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LABORATORIO No 9: electroforesis de cidos nucleicos

I. INTRODUCCION

La electroforesis en gel es una tcnica muy utilizada para separar molculas o


fragmentos de molculas de cidos nucleicos. Los materiales ms comunes para
separar molculas de cidos nucleicos son polmeros como la poliacrilamida o la
agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un
tampn de pH alrededor de 8. De esta forma, las molculas de DNA o RNA sometidas
a electroforesis se desplazarn al polo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen carga
negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar
molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. As, molculas de DNA de
diferente tamao, van a emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis. La
distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser inversamente proporcional al
logaritmo de su peso molecular. Es importante la utilizacin de marcadores de tamao
conocido porque nos permitirn calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA
problema.

El trmino electroforesis se usa para describir la migracin de una partcula cargada


bajo la influencia de un campo elctrico. Muchas molculas importantes biolgicamente
(aminocidos, pptidos, protenas, nucletidos, cidos nucleicos) poseen grupos
ionizables y existen en solucin como especies cargadas, bien como cationes, o bien
como aniones. Estas especies cargadas se van a separar en funcin de su carga cuando
se aplica un voltaje a travs de los electrodos. Existen muchos tipos de electroforesis,
que se engloban en dos categoras fundamentales

Electroforesis de frente mvil.


Electroforesis de zona

En el caso de los geles de agarosa, se le aade bromuro de etidio, sustancia que se


intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz
ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lmpara de luz UV, y se
vern las bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores
de peso molecular.

El DNA problema que se va a analizar mediante electroforesis en gel de agarosa en esta


prctica es DNA plasmdico. Los plsmidos son molculas de DNA extracromosmico,
circular y de pequeo tamao (entre dos y varios cientos de kilobases) que se encuentran
en muchas especies bacterianas. Se caracterizan porque se replican de manera
independiente del DNA cromosmico bacteriano, tienen su propio origen de replicacin, y
no son necesarios para la viabilidad general de la clula, pero pueden contener genes que
contribuyan a la supervivencia en condiciones especiales, como los que confieren
resistencia a antibiticos. Una determinada clula bacteriana puede no tener ningn
plsmido o puede albergar un nmero variable de los mismos. Algunas clases de
plsmidos poseen la propiedad conocida como replicacin relajada, esto es, estn
presentes en forma de muchas copias por clula, lo que facilita enormemente su
aislamiento y purificacin.
II. OBJETIVOS

Determinar la importancia de la electroforesis de cidos nucleicos

III. MATERIALES Y REACTIVOS

Material
Puntas de 10 y 200 ul
Guantes estriles
Tubos de PCR

Reactivos
Mix de PCR
Buffer de carga
agarosa
Buffer TBE 0.5X
Enzima de restriccin
Bromuro de etidio 10mg/ml
Marcador de peso molecular

Equipos
o Cmara de electroforesis
o Transiluminador
o Horno microondas
o Micro pipetas de 10, 100 y 1000 ul
o termociclador
IV.PROCEDIMIENTO

i. REACCIN EN CADENA DE POLIMERASA PCR

Para la amplificacin coger 2 ul de la extraccin de cidos nucleicos ya


preparado; se utilizaran como cebadores los oligonucletidos que
flanqueen el gen de inters
1) Mezcla los reactivos para la amplificacin del ADN de inters

reactivos Volumen ul Para 5 reacciones


H2O PCR 9.5 47.5
Mix de PCR 1X 12.5 62.5
dNTPs 200 Um,
MgCl2 1.5 mM
Foward 50 pmoles 0.5 2.5
Reverse 50 pmoles 0.5 2.5
TaqADN- polimerasa 0.2 1
1.5U/ul

Tabla1 reactivos de la preparacin de PCR

2) Colocar 23ul del Mix preparado en microtubos y adicionar 2 UL


de cada muestra de ADN
3) En el termociclador perkin Elmer 2400, programar las siguientes
condiciones de reaccin

Desnaturalizacin: 94 C durante 30 seg

Hibridacin: 55C durante 30 seg

Polimerizacin: 72C durante 30 seg

4) Estas condiciones se repiten durante 35 ciclos y se programa


una incubacin final a 72C durante 7 minutos
5) Realizar la electroforesis en gel de agarosa al 2% con buffer
TBE 0.5X, utilizar como marcador de peso molecular el DNA
Ladder 100 bp
ii. DIGESTIN CON ENZIMAS DE RESTRICCIN

1) La mezcla para la reaccin se har de la siguiente forma en un


micro tubo de 1.5 ml
H2O 8UL
Producto de PCR 10ul
Buffer 10X 2ul
Enzima 10U/ul 1ul

2) Mezclar bien e incubar por 12 horas a 37 C

iii. PREPARACION DEL GEL DE AGAROSA 3%


TBE 0.5X 50ml
agarosa 2g

Calentar al microondas por 20 segundos


Dejar enfriar hasta 45 C
Dejar polimerizar 20 minutos en la cmara de electroforesis
A las muestras de ADN se adiciona 5 ul de buffer de carga y se
cargan en los pocillos teniendo cuidado de no mezclar las
muestras. Se deja correr durante 3 h a 80V
Transcurrido el tiempo retirar con sumo cuidado el gel de
agarosa, colorear con bromuro de etidio y visualizar el ADN
genmico digerido en el transiluminador UV

iv. CALCULO DE RF

Con los valores del marcador de peso molecular, se construye primero


una curva de calibracin donde se grafica los log (PM) vs el RF
El RF es la relacin entre la distancia de migracin de la banda de ADN
(d) y la longitud de todo el gel (l) o sea la distancia desde el borde
superior del gel hasta el frente de corrida. Con estos valores se obtiene
la ecuacin lineal

Log (PM)=mRF + b

Donde
M= pendiente
B= ordenada al origen
V. RESULTADOS

PM(BP) RF

1300 0.29

1200 0.35

MP
1100 0.38

1000 0.41

900 0.44

800 0.48

700 0.52

FIG 1 electroforesis en gel de agarosa1 electroforesis en gel


600 0.55 de agarosa 3% carriles 2, 4,5 y 6 y carril 8 ADN usado
como control

FIG 500 0.58

400 0.64

300 0.71

200 0.80

100 0.91
VI. DISCUSIN DE RESULTADOS

El fundamento de la tcnica realizada es que la electroforesis en gel es una tcnica


muy utilizada para separar molculas o fragmentos de molculas de cidos nucleicos.
Los materiales ms comunes para separar molculas de cidos nucleicos son
polmeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de
electroforesis, sumergidos en un tampn de pH alrededor de 8. De esta forma, las
molculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se desplazarn al polo positivo ya
que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz
molecular y permiten separar molculas cargadas en funcin de su tamao y forma.
As, molculas de DNA de diferente tamao, van a emigrar de forma distinta en un gel
de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser
inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la
utilizacin de marcadores de tamao conocido porque nos permitirn calcular los pesos
moleculares de las muestras de DNA problema.

En el caso de los geles de agarosa, se le aade bromuro de etidio, sustancia que se


intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz
ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lmpara de luz UV, y se
vern las bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores
de peso molecular.
Cuando realizamos la electroforesis en gel de agarosa se consigue separar la mezcla
de las muestras segn su carga, cuando el tamao de las muestras es similar migran
juntas con el gel, se le aade un buffer y colorante. La electroforesis es una tcnica
habitual en los laboratorios, as como lo practicamos nosotros, permite separar
especies qumicas (cidos nucleicos o protenas) a lo largo de un campo elctrico en
funcin de su tamao y de su carga elctrica. Los cidos nucleicos, ADN y ARN, tienen
por naturaleza carga negativa. Si ponemos fragmentos del ADN extrado de una
muestra biolgica sobre un soporte poroso (gel) y aplicamos un campo elctrico, se
producir la migracin diferencial de los fragmentos a travs de los poros de la matriz,
la tincin del gel de agarosa que usamos fue con bromuro de etidio, que es una
sustancia fluorescente que se intercala en la molcula de ADN, y la exposicin con luz
ultravioleta, permite observar el resultado de sta migracin. El tamao de los
fragmentos de ADN se puede estimar comparndolos con el patrn de bandas que se
obtiene de marcadores comerciales de peso molecular conocido. La electroforesis de
ADN es til para comparar patrones de bandas de diferentes muestras biolgicas. As
por ejemplo se puede usar para comparar muestras de individuo sano frente a individuo
enfermo, para la identificacin de cidos nucleicos de agentes infecciosos o para la
obtencin de un fragmento determinado de ADN que, una vez localizado en el gel,
puede ser extrado para anlisis posteriores. Es as como la muestra de nuestra
compaera se vio en la prueba de electroforesis junto con la de la muestra problema.
En la prctica obtuvimos diferentes RF a distintos niveles de pares de bases para
poder determinar a qu nivel de pares de bases se encuentra nuestra muestra
problema interpolamos con la muestra patrn.

VII. CONCLUSIONES

Observamos la importancia que tiene la electroforesis de cidos nucleicos

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Voet Fundamentos de bioqumica editorial medica panamericana segunda


edicin 2007 Madrid Espaa cap. 23 estructura de cidos nucleicos
Rafael oliva virgili Genoma humano UNIVERSIDAD DE BARCELONA 2006
pag 41
German Antonio Giraldo laboratorio de bioqumica primera edicin setiembre
2010 pag 146