UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO

Departamento de Ciencias
Laboratorio de Microbiologa Molecular y Biotecnologa

RNA INTERFERENTE (iRNA)

Y SUS APLICACIONES

Blgo. Dr. Jos Gonzlez Cabeza

Flujo de Informacin

Blgo. Dr. Jos Gonzlez Cabeza

Tipos de RNA

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 Caenorhabditis elegans
Caenorhabditis elegans es
una especie de nematodo
de la familia Rhabditidae
que mide aproximadamente
1 mm de longitud, y vive en
ambientes templados. Ha
sido un importante modelo
de estudio para la biologa,
muy especialmente la
gentica del desarrollo,
desde los aos 70.

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 ANTECEDENTES
En los aos ochenta se observ en bacterias que molculas pequeas (unos 100
nucletidos) de RNA pueden aparearse con secuencias complementarias e inhibir la
sntesis de protenas. Este proceso de activacin antisentido tambin ocurre en clulas
eucariotas, como se demostr por primera vez en 1993 con el gusano C. elegans. Durante
aos se pens que este modelo de regulacin no era comn, hasta que se demostr la
existencia de un gran nmero de molculas pequeas de RNA. Aunque solamente un 2% del
genoma contiene secuencias codificantes para aproximadamente 30.000 genes, se
transcribe cerca del 50% del genoma en RNA.

Muchos de estos transcritos no contienen una seal de lectura ORF (open reading frame)
por lo que no son traducidos a protenas. Ms bien se trata de RNAs no codificantes
(ncRNAs), que sin embargo dan origen a RNAs biolgicamente activos, incluyendo variantes
que pueden regular o silenciar a los genes codificantes.
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 ANTECEDENTES

Richard Jorgensen

En petunia, se han descrito fenmenos de cosupresin o Silenciamiento Gnico

Post-Transcripcional (PTGS) de la expresin del gen CHS, provocando distintos
fenotipos de coloracin de los ptalos de las flores.
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Ciclo de vida de Neurospora crassa
Otros cientficos, en la
Universidad de Roma con el
hongo Neurospora crassa
observaron que cuando
introducan copias
adicionales del gen que
codifica para el pigmento
naranja que sintetiza el
hongo, los hongos
transgnicos perdan su color
naranja y se producan
hongos blanquecinos. A este
fenmeno lo llamaron
quelling o supresin.

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 ANTECEDENTES
Descubierto accidentalmente cuando se inyecto una cadena anti-sentido para bloquear la
expresin del gen par-I en Caenorhabditis elegans
En 1995 el estudiante Sue Guo del laboratorio de Kemphues en la Universidad de Cornell,
estudiando la influencia de genes especficos en desarrollo, demostr que cuando introduca
secuencias en forma de oligonucletidos antisentido y sentido juntos en C. elegans la
supresin del gen de inters era mayor que cuando introduca los oligos sentido o
antisentido de forma individualizada.

Ninguno de los grupos anteriores fue capaz de dar una explicacin al fenmeno de supresin
que observaron en sus experimentos
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 ANTECEDENTES

- Craig C. Mello - - Andrew Z. Fire -

Escuela de Medicina en la Universidad de Stanford
Universidad de Massachussets en California

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 Experiencia de Mello y Fire
En 1998, Fire y Mello finalmente resolvieron el misterio, al inyectar un RNA de doble cadena
dentro de C. elegans.

Ninguno de los grupos

anteriores fue capaz de dar
una explicacin al fenmeno
de supresin que observaron
en sus experimentos.

Seran Fire-Mello los que

demostraran en 1998 la
existencia del RNA
interferente como
explicacin de este proceso
de control selectivo de la
expresin gnica.
Phenotypic effect after injection of single-stranded or double-
stranded unc-22 RNA into the gonad of C. elegans. The unc-
22 gene encodes a myofilament protein. Decrease in unc-
22 activity is known to produce severe twitching movements.
Injected double-stranded RNA, but not single-stranded RNA,
induced the twitching phenotype in the progeny.
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 Experiencia de Mello y Fire

Fire et al, 1998, Nature 391, 806811

The effect on mex-3 mRNA content in embryos after injection of single-stranded or double-
stranded mex-3 RNA into the gonad of C. elegans. mex-3 mRNA is abundant in the gonads and
early embryos. The mRNA was lost after injection of double-stranded RNA, while injection of
antisense RNA only reduced the content of mRNA to some extent. The extent of brown colour
reflects the amount of mRNA present.
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Nobel de Fisiologa y Medicina 2 de octubre de 2006

- Craig C. Mello - - Andrew Z. Fire -

Escuela de Medicina en la Universidad de Stanford
Universidad de en California
Massachussets

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Tres Experiencias demostraran el
Silenciamiento Gnico

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MECANISMO DE SILENCIAMIENTO GNICO
Varios grupos de investigacin se lanzaron al
estudio bioqumico del proceso de RNAi,
demostrando con embriones de Drosophila que el
dsRNA es procesado a un tamao de 21-23
nucletidos, semejante al descrito en plantas. Se
propuso que este dsRNA, llamado RNA pequeo
de interferencia (small-interfering RNA, siRNA)
acta como gua para la rotura del mRNA.

Posteriormente, por ensayos in vitro con cultivos

celulares de Drosophila, se descubri la
maquinaria del RNAi. Se demostr la existencia de
un complejo llamado RISC (RNA induced silencing
complex) que interacciona con el mRNA a travs
del RNA antisentido de bajo tamao donde el
mRNA es fragmentado y posteriormente
degradado.
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BIOQUMICA DE LOS iRNA

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miRNAs y siRNA COMO REGULADORES
DE LA EXPRESIN GNICA

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miRNAs COMO REGULADORES
DE LA EXPRESIN GNICA

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MICRO RNAs COMO REGULADORES
DE LA EXPRESIN GNICA

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miRNAs y siRNA COMO REGULADORES
DE LA EXPRESIN GNICA
Va del ARN de interferencia. Las dos
vas de procesamiento se indican con
los nmeros 1 y 2. Los pasos de cada
va se sealan con letras.
1. Biognesis de microARN: a)
procesamiento por drosha en el
ncleo, b) exportacin de la
molcula pre-microRNA del ncleo
al citoplasma por exportina-5, c)
segundo procesamiento por dicer,
d) identificacin y desnaturalizacin
del microARN por miRISC, e)
seleccin asimtrica de una de las
cadenas del microARN, f)
apareamiento con el mARN blanco y
represin de la traduccin.
2. Biognesis de los siARN: a)
presencia de un RNA de doble
cadena en el citoplasma, b)
procesamiento por dicer, c)
identificacin del dplex de 19 a 12
pares de bases por siRISC, d)
seleccin asimtrica de una de las
cadenas del dplex, e)
apareamiento con el ARNm blanco y
subsiguiente degradacin.

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miRNAs y siRNA COMO REGULADORES
DE LA EXPRESIN GNICA

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 Mirtrones
Los mirtrones (Mirtrons en
ingls) son precursores
dsRNA con estructura de
hairspin semejante al
precursor pre-miRNA, que
provienen de secuencias
cortas de intrones que sufren
un proceso de empalme y
corte o splicing (en ingls).

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 Mirtrones y hpRNA

siRNA endgenos pueden ser

generados a partir de
transcritos con secuencias
repetidas invertidas que al
doblarse forma un rizo o
hairpin (hpRNAs) a
semejanza de un miRNA,
pero son ms largos y no
requieren del procesamiento
por el complejo Drosha. Su
existencia ha sido confirmada
en Drosophila, oocitos de
ratn y clulas
pluripotenciales embrionarias
de ratn.

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iRNA como Herramienta para
el Silenciamiento de Genes

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iRNA como herramienta de Silenciamiento de Genes
Figura 4. Generacin de shRNAs expresados en
vectores de expresin. Los vectores de expresin
son derivados de plsmidos o de
lentivirus/retrovirus. Estos presentan
generalmente: a) sitios de restriccin especficos
donde se inserta el shRNA; b) un promotor
eucaritico de polimerasa para la expresin del
shRNA; c) un marcador o resistencia a antibiticos
para la seleccin de las clulas que contenga el
vector, y d) resistencia a ampicilina/kanamicina
para la seleccin de bacterias transformadas con el
vector. Los shRNA son sintetizados a partir de una
sola hebra que codifica para la secuencia sentido
(19nt), seguido de 5-10 nt que forman la
estructura de rizo y la secuencia anti-sentido
complementaria de 19-29 nt. La hebra es clonada
(insertada) dentro del vector de expresin,
introducida a la clula y transcrita mediante el
promotor eucaritico de polimerasa III (Pol III)
como el H1 y U6. Los shRNAs son entonces
procesados por Dicer, para producir los siRNAs y
desencadenar el mecanismo de RNAi.
GFP=protena verde fluorescente..
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iRNA como herramienta de Silenciamiento de Genes

La inhibicin artificial de la expresin de genes mediante RNAi es conocido

como silenciamiento o knocking down debido a que la inhibicin no es
total, a diferencia del knocking out donde el gen es eliminado
completamente del genoma. Usando la informacin acerca del RNAi en
mamferos, se desarrollaron los siguientes mtodos para el silenciamiento
de genes
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 iRNA como herramienta de Silenciamiento de Genes
Inhibicin artificial de expresin de genes mediante RNAi Silenciamiento o knocking
down debido a que la inhibicin no es total, a diferencia del knocking out donde el gen es
eliminado completamente del genoma.

El uso de RNAs
pequeos con
estructura de
El uso de siRNAs hairpin (shRNA o
sintticos de 21 nt short hairpin
introducidos RNA) expresados
directamente a la en vectores-
clula mediante plsmidos,
transfeccin o introducidos a la
electroporacin. clula mediante
transfeccin o
electroporacin.

El uso de shRNA expresados en vectores de

expresin virales, introducidos a la clula mediante
infeccin con pseudo-partculas virales.
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 APLICACIONES DEL
LOS iRNA EN BIOMEDICINA

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En Cncer Ciclo celular

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En Cncer Ciclo celular

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Cncer Biomarcadores / Tto. Personalizado

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 Cncer - Biomarcadores
La escala de los miRNA dirigidos a las vas inmunes en el cncer muestra un desequilibrio de los
miRNAs supresores de tumores, que son ms frecuentes que los miRNAs oncognicos segn el
conocimiento de hoy en da. Los miRNA oncognicos estn altamente expresados en cncer,
mientras que los miRNA supresores de tumores poseen una expresin reducida.

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Cncer - Quimioresistencia

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 Infecciones
Silenciamiento del Virus de la Hepatitis C

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 Infecciones

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 Infecciones
Silenciamiento del VIH

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 APLICACIONES DEL
LOS iRNA EN CONTROL DE
PLAGAS

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 APLICACIONES EN CONTROL DE PLAGAS
Plantas transgnicas que expresan ARNdc. A. Plantas de maz expresando ARNdc
especfico para la protena V-ATPase de Diabrotica virgifera virgifera. A la
izquierda, una planta no-transgnica, mostrando dao en la raz y a la derecha, la
planta transgnica (tomada de Baum et al. 2007).

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 APLICACIONES EN CONTROL DE PLAGAS
Plantas transgnicas que expresan ARNdc. B. Cpsulas de algodn expresando
ARNdc dirigido contra el gen CYP de Helicoverpa armgera (tomado de Mao et al.
2011).

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 Seleccin de Blancos para iRNA
En Europa, Helicoverpa armigera causa
los mayores daos en la zona
mediterrnea y es la especie que
puede ocasionalmente causar daos en
las plantaciones de ctricos.

Xiong et al. (2013): Evaluacin de secuencias de ARNdc dirigidas, especficamente, a genes

involucrados con el metabolismo de la muda en Helicoverpa armgera; consiguiendo
resistencia de la planta al ataque del insecto, pues las larvas que se alimentaron de la planta
transformada presentaron tasas de mortalidad, entre el 30 y el 50%, as como tambin
deformaciones en el desarrollo y en la disminucin en la tasa de crecimiento de los individuos
sobrevivientes. Blgo. Dr. Jos Gonzlez Cabeza
Seleccin de Blancos para iRNA

Khajuria et al. (2015): Silenciaron en D.

virgifera virgifera el gen hunchback (hb), el
cual, codifica para un factor de transcripcin
importante en el desarrollo del plan corporal
y tambin el gen brahma, relacionado con la
embriognesis, logrando producir ausencia
de desarrollo embrionario en la descendencia
de los organismos tratados.
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Seleccin de Blancos para iRNA

Zhu et al. (2012). Silenciaron en Cimex lectularius

el gen codificante para una protena
multidominio denominada CPR (NADPH-
Citocromo P450 Reductasa), relacionada con va
metablica vital en el desarrollo de resistencia a
pesticidas, en dicho insecto. Mediante el
silenciamiento de dicho gen lograron obtener
una significativa reduccin de la resistencia del
insecto al insecticida deltametrin.

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 Suministro o liberacin de Inductores de iRNA
Ingestin directa de las secuencias de silenciamiento

Un caso muy exitoso: Silenciamiento de 5 importantes genes constitutivos en mosca

blanca (Bemisia tabaci) = Obtener altas tasas de mortalidad en el insecto, seis das
despus de la ingesta de siRNAs y ARNdc Se que secuencias de siRNAs se
mantuvieron estables en la dieta del insecto, al menos durante siete das, a
temperatura ambiente.
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Suministro o Liberacin de Inductores de iRNA
Nuevas metodologas

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Suministro o Liberacin de Inductores de iRNA

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 Suministro o Liberacin de Inductores de iRNA
Otros estudios Presentado alternativas diferentes para el suministro de ARNdc utilizaron
nanopartculas polimricas de quitosano ensamblados a secuencias de ARNdc, dirigidas
contra genes de quitin sintasa (CHS1 y CHS2), en Anopheles gambiae, las cuales, fueron
administradas al insecto, a travs del alimento A pesar de no presentar mortalidad =
Individuos tratados aumentaron la susceptibilidad al insecticida diflubenzuron.

+
dsRNA
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 Suministro o Liberacin de Inductores de iRNA

Igualmente Uso de ARNi de forma conjunta + Toxinas tipo Cry de Bacillus thuringiensis (Bt)
Constituir en una de las estrategias ms empleadas en la lucha contra los insectos plaga de cultivos de
importancia econmica.
Es factible suponer que la resistencia que presentan algunas especies de insectos a las toxina tipo Cry de
Bacillus thuringiensis (Bt), se podra superar exitosamente, mediante el silenciamiento de los genes que
estn directamente involucrados en ella, retrasando, de esta forma, la evolucin de resistencia al usar
diferentes modos de accin (Baum & Roberts, 2014).
Blgo. Dr. Jos Gonzlez Cabeza
 Textos

Blgo. Dr. Jos Gonzlez Cabeza

muchas gracias,
es turno de Uds.
Blgo. Dr. Jos Gonzlez Cabeza

gonzalezbiotec@hotmail.com
www.gonzalezcabeza.com

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Blgo. Dr. Jos Gonzlez Cabeza