Diagnstico Molecular

Tecnologa Mdica
Universidad Santo Toms, Iquique.

EXTRACCIN DE ADN A TRAVS DE CHELEX

Ignacio Candia Ramos

Docentes: Pablo Herrera

Ivania Cortes
Estefania Cifuentes
 I. Que es Chelex?

La resina Chelex 100 y la resina Chelex 20 son copolmeros de estireno divinilbenceno que
contienen iones de iminodiacetato emparejados que actan como grupos quelantes en la
unin de iones de metal polivalente. La resina quelante Chelex se clasifica con las resinas
de intercambio catinico dbilmente cidas en virtud de sus grupos cido carboxlico, pero
difiere de los intercambiadores ordinarios debido a su alta selectividad para los iones
metlicos y su fuerza de unin mucho ms alta. La resina quelante Chelex se regenera
eficientemente en cido diluido y funciona en soluciones bsicas, neutras y dbilmente
cidas de pH 4 o superior. A un pH muy bajo, la resina acta como un intercambiador de
aniones.
Caractersticas:

Tiene una selectividad ms fuerte para los iones de cobre, hierro y otros metales
pesados sobre los cationes monovalentes como el sodio y el potasio.

La selectividad para los cationes metlicos corresponde al cido iminodiactico.

La selectividad para iones divalentes sobre monovalentes es aproximadamente de

5,000 a 1.

Tiene una gran atraccin para los metales de transicin, incluso en soluciones
salinas ligeramente concentradas.

II. Fundamento de la Extraccin de ADN utilizando la resina CHELEX

El uso de Chelex se convirti en un proceso de extraccin comn debido a su simplicidad y

costo. Chelex es una suspensin, en agua, de pequeas partculas compuestas de
copolmeros de estireno-divinilbenceno que contienen iones de iminodiacetato apareados.
Las cuentas de Chelex no se unen al ADN, sino a los iones metlicos polivalentes (como
Mg+2, Ca+2 y Fe+2). La eliminacin de Mg+2 inhibe la actividad de muchas enzimas
biolgicas, incluidas las nucleasas. La eliminacin de Ca+2 es beneficiosa cuando se desea
aislar ADN de huesos, dientes o cscaras de huevo y la eliminacin de Fe+2 es til si el
material biolgico es sangre.

En la extraccin por Chelex, el material celular se hierve con cuentas de Chelex, un

procedimiento que rompe las clulas y libera el ADN. Chelex (suspensin de resina de
intercambio inico) protege el ADN interfiriendo con el enlace a iones de magnesio, que las
enzimas que destruyen el ADN necesitan para funcionar. Despus de hervir, la muestra se
centrifuga. El Chelex y todos los componentes celulares, excepto el ADN, forman un gran
botn en el fondo del tubo. El sobrenadante, que contiene el ADN extrado, se transfiere a
un nuevo tubo. El ADN extrado generalmente se almacena congelado a -20C o -80C
hasta que se use. La ebullicin necesaria para la extraccin de Chelex hace que las hebras
de ADN se separen, produciendo ADN monocatenario como resultado del proceso de
extraccin y, por lo tanto, solo es til para procedimientos de prueba basados en PCR. Sin
embargo, esto no es un problema. Los mtodos actualmente empleados de anlisis de ADN
usan hebras de ADN separadas.

Sin embargo, Chelex en s mismo inhibe la PCR, principalmente por la alteracin de la

concentracin ptima de iones de magnesio. Por lo tanto, para evitar la transferencia de
resina con la muestra, Chelex debe reciclarse completamente antes de eliminar el ADN
extrado.

El mtodo Chelex de extraccin de ADN es ms rpido que el mtodo de extraccin

orgnica. Adems, la extraccin de Chelex implica menos pasos y, por lo tanto, menos
oportunidades de contaminacin de muestra a muestra.

III. Desarrollo y fases del mtodo

El procedimiento real es simple, ya que el material a analizar, se agrega a una suspensin

de CHELEX en agua a una concentracin final de Chelex de 5-10%. La suspensin se
incuba entre 50C y 60C en presencia de proteinasa K y DTT si es necesario, durante 30
minutos o ms. La agitacin en un vortex puede ayudar a la ruptura fsica del material que
se examina. La suspensin luego se calienta a 100C (en un bao de agua hirviendo, por
ejemplo) durante 8 minutos; este proceso de ebullicin desnaturaliza las protenas restantes
e inactiva la proteinasa K. El ADN permanece en solucin todo el tiempo, pero el acto de
hervir tambin desnatura el ADN hacindolo monocatenario. El tubo se retira del calor y se
centrifuga durante 3 minutos para sedimentar el Chelex (y con ello los iones) dejando el
ADN puro en el sobrenadante, el cual se agrega a un tubo nuevo y estril.

Las clulas se centrifugan primero para formar un sedimento antes de aadir Chelex. Las
clulas se lisan luego a travs de la incubacin a alta temperatura y agitacin. Las
molculas polivalentes se unen a las cuentas de Chelex mientras que el ADN queda
circulando libremente. La solucin se centrifuga para sedimentar las cuentas de Chelex, y
con ellas los contaminantes, mientras que el ADN que contiene el sobrenadante se traspasa
a un nuevo tubo.
Figura 1. Proceso de extraccin Chelex.
Figura 2. Esquema comparativo entre las diversas tecnicas de extraccion de ADN.
IV. Aplicaciones del mtodo Chelex

Anlisis de metales traza en aguas naturales, reactivos, bioqumicos y fluidos fisiolgicos.

Eliminacin de trazas de metales de reactivos, bioqumicos, fluidos fisiolgicos, medios de

cultivo, suelos y sistemas enzimticos.

Recuperacin de metales de las corrientes de proceso.

Cromatografa de metales estrechamente relacionados.

Otras aplicaciones documentadas para Chelex son: Eliminacin de metales desde una
suspensin celular, Preparacin de apoenzima libre de metales, Eliminacin de trazas de
metales de soluciones de tampn y agua de mar, Eliminacin de hierro de las bacterias,
Purificacin de dinucletidos, Eliminacin de calcio de proteinquinasas y Extraccin de ADN
para PCR, entre muchas otras.

En la prctica se ha observado que Chelex presenta ventajas por sobre el mtodo de

extraccin fenol-cloroformo y por proteinasa K. El tratamiento por ebullicin es til para
liberar ADN de un nmero bajo de clulas, y que Chelex protege el ADN de los efectos de la
ebullicin. Tambin se ha encontrado que, a diferencia de otras clulas, los
espermatozoides no liberan el ADN del tratamiento de ebullicin por si solo; se requiere un
pretratamiento con proteinasa K y tratamiento con DTT. Por lo tanto, depender del tipo de
muestra o tejido, si se acompaa a Chelex por otro tipo de mtodo extractivo. Chelex puede
quelar una gran cantidad de iones divalentes que pueden ser donados por la muestra, y las
cuentas de Chelex se pueden eliminar fcilmente para que no interfieran con las
amplificaciones de PCR posteriores que requieren Mg+2.
BIBLIOGRAFA

Butler, J. M. (2005). Forensic DNA typing: biology, technology, and genetics of STR markers.
Academic Press. 42-43 pp.

Kobilinsky, L. F., Levine, L., & Margolis-Nunno, H. (2007). Forensic DNA analysis. Infobase
Publishing. 35 pp.

Linacre, A., & Tobe, S. (2013). Wildlife DNA analysis: applications in forensic science. John Wiley &
Sons.

Nobel, A. (2000). Chelex 100 and Chelex 20 Chelating Ion Exchange Resin Instruction Manual. Bio-
Rad Laboratories.

Rolfs, A., Weber-Rolfs, I., & Finckh, U. (Eds.). (1994). Methods in DNA amplification. Plenum Press.

Walsh, P. S., Metzger, D. A., & Higushi, R. (2013). Chelex 100 as a medium for simple extraction of
DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques 10 (4): 506-13 (April 1991).
Biotechniques, 54(3), 134.