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Toxicidad crioprotectora
Los agentes crioprotectores (CPA) se desarrollaron para sustituir una porcin de agua dentro
y alrededor de las clulas, reduciendo el tamao de los cristales de hielo y limitando la
concentracin excesiva de sales durante la congelacin. Desafortunadamente, los CPA son
txicos para las clulas vivas, los tejidos y los rganos (bioinyecciones) y la toxicidad de los
CPA aumenta con la concentracin y el tiempo de contacto en estado lquido. Los CPA se
unen a las protenas y otras molculas, interrumpen mltiples vas bioqumicas dentro de las
clulas y causan desequilibrio osmtico [9]. Adems, muchos tejidos y rganos tienen una
permeabilidad limitada incluso para los CPA ms penetrantes, como Me2SO, lo que dificulta
la carga de altas concentraciones de CPA y lleva mucho tiempo. Por lo tanto, es necesario
desarrollar mtodos alternativos para la criopreservacin con una concentracin de CPA ms
baja o libres de CPA para abordar la creciente demanda de criopreservacin de muestras
biolgicas de calidad.
Para probar la hiptesis anterior sobre los glbulos rojos humanos (RBC), se desarrollaron
mtodos y aparatos que se presentan a continuacin.
Modelo biolgico.
Los glbulos rojos se eligieron como un modelo para desarrollar y probar el mtodo preliminar.
A diferencia de los tejidos y rganos complejos, es relativamente fcil analizar y cuantificar los
daos a los glbulos rojos, que generalmente se realiza mediante la medicin de la
hemoglobina libre y la morfologa celular. Los glbulos rojos no tienen ncleo, ADN o ARN y,
por lo tanto, carecen de capacidad de reparacin de membranas, lo que hace que sus
membranas sean ms sensibles a los daos cuando se comparan con los tipos de clulas
nucleadas con capacidades avanzadas de reparacin de membranas. Dado que el dao a las
membranas celulares es un resultado directo de la formacin de cristales de hielo, la
reparacin de las membranas por las clulas puede ser indeseable para probar los mtodos
de criopreservacin. Si el mtodo funciona en glbulos rojos, entonces hay una buena
probabilidad de que tambin funcione en muestras biolgicas ms complejas.
La suspensin celular se extruy del tubo empujando el tapn de goma con un alambre de
acero inoxidable (1,37 mm de dimetro, 21 cm de largo). Alrededor de 90L de suspensin
de clulas, obtenida de la porcin media del tubo, se centrifugaron a 3200 RPM durante 3 min.
La concentracin de hemoglobina en el sobrenadante se midi usando el analizador
HemoCue Hb 201+ (HemoCue AB, Suecia). Se calibr el analizador y se confirm su precisin
con los controles estndar de hemoglobina trilivel (Stanbio, Boerne, TX) y la siguiente prueba
de linealidad. Una muestra de sangre completa con concentracin de hemoglobina de 13,2 g
/ dL (dentro de los lmites normales para la sangre humana) se diluy 1: 1, 1: 4, 1: 9 y 1:19 en
una solucin salina isotnica para obtener las siguientes concentraciones de hemoglobina:
50%, 25%, 10% y 5%. El contenido de hemoglobina en las soluciones resultantes se midi
con el analizador y se grafic. Los resultados de la prueba fueron lineales con una desviacin
insignificante de una lnea recta.
Resultados
Se pueden encontrar evidencias indirectas de la inhibicin del crecimiento del cristal de hielo
por presin en los estudios de HPFe [3,5,14,18]. El tamao de los cristales de hielo
individuales formados por debajo de 200 MPa con una velocidad de enfriamiento de> 60,000
C / min es a menudo <10 nm (el lmite de resolucin de los microscopios electrnicos) [5,3]
y el tamao de los cristales de hielo parece aumentar con una reduccin de velocidad de
enfriamiento de las muestras. Se necesitan ms estudios definitivos sobre la tasa de
crecimiento de los cristales de hielo bajo presin.
Tasas de enfriamiento.
El hielo intracelular es uno de los principales factores perjudiciales para las membranas de
RBC a presin ambiental. La velocidad de enfriamiento de 160 C / min es lo suficientemente
rpida como para que los RBC no tengan tiempo de perder agua lquida durante el
enfriamiento y el agua lquida se convierte en hielo intracelular. Por lo tanto, los cristales de
hielo intracelular formados bajo presin dentro de los glbulos rojos cuando se enfran a una
velocidad de 160 C / min tienen que ser significativamente ms pequeos y / o tener una
forma diferente en comparacin con cristales de hielo intracelulares formados a presin
ambiente.
El enfriamiento de la sangre completa con 5% de Me2SO a una velocidad de 160 C / min
result en una hemlisis ms baja (5 1,2%) en comparacin con el enfriamiento a una
velocidad de 35 C / min (7,6 1,4%) (Figuras 4 y 5). Las mayores velocidades de
enfriamiento pueden dar como resultado pequeos cristales de hielo y pueden explicar la
menor hemlisis de los glbulos rojos. Adems, hay otras dos razones por las cuales la
velocidad de enfriamiento de las muestras biolgicas debe maximizarse cuando se congela
con CPA bajo presin elevada. Primero, los CPA son txicos para las clulas vivas y la
toxicidad aumenta con el tiempo que pasa en contacto con el CPA lquido. En segundo lugar,
la presin superior a 100 MPa puede ser letal para los rganos mamferos si se aplica durante
ms de 2 min y el impacto negativo de la presin aumenta con el aumento de presin y el
tiempo empleado bajo presin [12,13].
Utilizando tcnicas de enfriamiento rpido, es posible congelar grandes muestras de biomasa
(20+ mm de espesor) en 1-2 minutos, limitando o eliminando el impacto de la alta presin
hidrulica y la toxicidad de CPA antes de la congelacin. Cuando la bio muestra est en estado
congelado (slido), tanto la presin hidrulica como los CPA tienen poco o ningn efecto en
las muestras biolgicas. Por lo tanto, la velocidad de enfriamiento de las muestras biolgicas
debe maximizarse para reducir el tiempo empleado bajo la presin, la exposicin a los CPA
lquidos y el tamao de los cristales de hielo.
Se investigaron las velocidades de enfriamiento de 35 C / min y 160 C / min porque se
aproximan a las velocidades de enfriamiento ms rpidas que se pueden lograr en la
superficie (160 C / min) y en el centro (35 C / min) de muchas muestras biolgicas grandes,
como unidades de sangre (400 ml) y rganos (rin) debido a la conductividad trmica limitada
de las muestras biolgicas. Las velocidades de enfriamiento anteriores se pueden obtener
sumergiendo las muestras biolgicas en nitrgeno lquido o por contacto con placas de metal
fro. La hemlisis baja despus del enfriamiento con dos velocidades de enfriamiento muy
diferentes permite mantener la hemlisis bajo control en todo el volumen de una unidad de
sangre y puede abrir la posibilidad de una criopreservacin exitosa de rganos, como el
corazn y el rin.
Aplicaciones futuras
A pesar de que el mtodo aprobado por la FDA para la criopreservacin de glbulos rojos
[16,21] a menudo resulta <15% de procesamiento antes de la descongelacin, requiere un
40% de glicerol combinado con un procesamiento costoso y largo usando equipos
especializados [21]. Por otro lado, el 8% de glicerol es mucho menos txico que el 40% [9] y
la adicin y eliminacin del 8% de glicerol se puede hacer relativamente rpido en 1-2 pasos
simples. Por lo tanto, la reduccin de la concentracin de CPA no solo reduce la toxicidad,
sino que tambin simplifica el procesamiento de las muestras biolgicas.
A pesar de mltiples intentos, los cientficos no han podido criopreservar y restablecer las
funciones normales de bio-muestras complejas, como tejidos y rganos de mamferos. Los
protocolos de criopreservacin se basan en el uso de: (1) protocolos optimizados de
enfriamiento y calentamiento, que son imposibles de lograr en la mayora de los tejidos y
rganos debido a la baja conductividad trmica de los tejidos biolgicos; y / o (2) alta
concentracin de CPA, que son txicos para las clulas y son difciles de distribuir dentro de
los tejidos y rganos. Inevitablemente, habr demasiados CPA en algunos lugares
(demasiado txicos) y no lo suficiente en otros (demasiados cristales de hielo). Por otro lado,
la presin hidrulica, aplicada a la muestra biolgica, puede distribuirse de manera rpida e
igual a lo largo de todo el volumen de la muestra biolgica, creando condiciones favorables
para la criopreservacin, que no pueden realizarse a presin ambiente.
Conclusin
Aunque no se sabe cmo la presin previene el dao de los cristales de hielo, los resultados
anteriores sobre la hemlisis de los glbulos rojos indican que el tamao, la forma y la
distribucin de los cristales de hielo, formados a 120 MPa en combinacin con una
concentracin relativamente baja de Me2SO o glicerol, tienen poco o ningn efecto sobre la
integridad de las membranas de RBC en comparacin con los cristales de hielo formados a
presin ambiental (Figuras 4 y 5). La presin parece ser un amplificador de las propiedades
crioprotectoras de los CPA y puede reducir la concentracin de CPA necesarios para la
conservacin y recuperacin de muestras biolgicas viables. Dado que los tejidos y los
rganos son altamente susceptibles a la toxicidad de los CPA [10, 9], el desarrollo del mtodo
de bajo CPA puede ser otro paso hacia la criopreservacin exitosa de los tejidos y rganos.
Se necesita ms investigacin para optimizar el mtodo y determinar si es clnicamente
aplicable.
Referencias