UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE TECMAC

DIVISIN DE BIOTECNOLOGA

ELABORO:

M. EN D. JESS ALARCN BONILLA

Q.B.P. BEATRIZ ORTEGA ESCAMILLA
I.B.Q. MNICA ARACELI CAMACHO GONZLEZ

NDICE

PRACTICA No. 1 HIDRLISIS CIDA Y ENZIMTICA DEL ALMIDN 2

PRACTICA No. 2 CINTICA ENZIMTICA 4

PRACTICA No. 3 DETERMINACIN DE Vmax Y Km Y EVALUACION DEL TIPO DE INHIBICIN 8

PRACTICA No. 4 PRODUCCIN DE AMILASAS Y CELULASAS MICROBIANAS 13

PRACTICA No. 5 OBTENCIN DE AMILASAS VEGETALES 15

PRACTICA No. 6 OBTENCIN DE LACTATO DESHIDROGENASA Y SUS COFACTORES A

PARTIR DE TEJIDO ANIMAL 17

PRACTICA NO. 7 INMOVILIZACIN DE UNA PROTEASA VEGETAL EN RESINAS DE

INTERCAMBIO IONICO Y DE ADSORCIN 20

MAY-SEP 2012
 PRCTICA No. 1

HIDRLISIS CIDA Y ENZIMTICA

DEL ALMIDN

INTRODUCCIN

OBJETIVO (S)

Recordar los conceptos de hidrlisis

Identificar la estructura del almidn

Reconocer por reacciones de identificacin, los compuestos resultantes de la hidrlisis

cida y enzimtica del almidn.

MARCO TERICO. Fundamento de reacciones

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO

Solucin del enzima: Se prepara colectando 1 ml de saliva (previo enjuague de la
boca con agua destilada) y diluyndolo hasta 10 ml con agua destilada
50 ml Solucin de almidn al 2%
1 frasco HCl concentrado
1 frasco Lugol
50 ml Solucin de glucosa al 2%
50 ml Solucin de maltosa al 2%
1 frasco Reactivo de Benedict o Reactivo de Fehling
1 pza Vaso de precipitados de 50 ml
3 pza Vidrios de reloj
1 pza Parrilla elctrica (o mechero/tripie/malla de asbesto)
1 pza Bao mara a 37C
1 pza Agitador de vidrio
6 pza Pipetas Pasteur
6 pza Pipetas de vidrio de 1 ml
2 pza Pipetas de vidrio de 5 ml
2 pza Pipeta de vidrio de 10 ml
1 pza Termmetro

METODOLOGA

Hidrlisis cida
1. Agregar 20 ml de almidn al 2% en un vaso de precipitados.
2. Agregar 1 ml de HCl concentrado.
3. Agitar con una varilla de vidrio y llevar a un bao de Maria hirviendo, el vaso de
precipitados debe permanecer en el bao durante cada determinacin.

2
 4. Anotar el tiempo de inicio de la hidrlisis,
5. Cada 5 minutos hacer una reaccin con lugol en una placa de porcelana (vidrio de reloj en
fondo blanco).
6. Hacer la reaccin hasta que ya no haya cambio de coloracin (la reaccin da el mismo
color del lugol). Anotar el tiempo de la hidrlisis.
7. Tomar 0,5 ml de este hidrolizado y colocarlo en un tubo de ensaye rotulado como (cida)

Hidrlisis Enzimtica
1. En un tubo de ensayo 16x100 medir 4 ml de almidn al 2%
2. Colocar dicho tubo en un bao mara a 37C por 5 minutos.
3. Agregar 2 ml de la solucin de la enzima.
4. Agitar la mezcla por golpeteo y anotar el tiempo de inicio de la hidrlisis
5. Cada 5 minutos hacer la reaccin con lugol hasta completar 15 minutos.
6. A los 15 minutos sin sacar el tubo de ensayo del bao mara tomar 0,5 ml del hidrolizado
y colocarlo en un tubo de ensaye etiquetado como (15).
7. Continuar haciendo la reaccin con Lugol cada 5 minutos hasta los 30 minutos.
8. Completados los 30 minutos, retirar el tubo del bao mara y tomar 0,5 ml de este
hidrolizado y colocarlo en un tubo de ensaye etiquetado como (30).
9. Previamente preparar tubos de ensaye con 0,5 ml de las siguientes soluciones:
Sol. Almidn al 2 % ----------------------- 0,5 ml
Glucosa al 2% ------------------------------ 0,5 ml
Maltosa al 2% ------------------------------- 0,5 ml

10. Para conocer el grado de hidrlisis, realizar la reaccin de Benedict, adicionando a cada
tubo, incluidos los hidrolizados cido y enzimtico (15y 30); 2,5 ml del Reactivo de
Benedict. En caso de realizar la reaccin de Fehling adicionar a cada tubo
respectivamente, 1 ml de la solucin de Fehling A y 1 ml de la solucin de Fehling B.
11. Colocar todos los tubos al mismo tiempo en un bao mara de agua hirviendo por 5
minutos, retirar los tubos y observar.

RESULTADOS Y ANLISIS

1. Registrar en el siguiente cuadro el resultado de la reaccin de hidrlisis

Reactivo Reaccin de Benedict Grado de hidrlisis

(+/)
Almidn al 2%
Glucosa al 2%
Maltosa al 2%
Hidrolizado cido
Hidrolizado enzimtico (15)
Hidrolizado enzimtico (30)

CUESTIONARIO

1. Describir los tipos de especificidad que presentan las enzimas

2. En base a la utilizacin o no de un cofactor en la forma activa de la enzima, Cmo se
clasifican las enzimas?
3. Cuntos tipos de cofactores existen?
4. Cul es la funcin de las coenzimas?
5. Cul es la enzima empleada en la prctica? Escriba su nombre comn, su nombre
sistemtico y su nmero de clasificacin internacional (cuatro digitos)

CONCLUSIONES Y REFERENCIAS
3
 PRCTICA No. 2

CINTICA ENZIMTICA

INTRODUCCION.

OBJETIVO (S)

Evaluar el efecto del pH y la temperatura sobre la transformacin de un sustrato en una

reaccin mediada por una enzima.

Evaluar el efecto del a concentracin de la enzima y de la concentracin del sustrato sobre

la velocidad de reaccin mediada por una enzima.

MARCO TERICO

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.

20 ml Solucin del enzima: Se prepara colectando 1 ml de saliva (previo enjuague

de la boca con agua destilada) y diluyndolo hasta 20 ml con agua destilada.
20 ml Disolucin de almidn al 0,5 %.
100 ml Solucin de Lugol
20 ml Disoluciones tampn de pH 5.0; 6.8 y 8.0.
12 pza Tubos de ensayo,
1 pza placa de porcelana con excavaduras. (vidrio de reloj fondo blanco)
3 pza vasos de precipitados de 50 ml
2 pza Bao mara a 40 y 50 C o baos termostatado,
1 pza Cronmetro.
5 pza goteros
2 pza Pipetas de 2 ml
1pza Termmetro

METODOLOGA
Estudio de la influencia de la [E].

1. Tome 4 tubos de ensayo y aada a cada uno 2 ml de disolucin de almidn al 0,5 %.

2. Aada a cada tubo 0.1; 0.2; 0.3 y 0.4 ml de disolucin del enzima respectivamente, y
complete hasta un volumen de 0,5 ml con agua. Aada primero el agua y luego la
disolucin del enzima, pues de lo contrario la reaccin comenzar a verificarse y usted no
tendr en cuenta el tiempo transcurrido. Inmediatamente despus de adicionar la solucin
del enzima al ltimo tubo ponga en marcha el cronmetro y comience a medir el tiempo
del experimento.
4
 3. En cada intervalo de 1 minuto ensaye en la placa con excavadura la reaccin de la
solucin experimental con el Lugol: para ello slo tiene que extraer con el gotero pequeas
cantidades de cada tubo de ensayo en reaccin a una excavadura de la placa y luego
adicionar una gota del reactivo de Lugol. Observe y anote el color para cada tiempo y cada
tubo ensayados. En cada toma de muestra con el gotero, enjuague el mismo en agua
destilada contenida en un vaso de precipitados.
4. Determine por el procedimiento anterior el tiempo que tarda cada uno de los tubos en no
dar reaccin alguna con el reactivo de Lugol, la mezcla de las dos gotas debe quedarse
del color original del Lugol. Si desea puede adicionar en una excavadura unas gotas de
agua y Lugol para tenerlo como solucin de control.
5. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla:

TUBO 1 2 3 4
Volumen de la enzima (ml)
Tiempo total de reaccin (min)
Velocidad de reaccin (1/min)

6. Con estos datos construya un grfico de [E] en el eje ordenado contra velocidad de
reaccin (1/t) en el eje de abscisas.

Estudio de la influencia del pH.

1. En 3 tubos de ensayo vierta respectivamente 2 ml de las soluciones tampones de pH 5.0;

6.8 y 8.0.
2. Aada a cada tubo 2 ml de la solucin del almidn al 0,5% y 2 ml de la solucin del
enzima. Incube a 40C y ensaye la reaccin con el Lugol segn se indica en el trabajo
experimental del estudio de la influencia de la [E].
3. Con los datos obtenidos extraiga las conclusiones sobre el rango de pH en el cual el
enzima muestra su actividad ptima.

Estudio de la influencia de [S].

1. Tome 4 tubos de ensayo y aada a cada uno 0.5; 1.0; 1.5 y 2.0 ml de solucin de almidn.
Complete el volumen de cada tubo hasta 2,0 ml con agua destilada.
2. Adicione a cada tubo 0,5 ml de disolucin del enzima Alfa amilasa e incbelos a 40 C.
3. A intervalos de 1 minuto ensaye la presencia de almidn mediante la reaccin con Lugol
de forma similar a como se describe en el trabajo experimental del estudio de la influencia
de la [E].
4. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla:
5. Con los datos de la tabla construya un grfico de velocidad de reaccin (volumen / tiempo)
en el eje ordenado contra volumen de sustrato en el eje de abscisas (que representa
concentracin de sustrato creciente en nuestro experimento).

TUBO 1 2 3 4
Volumen de sustrato (ml)
Tiempo total de reaccin (min)
Velocidad de reaccin (volumen/min)

5
Estudio de la influencia de la temperatura.

1. En 5 tubos de ensayo aada 5 ml de disolucin de almidn al 0,5% y 1 ml de solucin de

enzima.
2. Ponga a hervir uno de los tubos durante 5 min y reponga el volumen de agua perdida por
evaporacin. Incbelo a 40 C y ensaye de la forma estudiada la presencia de almidn en
l a diferentes intervalos de tiempo.
3. Incube un segundo tubo a 40 C y un tercero a 50 C, y ensaye en ellos la reaccin con
Lugol a intervalos de 1 minuto. Anote el tiempo que se demora en desaparecer la
coloracin azul.
4. Un cuarto tubo incbelo en un bao de hielo y ensaye tambin la reaccin con Lugol.
5. El ltimo tubo djelo a temperatura ambiente del laboratorio y ensaye con el Lugol hasta la
desaparicin de la reaccin positiva en intervalos de 1 minuto.
6. Con los datos obtenidos en el ensayo complete la siguiente tabla, y extraiga sus
conclusiones:

Color observado a diferentes tiempos (min)

TUBOS 5 10 15 20 25 30
1
2
3
4
5

RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS

1. Describa qu caractersticas estructurales del almidn permiten su identificacin mediante

las disoluciones de yodo, y el efecto de la amilasa salival sobre los enlaces del almidn.
2. Anexe la tabla y el grfico de velocidad de reaccin contra [E], tomando como
concentracin del enzima el volumen de la solucin utilizado en cada tubo. Por qu se
puede tomar como velocidad de reaccin el inverso del tiempo?
3. Plantee las conclusiones a que puede arribar de los resultados de ste experimento.
4. Describa lo observado al realizar el estudio de la influencia del pH en la velocidad de
reaccin del enzima alfa-Amilasa. A qu conclusin llega acerca del pH ptimo de este
enzima?
5. Qu efecto tendra la utilizacin del medio con pH muy cido o muy bsico en la
realizacin de este ensayo?
6. Anexe la tabla y el grfico elaborados segn las indicaciones del trabajo prctico, tomando
como valor de [S] el del volumen del mismo medido en cada tubo. Por qu en este caso
para calcular la velocidad de la reaccin es necesario dividir el volumen de sustrato entre
el tiempo?
7. Analice el grfico y plantee las conclusiones a que puede llegaren este caso.
8. Anexe la tabla resumen de los resultados del experimento del efecto de la temperatura
segn las indicaciones del trabajo prctico.
9. Explique qu le sucede al enzima del tubo que se hierve antes de incubarlo a 40 C
10. Plantee las conclusiones a que pudo arribar en este ensayo. Por qu no se debe emplear
el trmino de temperatura ptima?

6
CUESTIONARIO:

1. Cules son las caractersticas estructurales del almidn?

2. Qu tipo de enzima es la alfa-Amilasa salival?
3. Cules son los productos que origina la accin de este enzima sobre el almidn?
4. Explique cmo influyen en la velocidad de las reacciones enzimticas una variacin en la
concentracin del enzima presente, en la concentracin del sustrato, el pH y la
temperatura.

CONCLUSIONES

REFERENCIAS

7
 PRCTICA No. 3

DETERMINACION DE Vmax Y Km Y
EVALUACION DEL TIPO DE
INHIBICION

INTRODUCCIN.

OBJETIVO: El alumno realizar los clculos necesarios para la determinacin del tipo de
inhibicin, Vmax y Km de diferentes series de datos, en base a la cintica
enzimtica obtenida.

MARCO TERICO.
Ecuacin qumica de la reaccin catalizada de cada ejemplo. Tipo de enzima que cataliza
la reaccin y va biosinttica que incluye a cada reaccin.

MATERIALES Y EQUIPO.

Computadora (Excel)
Listas de datos de velocidades y concentraciones de sustratos.

METODOLOGA

1. Entrar al programa Excel en la PC

2. Introducir los datos y las frmulas necesarias para llevar a cabo los clculos
correspondientes.
3. Obtener las grficas necesarias.
4. Interpretar los datos obtenidos y determinar lo que se pide.

DATOS

Ejercicio 1: Utilizando los siguientes datos y haciendo uso del modelo de Lineweaver-Burk y el
modelo de Eadie-Hofstee, determina el valor de Vmx y la Km por cada mtodo y compara los
resultados.
VELOCIDAD [SUSTRATO]
TIEMPO
(moles/min) (mM)
1 18,8 3
2 23,6 11
3 29,8 18
4 30,5 19
5 35,5 21
6 40,5 35
7 45,5 41
8 50,5 45
9 55,5 68
10 60,5 78

8
Ejercicio 2: La sintetasa de citrato mitocondrial del cerebro de rata es inhibida por el fenil-piruvato.
La actividad de la enzima se midi a tres concentraciones diferentes de acetil-CoA en presencia
de cinco concetraciones diferentes de fenil-piruvato. Las velocidades iniciales de la reaccin se
expresan en nmoles de acetil-CoA incorporados/minmg de protena mitocondrial y aparecen
expuestos en la siguiente tabla:

Acetil-CoA
6,2 M 9,3 M 12,4 M

Fenil piruvato VELOCIDAD

(mM) (nmoles/minmg)
0,00 247,04 276,30 300,00
0,77 210,00 250,00 289,66
1,54 181,03 233,33 280,00
3,10 142,37 200,00 270,97
6,20 101,20 157,30 247,06

Determine:
a) Parmetros cinticos sin inhibidor
b) Tipo de inhibicin
c) El valor de Ki

Ejercicio 3: Cuando se produce un infarto al miocardio, un enzima es secretado al torrente

sanguneo. En el caso de una distrofia muscular una isoenzima que cataliza la misma reaccin, es
secretada al torrente sanguneo y se puede diferenciar fcilmente por tener un distinto valor de
Km, (Km de la isoenzima de msculo esqueltico = 2X105 M). Un ensayo en una muestra de
sangre de un paciente que leg al hospital inconsciente dio los resultados que se indican a
continuacin:

VELOCIDAD INICIAL

SUSTRATO ENZIMA DEL MIOCARDIO ENZIMA DEL PACIENTE

(M) (moles/mgmin) (moles/ml sueromin)
5,00 x 105 2,86 43
7,00 x 105 3,78 57
1,00 x 104 5,00 75
1,50 x 104 6,67 100
2,00 x 104 8,00 120
3,00 x 104 10,00 150

Determine:
a) Km de la enzima el miocardio
b) Km de la enzima del paciente
c) Se trata de un infarto al miocardio o de una distrofia
muscular?

9
Ejercicio 4: Los eritrocitos embrionarios contienen una enzima que cataliza la reaccin S P Los
eritrocitos adultos tambin poseen la actividad de dicha enzima para catalizar la reaccin S P.
Algunos datos cinticos se muestran en la tabla siguiente:

VELOCIDAD INICIAL
[S]
(moles/mgmin)
(M)
Eritrocito adulto Eritrocito embrionario
1,68 x 105 1,05 5,00
2,50 x 105 1,54 6,66
3,33 x 105 1,98 8,00
5,00 x 105 2,86 10,00
7,00 x 105 3,78 11,67
1,00 x 104 5,00 13,33
1,50 x 104 6,67 15,00
1,67 x 104 7,15 15,40
2,00 x 104 8,00 16,00

Determine:
a) Parmetros cinticos de la enzima en el eritrocito adulto
b) Parmetros cinticos de la enzima en el eritrocito embrionario
c) Qu conclusiones puede obtener referente a la identidad de
los dos enzimas?

Ejercicio 5: Se obtuvieron los datos experimentales de la velocidad de una reaccin enzimtica en

ausencia y en presencia de varios inhibidores (A, B, C y D), cuyos resultados se muestran en la
siguiente tabla:

[SUSTRATO] +A +B +C +D
CONTROL
(mM) (5 m) (20 m) (2 mM) (0,1 mM)
0,20 16,67 6,25 5,56 10,00 8,89
0,25 20,00 7,69 6,67 11,11 10,81
0,33 24,98 10,00 8,33 12,50 13,78
0,50 33,33 14,29 11,11 14,29 19,05
1,00 50,00 25,00 16,67 16,67 30,77
2,00 66,67 40,00 22,22 18,18 44,44
2,50 71,40 45,45 23,81 18,52 48,78
3,33 76,92 52,63 25,64 18,87 54,00
4,00 80,00 57,14 26,67 19,00 57,14
5,00 83,33 62,50 27,77 19,23 60,60

Determine:
a) La naturaleza de cada inhibidor (tipo de inhibicin)
b) El valor de Ki para cada inhibidor

10
Ejercicio 6: La mono-amino-oxidasa mitocondrial de hgado de rata es inhibida por uno de los
productos de la reaccin, el NH3. Para determinar el efecto del NH3 sobre la reaccin se realizaron
dos series de experiencias:
a) En una primera serie de experimentos se fij la concentracin de O 2 (0,23 mM) y
se trabaj variando la concentracin de benzilamina en presencia de
concentraciones fijas del inhibidor. Los resultados aparecen expuestos en la
siguiente tabla, donde las velocidades iniciales de la reaccin se expresan en
unidades arbitrarias:

VELOCIDAD INICIAL
BENZILAMINA NH3
(mM) (mM)
0,0 50,0 100,0 150,0 200,0
0,2 0,813 0,627 0,531 0,444 0,387
0,3 0,957 0,743 0,637 0,528 0,462
0,5 1,093 0,858 0,741 0,627 0,543
1,0 1,220 0,966 0,844 0,725 0,627
2,0 1,342 1,081 0,926 0,787 0,687

b) En una segunda serie de experiencias, se mantuvo constante la concentracin de

benzilamina (1,0 mM) y se vari la concentracin de O 2 en presencia de
concentraciones fijas del inhibidor. Los resultados aparecen expuestos en la
siguiente tabla, en la que las velocidades iniciales de la reaccin siguen
expresndose en unidades arbitrarias:

VELOCIDAD INICIAL
OXGENO NH3
(mM) (mM)
0,0 50,0 75,0 100,0 150,0
0,100 1,124 0,962 0,858 0,794 0,676
0,136 1,342 1,130 1,000 0,909 0,778
0,175 1,538 1,274 1,149 1,026 0,866
0,250 1,754 1,480 1,282 1,149 0,952
0,300 1,876 1,587 1,351 1,212 1,015

Determine:
a) El valor de los parmetros cinticos en ambos casos, incluida
la Ki del NH3.
b) Tipo de inhibicin ejercida por el NH3 sobre ambos sustratos

RESULTADOS Y DISCUSIN

CUESTIONARIO

1. Indique la importancia del estudio de la cintica enzimtica.

2. Cules son los parmetros cinticos que caracterizan el estudio de la cintica de una
enzima?
3. Qu tipo de tratamiento matemtico debe drsele a los datos obtenidos de una cintica
enzimtica para obtener los parmetros cinticos?

11
 4. Explique cmo durante el estudio de una cintica enzimtica, los parmetros cinticos se
ven alterados en presencia de:
a. Inhibidor competitivo
b. Inhibidor NO competitivo
c. Inhibidor Acompetitivo
5. Cul es el significado del nmero de recambio (turnover number)? Cmo se mide la
eficiencia cataltica?
6. Mencione 5 sustancias (frmacos) que acten como: inhibidores competitivos, no
competitivos y acompetitivos.

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFA

12
 PRCTICA No. 4

PRODUCCIN DE AMILASAS Y
CELULASAS POR
MICROORGANISMOS DEL SUELO

INTRODUCCIN.

OBJETIVO (S)

Analizar la actividad de enzimas producidas por los microorganismos del suelo

MARCO TERICO

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.

1 pza Placa con agar celolosa rojo congo
1 pza Placa con agar almidn
1 pza Hisopo estril o asa bacteriolgica
1 frasco Solucin de benzal 100 ml
1 pza esponja
1 pza Mechero o 2 lmparas de alcohol
1 pza Frasco con 90 mL de solucin salina estril
10 gr Muestra de de suelo.
1 balanza
1 Incubadora a 28 C
1 frasco Solucin de lugol
1 pza Pipeta pasteur

METODOLOGA.

A. Preparacin de la suspensin:
1. Pesar 10 g de muestra y realizar una dilucin en 90 mL de solucin salina estril
2. Homogenizar la suspensin y dejar sedimentar

B. Aislamiento de microorganismos amilolticos

1. Tomar la suspensin con un hispo estril y sembrar por estra masiva en la placa con agar
almidn
2. Incubar la placa a 28 C durante 48 a 72 hr.
3. Inundar con lugol las cajas y contar el nmero de colonias que presenten una zona clara de
hidrlisis a su alrededor .

C. Aislamiento de microorganismos celulolticos

1. Tomar la suspensin con un hispo estril y sembrar por estra masiva en la placa con agar
celulosa rojo congo.
2. Incubar la placa a 28 C durante 48 a 72 hr.
3. Contar el nmero de colonias que presenten una zona de hidrlisis a su alrededor.
13
RESULTADOS Y ANLISIS

Reporte en la siguiente tabla la presencia (+) o ausencia(-) de los grupos de

microorganismos que se detallan.

EQUIPO AMILOLTICOS CELULOLTICOS

1
2
3
4
5
6
7
8

Registrar la morfologa colonial de los microorganismos observados.

Comparar el nmero de organismos amilolticos y celulolticos obtenidos por cada equipo,

discuta sus resultados.

CUESTIONARIO

1. Escriba las reacciones enzimticas realizadas por cada uno de los grupos microbianos
aislados, indicando sustratos, enzimas y productos.
2. A que grupo de enzimas pertenecen las estudiadas en esta prctica?
3. Investigue la clasificacin de las enzimas de acuerdo con la E.C.
4. Mencione tres microorganismos productores de amilasa y 3 productores de celulasas
5. Explique las aplicaciones industriales o ambientales de las amilasas y las celulasas
6. Indique los sitios de corte de las alfa amilasas, beta amilasas, amiloglucosidasas y
pululanasas
7. Explique la forma de identificar las colonias productoras de amilasas por tincin con lugol,.

CONCLUSIONES

REFERENCIAS.

14
 PRCTICA No. 5

OBTENCIN DE AMILASAS DE
SEMILLAS DE GRAMNEAS

INTRODUCCION

OBJETIVO (S)

Aplicar los diferentes mtodos de extraccin para la obtencin de una enzima a partir de
una fuente vegetal.

MARCO TERICO

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO

10 gr Semillas de gramneas en germinacin

1 pza Mortero con pistilo
2 pza Vaso de precipitados.
1 pza Termostato.
1 frasco Solucin de Lugol
1 frasco Solucin de reactivo de Fehling o Tollens o Benedict
1 frasco Glicerina pura
1 frasco Solucin de almidn al 5%
1 pza Mechero.
5 pza Goteros
1 pza Embudo / Papel filtro
1 pza Termmetro
2 pza Pipetas de 2 y 5 ml
5 pza Tubos de ensaye
1 pza Placa de porcelana con excavaduras
1 pza Bao mara a 45 C
1 pza Gradilla

METODOLOGA

1. Prepare 30 ml de un macerado acuoso con 10 g de semillas de gramneas germinadas

teniendo en cuenta que el agua debe estar caliente (50 C). Aada 5 gotas de glicerina
para extraer lo ms posible los enzimas.
2. Deje reposar de 15 - 20 minutos de 30 - 45 C y filtre el extracto.

15
 3. En un tubo de ensayo, introduzca 5 ml de disolucin de almidn y de 1 - 2 ml del extracto.
A intervalos de 5 minutos, comprobar la degradacin del almidn por las amilasas
ensayando una muestra del sistema de reaccin en una placa con excavaduras con el
reactivo de Lugol. Para reconocer la presencia de azcares reductores (maltosa y
glucosa), realizar la reaccin con los reactivos de Fehling, Tollens o Benedict de una
muestra de 1 - 2 ml del sistema de reaccin.

RESULTADOS Y ANLISIS

1. Represente a travs de una ecuacin la accin hidroltica de las amilasas del almidn
(amilosa).
Nota : Utilice las estructuras qumicas.

1. Clasifique las amilasas de acuerdo con el Sistema Internacional.

2. Qu objetivo persigue realizar la reaccin con el reactivo de Lugol cada cierto
intervalo de tiempo?
3. Qu objetivo persigue realizar al final del experimento la reaccin con el reactivo de
Fehling? Represente la ecuacin.

CONCLUSIONES

REFERENCIAS

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 PRCTICA No. 6

OBTENCIN DE LACTATO
DESHIDROGENASA Y SUS
COFACTORES A PARTIR DE TEJIDOS
ANIMALES

INTRODUCCIN

OBJETIVO (S)

Obtener una enzima oxidorreductasa a partir de fuentes animales y observar su actividad.

MARCO TERICO

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

1 Rata de laboratorio o conejo pequeo

1 frasco Solucin de Cloruro de sodio al 0.9 %
1 frasco Solucin de Cianuro de potasio al 0.5% y al 0.01%
1 frasco Solucin de Lactato de sodio al 1%
1 frasco Solucin deAzul de metileno 0.002M
1 frasco Solucin de Fosfato dibsico de sodio 0.06M
1 frasco Cloroformo
1 frasco Nujol
5g Arena lavada
5 pza Tubos de ensaye de 18 x 150 mm
2 pza Pipetas de 2, 5 y 10 ml
1 pza Bureta de 25 ml
3 pza Vasos de precipitados
2 pza Mortero con pistilo
1 pza Matraz erlenmeyer de 125 ml
1 pza Bao mara a 37 C termostatado
1 pza Centrfuga
1 pza Cronometro
1 pza Termmetro
1 pza Gradilla
1 pza Tijeras

METODOLOGIA

Preparacin del sistema Deshidrogenasa LcticaNAD+

a) Preparacin de la coenzima NAD+

1. Matar una rata con ter, abrirla y obtener 4g de fragmentos de msculo de las patas
traseras.

17
 2. Cortar el msculo en fragmentos ms pequeos y ponerlos en agua a ebullicin por 5
min en un matraz Erlenmeyer de 125 ml (en proporcin de 6 ml de agua por gramo de
msculo)
3. Pasar la preparacin a un mortero con un poco de arena ( 1 g) y triturar bien el
msculo.
4. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 min. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como
Coenzima NAD+, el precipitado se desecha en el bote de la basura.

b) Preparacin de la enzima LDH

1. Colocar 4 g de msculo de las patas traseras en un mortero previamente sumergido en
hielo y adicionar cloruro de sodio al 0.9% (en proporcin de 8 ml/g de msculo), agregar
un poco de arena ( 1 g) y triturar perfectamente.
2. Dejar reposar la mezcla en el mortero por 30 min.
3. Centrifugar a 3000 rpm por 15 min. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como
Deshidrogenasa Lctica, LDH. El precipitado se desecha.

c) Determinacin de actividad enzimtica.

1. Mientras se obtienen los sistemas enzimticos, preparar las 3 series siguientes en tubos
de ensaye etiquetados como se indica a continuacin.
NOTA: Trabajar las soluciones de CIANURO DE POTASIO con MUCHA PRECAUCION,
ya que es una sustancia altamente peligrosa, no se debe de utilizar pipeta, manipular
dicha sustancia con bureta y lavarse PERFECTAMENTE las manos.

Tubo No. 1 2 3 4
KCN al 0.5 % (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0
Lactato al 1% (ml) 1.0 1.0 0.0 1.0
Azul de metileno 0.002M (ml) 0.3 0.3 0.3 0.3
Agua (ml) 0.0 1.0 1.0 1.0
Sobrenadante Coenzima (ml) 1.0 0.0 1.0 1.0
Sobrenadante LDH (ml) 1.0 1.0 1.0 0.0
Lectura inicial
Lectura 15 min.
Lectura 30 min.
Lectura 60 min.

2. Mezclar bien el contenido de cada tubo y agregar a todos 1.0 ml de Nujol. Incubar en
bao mara a 37C y hacer observaciones a los tiempos indicados anotando en el
cuadro los grados de decoloracin con signos + y con 0 la falta de la misma.
NOTA: despus de haber agregado el Nujol, NO agitar el contenido del tubo.

RESULTADOS Y ANLISIS

1. Escriba los resultados de decoloracin en la tabla anterior.

2. Interprete el objetivo de cada tubo y el global del esquema
3. Diga cuales son las funciones de cada ingrediente adicionado.
4. Mencione otros tipos de oxidorreductasas importantes.
5. Qu aplicacin industrial podra drsele a las oxidorreductasas?
6. Por qu se debe de manejar con PRECAUCION el cianuro de potasio?
7. Por qu es importante las condiciones de reaccin del experimento?

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CONCLUSIONES

REFERENCIAS

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 PRCTICA No. 7

INMOVILIZACIN DE UNA PROTEASA

EN RESINAS DE INTERCAMBIO
INICO Y DE ADSORCIN

INTRODUCCIN

OBJETIVO

Evaluar la efectividad del intercambio inico como mtodo de inmovilizacin de enzimas.

MARCO TERICO

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO

Resina catinica Amberlite

1 frasco Papana (ablandador de carne) o Mexicana (extracto)
1 pza Columna de empaquetamiento o Bureta
Fibra de vidrio (pelo de ngel)
1 frasco Solucin cido clorhdrico 0.1 N
1 frasco Solucin reguladora de acetatos
Agua destilada
1 frasco Solucin de ovo albmina al 2% (a partir de huevo)
10 pza Tubos de ensaye 15 x 150 mm
1 pza Gradilla
1 pza Espectrofotmetro
1 pza Bao mara.
1 pza Pipetas de 1 y 5 ml.
1 pza Varilla de vidrio

METODOLOGA

a) Preparacin de la columna de intercambio inico

1. Lavar con agua destilada la resina de intercambio catinico

2. Colocar en el fondo de la columna una malla de fibra de vidrio
3. Empaquetar la resina utilizando como acarreador agua destilada
4. Adicionar lentamente (10 min aproximadamente), la solucin regenerante de HCl 0.1N
5. Enjuagar el exceso de cido con agua destilada hasta obtener un pH de 4 5

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b) Preparacin de la proteasa

1. Hacer una solucin al 0.01% de mexicana o papaina (ablandador de carne) en solucin

reguladora de acetatos.
2. Vaciar la solucin de la enzima lentamente (aproximadamente 10 min)
3. Enjuagar con solucin reguladora de acetatos.

c) Hidrlisis de la albmina.

1. Adicionar la solucin de ovo albmina al 2% lentamente (aproximadamente 10 min.)

2. Ir colectando los eludos en tubos de ensaye
3. Leer la absorbancia de los eludos en el espectrofotmetro a 280 nm.

RESULTADOS Y ANLISIS

1. Graficar tubo eludo contra Absorbancia a 280 nm

CUESTIONARIO

2. Graficar tubo eludo contra Absorbancia a 280 nm

3. Por qu se lee a dicha longitud de onda?
4. Qu tipo de aminocidos absorben a esa longitud de onda?
5. Explique cual es la funcin de la solucin de cido clorhdrico 0.1N
6. Explique por que es importante verter siempre con lentitud
7. Explique el mecanismo de reaccin llevado a cabo por la enzima

REFERENCIAS

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