PRACTICA N4: CRECIMIENTO MICROBIANO

I. INTRODUCCION
Los mtodos de cuantificacin de microorganismos permiten establecer la poblacin
total de microorganismos existente, tienen la ventaja de ser rpidos aunque no es
posible diferenciar a las clulas vivas de las muertas.
Recuento microscpico
Un volumen conocido de muestra es depositado en un portaobjetos especial para
cuenta (hematocitmetro o cmara de Neubauer) consisten de portaobjetos excavados
y cuadriculados que facilitan el recuento por unidad de superficie y de volumen.
Con la cuantificacin de microorganismos a travs del tiempo es posible el representar
grficamente el crecimiento microbiano. La curva presenta distintas fases:
Fase de latencia lag: perodo de adaptacin de un microorganismo a un nuevo medio
de cultivo.
Fase exponencial o logartmica: aumento regular de la poblacin que se duplica a
intervalos regulares de tiempo.
Fase estacionaria: cese del crecimiento por agotamiento de nutrientes, por
acumulacin de productos txicos, etc.
Fase de declinacin o muerte: el nmero de clulas que mueren es mayor que el nmero
de clulas que se dividen.

II. OBJETIVOS:
Determinar el crecimiento microbiano mediante conteo de clulas para obtener la curva
de crecimiento.
III. MATERIALES Y REACTIVOS
- 200 ml de Agua destilada
- Algodn
- 6 gr. Caldo nutritivo (Triptone soya broth - TSB)
- 2 Gradillas

- 3 pipetas de 5 ml
 - 16 pipetas Pasteur
- 1 probeta de 100 ml
- 1 Matraz Erlenmeyer de 125 ml
- Mecheros
- 16 Tubos con tapa

Equipos
- Balanza analtica
- Cmara de Neubauer
- Microscopio ptico
IV. PROCEDIMIENTO
Activacin de la cepa:
1. Pesar 6 gr del medio TSB y disolver en 200 ml de agua destilada tapar con tapn de
algodn y envolver para autoclavar.
2. Preparar materiales pipetas Pasteur, pipetas volumtricas, tubos de ensayo y
autoclavar junto con el medio nutritivo a 121C y 15 psi durante 15 minutos.
3. Trabajar en ambiente estril con ayuda de mecheros y dispensar el medio estril del
matraz en los 16 tubos de ensayo estriles (9 ml de medio en cada tubo), los cuales
se reservan hasta el da siguiente para la inoculacin y conteo, mientras que el medio
restante del matraz se utilizara para la activacin.
4. En ambiente estril con ayuda de mecheros y con asa de Kolle tomar una asada del
microorganismo (cepa) obtenido de la prctica de aislamiento e inocular en el matraz
con el medio restante de TSB, incubar a 35 C durante 15 horas, observar que haya
crecimiento.
Inoculacin de tubos para evaluar Crecimiento - conteo de clulas:
5. Tomar 1 ml del cultivo del matraz e inocular en cada uno de los 16 tubos con caldo
nutritivo (TSB), luego llevar a incubar a 35C solo 15 tubos inoculados quedando un
tubo para realizar el conteo celular en este tiempo (t0) siendo la concentracin inicial
o densidad en el tiempo cero que dara inicio la sesin de conteo.
6. Realizar el conteo de cada tubo cada 0.5 horas, de acuerdo a la tabla 1, contando
clulas siguiendo el procedimiento que se explica a continuacin.
TABLA 1: Horario de inoculacin de los microorganismos a tubos con medio de cultivo y
muestreo para cuantificar microorganismos

Hora MATRAZ Conteo

Inocular en matraz con
1:00 p.m.
medio nutritivo. Densidad
(da Incubar durante 15 - 24 celular
anterior) horas a 35C.
9:00 am. Tiempo 0 densidad 0
9:30 am. Tiempo 1 densidad 1
10:00 am. Tiempo 2 densidad 2
10:30 am. Tiempo 3 densidad 3
11:00 am. Tiempo 4 densidad 4
11:30 am. Tiempo 5 densidad 5
12:00 am. Tiempo 6 densidad 6
12:30 am. Tiempo 7 densidad 7
1:00 pm. Tiempo 8 Densidad 8
1:30 pm. Tiempo 9 Densidad 9
2:00 pm. Tiempo 10 Densidad 10
2:30 pm Tiempo 11 Densidad 11

Conteo de clulas
1. Tomar la cmara de Neubauer y colocar el cubreobjetos.
2. Bajo condiciones de asepsia y con ayuda de una pipeta Pasteur tomar una alcuota
de inculo de un tubo y colocar una gota de los cultivos en el rea hundida de la
cmara de Neubauer la cual se extender rpidamente (ver anexo). Evitar
escurrimientos.
3. Observar con los objetivos de 10X - 40X.
4. Contar las clulas en cuadros individuales. Para evitar el conteo de las mismas clulas
dos veces, omitir aquellas ubicados en las lneas de la parte superior e izquierda de
cada cuadro y contar los microorganismos ubicados en las lneas inferior y derecho
adyacentes: ejemplo
 5. Aplicar la siguiente frmula y calcular el nmero de microorganismos por
mililitro

V. RESULTADOS
Graficar la curva de crecimiento (nmero de clulas en funcin del tiempo) observar las
fases del crecimiento
VI. ANEXO: CAMARA DE NEUBAUER cuadriculas de conteo