Cuantificacin de Protenas

Para Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina
bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena concreta, cuando se quiere
conocer la actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico de
enfermedades, as como para otros muchos propsitos.

Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos

se basan en:

a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV,

b) para la formacin de derivados qumicos, o

c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes.

Ley de Lambert - Beer

La ley explica que hay una relacin exponencial entre la transmisin de luz a travs de una
sustancia y la concentracin de la sustancia, as como tambin entre la transmisin y la
longitud del cuerpo que la luz atraviesa.

Si conocemos l y A, la concentracin de la sustancia puede ser deducida a partir de la

cantidad de luz transmitida.

A = cl

Donde:

A = absorbencia

= Coeficiente de extincin molar.

l = longitud de la celda.

COEFICIENTE DE EXTINCIN MOLAR

Es una medida de la cantidad de luz absorbida por unidad de concentracin.

Un compuesto con un alto valor de coeficiente de extincin molar es muy eficiente en la

absorcin de luz de la longitud de onda adecuada y, por lo tanto, puede detectarse por
medidas de absorcin cuando se encuentra en disolucin a concentraciones muy BAJAS.

Mtodos para determinar protenas

Intervalo del UV
 Todas la protenas pueden ser detectadas, sin embargo solo ciertos residuos de aminocidos son
los que se leen en la regin del UV.

Por reacciones colorimtricas:

Enlaces peptdicos o ciertos aminocidos reaccionan y los productos coloridos son los que se
cuantifican

PROTENAS y la absorcin en la regin UV

Las bandas de absorcin ms significativas se encuentra en el ultravioleta cercano, en el

intervalo de longitud de onda entre 230 y 300 nm.

Concretamente absorben en este rango las cadenas laterales de los aminocidos

aromticos, la histidina y la cistina.

La cistina presenta una banda centrada a 250 nm, n-->s* (max ~ 300 M-1.cm-1), pero
apenas se puede considerar, ya que es muy dbil y el porcentaje relativo de puentes
disulfuro es muy pequeo en una protena.

Los aromticos absorben de 260-290 nm. La fenilalanina. Es el menos importante

cuantitativamente, aunque muestra un espectro complejo con mltiples bandas
diferenciadas en torno a 250-260 nm. Presenta tambin bandas de mayor energa que
solapan con el espectro del enlace peptdico en 215 y 180 nm. Sin embargo como no
absorbe por encima de 280 nm su contribucin al espectro en la zona del ultravioleta
cercano de protenas suele ser pequea.

La tirosina presenta un mximo a 275 nm con un hombro a 285 nm. La banda se desplaza
a mayores longitudes de onda cuando se produce la desprotonacin del OH del anillo
aromtico.

El triptfano agrupa al menos tres bandas diferentes.bajo el espectro centrado a 280 nm.
Tambin presenta bandas en la zona del UV lejano.

BIURET

Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los

enlaces peptdicos en medio bsico.

1Cu2+ se acompleja con 4 NH.

La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas

(enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias
interfieren.

La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de

protenas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).
Reaccin de Biuret

La reaccin debe su nombre al biuret, una molcula formada a partir de dos de urea (H2N-
CO-NH-CO-NH2), que es la ms sencilla que da positiva esta reaccin, comn a todos los
compuestos que tengan dos o ms enlaces peptdicos consecutivos en sus molculas.

LOWRY

ESTE PROCEDIMIENTO INVOLUCRA LA FORMACIN DE UN COMPEJO COBRE - PROTENA

EN SOLUCIN ALCALINA.

ESTE COMPLEJO REDUCE AL REACTIVO FOSFOMOLIBDICO- FOSFOTUNGSTATO LO QUE

PRODUCE UNA INTENSA COLORACIN AZUL.

Este mtodo consta de dos etapas:

Primera reaccin Biuret. Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas
formando complejos con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos
complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro. Adems, provocan el desdoblamiento
de la estructura tridimensional de la protena, exponindose los residuos de tirosina que
van a participar en la segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin
alcalina en forma de su complejo con tartrato.

Segunda reaccin reactivo de Folin- Ciocalteau. La reduccin, tambin en medio bsico,

del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos fenlicos de los residuos de tirosina
presentes en la mayora de las protenas, actuando el cobre como catalizador.

El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido

fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenlicos da
lugar a un complejo de color azul intenso.

BRADFORD

Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin Serva

Blue) a las protenas.

El colorante, en solucin cida, existe en dos formas una azul y otra

naranja.

Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-

colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre.

Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y pocas

sustancias interfieren en su determinacin.

Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones
bsicas.