HJB38_proof 22 November 2016 1/7

HAYATI Journal of Biosciences xxx (2016) 1 e 7

55
daftar isi yang tersedia di ScienceDirect
DISELENGGARAKAN OLEH 56
57

HAYATI Journal of Biosciences 58

59

jurnal homepage: ht tp: / / www. journals.elsevier .com / 60

hayat i - jurnal -dari -biosciences 61

62
63
artikel penelitian asli 64
65
1
Q17 Gen Kloning dan Ekspresi Protein dari Koi Herpes ORF25 66
2
67
3
68
Q16 Murwantoko,
Q2 * Cahya Kurnia Fusianto, Triyanto
4
69
5 Departemen Perikanan, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia.
70
6
71
7
72
8 Q3 articleinfo abstrak 73
9
74
10 Q4 Pasal sejarah: Koi herpes (KHV) disebabkan signi fi morbiditas dan mortalitas tidak bisa di koi dan ikan mas ( Cyprinus carpio). Glikoprotein telah digunakan
75
Menerima Oktober 2015 26 diterima untuk pengembangan vaksin sebagai vaksin Unit sub melawan banyak virus.
11 76
dalam bentuk revisi 11 Oktober 2016
12 KHV ORF25 adalah salah satu gen virus herpes koi yang mengkodekan glikoprotein. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkloning gen KHV
77
ORF25 dan mengekspresikan protein nya. The ikan mas ( Cyprinus carpio) menunjukkan nekrosis dan bercak putih insang yang dikumpulkan
13 Diterima 31 Oktober 2016 Tersedia 78
dari Magelang yang digunakan dalam penelitian ini. Primer yang dirancang untuk memperkuat ORF25 parsial berdasarkan KHV J regangan. KHV
14 xxx secara online
79
ORF25 adalah berhasil Ampli fi ed dan kloning dalam vektor ekspresi pET32a. analisis urutan menunjukkan bahwa ini KHV ORF25 memiliki 99%
15 80
homologi dengan urutan KHV genotipe KHV-J, KHV-I, dan KHV-U. epitop prediksi-sel T menunjukkan bahwa ORF ini memiliki sembilan IAD
16 KATA KUNCI:
epitop pola dan delapan pola Rothbard / Taylor. epitop prediksi-sel B menunjukkan protein yang mengandung 3, 23, dan 8 epitop berdasarkan 81
kloning,
17
cyprinid virus herpes 3, ekspresi, skala aksesibilitas permukaan Emini, Karplus dan Schulz fl skala fleksibilitas, dan ElliPro masing-masing. The KHV ORF25 protein rekombinan 82
18 telah berhasil diproduksi di Escherichia coli sebagai protein larut dengan sekitar 45 kDa dalam ukuran. Itu 83
19 ORF25, 84
20 Q5 protein rekombinan, vaksin tinggi 85
21 produksi protein dicapai ketika induksi protein dilakukan pada kepadatan bakteri di OD 600 sebagai
86
22 1.0 dengan 1-mM IPTG dan diinkubasi pada 37 C selama 18 jam. Protein diperkirakan memiliki imunogenisitas dan potensi sebagai vaksin
87
23
diperlukan untuk dievaluasi di masa depan. hak cipta 2016 Institut Pertanian Bogor. Produksi dan hosting yang oleh Elsevier ini adalah akses
88
terbuka
24 89
Artikel di bawah lisensi CC BY-NC-ND ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).
25 90
26 91
27 92
28 93
29 94
1. Perkenalan dikemas dalam sebuah kapsid ikosahedral arsitektur karakteristik yang dikelilingi oleh lapisan
30 95
tegument protein dan
31 96
Q6 Penyakit masalah budidaya utama yang mempengaruhi kuantitas dan kualitas produk perikanan fi akhirnya dengan sebuah amplop yang berisi glikoprotein virus host-diturunkan ( Aoki et al. 2007 ).
32 97
dan signi fi cantly mengurangi ekonomi industri akuakultur. Koi herpesvirus (KHV) juga dikenal Selain bentuk linear, Fujioka et al. (2015) juga melaporkan genom kehadiran KHV dalam bentuk DNA
33 98
sebagai, cyprinid virus herpes 3, koi herpes-seperti virus, dan ikan mas interstitial nephritis gill virus ganda melingkar atau concatemeric. Perbedaan ini diduga terjadi karena KHV genom dapat
34 99
nekrosis disebabkan signi fi morbiditas dan mortalitas tidak bisa baik dalam ikan mas dan ikan koi ( Hedrick diedarkan untuk pemeliharaan jangka panjang tanpa replikasi virus aktif. Aoki et al. (2007) melaporkan
35 100
et al. 2000; Michel et al. 2010; Ilouze et al. 2011 ). Itu fi wabah pertama dari KHV dilaporkan pada bahwa urutan genom lengkap KHV isolat dari Amerika Serikat (KHV-U), Israel (KHV-I) dan Jepang
36 101
tahun 1998 dan con fi rmed pada tahun 1999 di Israel. Sejak itu, kasus lain telah con fi rmed di Amerika (KHV-J) share> 99% urutan nukleotida identitas. Mereka menyarankan bahwa KHV leluhur awalnya
37 102
Serikat, Eropa, dan Asia ( Hedrick et al. 2000 ). Di Indonesia, infeksi KHV dimulai di Blitar, Jawa Timur, menyimpang menjadi dua garis keturunan genetik, KHV-U / I (genotipe Eropa) dan KHV-J (genotipe
38 103
pada Maret 2002. Ini menyebar dengan cepat melalui Pulau Jawa dan menyebabkan kematian yang Asia). Rantai polimerase reaksi (PCR) pola dan urutan analisis didasarkan pada alel dari tiga domain
39 104
sangat tinggi (80% e 90%). Dari pulau Jawa yang KHV menyebar ke Sumatera, Kalimantan dan dari KHV klasifikasi alternatif fi Sistem kation con fi rmed bahwa genotipe dari KHV BA-08 isolat Cyprinid
40 106
pulau-pulau lain ( Sunarto dan Cameron 2006 ). KHV diklasi fi ed dalam Alloherpesviridae keluarga, herpesvirus 3 e genotipe ketiga ( Kim dan Kwon 2013 )
41 107
yang terdiri dari linear, beruntai ganda genom DNA dari sekitar 295 kbp
42 108
43 105
44 109
45 110
46 111
Berdasarkan pola diamati dari polimorfisme, Kurita et al. (2009) melaporkan sampel KHV yang
47 112
dibagi menjadi dua kelompok, ditunjuk sebagai genotipe Asia dan Eropa dengan masing-masing
48 113
genotipe mengandung dua dan tujuh varian, masing-masing. Homogenitas KHVs Asia menunjukkan
49 * Penulis yang sesuai. 114
bahwa invasi KHV ke daerah ini terjadi baru-baru ini dan virus yang menyebar dengan cepat ketika
50 E-mail alamat: murwantoko@ugm.ac.id . murwantoko@yahoo.com
115
51 (Murwantoko).
116
peer review di bawah tanggung jawab Institut Pertanian Bogor.
52 117
53 118
http://dx.doi.org/10.1016/j.hjb.2016.10.001
54 119
1978-3019 / Hak Cipta 2016 Institut Pertanian Bogor. Produksi dan hosting yang oleh Elsevier ini adalah sebuah artikel akses terbuka di bawah CC BY-NC-ND lisensi ( http: // creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).

Silakan mengutip artikel ini dalam pers sebagai: Murwantoko, et al, Gene Kloning dan Ekspresi Protein Koi Herpes ORF25, HAYATI J Biosci (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.hjb.2016.10.001.
 HJB38_proof 22 November 2016 2/7

2 Murwantoko, et al

1 Q9 dibandingkan dengan kasus Eropa KHV. Semua 10 sampel dari Asia (Jepang, Taiwan, Filipina, Reaksi dievaluasi oleh 1% elektroforesis agarosa (Nacalai) dari TAE (40 mM Tris-asetat pH 8,3, 1 66
2 Indonesia) yang diklasifikasikan fi ed sebagai Asian Genotipe dengan A1 dan A2 varian. Kemudian, Dong mM EDTA) menggunakan Mupid Muka elektroforesis horizontal (Advance, Jepang). gel diwarnai 67
3 et al. (2013) dengan etidium bromida dan diamati di bawah transilluminator UV (Ekstra Gene, Taiwan) 68
4 menipu fi rmed munculnya U / I genotipe di koi dewasa menderita kematian massal di Cina pada tahun 69
5 2011. Berdasarkan TK dan ORF136H 70
6 gen, urutan analisis mengungkapkan bahwa KHV-GZ11 adalah genotipe Eropa berbeda dari KHV. PCR produk dari ORF25 yang puri fi ed menggunakan phenolchloroform dan diikuti oleh 71
7 Virus ini selanjutnya dipelajari pada tingkat genom keseluruhan oleh Li et al. (2015b) . vaksinasi fi sh pencernaan dengan Eco R1 dan Belakang III (Toyobo) pada 37 C selama 2 jam, maka yang agarosa 72
8 electrophoreted. pita DNA yang diinginkan itu dipotong dan DNA pulih dari agarosa menggunakan
adalah salah satu cara untuk mencegah fi Penyakit sh akibat infeksi KHV. Yuasa dan Sano (2009) melaporkan 73
9 bahwa pengembangan vaksin adalah salah satu pengembangan langkah-langkah pencegahan Ron Gel Extraction kit (BIORON). Puri fi ed PCR fragmen diligasi ke pET-32a ( ) ( Novagen) 74
10 terhadap KHV di Jepang. Imunologi studi oleh alami tahan dan imunisasi virus yang dilemahkan telah menggunakan DNA ligase T4 (Toyobo) di 16 C semalam. Campuran ligasi menjelma menjadi Escherichia 75
11 menunjukkan signi fi elevasi tidak bisa respon humoral untuk vaksinasi. Selanjutnya, kedua inokulasi coli DH5Sebuah menggunakan heat shock pada 42 C selama 90 detik diikuti dengan inkubasi pada 76
12 virus dan tantangan menunjukkan perlawanan anti-virus yang sangat tinggi dan lowmortality ( Ronen es ( Sambrook dan Russell 2001 ). Bakteri dikultur pada LB agar yang mengandung 50 m g / mL 77
13 et al. 2003 ). Adkison et al. (2005) menunjukkan bahwa korban dari KHV wabah menunjukkan titer ampisilin semalam. Koloni pertumbuhan dikultur dalam LB broth yang mengandung ampisilin dan 78
14 antibodi yang tinggi terhadap KHV dan imunisasi pasif bisa melindungi ikan mas dari infeksi KHV. Yasumotoberbudaya pada 37 C semalam. Plasmid diisolasi dari bakteri menggunakan Mini penyusunan 79
15 et al. (2006) dan Miyazaki et al. (2008) telah terbukti ef fi keampuhan imunisasi lisan dengan vaksin metode lisis alkali (Sambrook dan Russel 2011). Kehadiran plasmid rekombinan diperiksa oleh 80
16 liposom-KHV adalah ef fi cacious terhadap infeksi KHV pada ikan mas. pencernaan plasmid menggunakan 81
17 82
18 83
19 84
20 85
21 Eco RI dan Belakang enzim III (Toyobo). 86
22 KHV ORF25, salah glikoprotein membran KHV ( Aoki et al. 2007 ), Memiliki sifat imunogenik 87
23 seperti yang ditunjukkan oleh vaksinasi DNA terhadap KHV ( Nuryati et al. 2010; Nuswantoro et al. 2.4. Sequencing dan analisis data 88
24 2012; Zhou et al. 2014 ). Selain vaksin DNA, protein rekombinan dapat digunakan sebagai fi vaksin sh Plasmid rekombinan disekuensing menggunakan S-Tag dan primer T7terminator oleh layanan 89
25 perusahaan (Macrogen). urutan DNA dari kedua primer yang tumpang tindih untuk menentukan 90
26 Q7 ( Lecocq-Xhonneux et al. 1994 ; Soomerset et al. urutan lengkap. urutan DNA dianalisis menggunakan BLAST untuk mencari homologi dengan data 91
27 2005; Lin et al. 2007; Shin et al. 2013; Kim et al. 2015 ), Dalam penelitian ini kami kloning KHVORF25 pada GenBank. Epitop sel T yang diprediksi oleh GENETYX berdasarkan pola IAD ( Sette et al. 1989 ) 92
28 dari virus Indonesia, dinyatakan protein dalam Escherichia coli dan menjelajahi potensi sebagai Dan pola Rothbard / Taylor ( Rothbard dan Taylor 1988 ). Itu 93
29 kandidat vaksin. 94
30 95
31 prediksi epitop sel B dilakukan kita- Q10 96
32 2. Bahan dan Metode ing " B Sel epitop Prediksi Alat " dari IEDB ( http: // alat. iedb.org/main/html/bcell_tools.html ) 97
33 Berdasarkan Emini skala aksesibilitas permukaan ( Emini et al. 1985 ), Karplus dan Schulz fl skala 98
34 2.1. Mencicipi fleksibilitas ( Karplus dan Schulz 1985 ) Dan ElliPro ( Ponomarenko et al. 2008 ). 99
35 ikan mas ( Cyprinus carpio) menunjukkan gejala nekrosis dan bercak putih insang yang diperoleh 100
36 dari Magelang pada bulan Juni 2012 yang digunakan dalam penelitian ini. DNA 101
37 Q8 isolasi dilakukan dari 102
38 insang menggunakan metode TNES ( Murwantoko 2009 ). Menipu fi knis infeksi KHV dilakukan oleh 2.5. produksi protein 103
39 PCR berdasarkan primer timidin kinase, KHV-TKF (GGGTTACCTGTACGAG) dan KHV-TKR Plasmid rekombinan dari pET32-KHV-ORF25 menjelma menjadi E. coli BL21 DE3 metode kejut 104
40 (CACCCAGTAGATTATGC) ( Bercovier et al. 2005 ). menggunakan panas dijelaskan sebelumnya. Bakteri diinokulasi ke dalam 100 mL LB broth yang 105
41 mengandung ampisilin (50 m g / mL), kemudian diinkubasi dengan shaker pada 37 C semalam. Kultur 106
42 bakteri diinokulasikan ke 1000 mL LB broth maka productionwas protein yang diinduksi dengan 107
43 2.2. desain primer menambahkan IPTG ke media. sel bakteri dipanen dengan sentrifugasi pada kecepatan 3500 rpm 108
44 Studi sebelumnya menunjukkan bahwa KHV isolat Indonesia yang terkait erat dengan KHV-J selama 15 menit pada Refrigerated Centrifuge 5810R 109
45 dari Jepang ( Murwantoko 2009; Sunarto et al. 2011; Murwantoko et al. 2012 ), Sehingga urutan primer 110
46 dirancang berdasarkan TUMST1 KHV regangan (Jepang; nomor aksesi AP008984) sebagai 111
47 template. Isi GC, loop diri anil, dan loop jepit rambut diperiksa menggunakan software Oligocalculator (Eppendorf). pelet bakteri dikumpulkan dan diresuspensi dalam 10% dari mediumvolume dari 112
48 phosphate-buffered saline. sel bakteri terganggu oleh sonikasi menggunakan Ultrasonic Generator 113
49 US-300T (Nissei, Jepang). 114
50 ( http://www.basic.northwestern.Edu/biotools/oligocalc. 115
51 html ). Primer yang dirancang untuk memperkuat fragmen DNA yang dikodekan protein ORF25 parsial Kelarutan protein diperiksa dengan sentrifugasi suspensi bakteri disonikasi pada 10.000 g selama 117
52 tidak termasuk hidrofobik asam amino cluster. Primer adalah 28 bp panjang dengan tambahan 3 menit untuk memisahkan fraksi larut dan tidak larut. Optimalisasi produksi protein dilakukan dengan 118
53 kombinasi kepadatan bakteri yang berbeda, konsentrasi IPTG dan panjang induksi. perlakuan 119
54 Eco RI situs pembatasan primer maju dan Belakang Situs pembatasan III di primer terbalik. Mereka tersebut induksi pada kepadatan optik (OD 600) 0,6, 0,8, dan 1; induksi pada IPTG selama 116
55 primer adalah: KHV-ORF25-F: AGCTGAATTCGGTTCGAGGACCAACGTC, konsentrasi 0,6, 0,8 dan 1 mM; dan panjang induksi 3, 6, dan 18 jam. protein dianalisis menggunakan 120
56 dan KHV-ORF25-R: 10% SDS-PAGE ( Sambrook dan Russel 2001 ) Menggunakan HALAMAN menjalankan elektroforesis 121
57 AGATAAGCTTCAGGTTTCCCCTGCGCCA. vertikal AE-6530 (Atto, Jepang) diwarnai oleh Coomassie biru cerah. 122
58 123
59 2.3. ampli DNA fi kation dan pemurnian dari gel agarosa 124
60 ampli fi kasi DNA KHV menggunakan timidin kinase dan ORF25 pasangan primer dilakukan 125
61 dengan menggunakan Thermalcycler Mastercycler Pribadi ( Eppendorf, Jerman) menggunakan PCR 126
62 Mix Kappa (Biosystems). Reaksi PCR dilakukan sebagai berikut: satu siklus dari 95 C selama 5 127
63 menit, 30 siklus 94 C selama 30 detik, 56 C selama 30 detik, 72 C selama 75 detik, diikuti oleh satu 2.6. puri protein fi kation 128
64 siklus dengan 72 C selama 5 menit. PCR puri protein fi kation dari suspensi bakteri disonikasi dilakukan dengan menggunakan Ni-NTA 129
65 agarosa (Qiagen) sesuai dengan 130

Silakan mengutip artikel ini dalam pers sebagai: Murwantoko, et al, Gene Kloning dan Ekspresi Protein Koi Herpes ORF25, HAYATI J Biosci (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.hjb.2016.10.001.
 HJB38_proof 22 November 2016 3/7

Gen kloning dan ekspresi protein 3

1 protokol QIAexpressionist kit pada kondisi didenaturasi menggunakan cuci penyangga (100 mM NaH 2 66
2 PO 4, 10 mM TrisHCl, 8 M urea) pH 8, 67
3 6.3, 5.9 dan elusi penyangga (100 mM NaH 2 PO 4, 10 mM TrisHCl, 8M urea) pH 4,5. protein dianalisis 68
4 menggunakan SDS HALAMAN 12%. 69
5 70
6 3. Hasil 71
7 72
8 3.1. KHV ORF25 ampli fi kation 73
9 Sampel ikan mas dari Magelang adalah con fi rmed untuk terinfeksi KHV. analisis PCR dengan 74
10 KHV-TKF dan KHV-TKR primer ( Bercovier et al. 2005 ) Menggunakan DNA dari jaringan insang 75
11 sebagai template diproduksi single band sekitar 400 bp ( Gambar 1 A lane 1). Dari sampel DNA, yang 76
12 ORF25 protein membran adalah ampli fi ed menggunakan KHV-ORF25-F / KHV-ORF25-R primer. 77
13 Band tunggal di sekitar 1000 ukuran bp diproduksi pada ukuran yang diharapkan ( Gambar 1 B lane 1). 78
14 Produk PCR dicerna menggunakan Eco RI dan 79
15 80
16 81
17 Belakang AKU AKU AKU ( Gambar 1 B lane 2) dan digunakan untuk kloning. 82
18 83
19 Gambar 2. elektroforesis agarosa dari plasmid terisolasi pada kondisi asli (A) dan pada dicerna dengan Eco RI dan Belakang 84
3.2. kloning
enzim III (B). (A) M: 1 KB DNA ladder, jalur 1: plasmid rekombinan, jalur 2: plasmid kosong. (B) Lane 1: plasmid
20 85
Transformasi dari campuran ligasi pET32 dan DNA masukkan ke dalam E. coli DH5 Sebuah menghasilkan
kosong, jalur 2: plasmid rekombinan, jalur 3: KHVORF25 amplikon.
21 86
empat koloni di LB agar yang mengandung ampisilin. Evaluasi kehadiran rekombinan dengan
22 87
elektroforesis agarosa menunjukkan bahwa plasmid memiliki berat molekul yang lebih tinggi ( Gambar
23 88
2 A lane 1) dibandingkan dengan plasmid lain ( Gambar 2 Sebuah jalur 2). Plasmid pencernaan dengan Eco signi fi tidak bisa homologi tinggi. Hasil penelitian menunjukkan 99% homologi dengan KHV genotipe
24 89
RI dan Belakang Pembatasan III enzim pengintaian fi rmed bahwa plasmid adalah plasmid rekombinan KHV-J (Jepang), KHV-I (Israel), dan KHV-U (USA) ( Aoki et al. 2007 ), Saring KHV-GZ11 (Cina) ( Li et
25 90
sebagai band 1000 bp muncul ( Gambar 2 B lane 1), sedangkan untuk plasmid kosong, band ini tidak al. 2015b ), Mengisolasi SNUKHV (Korea Selatan), strain FL (Belgia), mengisolasi HZ419 (Cina),
26 91
muncul ( Gambar 2 B lane 1). Ukuran dimasukkan DNAwas sama dengan produk PCR menggunakan mengisolasi FL (Belgia). Terjemahan ke dalam asam amino dilakukan dengan menggunakan
27 92
KHVORF25-F / -KHV-ORF25-R primer ( Gambar 2 B jalur 3). program GENETYX seperti yang disajikan dalam Gambar 3 . Alignment beberapa dari KHV ini dengan
28 93
strain KHV dari GenBank menunjukkan ada satu nukleotida yang berbeda di nomor 254 (sitosin dari
29 94
isolat ini bukan timin di strain KHV lain) dan diproduksi nukleotida yang berbeda pada tingkat
30 95
penjabaran alanine bukan valin (data tidak ditampilkan) .
31 96
32 97
3.3. Sequencing dan analisis data
33 98
Plasmid rekombinan disekuensing menggunakan S-Tag dan primer T7terminator. Urutan dari
34 99
yang primer yang tumpang tindih untuk menentukan urutan kloning KHV ORF25 gen. Ukuran panjang Prediksi epitope T-sel KHVORF25 ini menggunakan program GENETYX menunjukkan sembilan
35 100
penuh ORF25 adalah 1.833 nt pada KHV-TUMST1 saring dan 1805 nt pada KHV-U dan strain KHV-I. epitop diakui oleh pola IAD dan delapan epitop diakui oleh pola Rothbard / Taylor. Salah satu epitop
36 101
Hasil sekuensing menunjukkan bahwa ini KHV ORF25 terdiri hanya dari 1.012 nt, berarti ini KHV diakui oleh IAD dan pola Rothbard / Taylor. Prediksi epitop sel B dari KHV ORF25 dilakukan
37 102
ORF25 hanya gen parsial ( Gambar 3 ). Urutan ini telah disampaikan ke GenBank dengan aksesi tidak menggunakan " B Sel epitop Prediksi Alat ". Analisis berdasarkan skala aksesibilitas permukaan Emini,
38 103
ada KX538957. Analisis BLAST menunjukkan bahwa hanya sembilan entri data menunjukkan Karplus dan Schulz fl skala fleksibilitas dan ElliPro diprediksi KHV ORF25 berisi 3, 23, dan 8 epitop,
39 104
masing-masing. Setidaknya tiga epitop diprediksi dari dua skala dan dua epitop diakui oleh semua
40 105
tiga skala ( Gambar 3 ).
41 106
42 107
43 108
44 109
45 110
3.4. produksi protein
46 111
Produksi protein dilakukan di bawah sistem ekspresi pET32a. Karena KHV ORF25 adalah gen
47 112
parsial, kodon start dan berhenti kodon berasal dari plasmid. protein KHV ORF25 berhasil diproduksi
48 113
di E. coli BL21. Hal ini dapat dilihat pada kehadiran protein sekitar 45 ukuran kDa sebagai band yang
49 114
dominan di SDS HALAMAN. Ekspresi protein dapat disebabkan oleh penambahan IPTG di
50 115
kepadatan bakteri di OD 0,6, 0,8, dan 1,0. Peningkatan produksi protein mengikuti jam inkubasi 3, 6
51 117
dan 18 jam. Dari kondisi tersebut, kita dapat melihat bahwa induksi pada kepadatan bakteri di OD 1,0
52 118
dan waktu induksi 18 jam menghasilkan protein tertinggi ( Gambar 4 ). IPTG induksi pada berbagai
53 119
konsentrasi IPTG 0,6,
54 116
55 120
56 121
57 122
0,8, dan 1 mM tidak menunjukkan signi fi perbedaan tidak bisa di produksi protein. Semua pengobatan
58 123
menunjukkan ketebalan pita protein yang sama ( Gambar 5 SEBUAH). uji kelarutan menunjukkan
59 124
bahwa ORF25 protein rekombinan diungkapkan dominan pada kondisi tidak larut ( Gambar 5 B).
60 125
61 126
Gambar 1. elektroforesis gel agarosa produk KHV PCR dari con fi knis dari kehadiran KHV dengan Bercovier primer (A)
62 127
M. 100 bp ladder DNA. 1. sampel DNA sebagai template. 2. kontrol negatif. elektroforesis gel agarosa produk KHV
63 3.5. protein Puri fi kation 128
PCR dari ORF25 (B) M: l /
64 Belakang III DNA marker, 1: KHV ORF25 amplikon, 2: cerna KHV ORF25 amplikon dengan enzim restriksi. Puri fi kation menggunakan Ni-NTA agarosa menunjukkan bahwa protein target berhasil terikat 129
65 manik-manik Ni-NTA seperti dapat dilihat bahwa hanya 130

Silakan mengutip artikel ini dalam pers sebagai: Murwantoko, et al, Gene Kloning dan Ekspresi Protein Koi Herpes ORF25, HAYATI J Biosci (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.hjb.2016.10.001.
 HJB38_proof 22 November 2016 4/7

4 Murwantoko, et al

1 66
2 67
3 68
4 69
5 70
6 71
7 72
8 73
9 74
10 75
11 76
12 77
13 78
14 79
15 80
16 81
17 82
18 83
19 84
20 85
21 86
22 87
23 88
24 89
25 90
26 91
27 92
28 93
29 94
30 95
31 96
32 97
33 98
34 99
35 100
36 101
37 102
38 103
39 104
40 105
41 106
42 107
43 108
44 109
45 110
46 111
47 112
48 113
49 114
50 115
51 117
52 118
53 119
54 116
55 120
56 121
57 122
58 123
59 124
60 125
61 126
62 127
63 Gambar 3. Nukleotida dan asam amino urutan KHV ORF25. Urutan dengan menggarisbawahi menunjukkan urutan primer. Asam amino yang diprediksi sebagai epitop F-sel berdasarkan IAD dan pola Rothbard / Taylor ditandai dengan I dan R, 128
64 masing-masing. Asam amino yang diprediksi sebagai epitop sel B berdasarkan Karplus dan Schulz fl skala fleksibilitas, Emini skala aksesibilitas permukaan, dan ElliPro ditunjukkan dengan K, L dan E, masing-masing. 129
65 130

Silakan mengutip artikel ini dalam pers sebagai: Murwantoko, et al, Gene Kloning dan Ekspresi Protein Koi Herpes ORF25, HAYATI J Biosci (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.hjb.2016.10.001.
 HJB38_proof 22 November 2016 5/7

Gen kloning dan ekspresi protein 5

1 4. Diskusi 66
2 67
3 KHV disebabkan signi fi morbiditas dan mortalitas tidak bisa baik dalam ikan mas dan ikan koi ( Hedrick 68
4 et al. 2000; Michel et al. 2010; Ilouze et al. 2011 ). Tanda-tanda eksternal dari KHV terinfeksi fi sh 69
5 bengkak dan nekrotik gill fi menyesalkan, produksi berlebihan lendir atau patch berubah warna pada 70
6 kulit (Hedrick et al. 2005). Tanda-tanda KHV patologis di alat penyapu insang meliputi peningkatan 71
7 subepitel di fl peradangan dan kemacetan pembuluh darah pada lengkung insang, disertai dengan 72
8 pelemahan dari ketinggian alat penyapu '. perubahan patologis parah yang dicatat di ginjal sebagai in 73
9 peritubular ringan 74
10 75
Gambar 4. SDS PAGE dari optimalisasi produksi protein dengan induksi dengan 1 mM IPTG pada kepadatan dan
11 76
induksi bakteri yang berbeda waktu. Lane 1: non-induksi, jalur 2 e 4: induksi pada kepadatan OD 0,6 dengan waktu
12 induksi untuk 3 (jalur 2), 6 (jalur 3), 18 jam (jalur 4). Lane 5 e 7: induksi pada kepadatan OD 0,8 dengan waktu induksi
77
fl peradangan di fi menyusup tampak jelas pada awal infeksi dan akan diikuti oleh interstitial berat di fl peradangan
13 selama 3 (jalur 5), 6 (jalur 6), 18 jam (jalur 7), jalur 8 e 10: induksi pada kepadatan OD 1,0 dengan waktu induksi di fi menyusup, bersama dengan kemacetan pembuluh darah ( Ilouze et al. 2011 ). Dalam penelitian ini, 78
14 selama 3 (jalur 8), 6 (jalur 9), 18 jam (jalur 10). M: protein ukuran marker dengan ukuran yang ditunjukkan. ikan mas dari Magelang menunjukkan nekrosis dan putih patch dari insang digunakan. PCR 79
15 menggunakan DNA diekstraksi dari orang-orang insang dengan Bercovier pasangan primer con fi rmed 80
16 bahwa fi sh terinfeksi KHV. 81
17 82
18 Analisis KHV ORF2 dengan sampel dari Toba danau, Sumatera Utara ( Murwantoko 2009 ), Pada 83
19 KHV ORF124 dengan sampel dari Yogyakarta ( Murwantoko et al. 2012 ), Penanda I, penanda II dan 84
20 timidin kinase dengan sampel dari berbagai daerah di Indonesia ( Sunarto et al. 2011 ) Menunjukkan 85
21 bahwa semua sampel milik garis keturunan KHV Asia. Dalam penelitian ini KHV ORF2 fromMagelang 86
22 menunjukkan homologi yang sama dengan KHV Asia dan genotipe Eropa. Hasil ini menunjukkan 87
23 bahwa ORF25 tidak dapat digunakan untuk membedakan garis keturunan. 88
24 89
25 90
26 Vaksinasi merupakan pendekatan yang penting untuk mengendalikan penyakit. Ronen et al. 91
27 (2003) telah membuktikan bahwa KHV dapat dikembangkan sebagai ef fi Vaksin efisien karena 92
28 menggunakan virus yang dilemahkan pada inokulasi virus dan tantangan mengakibatkan tingginya 93
29 tingkat antibodi terhadap virus dan ketahanan anti-virus yang sangat tinggi. Hasil ini juga didukung 94
30 oleh 95
31 Adkison et al. (2005) menggunakan tes enzyme-linked immunosorbent, mereka mendeteksi adanya 96
32 antibodi anti-KHV dalam serum koi berikut eksposur baik alami atau eksperimental untuk KHV. Untuk 97
33 mengurangi kemungkinan virus yang dilemahkan kembali kepada patogen, Perelberg et al. (2005) 98
Gambar 5. SDS PAGE dari IPTG induksi dan kelarutan. Optimasi konsentrasi IPTG untuk induksi ( SEBUAH ). E. coli kepadatan
34 iradiasi dan dipilih klon tambahan yang sesuai untuk vaksinasi. Hasil penelitian mereka menunjukkan 99
OD 1,0 diinduksi dengan IPTG 0,6 (lane
35 bahwa aman dan ef fi vaksin profilaksis sien dapat dikembangkan dengan memilih virus yang 100
1), 0,8 (jalur 2), dan 1,0 mM (jalur 3). M: Protein ukuran marker dengan ukuran yang ditunjukkan. (B) suspensi bakteri
36 The disonikasi ( SEBUAH , Jalur 3) disentrifugasi pada 10.000 g selama 3 menit; supernatan dikumpulkan sebagai fraksi dilemahkan yang tepat. Namun, Yuasa dan Sano (2009) menemukan bahwa meskipun vaksin 101
37 larut (jalur 1); pelet ditangguhkan PBS sebagai fraksi tidak larut (jalur 2). dilemahkan efektif dalam mencegah penyakit, risiko pembalikan ke bentuk patogen adalah ancaman 102
38 potensial. 103
39 104
40 105
41 106
42 Glikoprotein telah banyak digunakan untuk pengembangan vaksin terhadap banyak virus seperti 107
43 virus hemorrhagic septicemia ( LecocqXhonneux et al. 1994 ), Hepatitis virus C ( Stamataki et al. 2007 ), 108
44 Di burung fl virus influenza ( Yang et al. 2010 ). Virus herpes mempekerjakan glikoprotein untuk masuk 109
45 sel, sebuah proses yang melibatkan fusi amplop virion dengan membran sel ( Farnsworth et al. 2007 ). 110
46 glikoprotein KH ini, ORF25 telah digunakan untuk vaksinasi DNA terhadap KHV dan menunjukkan 111
47 perlindungan ( Nuryati et al. 2010; Nuswantoro et al. 2012; Zhou et al. 2014 ). Selain vaksin DNA, 112
48 protein rekombinan telah digunakan secara luas dalam pengembangan fi Vaksin sh. kapsid protein 113
49 rekombinan dari betanodavirus virus nekrosis saraf (Soomerset et al 2005.; Lin et al. 2007 ), Protein 114
50 mantel virus nekrosis saraf ( Kim et al. 2015a ), Protein mantel utama iridovirus batu bream ( Shin et al. 115
51 2013 ), Glikoprotein virus hemorrhagic septicemia ( LecocqXhonneux et al. 1994 ). ef fi keampuhan 117
52 metode vaksinasi harus diuji; Sommerset et al. (2005) menemukan bahwa vaksinasi menggunakan 118
53 protein kapsid rekombinan dari nodavirus diproduksi perlindungan yang lebih tinggi dibandingkan 119
54 Gambar 6. puri protein fi kation menggunakan Ni-NTA agarosa. Lane 1: protein terdenaturasi, jalur 2 e 4: cuci fraksi, jalur dengan DNA rekombinan di turbot ( Scophthalmus maximus). Pola yang sama direkam oleh Fu et al. 116
55 5 e 6: elusi fraksi dengan pH 4,5 elusi penyangga, jalur 7: fraksi elusi dengan TE elusi penyangga. M: Protein marker (2015) menggunakan ORF086 dari ISKNV pada bertengger Cina ( Siniperca chuatsi). Dalam penelitian 120
dengan ukuran yang ditunjukkan.
56 ini kami menyatakan KHV ORF25 protein di E. coli. 121
57 122
58 123
59 124
60 sejumlah kecil protein yang ditemukan dalam fl ow melalui atau fraksi cuci. Elusi buffer dengan 125
61 penyangga pH rendah tidak bisa melepaskan protein dari manik. elusi 126
62 Q11 dari jejak protein target menggunakan Tris- 127
63 EDTA dalam elusi penyangga terakhir dan diperoleh hasil bahwa sebagian besar protein target 128
64 berhasil dielusi dan puri fi ed ( Gambar 5 ). puri protein fi kation menggunakan Ni-NTA agarosa (lihat Gambar Panjang penuh KHV ORF25 dari TUMSTI KHV regangan disusun oleh 1.806 nt dan dikodekan 129
65 Q12 6 ). 601 asam amino. Dalam penelitian ini 130

Silakan mengutip artikel ini dalam pers sebagai: Murwantoko, et al, Gene Kloning dan Ekspresi Protein Koi Herpes ORF25, HAYATI J Biosci (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.hjb.2016.10.001.
 HJB38_proof 22 November 2016 6/7

6 Murwantoko, et al

1 PCR panjang amplikon dan sequencing hasilnya menunjukkan DNA panjang fragmen hanya 1.010 Bercovier H, Fishman Y, Nahary R, Sinai S, Zlotkin A, Eyngor M, Gilad O, Eldar A, 66
Hedrick RP. 2005. Kloning koi herpes (KHV) gen encoding timidin kinase dan penggunaannya untuk
2 bp. primer ini dirancang untuk mengecualikan daerah klaster hidrofobik untuk mencapai produksi 67
ahighlysensitive PCRbaseddiagnosis. BMCMicrobiol 5: 1 e 9.
3 protein yang tinggi. Seperti dalam ekspresi tingkat tinggi, membentang hidrofobik di polipeptida yang Brooks SA. 2004. glikosilasi tepat dari protein rekombinan untuk digunakan manusia: 68
4 hadir pada konsentrasi tinggi dan tersedia untuk interaksi dengan daerah yang sama. Semua faktor implikasi dari pilihan sistem ekspresi. mol Biotechnol 28: 241 e 55. 69
Croset A, Delafosse L, Gaudry J, Arod C, Glez L, Losberger C, Begue D, Krstanovic A,
5 ini menyebabkan ketidakstabilan protein dan agregasi ( Rosano dan Ceccarelli 2014 ). Dalam 70
Robert F, Vilbois F, Chevalet L, Antonsson B. 2012. Perbedaan dalam glikosilasi protein rekombinan dinyatakan
6 penelitian ini protein KHV ORF25 berhasil diproduksi di E. coli BL21 bawah pET32a ( ) sistem. The 71
dalam sel HEK dan CHO. J Biotechnol 161: 336 e 48.
7 proteinwas menyatakan dominan dan itu tidak larut. Penggunaan sistem T7 promotor dalam 72
Dong C, Li X, Weng S, Xie S, Dia J. 2013. Munculnya genotipe Eropa yang fatal 73
8 diterapkan tuan rumah akan mengarahkan bakteri tuan rumah untuk memproduksi menargetkan
CyHV-3 / KHV di Cina daratan. Vet Microbiol 162: 239 e 44.
9 protein hingga 50% dari total protein yang dihasilkan ( Sambrook dan Russel 2001 ). Ekspresi protein 74
Emini EA, Hughes JV, Perlow DS, Boger J. 1985. Induksi hepatitis A virus-
10 dari penelitian ini adalah lebih baik dari penelitian sebelumnya yang sama dengan Murwantoko et al. antibodi oleh virus-spesifik fi c peptida sintetik. J Virol 55: 836 e 9. 75
11 (2012) yang tidak menunjukkan protein yang dominan menyatakan Band. Ukuran protein KHV ORF25 Farnsworth A, Wisner TW, Webb M, Roller R, Cohen G, Eisenberg R, Johnson D. 76
2007. Herpes simplex virus glikoprotein gB dan gH fungsi dalam fusi antara amplop virion dan membran nuklir
12 adalah sekitar 45 kDa. Ukuran yang berasal dari sekitar 337 residu asam amino dari KHV ORF25 77
luar. Proc Natl Acad Sci 104: 10187 e 92.
13 penelitian ini dan 162 residu asam amino fromplasmid pET32 di hulu KHV ORF25 seperti Trx-Tag, 78
14 Nya-Tag dan S-Tag protein dan 18 residu asam amino di hilir KHV ORF25 untuk menghentikan Fu X, Li N, Lin Q, Guo H, Liu L, Huang Z, Wu S. 2015. ORF086 protein Awal adalah 79
kandidat vaksin yang efektif untuk limpa menular dan virus nekrosis ginjal pada bertengger Cina chuatsi
15 kodon dari pET32a. 80
Siniperca. ikan Shell fi sh Immunol 40: 200 e 5.
16 Fujioka H, Yamasaki K, Furusawa K, Tamura K, Oguro K, Kurihara S, Seki S, Oshima S, 81
17 Imajoh M. 2015. Prevalensi dan karakteristik Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3) infeksi pada ikan mas ( Cyprinus 82
carpio L.) yang mendiami tiga sungai di Kochi Prefecture, Jepang. Vet Microbiol 175: 362 e 8.
18 83
19 Hedrick RP, Gilad O, Yun S, Spangenberg J, Marty R, Nordhausen M, kebus M, 84
20 Bercovier H, Eldar A. 2000. A virus herpes yang terkait dengan kematian massal dari remaja dan dewasa koi, 85
strain ikan mas. J Aquat Anim Kesehatan 00:44 e 55.
21 86
Hedrick RP, Gilad O, Yun SC, McDowell TS, Waltzek TB, Kelley GO, Adkison MA.
22 -Sel T analisis prediksi epitop protein KHV ORF25 ini menunjukkan bahwa sembilan dan delapan 87
2000. isolasi awal dan karakterisasi virus Herpes-seperti (KHV) dari koi dan ikan mas. Banteng Ikan Res Agen ( Suppl
23 epitop yang tersedia berdasarkan iAd dan 2): 1 e 7. 88
24 Ilouze M, Davidovich M, Diamant A, Kotler M, Disyon A. 2011. Pecahnya ikan mas 89
Rothbard / Taylor pola, masing-masing. -Sel B
penyakit yang disebabkan oleh CyHV-3 sebagai model untuk penyakit virus baru yang muncul dalam budidaya:
25 Prediksi epitope menunjukkan protein ini berisi 3, 23, dan 8 epitop berdasarkan aksesibilitas 90
tinjauan. Ecol Res 26: 885 e 92.
26 permukaan Emini, Karplus dan Schulz Karplus PA, Schulz GE. 1985. Prediksi rantai fl fleksibilitas dalam protein. Natur- 91
27 fl fleksibilitas dan ElliPro skala, masing-masing. Banyak T-sel dan sel B epitop diakui oleh lebih dari Wissenschaften 72: 212 e 3. 92
Kim HJ, Kwon SR. 2013. Bukti untuk dua koi herpes (KHV) genotipe di South
28 satu pola. Hasil tersebut menunjukkan bahwa meskipun ini adalah protein parsial KHV ORF25, masih 93
Korea. Dis Aquat Organ 104: 197 e 202.
29 diperkirakan memiliki imunogenisitas tinggi. Kim J, Kim J, Kim W, Oh M. 2015. Pengembangan vaksin protein rekombinan 94
30 berdasarkan sintesis protein sel-bebas untuk kerapu sevenband Epinephelus septemfasciatus terhadap nekrosis 95
saraf virus. J Microbiol Biotechnol 25: 1761 e 7.
31 Glikosilasi adalah salah satu modi posttranslational paling umum fi kation protein. Ini memiliki 96
Kurita J, Yuasa K, Ito T, Sano M, Hedrick RP, Engelsma MY, Haenen OLM, Sunarto A,
32 peran penting bagi struktur protein, stabilitas dan fungsi. in vivo yang glycostructures di fl farmakokinetik Kholidin EB, Chou H, Tung M, de la Pe ~ na L, Lio-Po G, Tu C, Jalan K, Iida T. 2009. 97
33 pengaruh dan imunogenisitas. Hal ini juga diketahui bahwa signi fi perbedaan tidak bisa di glikosilasi epidemiologi molekuler dari koi herpes. ikan Pathol 44:59 e 66. 98
Li N, Fu X, Guo H, Lin Q, Liu L, Zhang D, Fang X, Wu S. 2015a. Protein yang dikode oleh
34 dan glycostructures ada antara protein rekombinan dinyatakan dalam mamalia, ragi dan sel 99
ORF093 adalah calon vaksin yang efektif untuk limpa menular dan virus nekrosis ginjal pada bertengger Cina chuatsi
35 serangga. glikosilasi yang berbeda di HEK dan CHO sel mamalia telah diamati oleh Croset et al. Siniperca. ikan Shell fi sh Immunol 42:88 e 90. 100
36 (2012) . Glikoprotein yang glikosilasi dengan array bewilderingly heterogen yang kompleks Li W, Lee X, Weng S, Dia J, Dong C. 2015b. Seluruh genom urutan novel 101
Cina cyprinid virus herpes 3 isolat mengungkapkan adanya genotipe Eropa yang berbeda di Asia Timur. Vet
37 102
Microbiol 175: 185 e 94.
38 103
Vaksin virus nekrosis saraf mulut Lin C, Lin JH, Chen M, Yang H. 2007. Sebuah bahwa
39 menginduksi kekebalan protektif pada larva kerapu ( Epinephelus coioides). akuakultur 268: 265 e 73. 104
40 N- dan HAI- glycans terkait, yang merupakan produk dari aktivitas terkoordinasi enzim penduduk di 105
Lecocq-Xhonneux F, Thiry M, Dheur saya, Rossius M, Vanderheijden N, Martial J, de
41 retikulum endoplasma dan aparatus Golgi sel ( Brooks 2004 ). Karena dalam ekspresi protein 106
Kinkelin P. 1994. viral haemorrhagic septicaemia virus glikoprotein rekombinan dinyatakan dalam sel serangga
42 penelitian ini adalah bakteri yang tidak memiliki retikulum endoplasma dan aparatus Golgi, glikosilasi menginduksi kekebalan protektif di rainbow trout. 107
43 protein diharapkan menjadi sangat terbatas. Untuk membuktikan apakah kurangnya glikosilasi J Gen Virol 75: 1579 e 87. 108
Michel B, Leroy B, Stalin Raj V, Lieffrig F, Mast J, Wattiez R, Vanderplasschen AF,
44 mempengaruhi imunogenisitas, yang in vivo imunogenisitas dan perlindungan tes harus ditangani. 109
Costes B. 2010. genom cyprinid virus herpes 3 mengkodekan 40 protein yang tergabung dalam virion dewasa. J
45 Gen Virol 91: 452 e 62. 110
46 Murwantoko. 2009. protein membran Kloning ORF2 dari koi herpes Danau Toba, 111
isolat Indonesia. HAYATI J Biosci 16:49 e 53.
47 112
Murwantoko, Setyowati DN, Pratiwi R, Kawaichi M. 2012. Kloning dan ekspresi
48 ORF124 koi herpes sebagai vaksin. Indones J Biotechnol 17:42 e 50. 113
49 Miyazaki T, Yasumoto S, Kuzuya Y, Yoshimura T. 2008. Sebuah studi utama pada lisan 114
referensi Uncited
vaksinasi dengan liposom penjebakan virus koi herpes (KHV) antigen terhadap infeksi KHV pada ikan mas, pp.
50 115
99 e 184. Dalam: Bondad-Reantaso MG, Mohan CV, Crumlish M, Subasinghe RP (Eds.). Penyakit di Asia
51 117
Q15 Hedrick et al. 2000; Li et al. 2015a . Budidaya VI. Bagian Kesehatan ikan. Manila, Filipina: Asia Perikanan Society. Nuryati S, Alimuddin Sukenda,
52 Soejoedono RD, Santika A, Pasaribu FH, 118
53 119
Ucapan Terima Kasih Sumantadinata K. 2010. Pembangunan vaksin DNA menggunakan glikoprotein gen dan ekspresinya terhadap
54 116
peningkatan tingkat kelangsungan hidup ikan mas KHV yang terinfeksi ( Cyprinus carpio). J Natur Indones 13:47 e 52.
55 120
Penelitian ini didanai oleh Universitas Hibah Penelitian Universitas Gadjah Mada 2014
56 Nuswantoro S, Alimuddin, Yuhana M, Santika A, Nuryati S, Zainun Z, Mawardi M. 121
Q13 . 2012. Ef fi keampuhan vaksin DNA encoding koi herpesvirus glikoprotein GP-25 di remaja ikan mas dengan
57 122
selam. J Akuakultur Indones 11:76 e 85.
58 Ponomarenko J, Bui H, Li W, Fusseder N, Bourne PE, Sette A, Peters B. 2008. ElliPro: a 123
59
Referensi alat berbasis struktur baru untuk prediksi epitop antibodi. BMC Bioinform 124
2008 (9): 514.
60 125
Adkison MA, Gilad O, Hedrick RP. 2005. Sebuah enzyme linked immunosorbent assay Ronen A, Perelberg A, Abramowitz J, Hutoran M, Tinman S, Bejerano I. 2003. Ef fi
61 (ELISA) untuk mendeteksi antibodi terhadap koi herpes (KHV) dalam serum koi Cyprinus carpio. ikan Pathol 40:53 Vaksin efisien melawan virus yang menyebabkan penyakit mematikan di berbudaya Cyprinus carpio. Vaksin 21: 126
62 e 62. 4677 e 84. 127
Aoki T, Hirono saya, Kurokawa K, Fukuda, Nahary R, Eldar A, Davison AJ, Waltzek TB, Rosano GL, Ceccarelli EA. 2014. ekspresi protein rekombinan di Escherichia coli:
63 128
Bercovier H, Hendrick RP. 2007. Genome urutan tiga koi herpes isolat yang mewakili distribusi memperluas kemajuan dan tantangan. depan Microbiol 5: 1 e 17.
64 Rothbard JB, Taylor WR. 1988. Pola urutan umum untuk epitop sel T. EMBO 129
bermunculan penyakit koi mengancam dan ikan mas di seluruh dunia. J Virol 81: 5058 e 65.
65 Q14
J 7:93 e 100. 130

Silakan mengutip artikel ini dalam pers sebagai: Murwantoko, et al, Gene Kloning dan Ekspresi Protein Koi Herpes ORF25, HAYATI J Biosci (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.hjb.2016.10.001.
 HJB38_proof 22 November 2016 7/7

Gen kloning dan ekspresi protein 7

1 Sambrook J, Russel DW. 2001. Kloning Molekuler: Manual Laboratorium. New York: Sunarto A, Cameron A. 2006. Epidemiologi dan Pengendalian Koi Herpesvirus di 15
CSHL Press. Indonesia, Prosiding: Simposium Internasional ke-11 di Kedokteran Hewan Epidemiologi dan Ekonomi.
2 16
Shin YJ, Kwon TH, Seo JY, Kim TJ. 2013. imunisasi oral fi sh terhadap iridovirus
3 Infeksi menggunakan antigen rekombinan yang dihasilkan dari kalus padi. Vaksin 31: 5210 e 5. Sunarto A, Mc Coll KA Crane M St J, Sumiati T, Hyatt AD, Barnes AC, Walker PJ. 2011. 17

4 Isolasi dan karakterisasi koi herpesvirus (KHV) dari Indonesia: identifikasi fi kation dari garis keturunan genetik 18
Sette A, Buss S, Apella E, Smith JA, Chesnut R, Milles C, Colon SM, Grey HM. 1989. baru. J Fish Dis 34:87 e 101.
5 19
Prediksi major histocompatibility daerah mengikat kompleks antigen protein dengan analisis pola urutan. Proc Yang J, Wang H, Wang S, Yang P, Liu K, Jiang C. 2010. ekspresi tingkat tinggi, puri-
6 20
Natl Acad Sci 86: 3296 e 300. fi kation dan karakterisasi kodon dioptimalkan rekombinan hemagglutinin 5 protein dalam sel mamalia. Chin Med
7 Stamataki Z, Coates S, Evans MJ, Wininger M, Crawford K, Dong C, Fong Y, Chien D, J 123: 1073 e 7. 21

8 Abrignani S, Balfe P, Beras CM, McKeating JA, Houghton M. 2007. Hepatitis C amplop virus glikoprotein Yasumoto S, Kuzuya Y, Yasuda M, Yoshimura T, Miyazaki T. 2006. imunisasi Oral 22
imunisasi hewan pengerat menimbulkan antibodi penetral lintas-reaktif. Vaksin 25: 7773 e 84. ikan mas dengan vaksin liposom antigen peleburan koi herpes. ikan Pathol 41: 141 e 5.
9 23

10 Sommerset saya, Skern S, Biering E, Bleie H, Fiksdal IU, Grove S, Nerland AH. 2005. Yuasa K, Sano M. 2009. Koi herpesvirus: status KLB, diagnosis, pengawasan, 24

11 Perlindungan terhadap nodavirus halibut Atlantik di turbot diinduksi oleh vaksinasi protein kapsid rekombinan dan penelitian. Isr J Aquac Bamidgeh 61: 169 e 79. 25
tetapi tidak mengikuti vaksinasi DNA. ikan Shell fi sh Immunol 18:13 e 29. Zhou JX, Wang H, Li XW, Zu X, Lu WL, Zang DM. 2014. Pembangunan KHV-CJ
12 26
vaksin DNA ORF25 dan uji tantangan kekebalan tubuh. J Fish Dis 37: 319 e 25. Q1
13 27

14 28

Silakan mengutip artikel ini dalam pers sebagai: Murwantoko, et al, Gene Kloning dan Ekspresi Protein Koi Herpes ORF25, HAYATI J Biosci (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.hjb.2016.10.001.