ARTICULOS

EFECTO DE LA ADICIN DE -MANANASA AL ALIMENTO

DE POLLOS DE ENGORDE DE DIFERENTES NIVELES
NUTRICIONALES SOBRE EL RENDIMIENTO PRODUCTIVO,
ENERGA METABOLIZABLE, COEFICIENTE DE
DIGESTIBILIDAD DE AMINOCIDOS Y FUNCIN INMUNE
Los polisacridos no amilceos solubles (PNAs) estn presentes en la fraccin hemicelulosa
de la fibra como constituyente de la estructura primaria de la pared celular, encontrndose
tambin en la segunda capa mananos, xilanos, galactanos, arabinanos entre otros
(Dhawan y Kaur, 2007). Los PNAs interfieren en la mezcla de las enzimas digestivas con
los nutrientes impidiendo el movimiento adecuado del contenido intestinal as como el
transporte de las molculas hidrolizadas en la mucosa intestinal (Slominski, 2011).
La endocarbohidrasa 1,4- mananasa (BM) escinde al azar y el incremento de la disponibilidad de carbohidratos, los
los enlaces 1,4- glicosdicos de las principales cadenas de cuales son absorbidos y utilizados por los animales (Saki et
mananos, galactomananos, glucomananos y galactogluco- al., 2005). Por otro lado, se puede utilizar la suplementacin
mananos as como los enlaces de mananos de los subpro- con BM con el fin de atenuar la respuesta inmune de pollos
ductos de la hidrlisis: manobiosa, manotriosa y manosa de engorde ya que reducir la produccin de inmunoglobuli-
(Dhawan y Kaur, 2007). El uso de BM en dietas de pollos de nas (Ig) (Li et al., 2010) y leucocitos (Mehri et al., 2010). Estas
engorde es beneficioso debido a la hidrlisis de ciertas clases enzimas pueden ser empleadas como estrategia para reducir
de PNAs, lo cual reduce la viscosidad en el medio intestinal los costos de produccin en dietas de baja energa para po-
(Lee et al., 2003; Mehri et al., 2010); baja retencin de agua llos de engorde, en consecuencia se logra una mejor utiliza-
por la disgregacin de carbohidratos a molculas pequeas, cin de la energa del alimento (Wu et al., 2005; Li et al., 2010).

Niveles Nutricionales
MATERIALES Y MTODOS 1 - NN1 Rostagno et al.,2011
Todos los experimentos se llevaron a cabo en la granja avcola del Departamen- 2 - NN2 NN1 - 100 kcal
to de Ciencia Animal, UFV, Brasil en Abril y Mayo del 2013. 3 - NN3 NN1 - 3% Aas
4 - NN4 NN1 - 100 Kcal - 3% Aas
Enzimas
La -mananasa termoestable (CTCZYME) fue producida por fermentacin del
Tratamientos
Bacillus subtilis y fue incluida en una dosis de 500 g por tonelada de alimento de
Tratamiento 1 NN1
acuerdo con la recomendaciones del fabricante en niveles de 800 unidades/g.
Tratamiento 2 NN1 + -mananasa

Diseo experimental, Dieta y Animales Tratamiento 3 NN2

Se utilizaron 1600 pollos de engorde machos de la lnea Cobb 500 de 1 da de Tratamiento 4 NN2 + -mananasa

edad, divididos en 8 tratamientos, cada uno con 10 repeticiones de 20 aves por Tratamiento 5 NN3

unidad experimental (corrales con cama de viruta). Los tratamientos fueron los Tratamiento 6 NN3 + -mananasa
siguientes: Tratamiento 7 NN4
Tratamiento 8 NN4 + -mananasa

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El periodo experimental fue de 6 semanas (42 das) con una
dieta de inicio (0-3 semanas de edad) y dieta de acabado
(3-6 semanas de edad) preparada para los diferentes trata-
mientos. Los pollos de engorde tuvieron acceso al alimento
en harina y agua ad libitum.
Para los ensayos de determinacin de energa metaboliza-
ble aparente corregida por balance de nitrgeno (AMEn) y
coeficiente de digestibilidad ileal verdadera (TIDc) de ami-
nocidos se criaron 800 pollos de engorde machos de la l-
nea gentica Cobb 500. Las aves recibieron un alimento de
pre-inicio a base de maz y torta de soya.
Para determinar la AMEn se transfirieron 384 pollos a los 13
das de edad a jaulas, dividindolos en 8 tratamientos con
8 repeticiones de 6 pollos cada uno, stos fueron los mis-
mos a los utilizados en el ensayo de parmetros producti-
vos correspondientes a la etapa de 0-3 semanas de edad.
El alimento fue otorgado ad libitum por 8 das, incluyendo 3
das para adaptacin y 5 das para completar la colecta de
excreta de cada unidad experimental.
Para determinar el TIDc de los aminocidos se transfirieron
360 pollos a los 22 das de edad a las mismas jaulas de me-
tal, dividindolos en 8 tratamientos con 6 repeticiones de 6
aves cada uno, stos fueron los mismos adoptados para el
ensayo de evaluacin de parmetros productivos corres-
pondientes a la etapa de 3-6 semanas de edad. Se formul
una dieta libre de protena (PFD) con 0 500 g de BM por to-
nelada de alimento para determinar prdidas endgenas de
los valores de TIDc de aminocidos. Los tratamientos PFD y
PFD + BM fueron utilizados para determinar los coeficientes
de digestibilidad de aminocidos sin y con suplementacin
de enzimas, respectivamente. Se adicion un marcador in-
digestible para obtener los factores de indigestibilidad (IFs).
Parmetros Productivos, AMEn,
Balance de nitrgeno, TIDc y Funcin inmune
Se determin la ganancia de peso (GP), consumo alimenticio
(CA) e ndice de conversin alimenticia (ICA) durante los pe-
riodos de 0 a 3, 3 a 6, y 0 a 6 semanas.
En el ensayo de energa, se pesaron las excretas de cada
jaula al final de cada periodo experimental y se procesaron
hasta obtener una mezcla fina.
En el ensayo de digestibilidad se colect el contenido ileal
despus de 5 das de periodo de adaptacin a las dietas
experimentales.
A los 42 das de edad, se colectaron 6 ml de muestras de
sangre por puncin de la vena cava de 2 pollos por replicado
de cada tratamiento para la obtencin del suero en viales
de 2ml Eppendorf a 20C. Estas aves se sacrificaron para
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tomar las muestras de la bolsa de Fabricio, el bazo y el timo,
posteriormente se pesaron para determinar el peso relativo
de los rganos del sistema inmune.
Anlisis qumico
Las dietas y excretas fueron analizadas para materia seca
(MS) y protena cruda (PC). El mtodo de Kjeldahl fue utili-
zado para determinar el nitrgeno en las dietas y heces de
acuerdo con los mtodos de anlisis oficiales (AOAC, 1990).
El nitrgeno excretado (NE) fue calculado por multiplicacin
de la cantidad total de excreta en MS por el porcentaje de
nitrgeno en la excreta MS, de igual forma con el nitrgeno
consumido (NC). El porcentaje nitrgeno retenido (%NR) fue
calculado en relacin a la cantidad de nitrgeno consumido.
El balance de nitrgeno (BN) fue obtenido por la cantidad
de nitrgeno consumido menos el nitrgeno excretado, y se
determin el valor de energa bruta (EB) usando una bomba
calorimtrica adiabtica (C5001). Los valores de AMEn se
calcularon en base a los valores de EB de los alimentos y las
heces usadas en la ecuacin descrita por Matterson (1965).
Los anlisis de MS de las dietas (AOAC, 1990) y el contenido
ileal recolectado de las aves fueron realizados para clculos
de digestibilidad. La ceniza insoluble en cido fue analizada
utilizando la tcnica descrita por Van Keulen y Young (1977)
para determinar el TIDc de los aminocidos.
Los niveles de suero de las IgA, IgG y IgM fueron obtenidos
por anlisis de inmunoturbidimetra con la utilizacin de kits.
El peso relativo de cada rgano inmune (bazo, timo y bursa)
fue calculado de acuerdo a la siguiente ecuacin: peso re-
lativo de rgano inmune = peso del rgano/peso corporal.
Anlisis estadstico
La data fue analizada utilizando un diseo completamente
aleatorio con arreglo factorial 4x2 por anlisis de varianza
(ANOVA) utilizando el procedimiento PROC GLM (modelo li-
near general) con el software SAS (SAS Institute, 1990). Se
utiliz la funcin slice para revelar las interacciones signifi-
cantes y la prueba de Tukey con un nivel de significancia de
p< 0.05 para identificar diferencias significativas.
RESULTADOS
Parmetros productivos
En el periodo de 3 a 6 semanas de edad, las aves con ali-
mento suplementado con BM mostraron una GP y un CA
superior (p<0.05) y un ICA inferior (p<0.05) comparado con
las aves sin suplemento enzimtico en las dietas, en propor-
ciones 3.32%, 1.17% y 2.40%, respectivamente. A lo largo
de todo el periodo experimental (1-42 das de edad), la su-
plementacin con BM en la dieta increment el GP (p<0.05)
por 2.45% y mejor el ICA (p<0.05) por 1.85% comparado
con las dietas sin suplementacin enzimtica.
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Tabla 1. Efecto de los diferentes niveles nutricionales y la suplementacin con -mananasa en pollos de engorde.

Nivel Nutricional P Valor BM P Valor CV (%)

NL1 NL2 NL3 NL4 0 g/TM 500 g/TM

GP (g) 2683* 2618* 2613* 2549* 0.0000 2583* 2648* 0.0002 2.80
CA (g) 4191 4168 4150 4120 0.1235 4139 4175 0.0945 2.30
ICA 1.56* 1.59* 1.58* 1.63* 0.0000 1.60* 1.57* 0.0051 2.55

x,y Letras diferentes en la misma fila muestran diferencia estadsticamente significativa de acuerdo con la prueba de Tukey (P<0.05)
X,YLetras diferentes en la misma fila muestran diferencia estadsticamente significativa de acuerdo al Test F (P<0.05).

Energa metabolizable aparente corregida por
balance de nitrgeno (AMEn), nitrgeno consumido
(NC), nitrgeno excretado (NE), nitrgeno retenido
(NR) y porcentaje de retencin de nitrgeno (%RN)
La suplementacin de BM increment el AMEn por 1.49%
(P<0.05) en comparacin con los pollos de los tratamien-
tos sin adicin enzimtica, con valores que fueron 2.20%
menores que los tratamientos sin suplementacin (Tabla
2). Los bajos niveles nutricionales resultaron en valores in-
feriores de NC, NR y %RN (p<0.05), mientras la suplemen-
tacin de BM recuper los valores en los tratamiento NL2
y NL1 (p<0.05).

Tabla 2. Efecto de los diferentes niveles nutricionales y la suplementacin con BM en los valores de energa metabolizable aparente
(AME), energa metabolizable aparente corregida por balance de nitrgeno (AMEn), nitrgeno consumido (NC), nitrgeno excretado
(NE), nitrgeno retenido (NR) y porcentaje de nitrgeno retenido (%NR)

Nivel Nutricional Fuentes de Variacin

BM NL1 NL2 NL3 NL4 Media SEM NL BM NL*BM

AMEn 0 3186 3135 3212 3134 3167 Y

35.598 0.001 0.001 0.77
500 3238 3199 3245 3179 3215X
Media 3211x 3167y 3228x 3156y
NC 0 3.35 a,A
2.96 b,c.A
2.80 c,B
3.06b,A 3.04 0.140 0.001 0.001 0.024
500 3.31 a,A
3.21 a,A
3.16 a,A
3.10a,A 3.20
Media 3.34 3.09 2.99 3.08
NE 0 0.85 0.95 0.91 0.96 0.92Y 0.083 0.27 0.007 0.14
500 0.88 0.86 0.78 0.88 0.85X
Media 0.86 0.89 0.85 0.91
NR 0 2.48a,A 2.00b,c,B 1.86c,B 2.11b,A 2.12 0.114 0.001 0.001 0.001
500 2.48a,A 2.40a,A 2.41a,A 2.18b,A 2.37
Media 2.48 2.20 2.13 2.16
%NR 0 75.0a,A 68.1b,B 66.8b,B 69.2b,A 69.81 2.391 0.001 0.001 0.001
500 74.0a,A 74.1a,A 75.2a,A 71.2a,A 73.68
Media 74.53 71.16 71.04 70.25

x,yLetras diferentes en la misma fila muestran diferencia estadsticamente significativa de acuerdo con la prueba de Tukey (P<0.05)
X,YLetras diferentes en la misma fila muestran diferencia estadsticamente significativa de acuerdo al Test F (P<0.05).
a-bLetras diferentes en la misma fila muestran niveles nutricionales.
A-BLetras diferentes en la misma fila muestran suplementacin de enzimas.

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Coeficiente real de digestibilidad disminuyeron en 11.8% y 13.4% respectivamente, con

ileal de aminocidos
La suplementacin con BM increment el TIDc (p<0.05)
de todos los aminocidos: 1.01% para lisina, 1.20%
para metionina, 2.02% para cistena, 2.06% para treo-
nina, 1.28% para arginina, 2.97% para glicina, 1.78%
para serina, 0.87% para valina, 0.91% para isoleucina,
1.32% para leucina, 1.36% para histidina, 1.34% para
fenilalanina, 1.78% para tirosina, 2.04% para alanina,
2.07% para prolina, 1.72% para asprtico y 1.31% para
glutmico.
Funcin Inmune
Se redujo (p<0.05) el peso relativo de los rganos del
sistema inmune en pollos de engorde que consumieron
dietas con BM en comparacin con los que no recibie-
ron enzimas. El peso de la bolsa de Fabricio y el bazo
BM. Adicionalmente, la suplementacin con BM produjo
una buena reduccin (p<0.05) en el peso relativo del timo
(14.06%) comparado con las dietas no suplementadas.
Se observaron interacciones significativas (p<0.05) en-
tre los tratamientos NL y suplementacin con BM para
los valores de IgA, IgG y IgM. La adicin de BM redujo
(p<0.05) las concentraciones de IgA en suero en 33.54%,
pero no influy (p>0.05) sobre los valores de IgA en los
tratamiento NL1 y NL4. La suplementacin enzimtica
redujo (p<0.05) los valores de IgG de los pollos de engor-
de por 39.54% comparado con los que no recibieron di-
cha suplementacin. La adicin de BM redujo los valores
de IgM (p<0.05) en 36.46% comparado con los que no
recibieron la suplementacin. La adicin de enzimas re-
dujo los valores de IgM (p<0.05) en los tratamientos NL2,
NL3 y NL4 pero no afect al tratamiento NL1 (p>0.05).

Tabla 3. Efecto de los diferentes niveles nutricionales y la suplementacin con BM sobre el peso relativo de rganos del sistema inmu-
ne y concentracin de inmunoglobulinas en suero a los 42 das de edad

Nivel Nutricional Fuentes de Variacin

BM NL1 NL2 NL3 NL4 Media SEM NL BM NL*BM

Peso relativo de rgano del sistema inmune

Bursa 0 1.86 2.05 1.88 1.99 1.95Y 0.389 0.83 0.005 0.62
500 1.69 1.71 1.79 1.67 1.72X
Media 1.78 1.88 1.84 1.83
Bazo 0 1.06 1.12 1.05 0.91 1.04Y 0.202 0.22 0.001 0.53
500 0.89 0.91 0.90 0.87 0.90X
Media 0.98 1.01 0.98 0.90
Timo 0 3.59a,A 3.00a,A 3.06a,A 3.12a,A 3.20 0.701 0.94 0.003 0.005
500 2.23a,B 2.97,A 2.86a,A 2.94a,A 2.75
Media 2.91 2.99 2.97 3.03
Inmunoglobulinas (mg/dL)
IgA 0 5.90b,A 9.35a,A 5.25b,A 5.25b,A 6.44 1.736 0.001 0.001 0.001
500 4.85 a,A
4.75 a,B
3.30 a,B
4.25a,A 4.25
Media 5.37 7.05 4.27 4.75
IgG 0 1.70b,A 3.05a,A 1.85b,A 2.20b,A 2.20 0.785 0.001 0.001 0.003
500 1.45a,A 1.55a,B 1.20a,A 1.10a,B 1.33
Media 1.58 2.30 1.53 1.65
IgM 18.1b,A 29.3a,A 18.0b,A 19.30b,A 21.2 4.246 0.001 0.001 0.001
15.8a,A 14.9a,B 9.80b,B 13.35b,B 13.4
Media 16.9 22.1 13.9 16.3

x,yLetras diferentes en la misma fila muestran diferencia estadsticamente significativa de acuerdo con la prueba de Tukey (P<0.05)
X,YLetras diferentes en la misma fila muestran diferencia estadsticamente significativa de acuerdo al Test F (P<0.05).
a-bLetras diferentes en la misma fila muestran niveles nutricionales.
A-BLetras diferentes en la misma fila muestran suplementacin de enzimas.

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 ARTICULOS
DISCUSIN
La adicin de BM no mejor el performance durante la pri-
mera fase, y los resultados de este estudio concuerdan
con los de Li y colaboradores (2010), Mehri y colaborado-
res (2010) y Zou y colaboradores (2006), quienes no obser-
varon una mejora del crecimiento de las aves hasta que los
animales alcanzaron las 3 semanas de edad. Se puede de-
ber al estado fisiolgico inmaduro de los pollos impidin-
doles obtener los beneficios del suplemento enzimtico o
a que las aves estaban cerca de su potencial gentico.
Es importante resaltar que la adicin de BM increment
los valores de GP y CA y mejor el ICA durante el periodo
comprendido entre la cuarta y sexta semana de edad y por
lo tanto, durante todo el experimento. El presente estudio
corrobora lo dicho por Zou y colaboradores (2006), quie-
nes encontraron mejora en la ganancia diaria de peso y
la conversin alimenticia para las mismas etapas cuando
incluyeron 0.025% y 0.05% de BM al alimento basado en
maz y soja. Jackson y colaboradores (2004) trabajaron con
alimento libre de promotores de crecimiento y encontraron
que suplementando 80 millones de BM U/TM promueve el
incremento de la ganancia diaria de peso en las aves, y la
suplementacin de 110 millones de BM U/TM ejerci un
efecto como aditivo en el incremento de la ganancia diaria
y mejora del ICA en pollos de engorde comparados con el
tratamiento control. Otros estudios refuerzan la funcin de
BM en el mejoramiento del performance de los animales
(Lee et al., 2003; Daskiran et al., 2004; Li et al., 2010; Cho
y Kim, 2013), gracias a una serie de beneficios derivados
de la adicin de BM, como la hidrlisis de una clase de
mananos, siendo ste uno de los factores antinutricionales
ms importantes en la dieta de los pollos de engorde. La
reduccin en el tamao de las molculas por la accin de
la enzima permite mejorar la digestibilidad de los nutrien-
tes como materia seca (Cho y Kim, 2013), protena cruda
y fibra cruda (Li et al., 2010); produce mayores valores de
energa metabolizable (Daskiran et al., 2004; Kong et al.,
2011) e incrementa los coeficientes de digestibilidad ileal
de los aminocidos (Mussini et al., 2011).
La suplementacin BM increment los valores de AMEn
comparado con las dietas sin BM. Mussini et al. (2011) ob-
servaron el incremento de 41.62% en la energa metabo-
lizable ileal aparente de las aves que consumieron dietas
a base de maz y soja suplementadas con 0.1% de BM.
Hubo un incremento de 4.96% en los valores de AMEn de
las aves suplementadas con BM. Este hecho puede ser
explicado; sin embargo, el suplemento con BM pudo ge-
nerar la hidrlisis de PNAs a molculas ms pequeas. Lo
que permite una entrada de energa superior debido a que
la manosa, uno de los residuos de este proceso, puede
ser absorbida por el animal (Saki et al., 2005) y ser utiliza-
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da como fuente de energa. Otra hiptesis manejada por
Meng y colaboradores (2005) en un estudio in vitro relacio-
nada a la actividad de una preparacin de carbohidrasas
sobre polisacridos no amilceos. La degradacin por BM
produce oligosacridos y azcares libres, los que forman
un sustrato potencial de fermentacin para bacterias pre-
sentes en el intestino de los pollos de engorde. Una vez
fermentado, los cidos grasos voltiles son liberados para
que sean utilizados por las aves, aumentando as los valo-
res de AMEn en el alimento a base de maz y soja.
El suplemento de la enzima permite la reduccin de los
niveles de nutrientes en la dieta sin prdidas en el per-
formance animal. Adems, con la liberacin de energa, la
inclusin de ingredientes energticos puede disminuir, lo
que se refleja en la reduccin de costos de produccin.
En el presente estudio, la adicin enzimtica redujo el NE
en pollos de engorde. Este resultado mostr la importan-
cia del uso de enzimas para mejorar los nutrientes de los
animales debido a que se elimina menos nitrgeno en el
medio ambiente, en consecuencia se obtiene una reduc-
cin en el impacto ambiental por la produccin de pollos
de engorde.
Mussini y colaboradores (2011) observaron un incremento
lineal en el coeficiente de digestibilidad aparente de lisina,
metionina, treonina, triptfano, arginina, leucina e isoleuci-
na, cistena y valina con incremento de los niveles de BM
en la dieta de pollos de engorde de 0, 0.025, 0.050 y 0.1%.
Los PNAs pueden incrementar la excrecin endgena de
aminocidos (Angkanaporn et al., 1994) y la viscosidad de
la digesta ileal (Lee et al., 2003), aumentando el tiempo
de retencin, estimulando la secrecin endgena de ami-
nocidos e incrementando la produccin de mucina por
las clulas caliciformes presentes en el borde en cepillo
(Selle et al., 2009), comprometiendo su digestibilidad. As,
el mejoramiento de TIDc encontrado en el presente estu-
dio se explica por la disminucin de la viscosidad de la
digesta ileal y la cantidad de clulas caliciformes (Mehri et
al., 2010) debido al incremento de la hidrlisis de PNA con
la suplementacin de BM que permite un mejor contacto
entre la enzima y el sustrato facilitando la digestin de pro-
tenas y aminocidos.
En el presente estudio, el suplemento de BM redujo el peso
de la bolsa de Fabricio y el bazo. Resultados similares fue-
ron encontrados por Li y colaboradores (2010), cuando el
peso relativo del timo y bolsa de Fabricio disminuyeron a
las 6 semanas de edad de los pollos de engorde que reci-
bieron 1 y 2 g/kg de suplementacin enzimtica.
La adicin de BM redujo los valores de IgA, IgG y IgM en
suero de las aves. Cuando se encuentran en el lumen in-
testinal, los mananos son potentes estimuladores del siste-
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 ARTICULOS
ma inmune. La enzima BM disminuye
el contenido de mananos en el tracto
intestinal resultando en una menor
estimulacin del sistema inmune. El
presente estudio concuerda con Li y
colaboradores (2010), quienes encon-
traron una reduccin de los valores de
IgG y IgM en pollos de 3 semanas
de edad alimentados con 1 y 2 g/kg
de BM. Igualmente, el suplemento de
BM reduce la concentracin de hete-
rfilos y linfocitos en los animales de
35 das de edad (Mehri et al., 2010).
Cuando nosotros observamos las in-
teracciones, la enzima BM redujo exi-
tosamente la concentracin de inmu-
noglobulinas en el suero de las aves
alimentadas con diferentes planes
nutricionales, excepto las alimenta-
das con NL. Esto muestra que la ac-
cin de BM es efectiva solo cuando
los animales estn bajo estrs fisiol-
gico, en este caso, deficiencia nutri-
cional de sus dietas.
CONCLUSIONES
Este estudio muestra claramente que
las dietas formuladas por debajo de
la demanda nutricional pueden con-
ducir a prdidas en el perfomance, en
los niveles de Energa Metabolizable
Aparente corregida por balance de
nitrgeno (AMEn), y en el coeficiente
de digestibilidad ileal verdadera (TIDc)
de aminocidos. Esta es una ventaja
para el uso de la enzima -mananan-
sa en las dietas de pollos de engorde
debido a que incrementa la ganan-
cia de peso y mejora la conversin
alimenticia durante todo el periodo
evaluado. Ms aun, se observ el in-
cremento de la Energa Metabolizable
Aparente corregida por balance de
nitrgeno (AMEn), del coeficiente de
digestibilidad ileal verdadera (TIDc) de
aminocidos y la atenuacin del siste-
ma inmune. Por lo tanto, la suplemen-
tacin con una enzima -mananasa
es una herramienta importante en la
formulacin de dietas para mejorar el
desempeo productivo de pollos de
engorde.
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125.indd 64
LITERATURA CITADA
Angkanaporn, K., M. Choct, W. L.
Bryden, E. F. Annison, and G. Anni-
son. 1994. Effects of wheat pentosans
on endogenous amino acid losses in
chickens. J. Sci. Food Agric. 66:399
404.
AOAC. 1990. Official Methods of
Analysis. 15th ed. Association of Offi-
cial Analytical Chemists, Arlington,
VA.
Cho, J. H., and I. H. Kim. 2013. Effects
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