alors ses charges lectriques se modifier et son affinit pour le ligand
changer voire disparatre (lution non spcifique).
La force ionique en augmentant la concentration en sels (lution non spcifique).
La composition en ajoutant un compos (un tampon dlution qui contient un comptiteur ou
un ligand non fix) dont laffinit avec le ligand est plus forte (lution spcifique).
C) Applications
La chromatographie daffinit est adapte, soit lanalyse, soit la prparation de
substances biologiques. Elle a t utilise en:
- Enzymologie, pour lextraction denzymes et la purification dextrait enzymatiques.
- Immunologie, pour la purification danticorps.
- Protino-chimie, pour ltude des protines membranaires.
- Chimie des acides nucliques, pour le fractionnement de divers acides nucliques
(ARNm, ARNr, etc.)
Figure 11. Chromatographie dinteraction hydrophobe. Inspir de: "Strategies for Protein
Purification and Characterization" Marshak et al. (1996)- Cold Spring Harbor Laboratory Press.
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4. 2. Dfinition
Cest une des nombreuses techniques de sparation et danalyse de particules charges
par migration diffrentielles sous laction dun champ lectrique.
Des particules charges sont donc places dans un champ lectrique cr par une tension
continue et se dplacent vers le ple de signe oppos leur charge une vitesse proportionnelle
cette charge. Si on dpose une espce anionique (charge ngativement), elle migrera vers
lanode (+) et une espce cationique (charge positivement) du ct de la cathode (-).
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4. 3. Principe
Llectrophorse est une technique permettant de dplacer des ions (molcules ayant
perdu leur neutralit lectrique) sous leffet dun champ lectrique. Ceux-ci migrent vers leur
lectrode respective: Les anions migrent vers lanode et les cations migrent vers la cathode. Pour
les molcules non charges, il nexiste pas de migration. Du fait de leurs caractristiques propres
et des conditions de llectrophorse, la vitesse de migration et la distance parcourue dans la
matrice par ces ions diffrent, ce qui permet leur sparation.
4. 4. 1. Nature de la molcule
La taille et la charge de la molcule influencent le processus lectrophortique. En effet,
les petites molcules migrent facilement mais leur mobilit dpend des autres substances
dissoutes susceptibles de les solvater et de diminuer leur vitesse. De mme, la charge des
molcules influence directement leur mobilit. La charge est fonction du pH pour les molcules
ionisables, de la force ionique et de la formation ventuelle de complexes. Le signe de la charge
dtermine le sens de migration et sa vitesse.
4. 4. 3. Support
Certains supports possdent des proprits adsorbantes et peuvent fixer les molcules de
solvants ou de soluts. Il en rsulte un ralentissement de la migration entrainant un largissement
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des zones sur llectrophorgramme. Ces proprits adsorbantes sont lies la prsence de
certains groupements fonctionnels comme les hydroxyles.
4. 4. 4. Champ lectrique
Il reprsente la chute de potentiel par unit de longueur entre deux lectrodes spares par
une distance. Le champ lectrique est fourni par un gnrateur de courant continu. Le support
de ce champ est constitu par un tampon de pH dont les ions conduisent le courant dun ple
un autre. Ce support peut tre liquide: on parle alors dlectrophorse en veine liquide. Dans une
large majorit des cas, on utilise un support poreux stabilisant la phase liquide: on parle alors
dlectrophorse sur support ou dlectrophorse de zones. Le mlange sparer est dpos sur
un support poreux imprgn de tampon. Ce support peut tre du papier, un driv de cellulose,
de lamidon, de lagarose, du polyacrylamide, etc. Le support doit tre homogne et inerte.
Les particules sparer peuvent tre de nature et de taille trs diffrentes: des composs
organiques ou minraux, de la taille dune cellule ou de celle dun ion. Cette mthode est
souvent utilise pour sparer des acides nucliques, des petits peptides ou des protines.
4. 5. Types dlectrophorse
Llectrophorse peut tre en des conditions non dnaturantes ou en des conditions
dnaturantes (SDS-PAGE).
4. 5. 1. Electrophorse en des conditions non dnaturantes
Les molcules sont spares dans leur tat le plus proche possible de leur tat natif. La
vitesse de migration dpend de la charge native de la molcule et de sa structure
tridimensionnelle.
4. 5. 2. Electrophorse en des conditions dnaturantes
Les molcules sont soumises un traitement dnaturant avant la sparation
lectrophortique, dtruisant la structure tridimensionnelle native. La sparation est donc en
fonction de la masse molculaire. Les agents de dnaturation sont le SDS (Sodium Dodcyl
Sulfate) et le -mercaptothanol qui rduit les ponts disulfures des protines. Le SDS (Fig. 1) est
un dnaturant doux et un surfactant, il agit sur les protines de plusieurs faons:
- Si la protine est oligomrique, ses sous units sont spares les unes des autres.
- Il se fixe sur les protines, les tapissant de charge ngative (Fig. 2). Les protines transformes
en manopolyanions, possdent toutes la mme mobilit lectrophortique. La charge ngative
globale permet la migration vers lanode, mais les molcules sont spares uniquement en
fonction de leur masse molculaire.
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lagarose, du polyacrylamide (PAGE), etc. Les diffrents types dlectrophorse de zone sont
souvent nomms en fonction du type de support (papier, ester de cellulose, gel, etc.).
Electrophorse sur papier, sur actate de cellulose, sur gel (amidon, agar, agarose,
polyacrylamide).
Les fractions spares par lectrophorse de zone migrent comme des zones
individuelles. La taille des pores pour le support en gel peut influencer la vitesse de migration
(ralentissement du dplacement des grosses molcules).
A) Appareillage dlectrophorse
Lappareillage usuel est constitu de (Fig. 3):
Un gnrateur du courant continu stabilis reli aux lectrodes de la cuve. Ce courant cre
un champ lectrique qui va permettre de faire migrer les molcules.
Une cuve dlectrophorse ferme (horizontale ou verticale) et ventuellement thermostate
comportant deux compartiments. Chaque compartiment est rempli du tampon de migration.
Des accessoires comme le support dlectrophorse, les plaques de verre pour couler le gel
et les peignes pour creuser des puits dans le gel, dans lesquels les composs analyser
seront dposs.
Cuve Support
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B) Mode opratoire
Il consiste :
- Prparer le gel de concentration et le gel de sparation.
- Couler le gel de sparation entre des plaques de verre fixes sur un support suivi par le gel de
concentration.
- Dposer un peigne entre ces plaques.
- Retirer le peigne aprs polymrisation du gel (formation des puits).
- Dposer lchantillon et les marqueurs de masse molculaire dans les puits.
- Placer les plaques de verre contenant le gel polymris dans une cuve dlectrophorse.
- Remplir la cuve avec le tampon de migration.
- Mettre en marche le gnrateur de courant.
- Enlever le gel partir des plaques la fin de la migration.
- Colorer puis dcolorer le gel.
- Analyser le gel.
Prparation du gel
Elle consiste prparer deux gels: un gel de sparation dont les pores sont srs et un gel
de concentration dont les pores sont lches.
Le gel de polyacrylamide est une macromolcule rticule utilise comme support
dlectrophorse. Cest un copolymre dacrylamide qui forme des chanes et de NN-
mthylne bis-acrylamide qui assure le potage entre les chanes de polyacrylamide (Fig. 4). La
polymrisation de lacrylamide ncessite la prsence la prsence de deux catalyseurs: Le
TEMED (N, N, N, N-ttramthylthylne diamine: TMEDA) et le persulfate dammonium
[(NH4)2S2O8] qui deviennent des anions hyperactifs en prsence de lumire. La porosit du gel
varie en fonction du taux de lacrylamide, de bis-acrylamide, du TEMED (Fig. 5) et du
persulfate dammonium. Plus que le pourcentage dacrylamide est lev, plus que la densit des
chanes est leve et les mailles du rseau sont serres. Par consquence, plus le pourcentage
dacrylamide est lev, moins les molcules volumineuses peuvent migrer (Tab. 1). Donc, plus
que la masse molculaire du compos est leve, plus que la migration est lente.
Tableau 1. Pourcentage dacrylamide en fonction de la taille des protines sparer.
Acrylamide (%) Gamme de sparation (KDa)
7,5 45-400
10 22-300
12 13-200
15 2,5-100
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Acrylamide: CH2=CH-CO-NH2
+
Mthylne bis-acrylamide: CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2
=
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C) Applications
Llectrophorse est utilise pour vrifier la puret dune fraction chromatographique et
pour dterminer la masse molculaire dune protine inconnue laide des protines standards.
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4. 6. 1. Electrophorse bidimensionnelle
Cest une mthode de sparation des protines selon leur point isolectrique (pHi) et leur
masse molculaire. La sparation se fait en deux dimensions: La premire dimension consiste
sparer les protines selon leur pHi par isolectrofocalisation (IEF) et la deuxime dimension
consiste sparer les protines selon leur masse molculaire par lectrophorse en prsence de
SDS.
4. 6. 2. Isolectrofocalisation
La focalisation lectrique ou isolectrofocalisation (IEF) est une mthode de sparation
des protines en fonction de leurs points isolectriques (valeur de pH laquelle la molcule ne
prsente aucune charge nette).
LIEF est pratique sur lame ou sur colonne, dans lesquelles un gradient de pH est
prtabli. Le gradient de pH est ralis en imprgnant le gel avec un mlange de substances
amphotres de points isolectriques diffrents. Lorsque la diffrence de potentiel est applique,
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Matire: Techniques dextraction, de purification et de conservation .
les diffrents ampholytes se rangent dans lordre de leur point isolectrique et ralisent un
gradient de pH entre les deux lectrodes. Les protines dposes migrent vers lanode ou la
cathode selon leur charge mais, au fur et mesure de leur dplacement, le pH extrieur varie,
ainsi que leur propre charge: elles ne migrent plus quand leur charge nette est nulle (elles
focalisent lendroit o le pH est gal leur propre point isolectrique (Fig. 7).
Les ampholytes sont des mlanges dun certains nombre de molcules de faible masse
molculaire, donc trs mobiles, et comportant chacune plusieurs groupements acide carboxylique
et amine.
Le pH augmente
Ple acide Ple basique
AA BB CC DD EE FF GG
Anode (+) Cathode (-)
AA BB CC DD EE FF GG
Lchantillon protique est dpos dans un large puits au centre du gel. Les protines
migrent dans une direction ou dans lautre jusqu ce quelles rencontrent leur point
isolectrique, point o elles cessent de migrer.
Dans lIEF, le gel de polyacrylamide doit tre de forte porosit pour que la taille des
protines ninfluence pas leur migration.
LIEF est utilise pour dterminer le point isolectrique dune protine inconnue par
lutilisation des marqueurs de point isolectrique (standards), en traant la droite dtalonnage:
pHi standards = f(Rf). Il ya une relation linaire entre le point isolectrique des protines et leur
rapport frontal (Fig. 8).
Emplacement du dpt
Figure 9. Lame dimmunolectrophorse.
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Lantisrum spcifique est dpos dans une rigole dcoupe paralllement la direction
de la migration lectrophortique (Fig. 10). La plaque est place en chambre humide pendant 24
48 heures. Aprs cette priode, les arcs de prcipitation apparaissent.
Cette technique est une mthode analytique qui permet de dnombrer une trentaine de
protines dans le srum humain.
Lexploitation de la plaque est faite visuellement:
Par observation directe sur fond noir, ou la loupe clairante.
Par photographie et agrandissement.
Par coloration aprs lavage et schage.
Linterprtation des rsultats ncessite la comparaison de lchantillon analyser et un
srum normal. La comparaison porte sur:
La position lectrophortique des arcs.
Leur forme et leur paisseur.
Leur nettet.
Remarque:
Un arc pais, plus long et plus prs de la rigole indique un accroissement de la teneur en
cette protine.
Un arc plus fin, plus court et plus loign de la rigole indique linverse.
Un arc flou qui indique un mauvais rapport stoechiomtrique Ag-Ac, prs de la rigole,
signifie une augmentation de lantigne; loign de la rigole, une diminution.
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I) Dfinition de la conservation
La conservation est le maintien et la prservation dun lment dans un tat constant. Ce
mot est rencontr dans plusieurs domaines:
En cinmatographie, la conservation et la restauration des films.
En finance, la conservation de titres.
En politique, lidologie de conservation est appele conservatisme.
En cologie, la conservation de la nature et la conservation de la biodiversit.
En agroalimentaire, la conservation des aliments.
Scher, saler, acidifier, confire dans la graisse ou le sucre ont t longtemps les seuls
moyens connus et pratiqus pour conserver les aliments avant la dcouverte, par Nicolas Appert,
de la strilisation par la chaleur. Aprs la dcouverte de lintrt des traitements par la chaleur,
une nouvelle tape t franchie avec la conservation par le froid. Les esquimaux savaient
conserver leurs aliments dans la glace. Cest en 1876 que Charles Tellier inventa la premire
armoire conservatrice, anctre de notre rfrigrateur. En 1929, Clarence Bird-Seye inventait le
procd de surglation.
Dautres procds ont t utiliss avec succs: dshydratation, lyophilisation, etc. Quel
quen soit le principe ou le protocole, un procd de conservation a pour but soit de bloquer ou
de ralentir lvolution des flores microbiennes de laliment, soit de les dtruire.
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2. 1. 1. La dshydratation
Cette technique de stabilisation est trs ancienne: Elle est base sur la baisse de lactivit
deau du produit. Ds la plus haute antiquit, des grains, des fruits, des viandes, des poissons ont
t schs au soleil. Plus tard, le schage a t effectu dans des fours. Aujourdhui, les denres
sont dshydrates par diffrentes techniques: schoirs air chaud, cylindres chauffants, etc. Le
but de la dshydratation est dliminer la plus grande partie de leau lie prsente dans le produit
pour empcher le dveloppement de micro-organismes et bloquer lactivit enzymatique.
Il existe des tunnels de dshydratation comparables aux tunnels employs pour la
conglation. Les aliments sont soumis un courant dair chaud et sec. Lair est la fois la source
de chaleur (par convexion) et le vhicule permettant llimination de la vapeur deau.
Les produits obtenus par dshydratation (lait en poudre, crales, fruits secs) peuvent tre
conservs temprature ambiante dans des emballages les protgeant de lhumidit. Les
techniques actuelles de dshydratation permettent de conserver les qualits nutritionnelles des
denres alimentaires.
2. 1. 2. La lyophilisation
La lyophilisation (sublimation de leau froid ou cryodessiccation) est un procd trs
utilis qui conserve les proprits de laliment. Elle a t invente en 1906 par les franais
Arsne dArsonval et F. Bordas. Le produit est dabord congel puis plac pression rduite et
chauff. Le solvant passe directement de ltat solide ltat de vapeur (sublimation). Le solvant
sublim est gnralement de leau, mais ce peut tre galement un alcool. La dure moyenne
dun cycle de lyophilisation est comprise entre 60 et 72 heures. Ce procd de conservation a
diffrentes applications savoir les produits biologiques (protines, enzymes, micro
organismes...), les actifs pharmaceutiques et cosmtiques et les produits alimentaires.
La lyophilisation consiste enlever leau dun produit liquide, pteux ou solide, laide
de la surglation puis une vaporation sous vide de la glace sans la faire fondre. Le
rchauffement de leau ltat solide trs basse pression conduit sa sublimation (passage
directement de ltat solide ltat gazeux). La vapeur deau (ou de tout autre solvant) quitte le
produit et sera captur par conglation laide dun condenseur. Ce procd prserve
particulirement bien les proprits et la structure du produit sensible la chaleur. Il permet la
rhydratation rapide grce la structure poreuse des poudres et la petite humidit rsiduelle.
Trois phases majeures sont distingues dans un cycle de lyophilisation:
A) La conglation
Cest la phase la plus critique du cycle de lyophilisation car elle doit garantir que le
produit lyophiliser ne sera pas altr. Elle consiste diminuer de manire lente la temprature
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du produit une valeur comprise entre -20C et -80C, de faon bloquer leau sous forme
solide (sans cristaux) dans la situation o elle se trouvait ltat liquide; pour viter la lsion des
cellules, des vaccins, des enzymes, ou tout autre principe actif. Par contre, la trop rapide
conglation dun produit trs liquide, produit de petits cristaux de glace qui poussent le produit
actif vers le haut, ce qui peut galement le dnaturer.
B) La dessiccation primaire (la sublimation)
Cest une tape de sublimation effectue sous vide. Durant laquelle, leau contenue dans
le produit passe de ltat solide ltat gazeux. Elle est effectue une temprature suprieure
-20C et consiste extraire leau libre, qui est sous forme de glace libre (ou interstitielle). La
chaleur est apporte au produit sous un vide qui varie de 5 bar 500 bar selon le produit
lyophiliser. Ceci permet la sublimation de la glace. Au passage ces niveaux de vide, la chaleur
est principalement apporte par radiation ou conduction avec les tagres contenant le fluide
caloporteur (fluide charg de transporter la chaleur entre deux ou plusieurs sources de
temprature), la convection pouvant tre considre comme nulle.
La temprature pendant le cycle peut varier selon le produit et les besoins de production.
La vapeur deau est capte par un pige froid ou condenseur et la dshydratation du produit se
poursuivra en continu. Le flux de sublimation lintrieur de lyophilisateur est dtermin par le
niveau de vide, la temprature du produit et le temps de dessiccation. Un flux de vapeur trop
lev peut emporter avec lui le produit lyophiliser. Un cycle trop court laissera trop deau dans
le produit, qui pourra tre dgrad lors de la dessiccation secondaire. Par contre, un cycle trop
long peut dgrader certaines molcules actives. Lorsque la plus grande partie de leau sest
sublime, le produit initial a perdu environ 80 90% de son eau.
C) La dessiccation secondaire (le schage final)
Cest une tape qui seffectue toujours sous vide une temprature nexcdant pas 50C.
Le vide est pouss jusquaux environs 5 bar. Elle consiste enlever leau captive du produit
par dsorption, car des molcules deau restent piges en surface. Cest une tape dlicate, car
pousse trop loin, elle peut dnaturer le produit. Pour arracher les molcules, la temprature du
produit est maintenue ou augmente jusqu des valeurs positives. Lopration peut tre
complter en baignant le produit dans une atmosphre dazote, dont les molcules prendront la
place des quelques molcules deau restantes. A la fin du cycle, le produit est sec 95% ou plus.
La lyophilisation peut seffectuer naturellement (schage aux montagnes) ou, plus
rapidement, dans un appareil appel lyophilisateur (Fig. 1). Le lyophilisateur est un appareil qui
permet de lyophiliser, par dessiccation sous vide basse temprature, des produits et des
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microorganismes. Il est compos au minimum dune enceinte frigorifique pouvant tre tire au
vide et dune surface plus froide faisant office de pige frigorifique.
2. 1. 3. Le fumage et le salage
Le fumage (fumaison) est lun des plus anciennes mthodes de conservation utilis
depuis le Palolithique. Il se fait en complment du salage. Le fumage des viandes ou des
poissons combine laction de la chaleur (dshydratation) celle des produits de pyrolyse
(antiseptiques) tels que le formol, les acides organiques, les acides pyroliques, les alcools, les
ctones, les phnols, les crsols, etc.); de plus, il ya une action sur la saveur, la couleur et la
texture.
Le fumage consiste soumettre un aliment laction de la fume (composs gazeux) qui
se dgage lors de la combustion de vgtaux. Durant ce processus, il se produit une limination
partielle de leau dans laliment et une imprgnation des composants de fume en lui mme. La
fume est le rsultat de la pyrolyse du bois. Elle contient en moyenne 50% de particules solides
(suie, goudron, rsine), 25% de composs volatiles (phnol, acides organiques) et 25% deau.
Le salage (salaison) est une mthode de conservation base sur lutilisation du sel sec.
Pour une bonne dshydratation et empcher le dveloppement des microbes et des bactries, il
faut compter environ 15% de sel selon le poids du produit conserver. Le chlorure de sodium est
le plus utilis comme sel pour absorber leau prsente dans des aliments comme les fromages et
les poissons.
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2. 2. 1. La pasteurisation
La pasteurisation (dbactrisation thermo-contrle) tire son nom des travaux de Louis
Pasteur sur la stabilisation des vins au XIXe sicle. Cest lui qui la dcouvre en 1865. Elle
dsigne un traitement thermique qui dtruit, de manire plus au moins totale, des lments
microbiens sous leur forme vgtative. En ralit, la pasteurisation se fait parfois dans des
conditions liminant de manire certaine les microorganismes pathognes (Staphylococcus,
Salmonella, etc.) mais pas forcment toutes les formes vgtatives: certaines, thermorsistantes,
peuvent survivre au cot de formes sporules. La thermo-rsistance de certains lments dpend
du milieu dans lequel la pasteurisation est pratique. Plus le milieu est acide, moins la rsistance
la chaleur est leve. Par exemple, dans un jus de fruit ayant un pH infrieur 4.5, tous les
microorganismes seront dtruits tandis que pour un produit ayant un pH suprieur 4.5 (produits
carns), les micro-organismes rsistants plus de 100C ne seront pas dtruits. Dans ce cas, on
parle des semi-conserves.
La pasteurisation a t au dpart gnralement pratique des tempratures infrieures
100C, mais elle a volue vers une baisse du temps et une lvation de temprature (Tab. 1).
Elle sert dtruire les bactries des aliments sans pour autant changer leur composition, leur
saveur ou leur valeur nutritive. Elle sapplique dans divers cas: lait, vinaigre, jus de fruit, etc. Un
lment pasteuris doit tre conditionn dans un emballage tanche et conserv au froid (+4C)
afin de prvenir la multiplication des bactries qui nauraient pas t dtruites. Pour
la conservation des vitamines, ce processus est le moins agressif des techniques thermiques.
Plusieurs procds de pasteurisation existent, parmi lesquels:
A) La pasteurisation basse
Le produit est maintenu au moins trente minutes 60-65C dans une enceinte double
paroi dans laquelle se trouve de leau chaude. Ce procd a t abandonn pour le lait (il tait
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essentiellement destin inactiver Mycobacterium bovis). Il est encore trs utilis pour les corps
gras et les jus de fruits.
B) La pasteurisation rapide haute temprature
Elle consiste chauffer laliment un temps trs court, de quinze secondes deux minutes,
une temprature leve (70 90C). Le produit est plac entre des plaques dacier inoxydable
chauffes par un circuit deau chaude. Lindustrie laitire recourt ce procd pour prparer le
lait pasteuris. Elle est utilise aussi pour pasteuriser des pures de lgumes, des potages. Cest
une alternative la pasteurisation basse pour tous les produits concerns par ce type de
traitement.
Tableau 1: Barmes de pasteurisation.
Denre Temprature et temps ncessaire
Lait 30 minutes 60C ou 15 secondes 72C
Crmes/Crmes dessert 30 minutes 71C ou 16 20 secondes 82C
Jus de pommes en bouteilles 30 minutes 77C
Boissons gazeuses base de jus de fruit 30 minutes 66C
2. 2. 2. Lappertisation
En 1785, un confiseur, Nicolas Appert, eut lintuition dun procd de conservation qui
devait rvolutionner les habitudes alimentaires, liminer le scorbut et faire natre toute une
industrie: il enferma des lgumes dans des bouteilles tanches quil plongea un temps prolong
dans de leau bouillante. Laspect des lgumes restait identique pendant plusieurs mois, leur gout
tait prserv. Cette technique de conservation est appele appertisation autrement dit
strilisation par la chaleur couple un conditionnement tanche. Elle correspond un
traitement permettant dliminer tous les microorganismes (y compris sous forme sporule). Les
paramtres du traitement sont suprieurs ceux de la pasteurisation et ils varient selon le produit
entre dix minutes 115C et trente minutes 121C (Tab. 2).
Les traitements thermiques haute temprature prsentent linconvnient dinactiver une
proportion non ngligeable de diverses vitamines. Or, la relation temprature/dure est diffrente
pour les microorganismes et pour les vitamines. Un chauffage long temprature modre
dtruit les vitamines et nest pas suffisant pour inactiver les microorganismes. Au contraire, un
traitement pendant un temps trs court haute temprature est suffisant pour inactiver les
bactries tout en prservant les vitamines. Ce procd est utilis pour la conservation des
liquides. Le lait, par exemple, est chauff en couche mince une deux secondes 140C-150C:
cest le traitement ultra haute temprature (UHT). Ces laits sont conditionns aseptiquement en
rcipients tanches et striles; ils peuvent tre conservs plusieurs mois temprature ambiante.
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2. 3. 1. La cryoconservation
Cest la conservation, notamment de tissus organiques, trs basses tempratures
(utilisation dazote liquide). Cest une technique de fixation ou de stabilisation des matriaux
biologiques (cellules, tissus, organes, ou des embryons) par la conglation. Dans les prparations
histologiques, la cryoconservation (cryofixation) est employe pour maintenir la forme existante,
la structure et la composition chimique de tous les lments constitutifs des spcimens. Ces
derniers sont de petits chantillons de plantes ou de tissus dorigine animale, des suspensions
cellulaires de micro-organismes ou de cellules en culture, des suspensions de virus et des
chantillons de macromolcules purifies (comme les protines).
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2. 3. 2. La rfrigration
Elle consiste baisser la temprature dun aliment des valeurs lgrement suprieures
son point de conglation. Lintrt de la rfrigration consiste inhiber le dveloppement des
germes msophiles, dont la plupart des microorganismes pathognes. La rfrigration qui utilise
une temprature comprise entre 0C et 4C empche la multiplication de nombreux germes mais
pas celle des germes psychrophiles. A partir de 10C, lvolution de la flore msophile nest que
ralentie.
La conservation prolonge dune denre alimentaire et sa scurit vis--vis des
microorganismes pathognes impliquent donc:
- Une rfrigration la temprature la plus basse possible.
- Une rfrigration continue (la chane du froid ne doit pas tre interrompue).
La rfrigration est souvent associe dautres procds de stabilisation des aliments:
pasteurisation, addition dun conservateur, etc.
La rfrigration ne sutilise que pour quelques jours et est effectue dans un rfrigrateur
ou dans une chambre froide. Elle rduit les phnomnes doxydation et prserve les saveurs. Elle
est aussi utilise grande chelle pour conserver des fruits (pommes, poires) plusieurs mois dans
les stations fruitires. La dure de stockage varie selon les aliments (produits frais et/ou semi-
conserves).
2. 3. 3. La conglation
La conglation est une technique consistant abaisser la temprature dune denre
alimentaire de faon faire passer ltat solide gnralement leau, quil contient. Cette
cristallisation de leau contenue dans la denre permet de rduire leau disponible pour des
ractions biologiques et donc de ralentir ou arrter lactivit microbienne et enzymatique. La
conglation 18C permet une stabilisation totale vis--vis des microorganismes et entrane
une mortalit plus au moins importante selon la nature des germes et la vitesse de
refroidissement. La conservation au froid, une temprature infrieure -18C ou gale -24C
2C est utilise pour:
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2. 3. 4. La surglation
Un produit surgel est un aliment trs frais ayant subi une conglation ultrarapide. Il
sagit donc dun cas particulier de conglation. La surglation (-40C et mme - 80C), comme
la conglation, permet une stabilisation totale vis--vis des microorganismes et entrane une
mortalit plus au moins importante selon la nature des germes, celle de laliment, la vitesse de
refroidissement et la temprature de stockage.
Les produits surgels conservent toute leur texture, leur saveur et peuvent tre conservs
plus longtemps. Ils peuvent se conserver -18C pendant plusieurs mois (voire une anne) sans
modification notable des nutriments. Toutefois, pour certaines denres dorigine animale, la
prsence dune activit rsiduelle des enzymes peut causer le rancissement (altration des corps
gras entrainant une modification dsagrable de leur odeur et de leur saveur) des matires
grasses au stockage.
2. 4. La conservation par agents chimiques
Les additifs de conservation ou conservateurs chimiques sont utiliss dans le but de
prolonger la dure de conservation des aliments. Les produits microbiostatiques ou microbicides
susceptibles dtre ajouts aux aliments sont qualifis de conservateurs alimentaires. Un bon
conservateur doit tre bactricide plutt que bactriostatique; il doit agir sur les levures et les
champignons, il doit tre actif sur les germes pathognes et sur ceux responsables daltrations, il
doit tre stable et inoffensif (absence de toxicit) et sans action sur la valeur nutritionnelle.
Les effets des conservateurs alimentaires peuvent tre spcifiques (acides caprylique,
dshydroactique, sorbique et propionique, acide benzoque et benzoates, nitrites, anhydride
sulfureux, thanol, antibiotique, etc.) ou rsulter de modifications de certaines proprits de
laliment comme le pH (acide actique, citrique, formique, tartrique, lactique, etc.) ou lactivit
de leau (chlorure de sodium, saccharose, etc.). Ladjonction de sel ou de sucre modifie le got
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de laliment et permet dabaisser lactivit de leau des valeurs pour lesquelles seule une flore
non dangereuse pour le consommateur est susceptible de survivre ou de se multiplier.
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