MTODO COLORIMTRICO PARA LA DETERMINACIN DE LOS

COMPUESTOS ORTODIFENLICOS EN LOS ACEITES DE OLIVA

MTODO REVISADO: diciembre de 2007

Arturo Cert, Ana Romero y R. Cert

Instituto de la Grasa, (CSIC), Sevilla (Espaa)

1.- Material y aparatos

1.1.- Equipo para extraccin en fase slida (SPE)

1.2.- Cartuchos de diol (fase ligada) de 6 ml (0,5 g) (Waters o similar)
1.3.- Filtro de jeringa de acetato de celulosa; tamao del poro: 0,45 m (Alltech,
Scharlab o similar)
1.4.- Evaporador rotatorio bajo vaco
1.5.- Espectrofotmetro UV-visible a = 370 nm, provisto de cubetas de
absorcin de cuarzo con recorrido de 10 mm

2.- Disolventes y reactivos

2.1.- N-hexano para anlisis

2.2.- Mezcla de n-hexano y acetato de etilo 90:10 (v/v)
2.3.- Metanol para espectrometra UV
2.4.- Agua destilada o desionizada
2.5.- Molibdato sdico dihidratado para anlisis (Merck o similar)
2.6.- Pirocatecol (catecol) ( 99%) (Aldrich o similar)
2.7.- Solucin de metanol y agua 1:1 (v/v)
2.8.- Solucin A de metanol y agua 1:1 acidificada con cido clorhdrico y
preparada mediante la adicin de 0,5 ml de 6N HCl a 100 ml de solucin
de metanol y agua 1:1 (2.7)
2.9.- Solucin de molibdato sdico dihidratado al 5% en metanol y agua 1:1
(2.7)

3.- Lnea de calibrado

Obtener una lnea de calibrado (concentracin, expresada en mmol/ml, en

relacin con la absorbancia) mediante la medicin de las soluciones de pirocatecol en la
solucin A (2.8). Preparar las soluciones de pirocatecol dentro del intervalo de 0,02 a
0,07 mg/ml. Preparar estas soluciones en el momento y protegerlas de la luz. Con ayuda
de una pipeta, tomar 2 ml de solucin fenlica y verterlos en una probeta. A
continuacin, aadir 0,5 ml de solucin de molibdato sdico (2.9) y agitar la mezcla.
Medir la absorbancia a = 370 nm. Corregir la absorbancia de la solucin fenlica
mediante la absorbancia de un blanco obtenido mezclando 2 ml de solucin fenlica y
0,5 ml de mezcla de metanol y agua 1:1 (2.7).

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 Con las soluciones de catecol, hidroxitirosol y acetato de hidroxitirosol se
obtuvo la siguiente ecuacin para el intervalo de absorbancia de entre 0,2 y 0,8:

Concentracin de o-difenoles (mmol/ml) = (-0,170 + 8,236 * ABS) * 10-4

siendo ABS = absorbancia de la solucin fenlica absorbancia del blanco.

4.- Aislamiento del extracto fenlico

Disolver una muestra de aceite de oliva (6 0,001 g) en 6 ml de hexano (2.1).

Colocar un cartucho de diol con fase ligada de 6 ml (1.2) en un aparato de
elucin en vaco y acondicionarlo pasando 9 ml de metanol (2.3) y luego 9 ml de
hexano (2.1). A continuacin, liberar el vaco par evitar que se seque la columna.
Inyectar la solucin de aceite en la columna para su paso por el cartucho. Lavar
el recipiente de la muestra con dos dosis de 4 ml de hexano extrados del cartucho.
Volver a lavar el recipiente de la muestra con 3 ml de la mezcla de hexano y acetato de
etilo (90:10, v/v) (2.2) extrados del cartucho y desechados. A continuacin, colocar un
matraz cnico de 25 ml y eluir la columna con 15 ml de metanol (2.3). Evaporar el
disolvente en un evaporador rotatorio a temperatura ambiente bajo vaco hasta secarlo.
Disolver el residuo en 5 ml de solucin A acidificada (2.8).

5.- Determinacin espectrofotomtrica

Con ayuda de una pipeta provista de un filtro de jeringa de acetato de celulosa,

tomar 2 ml del extracto fenlico y verterlos en una probeta. A continuacin, aadir
0,5 ml de solucin de molibdato sdico (2.9) y agitar la mezcla. Medir la absorbancia a
= 370 nm. Corregir la absorbancia de la solucin fenlica mediante la absorbancia de
un blanco obtenido mezclando 2 ml del extracto fenlico y 0,5 ml de mezcla de metanol
y agua 1:1 (2.7).

Si la absorbancia de la solucin fenlica es superior a 0,8, ha de obtenerse y

disolverse un nuevo extracto fenlico en 10 ml de solucin A (2.8) en lugar de 5 ml.
Una alternativa puede ser la extraccin a partir de 3 g de aceite.

Si la absorbancia de la solucin fenlica es inferior a 0,2, se han de mezclar los

extractos fenlicos de dos o ms cartuchos y disolverlos en 5 ml de solucin A (2.8).
Utilizando un solo cartucho, la concentracin mnima determinada es de 0,15 mmol/kg
de aceite.

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5.- Clculos

La concentracin de o-difenoles en los aceites, expresada en milimoles/kg, se

calcula como sigue:

[C] en aceite (mmol/kg) = (Cextr * 2,5 * Vextr * 1.000) / 2 * Waceite

siendo:
Cextr (mmol/ml) = concentracin en el extracto calculada aplicando la
absorbancia a la lnea de calibrado;
2,5 = volumen (ml) de la mezcla de reaccin;
Vextr = volumen total (ml) de la solucin de extraccin (normalmente, 5 ml);
2 = volumen (ml) de la solucin de extraccin para la reaccin;
Waceite = peso (g) de la muestra de aceite.

Los resultados han de expresarse en milimoles de o-difenoles por kg de aceite.

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