Cultivo de meristemos.

Tcnica de cultivo que consiste en aislar aspticamente la regin meristemtica con 1-3 de los
primordios foliares ms jvenes e implantarla en un medio de cultivo estril, con el propsito de inducir
la diferenciacin de clulas y tejidos en plantas completas, mediante la utilizacin de medios de cultivos
adecuados.

Generalidades
En multitud de especies cuyo mtodo de propagacin habitual es de tipo vegetativo e incluso en algunas
cuya propagacin es por semilla, se encuentran problemas de contaminacin por diversos
microorganismos, que los mtodos tradicionales de desinfeccin utilizados por los propagadores y
viveristas no consiguen erradicar, ni siquiera mediante tratamientos qumicos agresivos, esto conlleva
una serie de prdidas econmicas por prdidas de produccin, de calidad de fruto y hasta de cosechas
completas. Incluso utilizando tcnicas de cultivo in vitro es a veces imposible eliminar a determinados
organismos patgenos, como virus, micoplasmas, bacterias y hongos endgenos, algunos de los cuales
se transmiten incluso va semillas, y ante los cuales muchas veces son ineficaces los antibiticos,
bactericidas y antivricos aadidos a los medios de cultivo.

Mtodo de saneamiento
La tcnica de cultivo in vitro de meristemos, como mtodo de saneamiento, se fundamenta en la
distribucin no uniforme de los microorganismos (virus, bacterias, micoplasmas) en los tejidos de las
plantas infectadas, y su disminucin progresiva hacia el pice del tallo. Por tanto, son mayores las
posibilidades que las clulas del meristemo apical se encuentren libres de microorganismos, a diferencia
de los tejidos ms organizados de las plantas. Desde que Morel y Martin (1955) mostraron la posibilidad
de regenerar clones de papa (Solanum tuberosum L), libres de virus, mediante el cultivo in vitro de
meristemos, varios trabajos han confirmado la existencia de esta tcnica de saneamiento, para el
saneamiento de numerosas especies portadoras de enfermedades. Algunos estudios han demostrado la
presencia de partculas virales en las clulas del meristemo pical; sin embargo plantas obtenidas a partir
del cultivo de meristemos resultaron libres de virus.

La obtencin de plantas libres de patgenos, por medio del cultivo de meristemos, hace suponer que las
zonas meristemticas tienen propiedades o caractersticas especiales, en relacin con el resto de los
tejidos, para mantenerse libre de virus. Este hecho supone la existencia de otros factores, los cuales
probablemente operan en el momento del cultivo in vitro y son responsables de la inactivacin del virus
en las nuevas plantas. Una interrupcin temporal de la organizacin normal del tejido meristemtico
ocasiona la inhibicin de la multiplicacin de los virus, debido a la no-disponibilidad de enzimas claves.
Para explicar la sanidad o limpieza del meristemo se han formulado varias hiptesis, una de ellas plantea,
que debido a la ausencia de tejido vascular en la proximidad del meristemo apical y que las conexiones
plasmodermticas en las clulas de este tejido son muy pequeas, por tanto los microorganismos se
desplazan muy lentamente hacia esta zona. Esta caracterstica morfolgica, unida a la activa
multiplicacin celular que all ocurre, puede explicar la baja concentracin o la ausencia de patgenos en
este tejido.

Existe la hiptesis sobre la produccin en las clulas meristemtica, de sustancias inhibitorias de los
microorganismos y que el efecto de las hormonas en el medio de cultivo, influyen en la inhibicin de los
virus mediante el cultivo de meristemos. Otra de las hiptesis se basa en la activa multiplicacin celular
en que se encuentra la zona meristemtica, invirtiendo la totalidad de la maquinaria bioqumica celular
para la formacin de macromolculas, membranas y otras estructuras de las clulas nuevas, dejando por
tanto a los virus, parsitos obligados, en condiciones desventajosas para su propia multiplicacin.

Tamao de los meristemos

El tamao ptimo del meristemo es entre 0.2-1mm, pero realmente el utilizado est en dependencia de
los objetivos que se persigan con propagacin comercial. Si el objetivo es la obtencin de plantas libres
de enfermedades sistmicas es necesario, la utilizacin de meristemos, pero si por el contrario
solamente se requiere de la multiplicacin y no hay peligro de diseminacin de enfermedades o se parte
de plantas sanas, se pueden utilizar pices de mayor tamao con un mayor porcentaje de regeneracin.

Aislamiento y siembra de los meristemos

El reconocimiento de la zona meristemtica vara entre especies, por tanto, se requiere de estudios
preliminares que revelen su ubicacin y manipulacin adecuada, con el objetivo de facilitar su
extraccin. Existen meristemos muy fciles de localizar, como son los expuestos, tal es el caso de la papa;
en otros cultivos pueden estar ms internamente protegidos y se necesita separar mayor cantidad de
pequeas hojas, para encontrar la zona meristemtica. Este es el caso de bulbos, ya sean de ajo (Allium
sativum L.), cebolla (Allium cepa L.) o en el caso de tubrculos o cormelos de (Xanthosoma sp.).

La diseccin asptica del meristemo es un proceso delicado y requiere de muchas horas de prctica; se
realiza con el apoyo de un microscopio esterioscpico, desprendiendo los foliolos que rodean el punto
de crecimiento, hasta que solo queda el pice con algunos primordios foliares, para su posterior
transferencia a medios de cultivo de establecimiento.

La eficiencia del cultivo de meristemos, como mtodo de saneamiento a patgenos, esta determinada
por los siguientes factores:

Origen y edad del explante inicial

La seleccin de un adecuado explante inicial determina mejores resultados en la regeneracin o
formacin de plantas in vitro. La seccin de tejido utilizada vara en dependencia de las caractersticas
morfolgicas de las diferentes especies, como regla general, se toman las yemas del tallo principal y de
los brotes axilares de las plantas.

Las principales causas de prdidas estn dadas por la muerte de los meristemos, ocasionada por daos
en el momento de la extraccin, y por la formacin de plantas no definidas con crecimiento en rosetas.
Tamao del explante inicial
El tamao de los meristemos es directamente proporcional a su regeneracin y crecimiento posterior in
vitro. En caa de azcar, pltanos y bananos, a pesar de emplearse pices meristemticos, de mayor
tamao, la principal causa de bajos ndices de establecimiento est dada por la necrosis de los tejidos,
producto de la oxidacin fenlica.

De forma general el riesgo de aparicin de patgenos en los tejidos vegetales aumenta con el
incremento del tamao de los explantes iniciales. La ubicacin de los patgenos en los tejidos es
determinante en la eleccin del tamao a utilizar, por ejemplo el (PLRV) es un virus confinado al floema y
puede ser eliminado cuando se extraen meristemos de mayor tamao.

Caractersticas genotpicas
Existe una marcada influencia del genotipo en el xito del cultivo de meristemos donde los porcentajes
de establecimiento varan entre especies, variedades y clones. Independientemente de la influencia del
origen del explante, del tamao de los meristemos y del genotipo, la eficiencia del cultivo de meristemos
como mtodo de saneamiento, depende de las condiciones de crecimiento segn los requerimientos de
las diferentes especies, la habilidad del operador para efectuar dicha escisin y la utilizacin de medios
de cultivo con adecuado balance hormonal que favorezca la regeneracin de los pices meristemticos.

Influencia del medio de cultivo

Es importante sealar que aunque el balance hormonal utilizado est en dependencia del genotipo que
se trabaje, para el xito del empleo del cultivo de meristemos como mtodo de saneamiento este factor
debe tenerse muy en cuenta. En el cultivo de meristemos no existe ningn medio de cultivo universal,
sin embargo, los medios basales propuestos por Murashige & Skoog (1962), con algunas modificaciones
en sus componentes, han sido los que con ms frecuencia se han utilizado. Un balance adecuado entre
auxina y citoquinina en el medio de cultivo es necesario para la formacin de plantas a partir de
meristemos.

Ventajas
Los meristemos son genticamente estables y resultan el tejido idneo para la iniciacin de programas
de propagacin in vitro.

El cultivo de meristemos permite eliminar la contaminacin de algunos virus por escape, puesto que los
tejidos meristemticos se mantienen sanos aun cuando el resto de las clulas estn infestadas.

Este mtodo resulta efectivo para el control de bacterias y hongos contaminantes y patgenos.

Los progresos alcanzados en su aplicacin han hecho posible propagar gran nmero de especies de
importancia econmica, los resultados han sido particularmente atractivos porque se pueden obtener
clones limpios de patgenos a partir de plantas sistmicamente infectadas.
Limitaciones
El xito en el cultivo de meristemo es juzgado por el porcentaje de regeneracin, tamaos pequeos
(0.1-0.2mm) crecen lentamente disminuyendo la eficiencia del mtodo.

La resistencia de algunos genotipos al cultivo in vitro limita su extensin a diferentes variedades y

especies.

En la actualidad el cultivo de meristemos apicales constituye una alternativa en la erradicacin de

patgenos, aunque no siempre se logran los niveles de efectividad deseados; por esta razn es
frecuentemente combinado con otros mtodos de saneamiento que aumenten su eficiencia y
generalizacin. En el Laboratorio de Biotecnologa Vegetal del Instituto de Investigaciones de Viandas
Tropicales (INIVIT), es frecuentemente utilizado con xito en la multiplicacin in vitro
de yuca, boniato y malanga, con el objetivo de obtener explantes libres de patgenos.

Fuentes
Garca, Leyanis y J.C. Noa (1998). Obtencin de plantas libres de patgenos. En: J.N. Prez (ed.)
Propagacin y Mejora Gentica de Plantas por Biotecnologa. pp. 135-149. IBP, Santa Clara.
Lpez, R. (2002). Produccin de plantas libres de virus y morfognesis indirecta a partir de
cultivo de meristemos de tres genotipos de quequisque (Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott).
Trabajo de Diploma. Universidad Nacional Agraria. Nicaragua. 40 p.
Morel, G. y Martin, C. (1955). Guerison de pomme de terre de maladie a virus. C.R. Acad. Sci.
Paris. 1315-1324.

Saneamiento del material vegetal: cultivo de meristemos

Carlos Lpez Encina y Jos Manuel Cazorla Gonzlez

En multitud de especies cuyo mtodo de propagacin habitual es de tipo vegetativo e incluso en

algunas cuya propagacin es por semilla, se encuentran problemas de contaminacin por
diversos microorganismos, que los mtodos tradicionales de desinfeccin utilizados por los
propagadores y viveristas no consiguen erradicar, ni siquiera mediante tratamientos qumicos
agresivos, esto conlleva una serie de prdidas econmicas por prdidas de produccin, de
calidad de fruto y hasta de cosechas completas. Incluso utilizando tcnicas de cultivo in vitro es
a veces imposible eliminar a determinados organismos patgenos, como virus, micoplasmas,
bacterias y hongos endgenos, algunos de los cuales se transmiten incluso va semillas, y ante
los cuales muchas veces son ineficaces los antibiticos, bactericidas y antivricos aadidos a los
medios de cultivo. Existen varios sistemas para sanear integralmente una planta eliminando los
microorganismos que las infestan; slo uno de ellos, la termoterapia (Kunkel, 1936; Kassanis,
1965), no necesita condiciones in vitro para aplicarse. Consiste en la incubacin del especimen a
sanear en un ambiente con alta temperatura (35 a 40C) y alta humedad, durante periodos de
20 das a varios meses, este mtodo se aplica con xito en frutales. En los otros sistemas de
saneamiento se aplican tcnicas de cultivo in vitro y se basan fundamentalmente en el cultivo
de meristemos o pices meristemticos. Suelen utilizarse procedimientos mixtos que combinan
termoterapia, microinjerto y formacin de tallos adventicios con el cultivo de meristemos.
La tcnica del cultivo de meristemos consiste en la diseccin e incubacin del meristemo apical
de una planta en condiciones de asepsia. Se considera como meristemo en sentido estricto al
domo meristemtico del pice o bien el domo meristemtico con uno o dos primordios foliares.
La dificultad del cultivo del meristemo aislado aconseja diseccionarlo y cultivarlo con al menos
uno de los primordios foliares, con lo que tambin se obtienen buenos resultados. As se
obtienen plantas libres de patgenos, pero atencin, porque esta definicin puede llevar a
error, ya que la aplicacin del sistema precisa de una serie de requisitos previos y posteriores.
Lo primero consiste en la identificacin y caracterizacin de los patgenos y la puesta a punto
de tcnicas de deteccin fiable, para que una vez aplicado el tratamiento de saneamiento se
puedan realizar pruebas y analizar las plantas obtenidas (ensayo mediante mtodos
inmunolgicos, injerto sobre especies marcadoras, microscopa electrnica) para verificar la
total eliminacin de determinados patgenos, pero cuidado, pueden existir otros patgenos
cuya eliminacin no se haya comprobado. Esto quiz se entienda mejor si aclaramos que la
obtencin de meristemos limpios es un proceso probabilstico, que no ocurre en el 100% de
los casos, sino slo en una alta proporcin, por eso unos meristemos se obtienen libres de
patgenos y otros no, y es necesario realizar tests de comprobacin de los patgenos uno por
uno, antes de certificar la planta como libre de patgenos. Una vez certificadas, estas plantas
deben ser tratadas con esmero para impedir su reinfeccin por vectores o por malas prcticas
higinicas en su manipulacin (Quak, 1977). Esta historia del cultivo de meristemos empez all
por 1934, cuando White observ que un virus del tabaco se distribua desigualmente a lo largo
de la planta, y luego Limasset y Cornuet (1949) propusieron que el meristemo podra estar libre
del virus. Esto llev a Morel y Martin en 1952 a cultivar meristemos de dalias infestadas por
virus y obtener plantas libres de dichos virus. Despus de este trabajo y siendo muy claras las
aplicaciones de este mtodo en horticultura y fruticultura, se dedicaron muchos esfuerzos en
este campo y hoy da es una tcnica de aplicacin rutinaria en multitud de especies (patata,
fresa). Luego surgieron las preguntas sobre el porqu de la distribucin diferencial del virus en
la planta y su ausencia en el meristemo. En una primera hiptesis se explicara la ausencia de
virus en el meristemo por problemas de transporte de los virus, as si estos se mueven por el
sistema vascular de la planta, como los vasos no llegan al meristemo, el virus no podra
alcanzarlo, e incluso si el virus fuera capaz de invadir o moverse de clula a clula, la velocidad
de avance de los virus sera inferior a la de crecimiento del meristemo e impedira su invasin;
otras hiptesis proponen una inhibicin de la replicacin de los virus en la zona meristemtica
debido a la alta tasa metablica del meristemo y a la elevada concentracin de reguladores en
esa zona. Aunque el motivo de la ausencia de virus en el meristemo no est totalmente
esclarecido, estas hiptesis o una conjuncin de las mismas parecen ser bastante correctas. De
todo esto se desprende sin mucho esfuerzo que el tamao del meristemo es quiz el factor ms
crtico de esta tcnica, y el xito en el saneamiento es mayor cuanto ms pequeo es el
explanto (desde 0.05 mm a 0.2 mm de dimetro) el tamao ms usual de un meristemo con los
dos Como ya se ha indicado es necesario ajustar el tamao del explanto, es decir el nmero de
primordios foliares que van a acompaar al meristemo para equilibrar el desarrollo del cultivo y
conseguir un porcentaje de axenia ptimo. Es necesario indicar que los requerimientos de los
medios de cultivo no son muy exigentes salvo si se cultiva el domo meristemtico sin primordios
foliares y slo es necesario efectuar los habituales ajustes en el medio para cada especie. Otros
factores que influyen en el xito del tratamiento son la rapidez en el aislamiento del meristemo,
para evitar la deshidratacin de esa frgil estructura y la poca del ao en que se obtiene el
explanto, siendo la influencia estacional muy fuerte en algunas especies (patata, clavel, etc).
En la actualidad esta tcnica se utiliza rutinariamente con especies ornamentales (begonias,
claveles, geranios), con especies hortcolas (patata, fresa), especies leosas (via, eucalipto,
manzano y ctricos), obtenindose espectaculares mejoras de calidad de planta y de produccin.