See

discussions, stats, and author profiles for this publication at:

https://www.researchgate.net/publication/264551854

Biotecnologa Vegetal (texto bsico

biotecnologa en espaol)

Book April 2005

CITATIONS READS

0 5,226

5 authors, including:

Humberto Prieto Miguel Jordan

Instituto de Investigaciones Agro Universidad Mayor
61 PUBLICATIONS 261 CITATIONS 34 PUBLICATIONS 340 CITATIONS

SEE PROFILE SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

Sweet cherry genome and genetic engineering View project

experimental evolution View project

All content following this page was uploaded by Humberto Prieto on 08 August 2014.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

 Biotecnologa Vegetal

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS

MINISTERIO DE AGRICULTURA

B IOTECNOLOGA

V EGETAL

Humberto Prieto E.
Miguel Jordan Z.
L. Pedro Barrueto Cid
Mara Cristina R. Cordeiro
Don J. Durzan
ISSN O717 - 4713

Santiago de Chile, 2005

1
COLECCIN LIBROS INIA N 15
 Biotecnologa Vegetal

BIOTECNOLOGA VEGETAL

2005, Instituto de Investigaciones Agropecuarias, INIA,

Centro Regional de Investigacin La Platina,
Santa Rosa 11610, La Pintana, Telfono (56-2) 7575100,
Fax: (56-2) 5417667. Casilla 439, Correo 3, Santiago, Chile.

N Inscripcin: 149.346

ISBN: 956-7016-23-2

ISSN: 0717-4713

Prohibida la reproduccin parcial o total de esta obra sin

permiso del Instituto de Investigaciones Agropecuarias,
Ministerio de Agricultura.

Diseo y diagramacin: Jorge Berros V.

Impresin: PROGRAF Impresores.

Cantidad de ejemplares: 1.000

Santiago, Chile, 2005.

2
 Biotecnologa Vegetal

en recursos humanos. Esto limita sus posibilidades de utiliza-

cin efectiva. Debido a su novedad y a su explosivo desarrollo,
las distintas biotecnologas son rpidamente reemplazadas por
otras ms modernas y algunas de ellas abren nuevos problemas
en el mbito de la bioseguridad, e incluso en la tica. A pesar
de lo anterior, cada da, estas herramientas toman un papel ms
importante y las instituciones de investigacin destinan ms re-
cursos a su implementacin.

Parece obvio sealar que la capacitacin en estas nuevas tec-

nologas resulta clave al momento de decidir aplicarlas a la
solucin de los problemas tecnolgicos de la agricultura. El li-
bro "Biotecnologa Vegetal", representa un esfuerzo comparti-
do de distinguidos profesionales especialistas en sus aspectos o
ramas ms relevantes, para exponer de una manera didctica y
sencilla, las principales estrategias actualmente en uso. El Insti-
tuto de Investigaciones Agropecuarias, ha decidido cooperar
en este esfuerzo al incluir esta publicacin dentro de su "Co-
leccin Libros INIA", serie que ha hecho una importante contri-
bucin al conocimiento de aspectos relevantes para la agricul-
tura nacional. Con la inclusin de este nuevo ttulo, aspiramos
tambin a cubrir la demanda por informacin ms all de nues-
tras fronteras, pues creemos que este libro puede transformarse
en un texto de referencia para la enseanza de la biotecnologa
en el mbito latinoamericano.

Paulina Seplveda Ramrez.

Directora Regional
INIA - La Platina.

6
INTRODUCCIN
INTRODUCCIN
L a seleccin, mejoramiento gentico
y desarrollo de plantas, puede ser
trazada desde tiempos prehistricos
(Cowan y Watson, 1985). Las tribus pri-
mitivas seleccionaban cuidadosamente
plantas, semillas o estacas, en su inten-
to por domesticarlas y con el propsito
de usarlas como alimento, fibras, curas
de enfermedades, tratamiento de heridas
y tambin, por qu no decirlo, de sus
necesidades espirituales. Un ejemplo de
esto es el uso del canelo (Drimys winteri)
en Chile en ritos sagrados por los
mapuches.
En los ltimos decenios, los mejoradores
de plantas han realizado cruzamientos
intentando obtener descendencias que
proporcionen nuevas caractersticas de
inters y beneficios para horticultores,
agricultores y su economa local
(Simmonds, 1979). Este aspecto repre-
senta ya una inconsciente utilizacin del
concepto "biotecnologa de plantas", y
a su vez manifiesta del mismo modo el
requerimiento de una coleccin de
germoplasma y de la mantencin de una
amplia gama de diversidad gentica. La
finalidad ltima: poseer una fuente de
genes, con mapas genticos que permi-
tan la obtencin de plantas de inters
econmico (Tanksley y McCouch, 1997).
La manera ms fcil de capturar y fijar
una ventaja gentica es a travs de la
propagacin vegetativa del genotipo
CAPTULO 1
Don J. Durzan
deseado. Sin embargo, algunas seleccio-
nes son difciles de propagar (usando
medios baratos, simples y fciles de rea-
lizar). Por otro lado, la domesticacin
por clones podra aumentar los riesgos
de plagas y enfermedades si stos son
colocados en sistemas de produccin no
directamente relacionados con sus ni-
chos o en sus respectivos ecosistemas
naturales. Por ello tambin la necesidad
de efectuar pruebas preliminares de in-
troduccin en cada regin.
Para mejorar la calidad, productividad,
utilidad y acelerar la introduccin de
caractersticas superiores en los produc-
tos agrcolas, la biotecnologa de plan-
tas ha desarrollado mtodos para la in-
troduccin de genes exgenos en espe-
cies econmicamente importantes. Esto
comprende todos los mtodos de modi-
ficacin gentica, fusin de clulas, cru-
zamientos controlados, apomixia y cul-
tivo de tejidos conducentes a la obten-
cin de clones y a la fijacin de carac-
tersticas ventajosas propias de cada
zona, regin o pas. Y esto ltimo es muy
importante a la hora de definir progra-
mas de desarrollo biotecnolgico en
pases como el nuestro.
La biotecnologa de plantas requiere la
integracin econmica de las ciencias
biolgicas con la produccin y utiliza-
cin tanto de los sistemas agronmicos
como silvcolas. Es un hecho objetivo
17

que, independiente del modelo econ-
mico en boga, la nueva industria emer-
gente proveer de productos y servicios
que generarn un mejor desempeo de
la propia economa en su conjunto
(Enrquez, 1998). Estas innovaciones sin
duda, tendrn un impacto en la calidad
ambiental y la salud y exigirn de mane-
ra consustancial una evaluacin y moni-
toreo de estas nuevas tecnologas den-
tro de la relacin costo/beneficio. Un
claro ejemplo de ello lo representa la
incorporacin de la tecnologa de los
cultivos genticamente modificados.
La nueva era genmica que est desper-
tando, est forzando a algunas compa-
as ms poderosas del mundo a rein-
vertir en ellas mismas para integrar
biotecnologa, agricultura, ciencias fo-
restales, alimentos, qumica de cosm-
ticos, farmacia, medio ambiente e indus-
tria informtica y as permanecer viables
en el nuevo mundo de la economa de
la globalizacin (Lander y Weinberg,
2000). Sin embargo, cierta oposicin por
parte de una legislacin genmica de-
masiado rigurosa, podra inhibir el pro-
greso de nuevas tcnicas de diagnsti-
co en el rea, por ejemplo, de la salud
(Chahine, 2002). El problema surge de
la posicin que pases en desarrollo de-
ban adoptar con respecto a la adopcin
de estas nuevas ramas de la ciencia y la
discusin sobre la necesidad de ellas
dentro del conjunto de requerimientos
que podran bien plantearse para ven-
cer estas condiciones de sub-desarrollo.
Sin perjuicio de que ms adelante en
este libro se traten tpicos pormenori-
18
BIOTECNOLOGA VEGETAL
zados de biotecnologa de plantas, a
continuacin se efectuar una visin si-
nptica aunque actualizada, sobre esta
excitante promesa de la biotecnologa
en esta poca llamada tambin de "era
del conocimiento". sta, a modo de con-
tribuir a una percepcin ms global y co-
herente sobre esta materia; esfuerzo nada
fcil, considerando que cada vez es ms
difcil precisar lo que debe ser omitido o
incluido en una prospeccin, por la ex-
plosiva velocidad con que el conoci-
miento cientfico avanza. Sin embargo,
inevitable y til para ir depurando a las
ciencias de errores o conceptos ingenuos.
La necesidad de una biotecnologa
de plantas para una mejor
calidad de vida.
La biotecnologa est ofreciendo muchos
beneficios para la agricultura, medicina,
medio ambiente e industria. Estas nue-
vas alternativas estn relacionadas
inexorablemente con el crecimiento
asombroso de nuestra poblacin mun-
dial, la pobreza, el desempleo crecien-
te, la asistencia mdica y los cambios
climticos globales que limitan las co-
sechas. Ello involucra no solamente a la
industria y gobiernos, sino que particu-
larmente a los agricultores (que debern
tambin absorber las nuevas biotecno-
logas) y a los consumidores.
La llegada de plantas transgnicas pro-
mete ayudar a incrementar la flexibili-
dad del manejo de los cultivos. Por
ejemplo, disminuyendo la fuerte depen-
dencia de los agroqumicos y reducien-
INTRODUCCIN
do la alta contaminacin de los suelos,
ros y lagos. Al mismo tiempo, aumen-
tando la produccin, favoreciendo la
precocidad de las cosechas y en gene-
ral, adicionando mayor valor agregado
a los productos al aumentar el valor nu-
tritivo y haciendo los productos menos
perecibles (por ejemplo, proveyendo de
mayor tiempo de almacenaje). Sin em-
bargo, una vez que se haya evaluado
adecuadamente el impacto de la tecno-
loga, ella deber ser probada como se-
gura (y aqu nuevamente surgirn discu-
siones sobre cmo hacerlo). Debern ser
tambin de costo adecuado y aceptable
para los productores y consumidores.
Por ello, se requiere de mtodos para se-
leccionar, preservar y clonar nuevos
genotipos. Entretanto, la produccin y
utilizacin de sistemas biotecnolgicos
deben ser flexibles o lo suficientemente
operantes, para adaptar y usar tierras
m a rg i n a l e s , p o c o p r o d u c t i v a s ( e s t o
involucrar disponer de genotipos resis-
tentes al fro, salinidad, altura, etc.). En
general, minimizar los riesgos debidos
a diversas contingencias en el campo.
Seleccin y propagacin vegetativa
de plantas difciles de propagar.
La investigacin sobre plantas transg-
nicas, buscando alterar selectivamente,
adicionar o remover caractersticas es-
pecificas de ellas, debe ser realizada
considerando las necesidades regiona-
les. Caractersticas tales como, resisten-
cia al fro, calor, sequa, contenido de
fibras, gusto, color, fragancia, son bue-
nos ejemplos de esto. Es importante tam-
bin seleccionar para resistencia a pla-
gas y enfermedades de rboles de im-
portancia econmica. Esto, tanto para
especies de clima tropical como el "mog-
no-brasileiro", Switenia macrophylla,
(Fam. Meliaceae), as como para las es-
pecies del gnero Nothofagus del sur de
Chile (Nothofagus pumilio, N. obliqua,
N. alpina y N. leonii) o para las confe-
ras de California (Pinus torreyana,
Sequoia sempervirens, Taxus brevifolia,
etc.). El manejo de la variabilidad gen-
tica de especies arbreas podr incre-
mentar la probabilidad de resistencia
para insectos barrenadores (Coleoptera)
u hongos que atacan el tronco (cancro)
y que dificultan as su uso comercial.
Ello especialmente en una poca donde
la demanda por maderas est aumentan-
do junto al aumento de la poblacin. Las
expectativas son que, de aqu a diez
aos, el consumo de madera, ser alre-
dedor de un 20% ms de lo que repre-
senta hoy.
Para la propagacin vegetativa, el enrai-
zamiento de estacas es a menudo el sis-
tema clonal elegido (ejemplo hbrido en-
tre Eucalyptus grandis x E. urophylla para
la produccin de celulosa). Entretanto,
los factores que afectan la capacidad del
enraizamiento son numerosos, especial-
mente en especies frutales, siendo pro-
cesos an escasamente comprendidos. La
propagacin de plantas mediante condi-
ciones in vitro: organognesis y embrio-
gnesis somtica (ver captulo 3), son
parte del arsenal de tcnicas (Figuras 1.1
a 1.5) que han sido empleadas en la
biotecnologa de plantas (Hartmann et
al., 2002).
19
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Figuras 1.1 a 1.5. Poliembriognesis. Tipo de embriognesis somtica frecuente en conferas,

inducida bajo condiciones in vitro. Sin embargo, es un proceso distinto al de embriognesis
somtica de dicotiledneas, pero que, como sta, puede permitir la multiplicacin de
embriones en grandes cantidades en biorreactores. Figura 1.1, muestra el aspecto de un
embrin cigtico (2 mm) de Picea abies (Abeto de Noruega), en el cual se distinguen muy bien
sus cotiledones. Pequeas cantidades de estos embriones, al ser colocados en frascos tipo
"nipple" y en presencia de un determinado medio nutritivo bsico, se multiplican
asexuadamente por simple ruptura longitudinal. Figura1.2, Los frascos permanecen en
oscuridad, girando a 1 rpm (clinostato). Figura1.3, presenta una muestra de embriones (0,5 mm),
que se destacan por su coloracin rojiza, debido a la tincin con acetocarmn. En azul, el
suspensor teido con azul de Evans. Los embriones ya maduros presentan el aspecto de la
Figura1.4. Por tanto, son muy parecidos a los embriones originarios de semillas (sexuales).
Ms adelante, los embriones son hechos germinar, transformados en plantas llevadas al campo
para su observacin y evaluacin. Figura 1.5, plantas (primer plano) con siete aos de edad,
las cuales no evidenciaron variabilidad gentica (variacin somaclonal), en relacin a sus
congneres obtenidas por semillas. Dependiendo del inters forestal, carga de trabajo del
laboratorio etc., los embriones (Figura 1.4) se pueden criopreservar pudiendo de
esta manera, distribuir mejor su disponibilidad durante el ao.

20
INTRODUCCIN
Los factores que son considerados im-
portantes dentro de esta perspectiva,
corresponden a la aplicacin de regula-
dores de crecimiento y/u hormonas ve-
getales (ver captulo 2: Figuras 2.2 y 2.3;
Tabla 2.2), procurando encontrar corre-
laciones entre respuestas experimenta-
les y dosis aplicadas. Ello dentro de un
contexto de diversos factores tales como
humedad, CO 2 y temperatura. En algu-
nos casos, el pre-acondicionamiento, as
como el conocimiento del origen de
dnde sern retirados los explantes en
la planta madre (zona juvenil, adulta o
embrionaria), son necesarios para me-
jorar la respuesta morfognica, definidas
antes de proceder a extraer el material.
Una estrategia que ha sido ampliamen-
te utilizada para la seleccin clonal, por
ejemplo en reas tropicales, como es el
caso de Hevea brasilensis, es el escruti-
nio de un gran nmero de plntulas. Esto
como una forma opuesta a la seleccin
de rboles maduros, sobre la base de su
aparente superioridad, ya que muchos
caracteres son influidos ambientalmente.
Plantas transgnicas
Las plantas trangnicas fueron una con-
secuencia natural del desarrollo de tc-
nicas como el cultivo de tejido in vitro
de plantas, pero ste era y es, fundamen-
talmente, una tcnica conservativa (ver
captulo 2). El problema de tornar el me-
joramiento ms rpido y factible en mu-
chas especies de importancia agron-
mica, quedaba todava abierto con ese
vasto arsenal de tcnicas que el cultivo
in vitro despliega (haploides, fusin de
protoplastos, clulas en suspensin,
etc.). Por eso entonces, el surgimiento
de plantas transgnicas era una cuestin
de tiempo.
Una especie se caracteriza por su incapa-
cidad natural para entrar, bajo circunstan-
cias normales, en una unin sexual fue-
ra de la especie. La biotecnologa de
plantas modifica esta imposicin, prove-
yendo en cambio, nuevos y tiles mto-
dos para introducir variacin gentica sin
participacin sexual (ver captulo 4). Los
bilogos de plantas ya han obtenido gran-
des ventajas de la reproduccin asexuada
para fijar aquellas caractersticas obteni-
das va cruzamiento.
Una gran utilidad de las plantas transg-
nicas es la de producir nuevos benefi-
cios y proveer servicios que remuevan
las dificultades inherentes para un de-
sarrollo sustentable de la agricultura.
Sustentable, se utiliza en este contexto,
como sinonimia de respeto al medio
ambiente, siendo sta la tnica que ms
tarde o temprano se impondr en el
gerenciamiento y produccin del agro-
negocio. Los transgnicos tambin po-
drn ofrecer nuevas opciones para la
substitucin de material, cuando los re-
cursos vegetales estn prximos a la ex-
tincin.
En la actualidad, hay muchos ejemplos
de plantas transgnicas en produccin,
como es la incorporacin de resistencia
al herbicida glifosato, utilizado en remo-
lacha, soya, raps, tomate, tabaco, algo-
dn, etc. (Jayaraman, 2002). El glifosato
es un potente exterminador de malezas
eliminando aquellas plantas que poseen
la va del cido shiqumico. La resisten-
cia contra insectos tambin se ha con-
seguido a travs de la introduccin en
la planta, del gen que codifica una toxi-
na de Bacillus thuringensis, la cual pro-
voca alteraciones fatales en el intestino
del insecto; a pesar de que, la gran plas-
21

ticidad genmica de estos, puede desa-
rrollar resistencia a esta toxina (Huang
et al., 1999). Otras alteraciones gen-
ticas han sido la modificacin de la com-
posicin de aceites de algunas olea-
ginosas en favor de cidos grasos ms
compatibles con la salud humana. El en-
riquecimiento del endosperma del arroz
con pro-vitamina A, no deja de ser una
esperanza para la poblacin de bajos in-
gresos (Ye et al., 2000). Tambin es im-
portante mencionar el problema de la
maduracin del tomate y retraso de este
proceso, conseguido por va transgnica
mediante la alteracin de la sntesis del
etileno, la hormona vegetal justamente
decisiva en la maduracin de ste. En
frutillas, especie conocida por su corta
vida de post-cosecha, la va transgnica
ha conseguido aumentar su perodo de
almacenamiento mediante la incorpora-
cin de secuencias antisentido del gen
que codifica para la enzima pectato-
liasa, relacionada con el ablandamien-
to del fruto (Jimnez-Bermudez et al.,
2002). Siendo larga la lista de ejemplos,
no se puede dejar de mencionar los es-
fuerzos por inducir la sntesis de ant-
genos en las plantas (vacunas) para in-
munizar poblaciones infantiles de sec-
tores de bajos recursos contra diversas
infecciones bronquiales o intestinales
(Tariq et al., 1995; ver captulo 6).
Algunos intentos por identificar otras
familias de genes, como los genes res-
ponsables de caractersticas cuantitati-
vas "QTL", (Quantitative Trait Loci; ver
captulo 7), se han visto frustrados por
la complejidad de los genomas. Para
ilustrar esta afirmacin, debe asumirse
que muchos rboles tienen un genoma
varias veces mayor al genoma humano.
Es as como en la Familia Pinaceae por
22
BIOTECNOLOGA VEGETAL
ejemplo, se encuentran rboles con al-
rededor de 20 billones de pares de ba-
ses, o sea, siete veces ms que lo halla-
do en humanos. Las limitaciones tecno-
lgicas del uso de QTLs, es que su ma-
nejo no implica el manejo de genes, sino
que stos identifican efectos genticos
que pueden estar ligados a muchos
genes. Por otro lado, los QTL no detec-
tan interacciones epistticas entre loci.
De esta forma, mapas de alta resolucin
gentica y experiencias de mutagnesis,
pueden potenciar la relacin entre genes
candidatos y el anlisis con QTL (Flint y
Mott, 2001).
Dentro del arsenal moderno de otras tc-
nicas, se pueden sealar la sintenia y la
quimeraplastia. La primera, es un mto-
do que compara mapas de genes de di-
ferentes especies, pudiendo ser usada
para evaluar la funcin de genes basa-
dos en la similitud de secuencias y po-
siciones dentro de la hebra de DNA. La
segunda, se refiere al mtodo de inser-
tar segmentos de DNA/RNA en la clula
vegetal, visualizando la induccin de
mutaciones de un gen especfico. En
maz, se puede lograr un gran nmero
de mutaciones por va de insercin de
DNA. El silenciamiento de RNA o la so-
bre-expresin de genes, han sido tam-
bin usados para desactivar o activar
genes en las plantas, respectivamente.
Mayor eficiencia en la produccin.
Gracias a la ingeniera gentica, genes
de especies incompatibles pueden ser
introducidos en plantas para aumentar
la produccin y calidad de los cultivos.
Para la agricultura, tales aspectos en
concordancia con componentes ecolgi-
INTRODUCCIN
cos conforman un enfoque conveniente
y, por lo dems, altamente demandado
hoy en da. Por otro lado, en la parte fo-
restal (Durzan y Campbell, 1974; Campi-
nhos et al., 1992; Ferreira, 1995; Campi-
nhos, 1999), no menos importante ha si-
do la contribucin del uso de los mar-
cadores moleculares, la propagacin
clonal y el uso de micorrizas, en la pers-
pectiva de aumentar la densidad de la
plantacin para disminuir costos (Lander
y Weinberg 2000). A consecuencia de
esto, surgen tambin preguntas fisiol-
gicas fundamentales, como por ejemplo,
Cules son los efectos de la competen-
cia por luz, por nutrientes, por agua, por
espacio, por crecimiento alomtrico y
por problemas de fitosanidad? (Sinclair
y Gardner, 1998).
Cambios en el clima global
Es ampliamente aceptado que existen
cambios en el clima global que afectan
la atmsfera, hidrsfera y litsfera de
muchas partes del mundo (Watson y
Team, 2001). O tal vez, que los cambios
en estas ltimas hayan llevado a cam-
bio en el clima global. Nuestra mayor
evidencia cientfica sugiere poderosa-
mente que un importante componente
de estos cambios es debido a la accin
humana. Entretanto, se necesitan ms
estudios para llegar a comprender las
causas ms profundas que los han origi-
nado, sus implicaciones a mediano pla-
zo y las posibles soluciones, a objeto de
direccionar ms adecuadamente las pre-
dicciones y soluciones ms plausibles.
Por ejemplo, cunto tiempo va a durar
la falta de agua en el norte de Chile?,
cunto ser su abundancia en el sur y
cmo sern afectadas las poblaciones
naturales de los diferentes ecosistemas?
Por ello, se tendrn que desarrollar nue-
vas plataformas tecnolgicas (Durzan y
Durzan, 1993).
Nuevas plataformas tecnolgicas
para el progreso de la
produccin agrcola
El estudio del genoma de las plantas est
presentndose ms difcil de lo imagi-
nado, de modo que se tienen que desa-
rrollar nuevos mtodos. Dentro de esta
perspectiva, los investigadores de plan-
tas podrn utilizar los "transposones" y
crear mutantes que ayudarn a identifi-
car efectos fenotpicos en su compara-
cin con los efectos ejercidos por genes
normales.
Una importante nueva tecnologa para
el estudio de plantas es el "DNA
microarray" (microarreglos de DNA),
conocido tambin por "DNA chip" o sim-
plemente "chip" (Dhiman et al., 2002;
ver captulo 8). Esta poderosa herramien-
ta capacita un rpido y simultneo an-
lisis de un gran nmero de experimen-
tos de hibridacin de cidos nucleicos
para identificar genes en respuesta a
"estrs" ambiental y cambios relaciona-
dos con etapas del desarrollo. Por ejem-
plo, saber cuntos genes intervienen en
la formacin de una manzana, un me-
ln, o una papa. As, la tecnologa del
"microarray" ayuda a la identificacin de
genes expresados ante un estmulo es-
pecfico y levanta el perfil transcrip-
cional de un determinado fenotipo, per-
mitiendo separar o identificar los efec-
tos adversos cuando la planta es some-
23

tida a variados estmulos. La tcnica ge-
nera modelos ms amplios de anlisis
para entender los factores involucrados
en el "diseo" de nuevos genotipos y
para el desarrollo de productos ms es-
pecficos, tales como drogas y vacunas,
por ejemplo, contra la mastitis en ani-
males.
En el futuro, laboratorios biotecnolgi-
cos podrn usar tambin fuerzas atmi-
cas minsculas y nanotecnologas para
investigar el DNA. As, los productos
sern mejor ajustados a las necesidades
de los genotipos deseables (Anon, 1999).
La explosin de nuevos datos de los es-
tudios genmicos y de la biologa
molecular en general, ha conducido al
nacimiento de la bioinformtica como
un paso crtico en la realizacin del ple-
no potencial de la revolucin biotecnol-
gica (Gwynne y Page, 2000). La bio-
informtica nos permite pensar de ma-
nera bastante asertiva la construccin de
la filogenia de las plantas. Por ejemplo,
en lo que se denomina evaluacin lineal
de secuencias de DNA. El prximo ni-
vel de diagnstico bioinformtico com-
prende el abordaje del genoma funcio-
nal basado en el anlisis de DNA, RNA,
protenas y metabolitos (Risch, 2000).
Esto involucra la identificacin de la fun-
cin y del gen, su organizacin y con-
trol sobre vas genticas que influencian
la fisiologa del organismo. Por cierto
que la bioinformtica ser decisiva en
esta cuestin. As, los datos provenien-
tes de la bioinformtica ayudarn a es-
tablecer la posicin relativa de un parti-
cular gen en un cromosoma, demarcar
su posicin y esclarecer el papel en una
va metablica, las que en plantas exis-
ten muchas por conocer mejor todava.
Es claro que la identificacin funcional
24
BIOTECNOLOGA VEGETAL
de un gen significa conocer su produc-
to; en este sentido, el proteoma envuel-
ve toda la terminologa usada para des-
cribir la expresin funcional de prote-
nas responsables de un fenotipo dado
(Pandey y Mann, 2000). En adicin a
esto, la biotecnologa de plantas tiene
que explorar la frmaco-genmica, o el
estudio de cmo las diferencias ge-
notpicas influyen en las consecuentes
y variadas respuestas de las plantas fren-
te a los agroqumicos (herbicidas, y
fungicidas). Ello implica entre otras co-
sas, seguir la pista de un determinado
metabolito en la clula (Roses, 2000; Shi
et al., 2001). El trmino "metanmico"
justamente est relacionado con este
concepto (Bailey, 1991). El diagnstico
"metanmico", por otro lado, ha gene-
rado el concepto de "metabolmico".
Este comprende la idea del anlisis de
conjunto de perfiles metablicos en el
interior de la clula, envolviendo por
tanto, aislamiento, separacin, identifi-
cacin y caracterizacin de esos perfi-
les o secuencias bioqumicas. Esto, en
un esfuerzo por realizar modelos que re-
lacionen estructura y funcin (Hunter,
1993; Kauffman,1993).
La tecnologa de los protoplastos, sin
duda, ha generado inters desde este
punto de vista. Al permitir fusionar c-
lulas, podra ofrecer mayores posibilida-
des de estudios de genomas susceptibles
o resistentes. El potencial de estudio
parece amplio y vasto. As no ser ex-
trao producir algn da, hbridos inter-
especficos. Por ejemplo, introduciendo
cloroplastos en la clula animal. Entre-
tanto, cabe mencionar que estos abor-
dajes han sido pocos exploradas en fun-
cin del limitado inters.
INTRODUCCIN
Planta, biotecnologa
y medio ambiente.
El excesivo uso de recursos renovables
y no renovables debido al incremento
de la poblacin y otros factores, coloca
bajo severa amenaza al medio ambien-
te, implicando la produccin de xido
de azufre, compuestos nitrogenados y
carbnicos.
La biotecnologa e industria qumica han
dependido fuertemente de derivados del
petrleo para la produccin de bienes y
servicios. Con los recientes progresos de
la biotecnologa de hoy, existe una con-
siderable promesa para el uso de plan-
tas y recursos renovables que puedan
aminorar este problema. La plataforma
tecnolgica de la bioingeniera de plan-
tas est sensibilizada con el problema e
incluye en sus procesos, nuevos abor-
dajes que puedan resultar en manufac-
turas con menor impacto ambiental.
Se han realizado esfuerzos significativos
para crear positivos beneficios en reas
como las siguientes: Produccin y uso
de energa, Reduccin de polucin, por minsculos enemigos (microorganis-
Reciclaje de materiales de desperdicio,
Progresos en agricultura y ciencias fo-
restales, Armas biolgicas. En este sen-
tido, la fermentacin de biomasa reno-
vable y reciclable, representa un esfuer-
zo integrado que puede disminuir los
problemas. As ella produce un produc-
to energtico (etanol) de "fuentes ver-
des", que provoca menos polucin que
su anlogo fsil. Por otro lado, los bio-
rreactores y digestores al producir gas
metano, con el consiguiente reciclaje de
desechos y produccin de energa, es-
tn dando su contribucin efectiva con-
tra la polucin. Los organismos genti-
camente modificados podran reducir los
desechos industriales evitando el impac-
to negativo del progreso (Wiseman,
1988). Hongos y plantas podran ser pro-
gramados para ser usados como indica-
dores de la calidad ambiental detectan-
do y absorbiendo txicos y metales pe-
sados; en fin, disminuyendo los riesgos
de cncer u otro tipo de enfermedades.
Nosotros estamos justamente comenzan-
do a comprender cmo las plantas cre-
cen y funcionan molecularmente, inclu-
sive con el uso de modelos de micro-
gravedad (Durzan, 2000). Tambin se re-
quiere de mejores modelos para definir
cmo la vida de las plantas se podra
extender a ambientes hostiles fuera de
nuestro planeta; por eso, la necesidad
de construir plataformas espaciales.
Tratndose del medio ambiente, es bue-
no hacer un poco de historia. sta nos
recuerda que nuestro ambiente nos ha
impuesto pesadas tragedias, causadas
mos). Fue as con las papas en Irlanda
en 1875, con el caf en Ceyln en 1870,
con los castaos en Estados Unidos en
1904 y en general, con ataques epid-
micos en cereales. Todos estos hechos
nos sugieren que agentes patognicos y
ms recientemente plantas transgnicas,
podran ser utilizados con fines milita-
res o terroristas (United Nations, 1969).
Los objetivos podran ser los productos
agrcolas y/o reservas de germoplasmas
naturales.
25

Cuatro pre-condiciones podran ser se-
aladas para provocar estas amenazas:
1. Una gran poblacin de plantas hos-
pederas debera estar presente.
2. El agente debera ser capaz de reco-
nocer y atacar una particular pobla-
cin.
3. Cantidades adecuadas del agente in-
feccioso o vector deberan estar dis-
ponibles.
4. El ambiente debera ser favorable a la
propagacin del vector. Los agentes
podran ser lanzados desde aviones,
misiles, aerosoles, etc.
El uso de otros mtodos tales como la
radiacin electromagntica y el rayo l-
ser, aplicados por avin, no podra ser
descartado. Esto permitira irradiar plan-
tas afectando su ciclo natural de desa-
rrollo, quebrando su dominancia apical,
ciclo floral, produccin de yemas, etc.
(Durzan y Campbell, 1979; Durzan,
1980). Empero, es bueno precisar que
sera el hombre, y no la ciencia, el res-
ponsable por el mal uso de ella.
La biotecnologa de plantas,
la industria y la salud
A travs del control de procesos metabli-
cos y fisiolgicos, la ingeniera bioqumi-
ca podra mejorar y modificar la produc-
cin de metabolitos secundarios que no
pueden ser sintetizados por problemas
qumicos o econmicos. Esto incluye hor-
monas, drogas anticncer, modificacin
de vitaminas, contenidos de carbohidra-
tos, etc. Las plantas podran ser clonadas
y cruzadas para proveer la apropiada di-
versidad gentica, necesaria para la pro-
duccin a gran escala en el campo.
26
BIOTECNOLOGA VEGETAL
Entretanto, ya a nivel de laboratorio, la
biotecnologa ha producido una serie de
productos farmacuticos. Entre ellos
pueden citarse: la insulina, el interfern
para el tratamiento de infecciones virales
y cncer, la hormona del crecimiento,
interleuquinas contra el cncer y
pptidos neuroactivos para disminuir la
intensidad del dolor. Existe una amplia
variedad de antibiticos y agentes
antimicrobiales. Sin embargo, muchos
de estos productos necesitan todava del
visto bueno de aprobacin por agencias
gubernamentales.
La frmaco-genmica, como rama emer-
gente de la biotecnologa, tendr gran
preponderancia en este sentido en el
futuro. Ello se debe a que requerir exa-
minar detenidamente las variaciones in-
dividuales en respuesta a la terapia con
drogas, polimorfismo gentico, marca-
dores y anlisis de ligamiento, sin llegar
necesariamente a involucrarse con tera-
pia gentica o clonaje de rganos hu-
manos.
Desafos futuros
La produccin sustentable de alimentos,
fibras, maderas, combustible, etc., per-
manecen como desafo frente a cuestio-
nes candentes, como lo es el explosivo
aumento de la poblacin mundial. Po-
blacin que hoy ya casi alcanza los seis
billones de habitantes, la exclusin so-
cial, la polucin, seguridad social, la dis-
minucin de los recursos naturales re-
novables y la corrupcin. Por otro lado,
la cantidad de tierra disponible para la
agricultura, aprovechamiento de la ener-
ga solar a un costo ms barato y la dis-
minucin de las fuentes de agua dulce,
INTRODUCCIN
levantan preocupaciones colocando l-
mites para los modelos propuestos de
produccin sustentable. La llegada de la
biotecnologa y toda su amalgama de
derivados, es solamente una fraccin de
las posibles soluciones para vencer todo
este abanico de desafos que se aveci-
nan (Mann y Plummer, 2002). Sin em-
bargo, las soluciones tendrn que ser
probadamente seguras y pblicamente
aceptadas, aspecto muchas veces nada
fcil. En ello debemos considerar la se-
rie de factores que pesan sobre ellas,
entre las cuales pueden citarse, la mis-
ma ciencia, la religin, la filosofa, la
economa, los derechos humanos y la
infaltable poltica. Existe eso s, la con-
viccin de que tomado en su conjunto,
este proceso biotecnolgico, al final de
cuentas, llevarn a mejorar la salud p-
blica, la industria y el conjunto de la
economa. Para esto, es clave partir de
una apropiada legislacin, pro-activa y
con agentes reguladores confiables, los
que a su vez gocen de la existencia de
recursos financieros y humanos apropia-
dos (Stock, 2002). Con todo esto en la
mano, los esfuerzos biotecnolgicos
conseguirn: ms con menos, calidad en
lugar de cantidad, reduccin de riesgos
y proveer una existencia humana ms
digna y duradera (Fukuya, 2002).
REFERENCIAS.
Anon. 1999. Biotech Mania. Research and
Development Magazine June:22-27.
Bailey, J. 1991. Toward a science of metabolic
engineering. Science 252:1668-1675.
Campinhos, E. 1992. The use/place of clonal
multiplication in tree breeding and pro-
pagation programmes: Prerequisites for
success and failure. 18 p. In: Regional
Symposium on Recent Advances Mass
Clonal Multiplication of Forest Trees for
Plantation Programmes. Edicin Diciembre
108. FAO and UNDP, Bogor, Indonesia.
Campinhos, E., La-Tarraca, S., Laranjeiro, A. y
Penchel F. 1993. The use/place of clonal
multiplication in tree breeding and
propagation programmes: Prerequisites for
success and failure. pp. 9-30. In: Davidson,
J. (ed.). Regional Symposium on Recent
Advances Mass Clonal Multiplication of
Forest Trees for Plantation Programmes,
Bogor, Indonesia, 1-8 Dec 1992. FAO,
Rome, Italy.
Campinhos, E. 1999. Sustainable plantations
of high-yield Eucalyptus trees for produc-
tion of fiber : the Aracruz case. New Forests,
17:129-143.
Cowan, C. y Watson, P. (eds.). 1985. The origins
of agriculture. An international perspective.
224 p. Smithsonian Institution Press, Was-
hington, D.C., USA.
Chahine, K. 2002. Industry opposes genomic
legislation. Nature Biotechnology 20:419.
Dhiman, N., Bonilla, R., O'Kane, D. y Poland,
G. 2002. Gene expression microarrays; a
21st century tool for directed vaccine design.
Vaccine 20:22-30.
Durzan, D. y Campbell, R. 1974. Prospects for
the mass production of improved stock of
forest trees by cell and tissue culture. Can.
J. Forest Res. 4:151-174.
27

Durzan, D. y Campbell, R. 1979. Inhibition of
female cone production in white spruce by
red light treatment during night under field
conditions. J. Exp. Env. Biol. 19:133-144.
Durzan, D. 1980. Progress and promise in
forest genetics. pp. 31-60. In: Proceedings
of the Conference on Paper Science and
Technology, The Cutting Edge. Fiftieth
Aniversary Year, The Institute of Paper
Chemistry, Appleton, WI, USA.
Durzan, D. y Durzan, M. 1993. Opportunities
for biotechnology transfer to developing
countries. HortTechnology 3:268-279.
Durzan, D. 2000. Metabolic engineering plant
cells in a space environment. Biotechnol.
Genet. Eng. Rev. 17:349-383.
Enrquez, J. 1998. Genomics and the world's
economy. Science 281:925-926.
Ferreira, M. y Grattapaglia, D. 1995. Intruduo
ao uso de marcadores RAPD e RFLP em an-
lise gentica. 220 p. EMBRAPA/CENARGEN,
Brasilia D.F., Brasil.
Flint, J. y Mott, R. 2001. Finding the molecular
basis of quantitative traits: Successes and
pitfall. Nature Reviews Genetics 2:237-445.
Fukuya, F. 2002. Our posthuman future
consequences of the biotechnology
revolution. 300 p. Farrar, Straus & Giroux,
New York, USA.
Gwynne, P. y Page, G. 2000. Bioinformatics
moves to center stage in the genetics
revolution. Science 288:1845-1859.
Hartmann, H., Kester, D., Davies, F. y Geneve,
R. 2002. Plant Propagation. Principles and
Practices. 7 th ed. 800 p. Prentice Hall, NJ,
New York, USA.
Huang, F., Buschman, L., Higgins, R. y McGau-
ghey, W. 1999. Inheritance of resistance to
Bacillus thuringiensis toxin in the European
corn borer. Science 284:965-968.
28
BIOTECNOLOGA VEGETAL
Hunter, L. (ed.) 1993. Artificial intelligence and
molecular biology. 480 p. AAAI Press/MIT
Press, Menlo Park, CA, USA.
Jayaraman, K. 2002. India approves GM cotton.
Nature Biotechnology 20:415.
Jimnez-Bermudez, S., Redondo-Nevado, J.,
Muoz-Blanco, J., Caballero, J., Lpez-
Aranda, J., Valpuesta, V., Pliego-Alfaro, F.,
Quesada, M. y Mercado, J. 2002. Manipu-
lation of strawberry fruit softening by
antisense expression of a pectate lyase gene.
Plant Physiol. 28:751-759.
Kauffman, S. 1993. The Origins of Order. Self-
organization and selection in evolution.
709 p. Oxford Univ. Press, Oxford, England.
Lander, E. y Weinberg, R. 2000. Genomics:
Journey to the center of biology. Science
287:1777-1782.
Mann, C. y Plummer, M. 2002. Forest Biotech
edges out of the lab. Science 295:1626-
1629.
Pandey, A. y Mann, M. 2000. Proteomics to
study genes and genomes. Nature 405:837-
846.
Risch, N. 2000. Searching for genetic
determinants in the new millennium. Nature
405:846-856.
Roses, A. 2000. Pharmacogenetics and the
practice of medicine. Nature 405:857-865.
Shi, M., Mehrens, D. y Dacus, K. 2001.
Pharmacogenomics: changing the health
care paradigm. Modern Drug Discovery
4:27-39.
Simmonds, N. 1979. Principles of Crop
Improvement. 408 p. John Wiley & Sons,
New York, USA.
Sinclair, T. y Gardner, F. 1998. Principles of
ecology in plant production. 189 p. CAB
Internacional, Oxon, England.
INTRODUCCIN
Stock, G. 2002. Redesigning humans. Our in-
evitable genetic future. 265 p. Houghton
Mifflin, Boston, USA.
Tanksley, S. y McCouch, S. 1997. Seed banks
and molecular maps: Unlocking genetic
potential from the wild. Science 277:1063-
1066.
Tariq, A., Mason, H., Clements, J. y Arntzen,
C. 1995. Oral immunization with a recom-
binant bacterial antigen produced in
transgenic plants. Science 268:714-716.
United Nations. 1969. Chemical and bacterio-
logical (Biological) weapons and effects of
their possible use. 100 p. In: Report of the
Secretary General, Department of Political
and Security Council Affairs, United
Nations, New York, USA.
Watson, R. y Core Writing Team (eds.) 2001.
Climate change 2001: Synthesis Report.
Contribution of Working Groups I, II, III to
Third Assessment Report of Intergovern-
mental Panel on Climate Change. 408 p.
Cambridge University Press, Cambridge and
New York, USA.
Wiseman, A. (ed.) 1988. Principles of Biotech-
nology. 211 p. Surrey University Press, New
York, USA.
Ye, X., Al-Babili, S., Klti, A., Zhang, J., Lucca,
P., Beyer, P. y Potrykus, I. 2000. Engine-
ering the provitamin A (-carotene) biosyn-
thetic pathway into (carotenoid-free) rice
endosperm. Science 287:303-305.
29
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

30
EL CULTIVO DE TEJIDOS
EL CULTIVO DE TEJIDOS
ANTECEDENTES HISTRICOS
DEL CULTIVO DE TEJIDOS
VEGETALES
E n la teora sobre totipotencialidad
formulada por Schleiden y Schwann
en 1838, cada clula vegetal es autno-
ma y capaz de regenerar una planta com-
pleta cuando est sometida a condicio-
nes especiales (Pierik, 1987a). Esta teo-
ra, adelantada para su poca, represen-
ta el primer paso para el desarrollo de
las tcnicas de cultivo de tejidos in vitro.
Basado en ella, en 1902, Haberlandt, un
fisilogo austro-hngaro, intent mante-
ner explantes foliares in vitro buscando
perpetuar su potencial mittico. Sin
embargo, sus resultados fueron negati-
vos (Dodds y Roberts, 1982) y su fraca-
so tuvo como principal causa la falta de
asepsia y el no uso de hormonas. Pocos
aos despus (1910), trabajos realizados
por Carrel y otros investigadores en cul-
tivos de clulas animales y humanas in
vitro, demostraron a travs de sus resul-
tados, un avance significativo.
Las investigaciones en el rea vegetal
continuaron. En 1922, se obtuvieron in-
teresantes resultados preliminares en tra-
bajos con races de tomate (Robbins,
1922), los que ms tarde se confirmaron
por White (1934), quien mostr que s-
tas no paraban de crecer in vitro, incluso
tras un largo tiempo, asombrando as a
la comunidad cientfica de la poca.
CAPTULO 2
L. Pedro Barrueto C.
En la dcada de 1930, se logr estable-
cer que el uso de vitaminas como B 1, B 6
y tambin la inclusin de compuestos or-
gnicos, tales como la sacarosa, permi-
tan el enriquecimiento de los medios
nutritivos utilizados anteriormente. As
se posibilit la mantencin contenida de
especies antes imposibles de ser introdu-
cidas al laboratorio, dando un empuje
significativo al desarrollo de plantas cul-
tivadas in vitro. Aqu, merece especial
atencin Skoog, en los Estados Unidos,
porque logra inducir regeneracin de
plantas a partir de explantes iniciales de
mdula de tabaco (Skoog y Tsui, 1948).
Por otro lado, en Francia, Morel y Martin
(1952), revolucionaban el ambiente al
promover el crecimiento de dalias libres
de virus a partir de yemas apicales.
Al final de la dcada de 1950, Reinert
en Alemania y Steward en los Estados
Unidos (Steward et al.,1958; Reinert,
1959), logran de manera casi simul-
tanea, inducir embriones no cigticos de
zanahorias, haciendo disponible as una
metodologa de propagacin clonal en
gran escala con especial repercusin en
las empresas forestales (ver captulo 1:
Figuras 1.1-5) y de comercializacin de
flores.
Por otro lado, al comenzar la dcada del
1960, Cocking en Inglaterra (Cocking,
1960) obtiene protoplastos (clulas sin
pared celular) y Murashige y Skoog
(1962), publican su medio nutritivo para
31

el cultivo de plantas in vitro, siendo esta
publicacin tal vez la ms citada en el
mbito del cultivo de tejidos vegetal de
todos los tiempos.
La suma de descubrimientos no se de-
tiene y en la misma dcada Guha y
Maheshwari (1964), dos investigadores
indios, consiguen obtener plantas
haploides a partir de granos de polen
inmaduros y algunos aos ms tarde en
los Estados Unidos, son publicados los
primeros resultados sobre seleccin in
vitro (Carlson, 1970). Mientras tanto,
Power hace lo mismo sobre fusin de
protoplastos (Power et al., 1970). Avan-
zando en el tiempo, Larkin y Scowcroft
(1981), introdujeron en la nomenclatu-
ra del cultivo de tejidos de planta, el
trmino de variacin somaclonal. En la
misma dcada, comienzan a aparecer
los primeros trabajos con Agrobacterium
tumefaciens y biobalstica, en el campo
de la transformacin gentica de plan-
tas (Larebeke et al., 1974; Klein, et al.,
1987).
Todas estas investigaciones, adems de
reafirmar la vitalidad de la teora de la
totipotencialidad, tuvieron un profundo
impacto en biologa de plantas, agricul-
tura y especialmente, en el cultivo de
tejido de plantas, tcnica que ofrece en-
tre otras, las siguientes ventajas:
Permite fijar caractersticas de hbri-
dos, en menor tiempo, que el mto-
do clsico de mejoramiento va cru-
zamientos repetitivos.
Produce gran cantidad de propgulos
(clones), a partir de un nmero redu-
cido de los mismos.
Los propgulos a su vez, pueden re-
32
BIOTECNOLOGA VEGETAL
presentar caractersticas superiores a
sus congneres oriundos de semillas.
Provee material clonal durante todo
el ao, con la ventaja que este mate-
rial est libre de contaminantes. Por
tanto, sin riesgo de diseminar plagas
o enfermedades a nuevas reas.
Sirve de base para trabajos de inge-
niera gentica y transformacin de
plantas,
Da soporte tcnico para la investiga-
cin bsica en diferentes campos de
la biologa, gentica, fisiologa,
fitopatologa, etc.
Puede facilitar enormemente el inter-
cambio de germoplasma entre pases.
LA BASE DEL CULTIVO in vitro,
EL MEDIO NUTRITIVO
Componentes inorgnicos
a.- Agua.
El agua es el componente ms abundante
de los seres vivos, pudiendo constituir
aproximadamente hasta el 90 % del peso
fresco de los mismos. Por eso, no slo
es fundamental en el medio nutritivo,
sino que tambin es el componente prin-
cipal.
Sus propiedades fsicas y qumicas son
resultantes de su estructura molecular.
A pesar de ser elctricamente neutra, es
un dipolo que presenta carga positiva y
negativa. Una consecuencia de esto, es
su capacidad de disolver o neutralizar
la atraccin de cargas elctricas de cris-
tales como NaCl, los cuales son desar-
mados como tales para ser convertidos
en iones hidratados aislados. Esta capa-
EL CULTIVO DE TEJIDOS
cidad del agua como disolvente de subs-
tancias inicas, est reflejada en su alta
constante dielctrica (en torno de 78),
si se compara con la de un lquido org-
nico no polar como el etanol, que es 24
(Hopkins, 1999a).
Otra propiedad resultante de aquella es-
tructura bipolar, es la atraccin electros-
ttica entre las molculas de agua a tra-
vs de puentes de hidrgeno. Por esta
propiedad, cada molcula de agua pue-
de ligarse a cuatro otras vecinas, confi-
gurando una red fantstica de conexio-
nes. Esto, sin duda, otorga un grado de
fuerza de cohesin molecular. Sin em-
bargo, estas ligaciones por puentes de
hidrgeno son dbiles (5 Kcal/mol), lo
cual hace que se rompan casi instant-
neamente. Debido a la fuerza electrost-
tica de las cargas de la molcula, que
estn siempre presentes, estos puentes
se reconstituyen casi con la misma ve-
locidad. As, el estado lquido del agua
al final de cuentas, es un estado osci-
lante entre esta red de molculas de
agua que se hace y deshace, que se arma
y desarma. De esta forma, se va gene-
rando la fluidez que para todos nosotros
es tan familiar a temperatura ambiente
y, que es fundamental para el transporte
de nutrientes, reacciones metablicas,
eficiencia fsico-qumica del coloide
protoplasmtico, presin osmtica y de
turgor de la clula vegetal (Voet y Voet,
1995).
La existencia de esa alta capacidad de
formar puentes de hidrgeno entre las
molculas de agua, tambin es respon-
sable por su alto calor de fusin y de
vaporizacin. Calor de fusin es la can-
tidad de energa necesaria para que una
substancia pase del estado slido al l-
quido. En el caso del agua, este valor es
de 80 cal/g ( 1,4 Kcal/mol). Por otro
lado, calor de vaporizacin es la canti-
dad de energa necesaria para una subs-
tancia dejar el estado lquido y pasar al
estado gaseoso. En el caso particular del
agua a 25 C, el calor de vaporizacin
es de 583 cal/g ( 10 Kcal/mol 44 KJ/
mol), que es a todas luces, un alto valor
para cualquier lquido. Debido a que la
mayor parte de esta energa es usada para
quebrar los puentes de hidrgeno, es pre-
cisamente el agua, el elemento indicado
para que los seres vivos la utilicen en los
procesos fisiolgicos de regulacin de
temperaturas fisiolgicas, como lo es la
transpiracin y el control de la tempera-
tura foliar (Taiz y Zeiger, 2002).
Desde el punto de vista prctico, en un
laboratorio de cultivo de tejidos, adems
de destilar el agua, es conveniente pa-
sarla por un sistema de desionizacin
para conferirle una mayor pureza. Ge-
neralmente puede aceptarse una resis-
tencia elctrica de aproximadamente 10
mega-Ohm. Por otro lado, los recipien-
tes donde sta se almacena, tambin
deben ser motivo de cuidado, siendo los
de vidrio Pyrex preferibles a los no
Pyrex, pues estos ltimos pueden libe-
rar impurezas, como algunas sales en
forma de silicatos, propio de vidrios po-
co procesados. Tambin son tiles reci-
pientes plsticos, pero muchos de stos
no son autoclavables.
b.- Sales Minerales.
Las sales minerales que encontramos en
un medio nutritivo disueltas en el agua,
son denominados de macro y micronu-
trientes y estn constituidos por aproxi-
madamente 17 elementos. Esta denomi-
33
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

nacin alude al hecho de que los pri-

meros, se adicionan al medio en mayor
cantidad que los segundos. As por ejem-
plo, el KNO 3 se puede adicionar hasta
1900 mg/L en el medio Murashige y
Skoog (MS), contra 6,2 mg/L de H 3 BO 3
(un micronutriente) en este mismo cl-
sico medio MS. La inclusin de estos
17 elementos est relacionada con el ca-
rcter esencial de ellos para la planta.
Esto quiere decir que, sta no se desa-
rrolla adecuadamente en su ausencia.
De esta forma, los elementos esenciales
son irremplazables por otros, an estan-
do estos vecinos en la Tabla Peridica.
Estos elementos son los siguientes: car-
bono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno,
fsforo, potasio, calcio, magnesio, azu-
fre, boro, cloro, cobre, fierro, mangane-
so, molibdeno, zinc y nquel (Salisbury
y Ross, 1992). Existen varias formulacio-
nes de medios nutritivos, entre ellas est
el medio: White, MS, B5, Nitsch, SP, etc.
(Tabla 2.1). En la actualidad, se cuenta
con medios especficos para la induc-
cin de diferentes morfognesis, consi- Figura 2.1.
derando por ejemplo si los explantes Plntula de Eucalyptus globulus
provienen de plantas leosas o herb- de 20 das de edad.
La planta ha sido germinada in vitro en
ceas, e incluso se han descrito medios medio SP ms Phytagel, con fotoperodo de
preferenciales dependiendo de ciertas 8 horas luz y temperatura de 25 2 C.
familias o grupos de plantas taxo- Las semillas, antes de ser colocadas a
nmicamente afines (Figura 2.1). germinar, fueron desinfectadas con
hipoclorito de sodio al 5 % durante
30 minutos y provenan de un lote
En muchos casos, la esencialidad o no almacenado durante 4 aos a 10 C
de un elemento en la planta, o en el rei- aproximadamente. En la figura se
no vegetal, todava no est clara. Res- puede observar el vigoroso desarrollo
pecto al fsforo y el magnesio por ejem- del hipoctilo y ausencia del epictilo.
plo, deduciremos fcilmente que unos
de sus papeles fundamentales en las
plantas se relacionan obviamente con la
constitucin del DNA y clorofila, respec-
tivamente. Pero en el caso del silicio,
este rol (o roles) se desconoce (n); as,
puede ser encontrado en muchas plan-

34
EL CULTIVO DE TEJIDOS

Tabla 2.1. Composicin de algunos medios nutritivos (mg/L)

1 2 3 4 5
Componentes MS B5 White Heller SP
**
(NH4)2SO4 134,0

(NH4)2NO3 1.650,0 825,0

NaNO3 600,0
KNO3 1.900,0 2.500,0 80,0 950,0
Ca(NO 3)2 300,0
CaCl2 . 2H 2O 440,0 150,0 75,0 220,0
MgSO 4 . 7H2O 370,0 250,0 720,0 250,0 185,0
Na2SO 4 200,0
KH2PO 4 170,0 125,0 85,0
NaH2PO4 . H2O 150,0 16,5
KCl 65,0 750,0
*
FeSO4 . 7H2O 27,8 27,8 13,9
Na2EDTA 37,3 37,3 18,65
FeCl3 . 6H2O 1,0
Fe2(SO4)3 2,5
MnSO4 . 4H2O 22,3 7,0 0,01 22,0
MnSO4 . H 2O 10,0
ZnSO4 . 7H2O 8,6 2,0 3,0 1,0 8,0
H3BO3 6,2 3,0 1,5 1,0 6,0
KI 0,83 0,75 0,75 0,01
Na2MoO 4 . 2H2O 0,25 0,25 0,25
CuSO4 . 5H2O 0,025 0,025 0,03 0,25
CoCl2 . 6H2O 0,025 0,025 0,25
NiCl2 . 6H2O 0,03
AlCl3 0,03
Mio-inositol 100,0 100,0 50,0
cido nicotnico 0,5 1,0 0,5 1,0
Piridoxina . HCl 0,5 1,0 0,1 1,0
Tiamina . HCl 0,1 10,0 0,1 1,0 1,0
Glicina 2,0 3,0
Pantotenato de Calcio 1,0 1,0
Sacarosa 30.000,0 20.000,0 20.000,0 20.000,0 20.000,0
Kinetina 0,04-10,0 0,1
2,4-D 0,1-1,0 6,0
AIA 1,0-30,0
pH 5,7-5,85 5,5 5,5 5,8
1
Murashige, T. y Skoog, F. 1962. Physiol. Plant. 15:473-497.
2
Gamborg, O., Miller, R.A. y Ojima, K. 1968. Exp. Cell Res. 50:151-158.
3
White, P. 1934. Plant Physiol. 9:585-600.
4
Heller, R. 1953. Researches on the mineral nutrition of plant tissue. Ann. Sci. Nat. Bot. Biol. Vg. 14:1-223.
5
Actual versin modificada de: Barrueto Cid, L., Machado, A., Carvalheira, S. y Brasileiro, A. 1999. Plant Cell Tiss. Org.
Cult. 56:17-23.
**Macronutrientes: NO 3, S0 4 , H 2 P04 , Ca, Mg, K.
*Micronutrientes: Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu, Co, Ni, Cl.

35

tas (ejemplo gramneas), pero no se ha
demostrado su esencialidad en solucio-
nes nutritivas, a pesar de que, en diato-
meas es vital (Epstein, 1975). El selenio
es otro elemento cuya esencialidad no
est declarada para la mayora de las
plantas, no obstante, algunas lo presen-
tan en relativamente altas concentracio-
nes en sus tejidos, (Astragalus y Atriplex,
por ejemplo) a pesar de ser un elemento
txico. El nquel es otro caso sorpren-
dente, se encuentra en la lista de ele-
mentos esenciales, a pesar de que princi-
palmente forma parte de enzimas bacte-
rianas. Entre ellas, la ureasa y monxido
de carbono (CO) deshidrogenasa, ambas
importantes en el ciclo del N 2 y CO 2 en
la naturaleza (Thauer, 2001).
La interaccin de los iones (aniones y
cationes) con la interfase celular, en el
mbito de la clula vegetal, ha sido es-
tudiada con intensiva atencin dentro de
la fisiologa vegetal. Por la informacin
disponible actualmente, el flujo de iones
a travs de la membrana celular depen-
de de una serie de factores. Entre ellos
se pueden citar: carga elctrica de los
iones, concentracin, temperatura, res-
piracin, configuracin de la membra-
na (protenas intrnsecas y extrnsecas),
potencial elctrico de membrana,
AT P a s a s , t r a n s p o r t a d o r e s , c a n a l e s ,
acuoporinas, etc. (Clarkson, 1984;
Levitan y Cibulsky, 2001; Taiz y Zeiger,
2002). Estos factores slo se mencionan
y no se describen, por alejarse del obje-
tivo del presente captulo.
En el laboratorio el uso de esta extensa
lista de sales minerales, plantea el pro-
blema de cmo manipularlas. Mante-
niendo la premisa de la mnima mani-
pulacin de los reactivos para as evitar
36
BIOTECNOLOGA VEGETAL
al mximo los focos de contaminacin,
es altamente recomendable la prepara-
cin de soluciones madres y su manten-
cin en el refrigerador o congelador
(cuando se pueda). Tambin, es reco-
mendable preparar soluciones madre
para macro y micronutrientes. En una so-
lucin madre, las distintas sales se pre-
paran varias veces en su concentracin
normal de trabajo por litro. En el caso
de los macronutrientes del medio MS,
por ejemplo, 10x para un litro (lo que
significa hacer un litro de una solucin
madre con diez veces la concentracin
de usual trabajo de macronutrientes). En
el caso de los micronutrientes, para el
mismo MS, la solucin madre podra ser
de 100x para100 mL de agua (lo que sig-
nifica hacer cien mL de una solucin
madre con cien veces la concentracin
de usual trabajo de micronutrientes). As,
en la preparacin de un litro de medio
(solucin de trabajo), deber utilizarse
1 mL de solucin madre de los micro- y
100 mL de solucin madre de los
macronutrientes.
Las cantidades de sales presentes en los
medios nutritivos, como los ya mencio-
nados, vara de medio en medio. Una
planta in vitro puede presentar deficien-
cias o consumo en exceso (o lujo), se-
gn se encuentre bajo o sobre la con-
centracin crtica del elemento, respec-
tivamente. Esto es, por ejemplo, depen-
diente de si la planta se encuentra sin
races o con ellas. Por este motivo, nu-
merosas veces son preferidos medios
ms diluidos, como el SP. La concentra-
cin crtica de un elemento, es aquella
un poco menor al nivel que da el creci-
miento ptimo de la planta (Hopkins,
1999b). La informacin sobre concen-
tracin crtica de un elemento, en su
EL CULTIVO DE TEJIDOS
mayora es proveniente de las condicio-
nes de nutricin de las plantas en el
campo, o de soluciones hidropnicas en
laboratorio. De esta forma, la utilizacin
de este concepto en el cultivo de teji-
dos, es una extrapolacin de la informa-
cin de las condiciones de nutricin. Sin
duda, una lnea de estudios que consi-
dere lo sealado, se visualiza promisoria
para la tcnica de cultivo de tejidos.
Componentes orgnicos
a.- Vitaminas.
Las vitaminas son una denominacin
genrica que incluye un grupo de sus-
tancias orgnicas presentes en pequeas
cantidades dentro de la clula, partici-
pando de determinadas funciones den-
tro de ella, como por ejemplo, ser un
cofactor no proteico de enzimas.
El nombre de vitaminas est ligado his-
tricamente al polaco Casimiro Funk,
quin descubri que este principio acti-
vo estaba vinculado a la prevencin del
denominada beriberi, una carencia
nutritiva relacionada con la vitamina B 1
en poblaciones que consuman preferen-
temente arroz blanco.
En general, las vitaminas forman parte
de enzimas, por lo que son importantes
para desempear una accin cataltica
normal. En este sentido, son cofactores
de las enzimas, igual que muchos ele-
mentos qumicos presentes entre los
macro y micronutrientes.
La vitaminas se dividen en liposolubles
(A, D, E, K) e hidrosolubles. Entre estas
ltimas tenemos: B 1: tiamina; B 2: ribofla-
vina; B 3: niacina; B 6: piridoxina; biotina;
cido flico; B 12 : cobalamina; cido
ascrbico: vitamina C (Voet y Voet,
1995).
En cultivo de tejidos vegetales bsicamen-
te son utilizadas las del complejo B, sien-
do la B1 probablemente la ms frecuente-
mente incluida. Es vital para la descar-
boxilacin del piruvato, pues es un
aceptor momentneo del grupo ace-
taldehdo, co-auxiliando a la piruvato
descarboxilasa, acetaldehido deshidro-
genasa y -cetoglutarato deshidrogenasa.
La vitamina B 6 (piridoxina), es grupo
prosttico de varias enzimas, siendo el
piridoxal-fosfato la forma ms activa como
grupo prosttico de enzimas que catalizan
reacciones de aminocidos, como por
ejemplo, las transaminaciones, en las cua-
les, el grupo amino de un -aminocido
es transferido a un -cetocido, ejemplo:
glutamato cetoglutamato; aspartato
oxaloacetato.
El cido pantotnico es otra vitamina con
funcin de coenzima, pues, es un cofactor
importante de la Coenzima A, molcula
que desempea un papel importante en-
tre la interfase de la gliclisis y el ciclo de
Kreb (piruvato oxaloacetato) (Stryer,
1992).
Otras vitaminas importantes del comple-
jo B (cido flico, vitamina B 12) y vita-
mina C (cido ascrbico), no son fre-
cuentemente citadas en la literatura del
cultivo de tejidos vegetales. A pesar de
esto, el cido ascrbico puede ser usa-
do como antioxidante (100-200 mg/L) de
explantes, antes de que stos sean ino-
culados en el medio nutritivo, para evi-
37

tar el fenmeno de pardeamiento
(browning). ste es bastante proble-
mtico en el cultivo de tejidos, especial-
mente en plantas leosas. Como an-
tecedente tcnico, es importante men-
cionar que esta vitamina debe ser cons-
tantemente ingerida por el hombre y que
su carencia produce el escorbuto (hemo-
rragias diversas y sangramiento de las
encas, entre otros).
La niacina (B 3 , cido nicotnico), como
componente del complejo vitamnico B,
est presente en la mayora de los me-
dios nutritivos. Adems, es precursor de
NAD + (nicotinamida-adenina-dinucle-
tideo) y NADP + (nicotinamida-adenina-
nucletideo-fosfato), siendo ste su ver-
dadero rol en la planta. En la mayora
de las deshidrogenasas donde estos com-
puestos estn presentes, se unen transi-
toriamente a ellas durante el ciclo
cataltico, oxidndose (NAD + ) o redu-
cindose (NADH), como en el caso de
la malato deshidrogenasa, donde el
malato es deshidrogenado y transforma-
do en oxaloacetato.
b.- Sacarosa
Es el soluto adicionado al medio nutriti-
vo en mayor cantidad como fuente de
energa, y es preferido a otros carbohi-
dratos (White, 1934). La sacarosa, des-
de el punto de vista estructural, est
constituida por la unin de D-glucosa y
D-fructosa ligadas covalentemente a tra-
vs de un enlace glucosdico. Es sinteti-
zada por numerosas plantas, pero no es
sintetizada por los animales superiores.
Constituye un producto intermediario de
la fotosntesis, extremadamente soluble
38
BIOTECNOLOGA VEGETAL
en agua y no tiene poder reductor, sien-
do la forma de transporte de los carbohi-
dratos ms utilizada por las plantas des-
de las hojas a otros rganos, proceso que
ocurre va floema. A travs de este re-
corrido, la sacarosa no es degradada por
enzimas, pero, la invertasa la desdobla
en sus componentes naturales, en el in-
terior de las clulas, en beneficio de la
gluclisis, formacin de almidn, celu-
losa, etc. (Salisbury y Ross, 1992).
Su adicin al medio se justifica debido a
que, el explante o las plntulas que se
generan in vitro, generalmente presentan
una baja tasa fotosinttica debido a sus
condiciones especiales de desarrollo, no
siendo completamente autotrficos.
La concentracin ms frecuentemente
utilizada vara entre 20 a 30 g/L, pero
dependiendo de los casos, puede adicio-
narse en concentraciones ms altas,
como en el cultivo de embriones, orqu-
deas, bulbificacin de ajo, etc.
Es oportuno resaltar que la sacarosa pue-
de ser hidrolizada en su paso por el auto-
clave. Aunque, el impacto de esto para el
explante o la planta no est claro, tampo-
co para el potencial osmtico del medio.
En el mercado, son comercializadas a
travs de diferentes marcas tales como;
Sigma, Merck, Carlo Erba, Fluka, etc.;
todas ellas con alto grado de pureza, lo
que encarece su costo. Adems, es reco-
mendable llamar la atencin sobre el
hecho de que el azcar comn de su-
permercado, presenta un alto grado de
sacarosa (tal vez 98 %), pero puede con-
tener impurezas.
EL CULTIVO DE TEJIDOS

Otros carbohidratos como: glucosa, ma- - Auxinas

nosa, fructosa, sorbitol, etc., tambin
han sido utilizados, sin embargo, no son
de uso frecuente (Tang, 2000).
c.- Hormonas
La mayora de los cultivos de tejidos
vegetales in vitro necesitan de estas
biomolculas (Tabla 2.2). No obstante,
la concentracin y el tipo de hormona
depender de cada caso. En general, son
tres grupos de hormonas las ms emplea-
das: auxinas, citoquininas y giberelinas.
Existen otras dos biomolculas muy im-
portantes dentro de las hormonas: el
etileno y el cido abscsico, que aunque
son menos utilizados, juegan papeles
importantsimos dentro del metabolismo
del explante in vitro. Por ejemplo, el
etileno es capaz de activar enzimas re-
lacionadas con la senescencia y oxida-
cin fenlica del tejido (Davies, 1995).
Entre stas (Tabla 2.2, Figura 2.2), est
el cido indolil-3-actico (AIA), cuya
sntesis es realizada a partir del tript-
fano, el cual dependiendo de la planta,
por va enzimtica puede primeramente
descarboxilarse o desaminarse, para des-
pus dar origen al indol-3-acetaladeh-
do, el cual, por oxigenacin da origen
al AIA. Esta hormona es sintetizada a
partir de tejidos meristemticos en la
planta (meristema apical, radicular, ye-
mas embriones, etc.). El cido naftalena-
ctico (ANA), picloram (cido 3,5,6
tricloropicolinico), cido indolbutrico
(AIB), cido 2,4-diclorofenoxiactico
(2,4-D), cido 4-cloroindol-3-actico (4-
Cl-AIA), etc., son ejemplos de auxinas.
No todas las auxinas son hormonas, es
as como el ANA, picloram, 2,4-D, etc.,
son denominados reguladores de creci-

Tabla 2.2. Lista de algunos reguladores de crecimiento y de hormonas

usadas en cultivo de tejidos de plantas.

Nombre Abreviatura Peso molecular (g)

cido indolil-3-actico AIA 175,2

cido indolil-3-butrico AIB 203,2
cido diclorofenoxiactico 2,4-D 221,0
cido -naftalenactico ANA 186,20
cido p-clorofenoxiactico APCF 186,60
cido 2,4,5-triclorofenoxiactico 2,4,5-T 225,49
cido 2-metoxi-3,6-diclorobenzoico Dicamba 221,0
cido 4-amino-3,5,6-tricloropicolnico Picloram 241,46
cido abscsico ABA 264,3
Adenina A 135,13
6-(4-hidroxi-3-metil-trans-2-butenilamino) purina Zeatina 219,0
N 6-furfuriladenina, o, 6-furfurilaminopurina Kinetina 215,2
6-bencilamino purina,o,6-benciladenina BAP, BA 225,3
6-(,-dimetilalilamino) purina,o, 2-isopenteniladenina 2iP 203,25
1-fenil-3-(1,2,3-tiadiazol-5-il) urea TDZ 220,2

39
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

A B
CH 2COOH CH 2CH 2CH 2OOH

N N
H

OCH 2COOH CH 2COOH

C D
Cl

Cl

OCH 2COOH OCH 2COOH

E F Cl

Cl
Cl Cl
G COOH H NH 2
CH 3O Cl Cl
Cl

Cl Cl COOH
N

Figura 2.2. Estructura qumica de algunas auxinas

usadas en micropropagacin.
A: AIA; B: AIB; C: 2,4-D; D: ANA; E: APCF; F: 2,4,5-T;
G: Dicamba; H: Picloram. Ver Tabla 2.2.

miento y no hormonas, pues no son pro- - Citoquininas.

ducidos por la planta.
La cantidad de auxinas usadas en los
medios nutritivos es baja, con concen-
traciones en el orden micromolar (M).
En cantidades mayores, producen efec-
tos de herbicida y por lo mismo, son
txicas. Pueden ser disueltas en KOH o
NaOH 0,1 N y almacenadas en conge-
lador como una solucin madre. Entre
las acciones fisiolgicas promovidas por
las auxinas en la micropropagacin es-
tn: la induccin de callos, induccin
de races, establecimiento de suspensin
celular, metilacin de la citocina, forma-
cin de frutos, etc. (Fernandez, 2000).
Este grupo de hormonas (Figura 2.3) es
normalmente usado en el cultivo de te-
jidos para promover el desarrollo de ye-
mas adventicias a partir de callos o
embriognesis somtica (Barrueto Cid et
al., 2004). Esto ha tenido un gran im-
pacto, por ejemplo, en la industria de la
floricultura. Tambin se ha demostrado
su influencia en la tuberizacin de pa-
pas (Solanum tuberosum) in vitro
(Palmer y Smith, 1969).
Las citoquininas pueden ser encontradas
libres o formando parte de anticodn de
tRNAs, como en el caso del tRNA de la

40
EL CULTIVO DE TEJIDOS

A NH 2 B CH 3
N CH 2 - CH= C
N CH 2OH
NH
N
N N
N H

N
N H
C
NHCH 2
N
N O

CH 2
N
N D
H NH
N
CH 3 N
CH 2 - CH= C
E CH 3
NH N
F N H
N
N N CH O
H H
N C N C N
N
N H S

Figura 2.3. Estructura qumica de algunas citoquininas.

A: Adenina; B: Zeatina; C: Kinetina; D: BAP; E: 2iP; F: TDZ. Ver Tabla 2.2.

serina (Hall, 1973). La biosntesis de las
citoquininas en plantas, Arabidopsis, es
preferentemente va ATP o ADP con
isopentenilpirofosfato ( 2-iPP) para dar
iPTP (isopenteniladenosina- 5-trifosfato
en el caso de ser usado ATP). En este
paso metablico participa la enzima
isopentenil transferasa (IPT) y es primor-
dial para la sntesis de citoquininas. IPTP
es un producto clave en la biosntesis
de la zeatina: 6-(4-hidroxi-3-metil-trans-
2-butenilamino purina). A partir de IPTP
sta se origina, siendo la zeatina, una
de las citoquininas ms activas en el
cultivo de tejidos. En bacterias, su sn-
tesis es a partir de AMP y no de ATP o
ADP como en Arabidopsis.
En general, los trabajos pioneros sobre
citoquininas fueron iniciados por Folke
Skoog en la Universidad de Wisconsin,
cuando trataba de encontrar algn com-
puesto que estimulara la proliferacin
celular en cultivos de tejidos in vitro
(Fosket, 1994).
La zeatina y 2iP [ (6 --dimetilamino-
purina, conocida tambin por IPA (iso-
pentenil adenina) ] , son dos citoquininas
naturales en oposicin a la Kinetina (6-
furfurilamino-purina) y BAP (6-bencila-
mino-purina), que son dos reguladores
del crecimiento. TDZ (N-fenil-N-1,2,3-
tidiazol-5-il urea) es una citoquinina sin-
ttica del grupo de la urea, no prica,
teniendo un poderoso efecto citocinni-
co en muchas plantas cultivadas in vitro
(Murthy et al.,1998).

41

Las citoquininas tambin son usadas en
pequeas cantidades (M), son solubles
en HCl 0,1 N y mantenidas como solu-
cin madre congeladas.
Las citoquininas, a pesar de ser un com-
ponente fundamental en los protocolos
de micropropagacin, pueden estimular
hiperhidricidad, fenmeno en el cual la
planta toma un aspecto vitrificado, por
tanto, sin valor comercial. La hiperhidri-
cidad es un desorden fisiolgico de la
planta in vitro, caracterizado por hojas
rgidas y quebradizas, anormalidad esto-
mtica y deficiente formacin de la cut-
cula. La vitrificacin puede tener otras
causas tambin, por ejemplo, exceso de
humedad relativa dentro del frasco, al-
tos niveles de NH4 y citoquininas
(Daguin y Letouz, 1986; Leshem, et al.,
1988; ver captulo 4).
- Etileno.
El etileno en su relacin con la planta,
fue conocido primero como un agente
qumico externo con poderosos efectos
fisiolgicos. Mucho ms tarde, se des-
cribi en efecto como una hormona ve-
getal propiamente tal, esto es, como un
principio activo producido por la plan-
ta (Johnston, 2000). Su sntesis est li-
gada a precursores como la metionina,
un aminocido que contiene un grupo
R apolar con S y CH 3 presentes.
Entre los efectos fisiolgicos de este gas
pueden citarse: ruptura de dormancia de
papas, induccin de maduracin de fru-
tas e induccin de abscisin foliar. Pa-
ralelamente a esto, el etileno tiene un
efecto regulador sobre otras actividades
de la planta, como respuesta a las heri-
42
BIOTECNOLOGA VEGETAL
das del tejido y estrs. En este sentido,
se le ha descrito induciendo poblacio-
nes de mRNAs de varios genes, entre
ellos, aquel que codifica para celulasas
(Tal e Imber, 1970). Vale la pena sealar
que etileno posee ya un rol asumido en
el proceso de defensa de las plantas, el
cual sera aportar en una respuesta de-
fensiva de tipo sistmico.
Interesante es que el CO 2 puede anular
algunos de sus efectos, lo que preferen-
temente se observa en la inhibicin de
proceso de maduracin de frutos clima-
tricos. Del mismo modo, la ciclohexi-
mida y la actinomicina D, pueden inhi-
bir respuestas al etileno, sugiriendo la
mediacin de eventos relacionados con
la transcripcin y transduccin, respec-
tivamente; debido a que estos compues-
tos actan a estos niveles de la sntesis
proteica (Leopold y Kriedemann, 1975).
El efecto local o a distancia, tal vez no
est mediado por ningn tipo de inter-
mediacin, por que como gas, se movi-
liza conforme a la ley de Fick, o sea, por
una gradiente de concentracin.
En el cultivo de tejidos, sus efectos son
contradictorios, pues existen casos don-
de participa promoviendo eventos, como
la embriognesis somtica y casos don-
de tiene un efecto inhibitorio, como en
la morfognesis (Hatanaka et al., 1995;
Kumar et al., 1998).
El explante tiene capacidad para produ-
cir esta olefina y por tanto, influir en su
concentracin dentro del frasco afectan-
do favorablemente o no, la direccin de
un proceso morfognico. Una manera de
disminuir el efecto perjudicial del
EL CULTIVO DE TEJIDOS
etileno presente en el tejido, es a travs
del uso de AgNO 3 . Este es un inhibidor
c o m p e t i t i v o d e l a h o r m o n a ( B e y e r,
1976). Tambin se puede incluir el uso
de CoCl 2 y NiCl 2 , los cuales son inhi-
bidores de su sntesis (Biddington, 1992).
En relacin a la naturaleza gaseosa del
etileno, es oportuno mencionar que ade-
ms en las plantas existe el xido ntri-
co (NO) (Wojtaszek, 2000), un gas que
se comporta como un potente modu-
lador de numerosos procesos biolgicos.
Entre ellos: apoptosis, lignificacin de la
pared celular, defensa de la planta fren-
te a patgenos, etc. (Beligni y Lamattina,
2001; Pedroso et al., 2000; Orozco-Cr-
denas y Ryan, 2002). Como modulador,
se ha descrito su accin en relacin con
la sntesis de guanosn-monofosfato c-
clico (cGMP), a partir de la enzima
guanilato ciclasa. El cGMP es conside-
rado un segundo mensajero y por lo tan-
to, est comprometido en reacciones de
transduccin de seales al interior de la
clula. En este sentido, NO tambin est
ejecutando roles de transducin de se-
ales a nivel de fitocromo, otra molcu-
la de carcter regulatorio en las plantas.
En los animales, NO es sintetizado va
L-arginina por la enzima xido ntrico
sintasa (NOS). En plantas, hasta ahora
esta va no ha sido plenamente acepta-
da, entre otras razones, porque esta en-
zima no ha sido aislada. Como radical
libre, NO puede producir fragmentacin
del DNA e inactivacin de ciertas enzi-
mas, por lo tanto, puede provocar la
muerte celular. Finalmente, se discute si
el NO esta metablicamente ligado al
etileno (Magalhes et al., 1999).
- Giberelinas.
La historia de la giberelinas (GA) est
ligada a los arrozales del Japn, en co-
mienzos del siglo XX. En efecto, se ob-
serv que plantas contaminadas con el
hongo Gibberella fujikuroi, crecan ms
que sus congneres (Matsumoto, 2000).
Las innumerables giberelinas existentes
en las plantas, son diterpenoides con tres
anillos aromticos, cuya base estructu-
ral, en ltimo trmino, es el isopreno,
un compuesto de cinco carbonos. Las
plantas producen una enorme cantidad
de isoprenoides, entre ellos, las resinas
de los pinos y el ltex del caucho. Entre
los precursores de la biosnteis de las
giberelinas estn el cido mevalnico,
isopentenilpirofosfato, kaureno, en una
larga sequencia de pasos metablicos
hasta culminar en el citosol, con la for-
macin de este tipo de hormonas.
Entre los efectos fisiolgicos de las
giberelinas, puede citarse la elongacin
de: plantas enanas (maz, poroto), plan-
tas en roseta (repollo), hipoctilo de le-
chuga y produccin de alfa amilasa en
semillas de gramneas. Resulta interesan-
te el hecho que existan sustancias que
pueden anular estos efectos, porque pue-
den afectar a su biosntesis; entre ellas:
AMO 1618, CCC, Fosfon D, Ancymidol,
etc. (Wareing y Phillips, 1982).
Entre los sitios de sntesis, puede citarse
el meristema apical y radicular, no exis-
tiendo evidencias muy poderosas sobre
su polaridad en la translocacin, porque
ha sido detectado tanto en el floema
como en el xilema. En el cultivo de teji-
dos vegetales, no es frecuente su uso.
43

Sin embargo, existen registros de su uti-
lizacin en la elongacin de brotes ad-
venticios de callos. Adems, debe tener-
se presente que las enrgicas condicio-
nes de temperatura y presin del auto-
clave, degradan la molcula y su presen-
cia en el medio de cultivo, pudiendo in-
hibir el enraizamiento de las plntulas.
- cido abscsico.
El cido abscsico (ABA) es un compues-
to hormonal que tiene ms accin
inhibitoria que estimuladora. Depen-
diendo de la posicin del grupo car-
boxilo, presenta dos formas isomricas
cis/trans (referido esto a la posicin de
los grupos sustituyentes en el doble en-
lace), pero, en funcin de una asimetra
del C 1, presenta tambin isomera . Sin
embargo, en la planta, la forma + y cis
son las ms abundantes. La oxidacin de
la xantofila, un carotenoide, constituye
una va de sntesis (Lemus, 2000), sien-
do en esta ruta, la 9cis-neoxantina un
intermediario importante capaz de ori-
ginar a la xantoxina (C 15), el precursor
ms inmediato de la sntesis del ABA
(Walton y Li, 1995).
El estrs hdrico en la planta estimula la
sntesis de ABA en la hojas, la que parte
en los cloroplastos (Orozco-Crdenas y
Ryan, 2002). Tambin, algunos plastidios
podran sintetizarlo (Cutler y Krochko,
1999). Desde el punto de vista fisiolgi-
co, el ABA estimula el cierre de los
estomas, desempeando un papel fun-
damental en la economa hdrica de la
planta (Walton y Li, 1995). Algunos
mutantes carecen de la capacidad para
cerrar sus estomas, presentando un mar-
chitamiento permanente. Las evidencias
44
BIOTECNOLOGA VEGETAL
experimentales en este caso han mostra-
do que la falta de ABA provocara tal
fenmeno, debido a que, aplicaciones
exgenas con ABA restituyen la condi-
cin hdrica normal (Tal y Imbert, 1970).
Por otro lado, trabajos ms recientes, in-
dican que el NO y ms especficamente
el cGMP, seran intermediarios a travs
de los cuales el ABA ejercera su accin
(Steven et al., 2002).
En cultivo de tejidos vegetales su uso es
muy restringido, pero hay referencias de
su utilizacin en la embriognesis som-
tica (Ammirato, 1983) y en la poliembrio-
gnesis (Cutler y Krochko, 1999), ya sea
para inhibir la germinacin de embrio-
nes mal conformados o como requeri-
miento del proceso de maduracin de los
mismos. Otros antecedentes dan cuenta
de que el ABA ha sido usado para alma-
cenar embriones cigticos durante algn
tiempo bajo condiciones in vitro. Luego
de este perodo, al remover la hormona,
los embriones germinan aparentemente
en forma normal. Tal prctica tendra uti-
lidad en la conservacin de germoplasma
de semillas recalcitrantes, como por
ejemplo en caf (Murthy et al., 1998).
- cido jasmnico.
El cido jasmnico (JA) y los jasmonatos
en general, se encuentra en forma natu-
ral en una serie de plantas desempean-
do un papel fundamental en el desarro-
llo de las mismas, especialmente en
cuanto a respuestas a estrs ambiental.
Respecto a su efecto sobre el desarro-
llo, JA y sus derivados pueden afectar la
maduracin de los frutos a travs de su
accin estimulante sobre la cido 1-ami-
nociclopropano 1-carboxlico sintetasa
EL CULTIVO DE TEJIDOS
(ACC-sintasa) y la ACC-oxidasa, dos en-
zimas claves en la sntesis del etileno.
En relacin al estrs ambiental, pueden
activar el sistema de defensa de la plan-
ta, la ya mencionada proteccin sist-
mica frente a ataques de hongos o insec-
tos, interaccin en la cual desempea un
papel importante la sistemina, polipp-
tido hormonal que gatilla la sntesis de
JA. ste a su vez, activa la expresin de
ciertos genes, por ejemplo los relacio-
nados con la inhibicin de proteinasas
(Creelman y Mullet, 1997). La ruta bio-
sinttica del cido jasmnico comienza
con el cido linolnico (18:3), un com-
ponente de la membrana celular y la
accin de lipoxigenasas (LOX) (Pea -
Corts, 2000).
En cultivo de tejidos, su uso ha sido ms
bien discreto y se lo ha vinculado a la
produccin de microtubrculos in vitro
en especies tuberizantes (Pelacho y
Mingo-Castel, 1991), inhibidor del cre-
cimiento de callos y de la germinacin
de semillas, cuando es aplicado exge-
namente (Steven et al., 2002).
- Triacontanol.
Dentro del conjunto de hormonas y re-
guladores del crecimiento de plantas que
tradicionalmente han sido utilizados en
la micropropagacin, se suma ahora
tambin el Triacontanol, como promo-
tor de induccin de yemas y enraiza-
miento (Reddy et al., 2002). Este com-
puesto es un alcohol primario de cade-
na larga [CH 3 (CH 2 ) 28 CH 2 OH], con peso
molecular de 438,8 g cuya biosntesis no
es bien conocida. Se encuentra presen-
te en la composicin de la cutcula de
las hojas, mezclado con otros compo-
nentes de la matriz cuticular; entre ellos,
cidos grasos simples, hidroxilados o
esterificados y ceras. El compuesto es
soluble en cloroformo y puede ser
autoclavado (121C / 20 min). En Malus
domestica, ha sido utilizado en concen-
traciones que van entre 2 a 20 g/L. En
esta especie acta estimulando la
brotacin y el enraizamiento (Tantos et
al., 2001). Esto permite incrementar las
respuestas regenerativas especialmente
en plantas de carcter leoso ms recal-
citrantes. Adems, es conveniente recal-
car que su uso an no es generalizado.
d.- Agentes gelificantes
El agente gelificante es un carbohidrato
(hetero-polisacrido) cuya concentra-
cin puede variar entre 50 a 90 %. Estos
agentes son necesarios para dar consis-
tencia al medio nutritivo, de modo que
el explante quede en la superficie. En el
mercado se ofrece en diferentes marcas
(Sigma, Merck, nacionales) y precios. La
cantidad por litro puede variar desde 2
g/L en el caso de Gelrite hasta 6 a 8 gr
por litro, en el caso del agar puro y sim-
ple. El agente gelificante se disuelve en
el agua a 100 C y solidifica alrededor
de los 45 C. Este ltimo dato es impor-
tante, porque en el caso de que sustan-
cias termolbiles deben adicionarse al
medio despus de autoclavado, esto
debe hacerse un poco antes de que la
temperatura del medio llegue a ese va-
lor. Otras preocupaciones respecto a este
tipo de ingrediente es que puede ir
acompaado de sales, producir vitri-
ficacin en las plantas obtenidas y de-
pendiendo del pH, puede ser hidro-
lizado en su paso por el autoclave
(George, 1993b).
45

Dentro del amplio espectro de ingredien-
tes del medio nutritivo, el precio del
agente gelificante es uno de los ms ele-
vados (sobre US$ 100/Kg). Por eso, a ve-
ces, se utilizan alternativas ms baratas
como es el almidn de maz, maicena
(Barrueto Cid et al., 1994) o soportes de
papel de cromatografa (Pierik, 1987c).
Sin embargo, la posibilidad de usar estas
alternativas ms baratas depender de la
complejidad del experimento; por ejem-
plo, en el caso de la embriognesis
somtica de vides el agente gelificante de
los medios debe ser de mxima calidad.
e.- Otros.
Es oportuno sealar que los medios nu-
tritivos pueden ser complementados con
una amplia gama de otras sustancias,
conforme su finalidad. Por ejemplo, en
el caso de seleccin para tolerancia a
estrs u obtencin de mutantes, pueden
contener variadas concentraciones de
NaCl; metales pesados (Cd, Al y otros);
anlogos de aminocidos (5-metiltrip-
tofano, p-fuorofenilalanina); anlogos de
bases pricas o pirimdicas (bromodeo-
xiuridina:BUdR; 8-azaguanina, etc);
antibiticos (cefotaxima, puromicina,
kanamicina, etc.); toxinas de hongos,
etc. El estrs es considerado como sin-
nimo de cualquier causa ambiental ca-
paz de desencadenar efectos hacia el
interior de la clula, estos cambios pue-
den ser elsticos (reversibles) o plsti-
cos (permanentes). En este ltimo caso,
con la adquisicin o prdida de una ca-
racterstica en particular.
Diversos trabajos en el rea, como ob-
tencin de mutantes, exigen normalmen-
te cultivos de clulas en medio lquido,
46
BIOTECNOLOGA VEGETAL
las cuales se someten por algn tiempo
a un tipo de mutgeno tal como etilme-
tano-sulfonato o radiacin gamma. Pos-
teriormente, las clulas se transfieren a
un medio slido en presencia de un
agente de seleccin deseado, el cual,
puede ser un antibitico, herbicida,
NaCl, etc., en diferentes concentracio-
nes. Las clulas que se multiplican bajo
condiciones de una concentracin alta
de cualquiera de estos agentes, estarn
presentando una resistencia a tal condi-
cin y, por lo tanto, sugiriendo la pre-
sencia de un mutante. Posteriormente,
estas clulas son inducidas a multipli-
carse para formar callos y a partir de
aqu, regenerar plantas. Finalmente, s-
tas se sometern a las pruebas corres-
pondientes para verificar si se ha gene-
rado realmente un mutante y, si su des-
cendencia presenta o no, tal caracters-
tica. Este tipo de trabajos tiene bastante
impacto en el rea agrcola, especial-
mente en el rea fitopatolgica, donde
la bsqueda de materiales resistentes a
enfermedades es muy persistente
(Thakur et al., 2002).
Finalmente, habra que sealar que el
cultivo de tejidos de plantas no es una
ciencia, sino una tcnica, como cual-
quier otra. As, el cultivo de tejidos uni-
do a otras tcnicas tales como: la inmu-
nofluorescencia para el estudio de mi-
crotbulos, el anlisis citomtrico para
determinar cantidad de DNA en el ciclo
celular, la autorradiografa para rastrear
y localizar compuestos radioactivos por
los pasajes secretos de la clula y la
transformacin gentica para el mejora-
miento de plantas, ha permitido grandes
avances en el estudio de la biologa de
plantas y en la comprensin del fen-
EL CULTIVO DE TEJIDOS
meno biolgico. De esta forma, el culti-
vo de tejidos de vegetales ocupa un lu-
gar clave dentro de lo que se ha deno-
minado la segunda revolucin verde,
refirindose a los grandes avances de la
biotecnologa, justamente, por todas
esas ventajas enumeradas al final del
captulo anterior.
ALGUNOS ASPECTOS PRCTICOS
SOBRE EL LABORATORIO DE
CULTIVO DE TEJIDOS
DE PLANTAS.
Como toda tcnica, el cultivo de tejidos
tiene necesidad de una infraestructura y
equipamientos bsicos para operar
(George, 1993a). En relacin a la infra-
estructura, son varios los espacios nece-
sarios para desarrollar un trabajo adecua-
do. Si se excluye la produccin de
plntulas a gran escala y si consideramos
una unidad acadmica o de investiga-
cin, la infraestructura bsica considera
cinco salas, incluyndose una dos
como fitotrones. Una sala de lavado y
secado del material de vidrio, una segun-
da de autoclavado, una tercera para pre-
paracin de medios y balanzas, una cuar-
ta de inoculacin y una quinta de man-
tencin y crecimiento, con fotoperodo
y temperatura controlada. Se estiman 15
m 2 aproximadamente por sala, alcanzn-
dose 75 m 2 de superficie total.
Esta estructura slo podra sustentarse
con un proyecto de investigacin y/o
venta de algn tipo de servicio, como
por ejemplo, plntulas o plantines para
el rea agrcola, forestal u ornamental.
En el tem sustancias qumicas, se inclu-
ye una extensa lista que considera; sa-
les, hormonas, vitaminas, agar, antibi-
ticos, etc. Por otro lado, no menos exten-
sa es la lista de material de vidrio que
invariablemente incluye, matraces
Erlenmeyer, tubos de ensayo, vasos pre-
cipitados, placas Petri, etc., todos de
diferentes capacidad volumtrica y re-
sistentes al autoclavado, de vidrio Pyrex
o polmeros plsticos.
A estas listas deben agregarse todava los
equipos, tales como cmara de flujo la-
minar, pH-metros, balanzas, lupas, mi-
croscopios, micropipetas, refrigeradores,
congeladores, centrfuga y equipos es-
pecializados segn sea el caso, por
ejemplo agitadores, electroporador, ul-
tracentrfugas, biorreactores, etc. Todo
eso sin contar con el personal tcnico y
de apoyo que debe gerenciar y ejecutar
las actividades corrientes de un labora-
torio con estas caractersticas.
Por consideraciones de costos, los labo-
ratorios de cultivo de tejidos de plantas,
estn cada vez ms restringidos y es fre-
cuente encontrarlos compartiendo de-
pendencias con el rea de transforma-
cin gentica, que tambin emplea la
misma infraestructura sealada.
Con el propsito de disminuir costos de
mantencin, el cultivo de tejidos de plan-
tas ha desarrollado nuevas estrategias o
soluciones innovativas, como es el caso
de los biorreactores. Estos sistemas de
propagacin de plantas en medios lqui-
dos de cultivo, pueden disminuir costos
de mantencin de una produccin de
plntulas a gran escala (Barrueto Cid et
al., 2002; Teixeira, 2002).
Considerando que la asepsia del ambien-
te y del material de trabajo es primordial,
47

el orden en el laboratorio y un equipo
como el autoclave, a pesar del costo de
adquisicin, son elementos bsicos. Ade-
ms, es oportuno llamar la atencin que
no todos los componentes de un medio
nutritivo se pueden autoclavar, como por
ejemplo, antibiticos, L-glutamina, GA 3,
pantotenato de calcio, colchicina, extrac-
tos de plantas, etc. (Pierik, 1987b). Para
el uso de estos componentes, es necesa-
rio disponer tambin de un sistema de
filtracin adicional.
En el momento de abrir un frasco de cul-
tivo para inocular un explante, el aire
circulante debe estar libre de microorga-
nismos. Eso slo es posible en presen-
cia de una cmara de flujo laminar, cuyo
aire circulante es siempre renovado y li-
bre de micropartculas. Por otro lado, el
mencionado frasco conteniendo el me-
dio nutritivo en su interior, ya debera
haber sido previamente esterilizado
(120C, 1 atmsfera por 20 minutos) para
anular el crecimiento de cualquier pa-
tgeno en su interior, pues el ambiente
interno es un ambiente propicio para el
desarrollo de esporas de bacterias y hon-
gos. En la Tabla 2.3, se muestra algunos
de los desinfectantes ms usados en un
laboratorio de cultivo de tejidos (Ba-
rrueto Cid, 2001).
Tabla 2.3. Agentes desinfectantes empleados en la
asepsia de explantes.
Agente desinfectante
Alcohol etlico
Cloruro de mercurio
Hipoclorito de calcio
Hipoclorito de sodio
Perxido de hidrgeno
48
BIOTECNOLOGA VEGETAL
La concentracin y los tiempos de ex-
posicin dependen del tipo de explante.
Es as como, las semillas requieren de
perodos ms prolongados y concentra-
ciones ms altas que un explante foliar.
Las pinzas y bistur, que es el material
que se pone en contacto con el explante,
puede ser esterilizado a travs de flameo
en el momento de la inoculacin. Por
lo tanto, es suficiente introducir el ma-
terial en el recipiente (generalmente un
tubo de ensayo con alcohol 95 %) y
retirarlo, luego exponerlo una sola vez
a la llama del mechero y despus apo-
yarlo en una placa Petri. Si la lmina de
alcohol cubri toda la superficie til de
la pinza o bistur, la llama generada ser
suficiente para lograr la desinfeccin, no
siendo necesario repetir la operacin.
El uso de luz UV ha disminuido como
agente de esterilizacin a partir de la apa-
ricin de las cmaras de flujo laminar, en
el laboratorio de cultivo de tejidos.
Los frascos usados para el trabajo de cul-
tivo de tejidos presentan una gran va-
riabilidad de formas y capacidad volu-
mtrica. El volumen de medio requeri-
do comnmente puede variar de 30 a 15
mL dependiendo si es placa de Petri o
Concentracin Tiempo
(%) (minutos)
75-95 0,5 -1
0,1-1,0 1-5
7-10 5-20
2,5 9 5-20
2-10 5-12
EL CULTIVO DE TEJIDOS
tubo de ensayo. Lo importante es que
ste deje un espacio interior libre de 70-
80% del volumen total del frasco. Esto
no es slo vlido para medios slidos,
sino que tambin para medios lquidos,
como es el caso de clulas en suspen-
sin, las cuales requieren de buenos y
poderosos agitadores para mantener las
clulas en constante movimiento por
perodos prolongados.
El medio nutritivo, representa una diver-
sidad enorme de sustancias (consultar
Tabla 2.1) para las necesidades nutricio-
nales del explante o de las plantas en el
interior de los frascos de cultivo. Esto de-
termina que el pH del medio normal-
mente quede en un rango muy cido 3,5
4,0 cuando ste termina de preparar-
se. Este pH es poco adecuado fisiolgi-
camente para la mantencin y creci-
miento del material micropropagado.
Por eso, la necesidad de contar con un
pH-metro para elevar el pH del medio
nutritivo antes de adicionar el agar y pro-
ceder a autoclavar, a niveles ms com-
patibles con la absorcin de los iones,
evitando de este modo provocar defi-
ciencias o toxicidad por exceso de ab-
sorcin. El valor de pH establecido en
cultivo de tejidos de planta ha sido em-
pricamente fijado en 5,8. Este valor pue-
de ajustarse con K OH o Na OH 0,1-1,0
N (Torres, 1989), sin haberse observado
efectos adversos o txicos sobre la c-
lula. Como la escala del pH es expo-
nencial, la diferencia entre 4 y 5, por
ejemplo, no es de una unidad sino de
10, por eso la preocupacin con este
factor. El uso del pH-metro requiere cier-
tos cuidados, como por ejemplo, no des-
cuidar la calibracin peridica ni dejar
secar el electrodo. En la eventualidad de
que el medio posea carbn activado, la
medicin del pH tambin debe ser rea-
lizada antes de adicionar el carbn acti-
vado. Despus de autoclavado el medio
y en la cmara de flujo laminar, es reco-
mendable agitarlo para que tanto el agar
como el carbn queden bien distribui-
dos en los frascos o tubos de ensayos.
49
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

REFERENCIAS. Clarkson, D. 1984. Ionic relations, pp. 319-

353. In: Wilkins, M. (ed.), Advanced plant
physiology. Pitmar Pub., Massachusetts,
Ammirato, P. 1983. Embryogenesis, pp. 82-123,
USA.
In: Evans, D. et al. (eds.), Handbook of plant
cell culture. Vol.1. Techniques for propa-
Creelman, R. y Mullet, J. 1997. Biosynthesis
gation and breeding. Macmillan Publishing
and action of jasmonates in plants. Ann.
Co., New York, USA.
Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:355-
381.
Barrueto Cid, L., Illg, R. y Piedrabuena, A.
1994. Regeneration of garlic plants (Allium
Cocking, E. 1960. A method for the isolation
sativum L. Cv. "Chonan") via cell culture in
of plant protoplast and vacuoles. Nature
liquid medium. In vitro 30:150-155.
187:927-929.
Barrueto Cid, L., Machado, A., Carvalheira, S.
Cutler, A. y Krochko, J. 1999. Formation and
y Brasileiro, A. 1999. Plant regeneration
breakdown of ABA. Trends in Plant Science
from seedling explants of Eucalyptus grandis
4:472-478.
x E. Urophylla. Plant Cell, Tissue and Organ
Culture 56:17-23.
Daguin, F. y Letouz, R. 1986. Ammonium-
induced vitrification in cultured tissues.
Barrueto Cid, L. 2000. Citocininas, pp. 55-74.
Physiologia Plantarum 66:94-98.
In: Barrueto Cid, L. (ed.), Introduo aos hor-
mnios vegetais. EMBRAPA Recursos Gen-
Davies, P. 1995. Plant Hormones: Their nature,
ticos e Biotecnologia, Brasilia, D.F., Brasil.
occurrence, and functions. pp. 1-38. In: Da-
vies, P. (ed.). Plant Hormones: Physiology,
Barrueto Cid, L. 2001. A propagao in vitro
Biochemistry and Molecular biology.
de plantas. O que isso?. Biotecnologia
Kluwer Academic Pub., Dordrecht, The
Cincia & Desenvolvimento 3:16-21.
Nederlands.
Barrueto Cid, L., Cruz, R. y Teixeira, J. 2002.
Dodds, J. y Roberts, L. 1982. Experiments in
Biorreatores de imerso permanente.
plant tissue culture. Cambridge University
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
Press, Cambridge, England.
4:50-53.
Epstein, E. 1975. Nutrio mineral das plantas
Barrueto Cid, L., Cruz, A. y Castro, L. 2004.
princpios e perspectivas. pp. 43-69. Univer-
Somatic, embryogenesis from three coffee
sidad de So Paulo, Rio de Janeiro, Brasil.
cultivars:"Rubi", "Catua Vemelho 81", and
"IAPAR 59". HortScience 39:130-131.
Fernandez, G. 2000. Auxina. pp. 15-53. In:
Barrueto Cid, L. (ed.). Introduo aos
Biddington, N. 1992. The influence of ethylene
hormnios vegetais. EMBRAPA Recursos
in plant tissue culture. Plant Growth
Genticos e Biotecnologia, Braslia D.F.,
Regulation 11:173-187.
Brasil.
Beligni, M. y Lamattina, L. 2001. Nitric oxide:
Fosket, D. 1994. Plant growth and develop-
a non traditional regulator of plant growth.
ment. A molecular approach. pp. 311-312.
Trends in Plant Science 6:508-509.
Academic Press, San Diego, USA.
Beyer, E. 1976. A potent inhibitor of ethylene
Gamborg, O., Miller, R. y Ojima, K. 1968.
action in plants. Plant Physiol. 58:268-271.
Nutrient requirements of suspension
cultures of soybean root cells. Experimen-
Carlson, P. 1970. Induction and isolation of
tal Cell Research 50:151-158.
auxotrophic mutants in somatic cultures of
Nicotiana tabacum. Science 168:487-489.

50
EL CULTIVO DE TEJIDOS
George, E. 1993a, Plant propagation by tissue
culture. Part 1: the technology. pp. 95-129.
Exegenetics Ltd., Reading, England.
George, E. 1993b. Plant propagation by tissue
culture. Part 1: the technology. pp. 337-
343. Exegenetics Ltd., Reading, England.
Guha, S. y Maheshwari, S. 1964. In vitro pro-
duction of embryos from anthers of Datura.
Nature 204:497.
Hall, R. 1973. Cytokinins as a probe of
developmental processes. Ann. Rev. Plant
Physiol. 24:415-444.
Hatanaka, T., Sawabe, E., Azuma, T., Uchida,
N. y Yasuda, T. 1995. The role of ethylene
in somatic embryogenesis from leaf discs
of Coffea canephora. Plant Science
107:199-204.
Heller, R. 1953. Researches on the mineral
nutrition of plant tissue. Ann. Sci. Nat. Bot.
Biol. Veg. 14:1-223
Hopkins, W. 1999a. Introduction to plant
physiology. pp. 26-27. John Wiley & Sons
Inc., New York, USA.
Hopkins, W. 1999b. Introduction to plant
physiology. pp. 67-68. John Wiley & Sons
Inc., New York, USA.
Johnston, M. 2000. Etileno. pp. 107-130. In:
Barrueto Cid, L. (ed.). Introduo aos
hormnios vegetais. EMBRAPA Recursos
Genticos e Biotecnologia, Brasilia D.F.,
Brasil.
Klein , T., Wolf, E., Wu, R. y Sanford, J. 1987.
High velocity microprojectiles for delivering
nucleic acids into living cells. Nature
327:70-73.
Kumar, P., Lakshmanan, P. y Thorpe, T. 1998.
Regulation of morphogenesis in plant tissue
culture by ethylene. In vitro 34:94-103.
Larebeke, N., Engler, G., Holsters, M., Elsacker,
S., Zaenen, I., Schilperoort, R. y Schell, J.
1974. Large plasmid in Agrobacterium
tumefaciens essential for crown gall-
inducing ability. Nature 22:169-170.
Larkin, P. y Scowcroft, W. 1981. Somaclonal
variation - a novel source of variability from
cell culture for plant improvement. Theor.
App. Gen. 60:197-214.
Lemus, E. 2000. cido Abscsico. pp. 159-180.
In: Introduo aos hormnios vegetais.
EMBRAPA Recursos Genticos e Biotecno-
logia, Brasilia D.F., Brasil.
Leopold, A. y Kriedemann, P. 1975. Plant
growth and development. pp. 169-181.
McGraw-Hill Pub. Com., New York, USA.
Leshem, B., Shaley, D. e Izhar, S. 1988.
Cytokinin as an inductor of vitrification in
melon. Annals of Botany 61:255-260.
Levitan, I. y Cibulsky, S. 2001. TRP ion channels-
two proteins in one. Science, 293:1270-1271.
Magalhaes, J., Pedroso, M. y Durzan, D. 1999.
Nitric oxide, apoptosis and plant stresses.
Physiolol. Mol. Biol. Plants 5:115-125.
Matsumoto, K. 2000. Giberelinas. pp. 83-105.
In: Barrueto Cid, L. (ed.). Introduo aos
hormnios vegetais. EMBRAPA Recursos
Genticos e Biotecnologia, Brasilia D.F.,
Brasil.
Morel, G. y Martin, C. 1952. Gurison de
dahlias atteins d'une maladie virus.
Compt. Rend. Acad. Sc. 235:1324-1325.
Murashige, T. y Skoog, F. 1962, A revised
medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiologia
Plantarum 15:473-497.
Murthy, B., Murch, S. y Saxena, P. 1998.
Thidiazuron: a potent regulator of in vitro
plant morphogenesis. In vitro 34:267-275.
51

Naidu, M. y Sreenath, H. 1999. In vitro culture
of coffee zygotic embryos for germplasm
preservation. Plant Cell Tissue and Organ
Culture 55:227-230.
Orozco-Crdenas, M. y Ryan, C. 2002. A nitric
oxide negatively modulates wound
signaling in tomato plants. Plant Physiol.
130:487-493.
Palmer, C. y Smith, O. 1969. Cytokinins and
tuber initiation in the potato Solanum
tuberosum L. Nature 221:279-280.
Pedroso, M., Magalhes, J. y Durzan, D. 2000.
A nitric oxide burst precedes apoptosis in
angiosperm and gymnosperm callus cells
and foliar tissues. J. Exp. Botany 51:1027-
1036.
Pelacho, A. y Mingo-Castel, A. 1991. Jasmonic
acid induces tuberization of potato stolons
cultured in vitro. Plant Physiol. 97:1253-
1255.
Pea-Cortes, H. 2000. cido jasmnico. pp.
131-157. In: Barrueto Cid, L. (ed.). Intro-
duo aos hormnios vegetais. EMBRAPA
Recursos Geneticos e Biotecnologia, Brasi-
lia D.F., Brasil.
Pierik, R. 1987a. In vitro culture of higher plants.
p. 21. Martinus Nijhoff Pub., Dordrecht, The
Nederlands.
Pierik, R. 1987b. In vitro culture of higher
plants. pp. 32-43. Martinus Nijhoff Pub.
Dordrecht, The Nederlands.
Pierik, R. 1987c. In vitro culture of higher
plants. pp. 54-60. Martinus Nijhoff
Plublishers, Dordrecht, The Netherlands.
Power, J., Cummins, S. y Cocking, E. 1970.
Fusion of isolated plant protoplasts. Nature
225:1016-1018.
Reddy, B., Giridhar, P. y Ravishankar, G. 2002.
The effect of triacontanol on micropropa-
gation of Capsicum frutescens and
Decalepis hamiltonii W & A. Plant Cell
Tissue and Organ Culture 71:253-258.
52
BIOTECNOLOGA VEGETAL
Reinert, J. 1959. ber die Kontrolle der
Morphogenese und die Induktion von
Adventivembryonen an Gewebekulturen
aus Karotten. Planta 53:318-333.
Robbins, W. 1922. Cultivation of excised root
tips and stem tip under sterile conditions.
Botanical Gazette 73:376-390.
Salisbury, F. y Ross, C. 1992. Plant Physiology.
pp. 116-135. Wadsworth Pub. Comp.,
Belmont, CA, USA.
Skoog, F. y Tsui, C. 1948. Chemical control of
growth and bud formation in tobacco stem
segments and callus cultured in vitro. Am.
J. Botany 35:782-787.
Steven, J., Desikan, R., Clarke, A. y Hanck, J.,
2002. Nitric oxide is a novel component of
abscisic acid signaling in stomatal guard
cells. Plant Physiol. 128:13-16.
Steward, F., Mapes, M. y Smith, J. 1958. Growth
and organized development of cultured
cells. I. Growth and division of freely sus-
pended cells. Am. J. Botany 45:693-703.
Stryer, L. 1992. Bioqumica. pp. 259-272.
Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, Brasil.
Taiz, L. y Zeiger, E. 2002. Plant Physiology. pp.
33-46. Sinauer Associates Inc. Pub., Sun-
derland, Massachusetts, USA.
Tal, M. e Imber, D. 1970. Abnormal stomatal
behavior and hormonal imbalance in
flacca, a wilty mutant of tomato. Plant
Physiol. 46:373-376.
Tang, W. 2000. High-frequency plant
regeneration via somatic embryogenesis
and organogenesis and in vitro flowering
of regenerated plantlets in Panax ginseng.
Plant Cell Reports 19:727-732.
Tantos, A., Mezarios, A., Farkas, T. y Szalai, J.
2001. Triacontanol-supported micropropa-
gation of woody plants. Plant Cell Reports
20:16-21.
EL CULTIVO DE TEJIDOS
Teixeira, J. 2002. Biorreatores. Biotecnologia
Cincia & Desenvolvimento 4:36-41.
Thakur, M., Sharma, D. y Sharma, S. 2002. In
vitro selection and regeneration of
carnation (Dianthus caryophyllus L.) plants
resistant to culture filtrate of Fusarium
oxysporum f. sp. dianthi. Plant Cell Reports
20: 825-828.
Thauer, R. 2001. Nickel to the fore. Science
293:264-265.
Torres, K. 1989. Tissue culture techniques for
horticultural crops. pp. 3-25. In: An AVI
Book, New York, USA.
Voet, D. y Voet, J. 1995. Biochemestry. pp. 29-
41. John Wiley & Sons Inc., New York, USA.
Walton, D. y Li, Y. 1995. Abscisic acid biosyn-
thesis and metabolism. pp. 140-157. In:
Davies, P. (ed.). Plant Hormones: Phy-
siology, Biochemestry and Molecular
Biology. Kluwer Academic Pub., Dordrecht,
The Nederlands.
Wareing, P. y Phillips, I. 1982. Growth & diffe-
rentiation in plants. pp. 145-147. Pergamon
Press, Oxford, England.
White, P. 1934. Potentially unlimited growth
of excised tomato root tips in a liquid
medium. Plant Physiol. 9:585-600.
Wojtaszek, P. 2000. Nitric oxide in plants to
NO or not to NO. Phytochemistry 54:1-4.
53
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

54
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
ESTADIOS DEL CULTIVO
DE TEJIDOS
ESTABLECIMIENTO
DEL EXPLANTE
P ara el establecimiento del explante,
la asepsia es una condicin relevan-
te y del todo imprescindible para el xi-
to e induccin morfognica del material
bajo condiciones in vitro. Una premisa
es que cualquier tipo de explante utili-
zado debe estar adems libre de patge-
nos endgenos, normalmente presentes
en la planta madre. Dado que se utili-
zan fragmentos de rganos o parte de
tejidos, stos deben ser extrados del te-
jido madre. En muchos casos existen
patgenos externos y el hecho de mani-
pulacin crea nuevos focos potenciales
de contaminacin. Se han descrito va-
rios protocolos vinculados con la pre-
esterilizacin, esterilizacin y post-este-
rilizacin de diferentes rganos vegeta-
les que son universalmente utilizados en
diferentes laboratorios (Yeoman, 1973;
Bonga, 1982a). El lavado de los explan-
tes con productos desinfectantes bajo
condiciones aspticas, elimina patge-
nos superficiales, pero puede ocasionar
daos en las clulas, produciendo
pardeamiento o necrosis y afectando
eventualmente a las respuestas morfog-
nicas. En general, de acuerdo a la su-
perficie de contacto y naturaleza del ex-
plante, existen tratamientos que vincu-
lan concentraciones ptimas de usar pa-
ra cada desinfectante versus tiempo de
exposicin. Concentraciones muy bajas
CAPTULO 3
Miguel Jordan Z.
y tiempos de exposicin cortos, produ-
cen desinfeccin incompleta del mate-
rial y posible contaminacin durante el
cultivo. Tiempos largos y concentracio-
nes mayores, impiden el desarrollo de
patgenos, pero pueden afectar la via-
bilidad y/o respuestas morfognicas
inducibles en las clulas del explante.
Algunos protocolos de desinfeccin se
indican en el Captulo 2. Otros com-
puestos que apoyan tratamientos para
eliminacin de patgenos son diversos
antibiticos, los cuales deben ser mani-
pulados cuidadosamente por su toxici-
dad y/o especificidad. Entre ellos se pue-
de citar para contaminacin bacteriana:
Carbenicilina, Cefotaxima, Geneticina,
Kanamicina, Higromicina y Rifampicina
y sus mezclas (soluciones de Guillard y
Provasoli). Los niveles de concentracin
empleados son del orden de 5-100 g/
mL. Una especial precaucin debe ser
tomada al usar Kanamicina, pues inhibe
la morfognesis en algunas especies
(Mihaljevic et al., 2001; Obando y
Jordan, 2001). Entre los antimicticos,
Amfotericina B, Captafol, Carbendazi-
ma, Fenbendazole, Imazalil y Nistatina,
son los ms frecuentemente usados. En
la prctica, tratndose de rganos de
mayor volumen obtenidos en terreno y
de los cuales se va a aislar un explante,
desinfecciones previas con Captan y
Benomyl durante algunas horas, y el uso
posterior de algunos de los antimicticos
55

indicados ms arriba, son eficientes en
la remocin de patgenos.
Frente a infecciones virales, es slo po-
sible el tratamiento en conjuntos de c-
lulas o tejidos especficos. Por ejemplo,
en meristemas caulinares y no en el res-
to de la planta. Existen productos que
han probado tener accin viricida, el
ms conocido es Virazole (Ribavirina)
[1-B-D-ribofuranosil 1,2,4-triazol-3-
carboxamida), un nuclesido anlogo,
con el cual fue posible eliminar in vitro
e in vivo el virus PVX en papa (Jordan et
al., 1983), como en otras especies que
comnmente se reproducen por va
vegetativa. Aunque el crecimiento de los
explantes y sus respuestas morfognicas
pueden verse afectadas parcialmente en
esta especie, concentraciones del orden
de 50 mg/L permitieron erradicar total-
mente PVX en cuatro clones de papa en-
sayados al cabo de 90 das de cultivo
(Jordan et al., 1983). En papa, comn-
mente se presenta tambin un viroide
(PSTV); el cual puede ser erradicado me-
diante la termoterapia; es decir, manten-
cin del tejido madre a altas temperatu-
ras en condiciones de humedad (30-
35C o ms por uno o varios das). fenilpropanos y derivados de flavonas.
En general, durante la termoterapia, se
induce una intensa divisin y elongacin
celular en las regiones meristemticas;
ello permite tener una porcin de teji-
dos libres de patgenos en aquellos con-
juntos celulares ubicados en la porcin
ms distal del meristema. La eliminacin
de patgenos se debe tambin a que en
dichas regiones existen ms comunica-
ciones celulares de tipo simplstico lo
cual reduce la velocidad de contamina-
cin de clulas infectadas a aquellas
56
BIOTECNOLOGA VEGETAL
nuevas en activo crecimiento, provocn-
dose una dilucin gradual con erradica-
cin total dependiendo del tratamiento.
OXIDACIN FENLICA
Los explantes de diferente origen, aun-
que predominantemente de material le-
oso o especies particulares y, segn
condiciones de cultivo, no prosperan
muchas veces a causa de un pardea-
miento (browning) de sus tejidos, el
cual se manifiesta superficial o interna-
mente comprometiendo varios estratos
de clulas, superficiales y/o ms profun-
das. Los explantes de especies que mues-
tran pardeamiento a causa de un meta-
bolismo fenlico oxidativo, generalmen-
te no prosperan. El pardeamiento impli-
ca la muerte celular y se debe, por lo
general, a la oxidacin conjunta de di-
versos productos fenlicos presentes en
la clula por accin de polifenoloxida-
sas, de efecto poco especfico (Jordan y
Feucht, 1977; George, 1993). El efecto
puede ocurrir en compuestos fenlicos
de diversa complejidad, entre ellos;
fenoles simples, cidos fenilcarbnicos,
El proceso se origina durante la excisin
del explante o con el proceso de desin-
feccin. Dado que enzimas y substrato
se encuentran en compartimentos celu-
lares distintos (en general fenoles en la
vacuola y tonoplasto, polifenoloxidasa
en el citoplasma); no existe reaccin en
condiciones in situ. Sin embargo, duran-
te la extraccin o desinfeccin del ex-
plante, donde ocurre muerte celular en
las zonas expuestas, dicha oxidacin es
causal del pardeamiento celular. El dao
puede ser incrementado dependiendo de
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
la estabilidad y metabolismo de estratos
celulares ms internos, pudiendo com-
prometer totalmente el explante.
La oxidacin qumica resulta de la ge-
neracin de quinonas en el anillo aro-
mtico, condicin que es altamente txi-
ca por su poder xido-reductor (George,
1993). Dado que las polifenoloxidasas
son poco especficas, las reacciones
afectan a varios compuestos fenlicos
diferentes qumicamente. Debido a que
las plantas leosas sintetizan grandes
cantidades de lignina y sobre la base de
que los precursores de lignina son com-
puestos fenlicos (cidos ferlico, si-
napnico, y p-coumrico), la produccin
de pardeamiento es ms comn en ma-
terial leoso. Por otro lado, los niveles
endgenos de fenoles determinan la
condicin fisiolgica del explante. Es
sabido que muchos fenoles actan en
forma inhibitoria frenando las respues-
tas de crecimiento, efecto que se visua-
liza principalmente en invierno. La dor-
mancia de muchos rboles est definida
por altos niveles endgenos de fenoles;
entre ellos el mismo cido p-coumrico.
En invierno (poca en que se produce
receso vegetativo), existe un mayor con-
tenido de fenoles en los tejidos y se pro-
duce normalmente una menor respues-
ta morfognica ante niveles apropiados
de reguladores promotores incorporados
al medio de cultivo.
Por el hecho que la condicin de la plan-
ta madre afecta significativamente la res-
puesta del explante, una prctica comn
para obviar o reducir el problema de
pardeamiento es el uso de material ju-
venil. El material juvenil expresa igual-
mente un potencial morfognico mayor
que explantes de origen adulto. Existen
caractersticas genticas fijadas y que se
expresan diferencialmente entre ambos
tipos de explantes de una u otra condi-
cin y que adems son heredables al
proceder a la propagacin vegetativa
(Bonga, 1982b). En muchos casos, y en
aquellas especies que sintetizan
antocianinas en sus explantes juveniles,
dichos pigmentos no afectan normal-
mente una posterior morfognesis. Por
el contrario, explantes que expresan un
metabolismo oxidativo, no desarrollan
estos pigmentos al desdoblarse sus pre-
cursores con anterioridad. Es importan-
te considerar que no es en s limitante
el nivel o contenido endgeno de com-
puestos fenlicos, sino su metabolismo
bajo condiciones in vitro. En general, las
especies que muestran un metabolismo
oxidativo ms activo, con pardeamiento
de explantes, son aquellos que o bien
presentan niveles altos de fenoles al co-
mienzo del cultivo, o que incrementan
dicho nivel durante el transcurso del cul-
tivo, afectando el proceso morfognico.
En algunos casos, cuando se trata espe-
cficamente de la sntesis del grupo de
antocianinas, la morfognesis no se ve
afectada (Jordan y Feucht, 1977). En es-
tos explantes la sntesis de fenoles ha
llegado a uno de los destinos finales sin
ocurrir oxidacin fenlica de compues-
tos intermedios (Tabla 3.1). Las antocia-
ninas son frecuentemente observables en
material juvenil el cual es considerado
de particular carcter morfognico, com-
parado con el material adulto (Bonga,
1982b).
57
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Tabla 3.1. Niveles de fenoles totales y respuestas morfognicas en hojas y anteras

de algunas especies frutales antes y despus de 40 das de cultivo in vitro.

Fenoles Fenoles
Antes del Posterior al
Espcies cultivo cultivo Resultados

() ()
Carica pubescens 0,18 0.02 Hojas y callos amarillos.
() ()
Carica x pentagona 1,28 0.59 Hojas caf y nuevos brotes
verdes, morfognesis.
() ()
Cyphomandra betacea 0,16 0,05 Hojas caf y nuevos brotes
verdes, morfognesis.
() ()
Pouteria lucuma 2,0 0,17 Hojas y nuevos brotes verdes

() ()
Solanum muricatum 0,21 0,38 Hojas y nuevos brotes verdes

() ()
Annona cherimola 0,1 0,93 Hoja y tallo de color marrn

() ()
Prunus avium 0,54 0,22 Anteras y callo color marrn

() ()
Prunus x Pandora 0,36 1,24 Anteras y callos rojizos
(antocianinas), andrognicos,
sin pardeamiento
)
Absorbancia a 730 nm con el reactivo de Folin-Ciocalteau/100 mg de tejido fresco.
()
M fenoles/100 mg de tejido fresco.
()
% Fenoles en el peso fresco.

USO DE ANTIOXIDANTES igualmente en varios procesos qumicos,

En algunas especies el efecto de pardea-
miento puede ser reducido lavando con
agua corriente esterilizada la zona de
corte o escisin del explante por tiem-
pos diversos (2-4 horas), antes de pro-
ceder al cultivo. Con ello, los compues-
tos fenlicos presentes en las clulas da-
adas son retirados. Si es posible, con-
viene realizar este proceso con una me-
nor tensin de O 2 , pues este gas eleva
el potencial redox, haciendo la oxida-
cin de fenoles ms rpida (George,
1993). En la prctica, se usan los antioxi-
dantes (o reductores), los cuales pueden
aplicarse durante las fases de desinfec-
cin o incorporarlas a los medios de cul-
tivo (Bonga, 1982a). Dichos productos
son de naturaleza diferente y actan
ya sea impidiendo la formacin de qui-
nonas o retirando compuestos inhibito-
rios del medio por propiedades fsicas
de adsorcin/absorcin, como tambin
evitando la oxidacin de fenoles en el
medio. Dentro de los productos ms co-
mnmente usados se tiene: PVP o polivi-
nilpirrolidona, de diferentes pesos mole-
culares; entre ellos PVP-360 o PVP-
6755; cistena; glutation; DIECA (Die-
tilditiocarbamato de sodio); c. amino-
oxiactico; mezclas de c. ascrbico
con c. ctrico, (durante la desinfeccin
o en el cultivo); -mercaptoetanol; tiou-
rea y carbn activado. Este ltimo, jun-
to a PVP, parece adsorber varios com-
puestos fenlicos que producen tejidos
heridos en el medio, conjuntamente con
productos de carcter txico derivados

58
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
de la transformacin de azcares (saca-
rosa) por autoclavado (hidroximetilfur-
fural). Los otros antioxidantes actan en
forma reductora, impidiendo, ya sea la
generacin de quinonas o de perxido
de hidrgeno, o bien manteniendo los
grupos tioles en forma reducida, activan-
do en este caso la sntesis de protenas
(George, 1993). Lo anterior implica que,
indirectamente, tambin varios com-
puestos de accin antioxidante pueden
promover crecimiento u organognesis
en algunas especies (glutation, c.
ascrbico, tiourea), como tambin acti-
var el crecimiento en condiciones de
receso (tiourea). Directamente, algunos
fenoles se comportan in vitro como fac-
tores promotores, ya sea del crecimien-
to, induccin de nuevos brotes y como
enraizantes (Lane, 1990), asumindose
una accin protectora de la degradacin
del cido indolactico (AIA) endgeno
o actuando como compuestos sinrgicos
al AIA. Entre estos compuestos se en-
cuentran el floroglucinol, el glicsido
floridzina, el catecol, resorcinol, c.
clorognico, c. cafeico y varios flavo-
noides. El primero, parece necesario de
incluir en medios para crecer algunas
especies frutales del gnero Prunus; el
segundo, por otro lado, estimula la rizo-
gnesis (Jordan, no publicado).
Existen otros productos que han sido
usados con xito aunque no represen-
tan en s condicin de antioxidantes.
Estos han demostrado buena eficiencia
en algunas especies de carcter muy oxi-
dativo y difciles de cultivar, como por
ejemplo Annona cherimola, en la cual
el uso de sorbitol e hidrolizado de case-
na cida ms PVP, favorece la induccin
de brotes de novo (Jordan et al., 1991;
1993). El efecto puede ser igualmente fa-
vorecido al usar un menor contenido de
sacarosa o reemplazando parcial o to-
talmente la sacarosa por sorbitol (Jordan,
1975). En algunos casos, la condicin de
los gelificantes igualmente tiene efectos
sobre el pardeamiento. Muchas veces la
marca del agar produce una respuesta
diferencial; en otros casos, el uso de Gel-
rite, agarosa o el reemplazo general de
geles por papel Whatman N1 (en me-
dio lquido), puede evitar o contrarres-
tar parcialmente el pardeamiento. Para
el caso de algunos cultivos leosos, la
eleccin del agar es determinante (Pierik
et al., 1997). El nivel de algunos micro-
elementos en la solucin debe ser igual-
mente ajustado segn el tipo de explante
y especie; por ejemplo, la concentracin
final del in Cu en la solucin, al con-
formar parte del grupo prosttico de las
polifenoloxidasas, puede favorecer la
oxidacin. Al respecto se ha informado
tambin que agentes quelantes adicio-
nados al medio, entre ellos EDTA o
EDDHA, inhiben parcialmente el
pardeamiento de algunas especies; ello
por la capacidad de fijar igualmente el
ion Cu o Fe en solucin, formando
quelatos.
La calidad de la luz es especialmente
importante en el control del pardea-
miento. Por un lado, la prctica reco-
mienda evitar la luz y dejar los cultivos
dos a tres das en oscuridad antes de
exponerlos a la radiacin. Por otra par-
te, es importante considerar que el fito-
cromo en presencia de luz roja (660 nm)
activa a la enzima fenilalanina-amonio-
liasa, que convierte el aminocido fe-
nilalanina al primer compuesto fenlico,
el cido trans-cinmico. Desencadena
as, la biosntesis posterior con incre-
mento de otros fenoles de la cadena;
59

entre ellos, por ejemplo, el cido p-cou-
mrico con varios efectos de carcter
inhibitorio (Mohr, 1976). Slo, o como
componente precursor de la lignina, el
cido p-coumrico presenta un rol de
defensa qumica contra el ataque de in-
sectos y animales fitfagos, en alelopa-
ta, como factor de competencia espa-
cial de las plantas, en forma intra e inter-
especfica y fisiolgicamente en la fun-
cin de inhibicin de la germinacin en
algunas especies.
MULTIPLICACIN DE PLANTAS
(MORFOGNESIS, ORGANOGNESIS,
EMBRIOGNESIS)
La generacin de nuevas formas y estruc-
turas, como ser rganos o embriones ori-
ginados de algunos tipos de explantes
donde no los haba, se denomina morfo-
gnesis o ms especficamente, organo-
gnesis o embriognesis, siendo todas de
carcter adventicio. Para poder generar
una morfognesis, los diferentes tipos de
explantes (clulas, tejidos y rganos cul-
tivados in vitro), deben poseer la infor-
macin y las condiciones endgenas y
del medio, conducentes a expresar las
diferentes respuestas morfognicas, posi-
bles. stas son organognesis caulinar
(brotes de novo), organognesis radicu-
lar o rizognesis (races) y embriognesis
(formacin de embriones).
La respuesta posible a inducir est de-
terminada, por el potencial de totipo-
tencia celular; o capacidad inherente
de cualquier clula vegetal viable, de
recapitular toda la informacin existen-
te en el genoma y de expresar sta a tra-
vs de la diferenciacin y desarrollo, ha-
60
BIOTECNOLOGA VEGETAL
cia la formacin de plantas completas
de igual caracterstica gentica. En este
proceso se debe definir la condicin ce-
lular o de rgano y el origen del mate-
rial, de carcter juvenil y/o adulto. Es
bien sabido que explantes de carcter
adulto poseen bajo o nulo potencial
morfognico in vivo o in vitro, versus
material de condicin juvenil, de mane-
ra que ste debe ser preferido. El Mate-
rial juvenil, ms morfognico o embrio-
gnico, evidencia un grado de metila-
cin menor del DNA como tambin una
mayor proporcin de conjugados de
poliaminas libres que material adulto,
pudiendo causar efectos sobre la acti-
vacin/desactivacin de genes (Fraga et
al., 2002; Joyce y Cassells, 2002; San-
tos y Fevereiro, 2002). La primera res-
puesta inductora de cualquier explante,
consiste en la desdiferenciacin de una
clula diferenciada. En todas las plan-
tas conformantes del Reino Vegetal exis-
te solamente un nmero reducido de c-
lulas, cada una con una diferente carac-
terstica de diferenciacin segn la fun-
cin a desarrollar, todas derivadas de
una clula embrionaria conformante de
la cigota. En todos los vegetales del pla-
neta, toda la anatoma y arquitectura
posible a generar se basa en el ordena-
miento de este reducido nmero de c-
lulas estables o permanentes, entre al-
gunas de ellas: clula meristemtica,
parenquimtica (varios tipos), fibra
esclerenquimtica / colnquima, trquea
/ traqueida, tubo criboso; clula de guar-
da y clula epidrmica. Dichas clulas
conforman a su vez tejidos especializa-
dos. La desdiferenciacin consiste en el
potencial de cualquiera de stas de vol-
ver a su condicin de origen de tipo
meristemtico. Las nicas clulas no
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
totipotentes y que tampoco pueden cam-
biar su patrn de expresin, son las que
carecen de ncleo, como las traqueidas,
las trqueas del floema o los tubos
cribosos correspondientes al floema.
Durante la diferenciacin se pueden re-
conocer cuatro eventos fundamentales:
a) seal inductiva y de percepcin don-
de se le atribuye un especial rol a la
auxina (AIA); b) expresin de genes que
especifican la identidad celular; c) ex-
presin de genes para conformar las es-
tructuras especificas y actividades de la
clula diferenciada y d) actividad de pro-
ductos gnicos y sus cambios en la es-
tructura celular para hacer efectiva la
funcin de la clula diferenciada. La re-
sultante de un conjunto de clulas con
actividad meristemtica bajo condicio-
nes in vitro es, inicialmente, la forma-
cin de nuevas clulas del tipo paren-
quimtico que conforman un agregado
celular. De acuerdo a ciertas condicio-
nes inductivas, dadas por niveles end-
genos/exgenos de auxina versus cito-
quininas y en algunos casos de sacaro-
sa, algunas de estas clulas se diferen-
cian en elementos floemticos como
tambin del tipo trqueas, crendose
una cierta polaridad en el sistema. En
otros, casos clulas desdiferenciadas se
diferencian nuevamente para formar un
primordio; de all derivan nuevos bro-
tes o nuevas races. El arreglo longitu-
dinal de estas clulas constituye poste-
riormente la raz funcional.
Cabe indicar que la mxima expresin
de totipotencia se puede citar en dos
ejemplos: 1) protoplastos, que corres-
ponden a clulas aisladas carentes de
pared celular. En este caso, estos pue-
den, junto con recapitular a plantas, ge-
nerar y resintetizar su pared celular, pro-
vistos los elementos en el medio de cul-
tivo (por ejemplo diversas pentosas) y 2)
microsporas (polen); cuyo programa on-
tognico, determinado y establecido fi-
lognicamente, consistente en la forma-
cin de gametos, puede ser alterado y
transformado en otro programa embrio-
gnico (nunca realizado antes, ni esta-
blecido por filogenia), conducente a la
generacin de plantas; en este caso, de
nuevas plantas haploides. De ac pue-
de establecerse el hecho de que el total
de la informacin conducente a la rege-
neracin de plantas (totipotencia), an
se mantena presente en el genoma de
esta clula. La morfognesis finalmente
puede ocurrir de dos maneras diferentes:
a) a partir de clulas diferenciadas sin la
proliferacin de tejido indiferenciado o
b) a partir de clulas no especializadas,
no organizadas y desdiferenciadas de ca-
llo o suspensiones celulares.
ORGANOGNESIS CAULINAR
Y RADICULAR
La induccin de brotes o de races pue-
de ser derivada de acuerdo a los niveles
hormonales presentes en un explante. Si
se considera un explante in vitro con
adicin de hormonas del tipo auxina
(AIA y anlogos sintticos) y citoquinina
(varias formas), ambas en concentracio-
nes relativamente altas, las clulas
desdiferenciadas generarn simplemen-
te tejido parenquimtico con algunos
elementos de vasos presentes. Si las mis-
mas hormonas se encuentran en propor-
ciones diferentes; un bajo nivel relativo
de la citoquinina, sin alterar la auxina,
61

el conjunto tisular ser menor, pero ge-
nerar exclusivamente races. Si en cam-
bio se incrementa el nivel de la citoqui-
nina, reduciendo el de auxina, se gene-
rarn exclusivamente brotes (Skoog y Mi-
ller, 1957). Este patrn de respuesta, que
se hall antes de los aos 60 especfica-
mente para tabaco, se ha generalizado en
el tiempo para un gran nmero de espe-
cies de carcter herbceo y leoso.
Los azcares, en cuanto a su tipo y con-
centracin, tambin influyen en las res-
puestas morfognicas. Normalmente, se
indica una asociacin de sacarosa a la
formacin de xilema, vinculado a pro-
cesos de diferenciacin muy tempranos
de la nueva raz. La sacarosa es el az-
car ms comnmente usado en trabajos
in vitro, aunque tambin han sido usa-
dos otros azcares en menor frecuencia.
La glucosa y la fructosa son menos co-
munes, posiblemente por representar a
azcares reductores (se asume que por
este motivo son tambin muy escasos en
la composicin de la savia de las plan-
tas con apenas el 1% o menos con res-
pecto al contenido de sacarosa). Sin em-
bargo, para el cultivo de la confera Se-
quoia sp., la fructosa aparece como el
azcar ms adecuado, como asimismo
las pectinas y el almidn (Koblitz, 1972).
En el caso de la zanahoria, despus de
la sacarosa, la glucosa y la maltosa tam-
bin sirven en forma satisfactoria
(Koblitz, 1972); la maltosa promueve
tambin el contenido de clorofila apo-
yando los fenmenos vinculados con la
org a n o g n e s i s e n b a b a c o ( C a r i c a x
pentagona) (Jordan y Piwanski, 1997).
Mientras la glucosa produce en general
bajas respuestas o gran pardeamiento en
tejidos de Prunus avium, este efecto pue-
62
BIOTECNOLOGA VEGETAL
de ser superado mediante el sorbitol
(Jordan, 1975). En presencia de sorbitol
(aunque no ante sacarosa), bajo iguales
niveles hormonales, se facilita la induc-
cin brotes en Annona cherimola (Jordan
et al., 1991). Finalmente, manitol pro-
mueve la regeneracin de brotes en ho-
jas en menta (Mentha x piperita y M.
spicata).
EMBRIOGNESIS SOMTICA
La embriognesis es consistente en la ge-
neracin de un embrin somtico y pos-
teriormente de plntulas, a partir de una
clula somtica (o en algunos casos ga-
mtica). Este proceso, bajo condiciones
in vitro, reviste las mismas etapas de de-
sarrollo que ocurren in vivo. Pueden for-
marse embriones somticos en forma
directa o indirecta; la primera es a par-
tir de una sola clula aislada flotando
en un medio de cultivo o fijada a un
substrato, generalmente derivada de una
suspensin celular (Litz y Gray, 1992).
La segunda forma de generacin indirec-
ta, ocurre igualmente a partir de una sola
clula que forma parte de un tejido no
organizado (callo) o de un rgano (por
ejemplo cotiledones, hoja, hipoctilo)
que se cultiva in vitro.
La iniciacin del proceso de embriog-
nesis se caracteriza por presentar, ini-
cialmente, divisiones celulares desigua-
les, conformantes de una clula apical
y otra basal; siendo la primera constitu-
yente del embrin. Ello determina la ge-
neracin de un patrn de eje apical-
basal, determinado por una expresin
gnica especfica durante la primera di-
visin celular, de carcter asimtrica.
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
Durante la ontogenia del embrin, se ex-
presan genes especficos que controlan
ya sea la formacin del futuro meristema
apical, de la raz primaria, as como ge-
nes encargados de la mantencin de la
polaridad apical-basal (Taiz y Zeiger,
2002). Segn el estado de desarrollo y ta-
mao, se distinguen tres estadios embrio-
gnicos: el globular, estado de corazn y
de torpedo.
Embriognesis directa (ED)
Es la formacin directa de embriones so-
bre los tejidos correspondientes al ex-
plante, sin mediar mayormente prolife-
racin celular intermedia. Ello ocurre
tambin naturalmente in vivo o in vitro,
como es el caso de ctricos, caf y otros
cultivos. En general, a partir de vulos y
de sus integumentos, de embriones nu-
celares, o tejidos nucelares, pueden ori-
ginarse embriones somticos directa-
mente como tambin en clulas epidr-
micas, pecolos y an de protoplastos
derivados de lmina de hojas.
Embriognesis indirecta
(o adventicia) (EI)
Se induce a partir de un callo o agrega-
do celular no organizado o de suspensio-
nes celulares. Este tipo de proceso in-
ductivo es ms frecuente que la ED. Por
lo general, existen varios tipos de reque-
rimientos: a) el genotipo particular debe
ser capaz de poder llevar a cabo la mor-
fognesis con el apoyo de un medio de
cultivo y de reguladores de crecimien-
to, b) el explante debe ser cultivado en
presencia de auxina para su iniciacin,
siendo el tiempo de permanencia un fac-
tor crtico, c) el nivel de sacarosa en los
medios de cultivo es crtico (sobre cier-
tos niveles no se produce induccin), d)
despus del cultivo en presencia de au-
xina, por lo general procede un subcul-
tivo con niveles menores o en ausencia
de ella, e) existe requerimiento de un ni-
vel adecuado de N, el cual puede ser
suplementado por el in NH 4 + o un ami-
nocido, como es el caso de glutamina
o alanina. Otra forma comn de produc-
cin de embriones somticos consiste en
la embriognesis secundaria, la cual
ocurre sobre otro embrin en desarro-
llo. Se considera este proceso como una
anomala, pero en algunos casos el fe-
nmeno puede servir en una mayor efi-
ciencia en la generacin de material de
una especie.
Poliembriognesis
(o poliembriognesis somtica)
En el caso particular de muchas confe-
ras, se ha descubierto que embriones
cigticos maduros o inmaduros, son ca-
paces de iniciar un proceso de embrio-
gnesis mltiple, conducente a la gene-
racin de embriones de igual condicin
gentica en forma simultnea (Gupta y
Durzan, 1986; Fowke y Attre, 1996). El
proceso tiene diferentes fases de cultivo,
el cual procede en oscuridad. La fase de
induccin y/o maduracin sincrnica de
embriones es crtica y requiere de regu-
ladores de crecimiento de carcter inhi-
bitorio (como es el ci d o abscsico
(ABA)). Tambin de potenciales hdricos
bastante negativos en el medio, genera-
dos por incremento de azcares u otros
osmticos, (especialmente polietilen-
glicol (PEG), como tambin manitol o
sorbitol) (Attre et al., 1995). Determinante
en algunas especies es la presencia de al-
tos niveles de uno o ms aminocidos
particulares.
63

Andrognesis
Este tipo de embriognesis es uno de los
ejemplos que mejor representa la totipo-
tencialidad celular. Consiste en que un
grano de polen, en una fase temprana
de su ontogenia (microspora unicelular
o uninuclear, cuya funcin es fecundar
a la megaspora), cambia de funcin y
constituye un embrin de origen gam-
tico, con la reduccin de su porcin cro-
mosomal (n). Dado que el proceso se
realiza por cultivo de anteras, los em-
briones gamticos se forman directa-
mente dentro de las tecas, proceso que
puede acontecer al finalizar un mes. Los
primeros antecedentes datan del ao
1964, en que a travs del estudio de la
morfognesis de anteras bajo condicio-
nes in vitro, se evidenci la totipotencia
del polen en su capacidad de cambiar
su programa fijado filognicamente a la
fecundacin a la generacin directa de
plantas (Guha y Maheshwari, 1964;
1966; 1967). Para la dcada de los aos
90, una gran cantidad de reportes infor-
maron sobre la posibilidad de obtener
plantas haploides en cereales y especies
leosas y sobre sus aplicaciones en
biotecnologa y mejoramiento gentico
(Bajaj, 1990).
El proceso tiene gran importancia en el
mejoramiento gentico de plantas dado
que: a) es posible en la prctica usar di-
rectamente la planta de caractersticas
haploides a travs de la variacin ga-
metoclonal (ejemplo la generacin de
material de caractersticas enanas o
enanizante para uso como patrones de
injerto; generacin de mutantes waxy
con mayor contenido en cera y, por tan-
to, mayor resistencia a patgenos, cam-
bios en el perodo de floracin, cambio
64
BIOTECNOLOGA VEGETAL
en el contenido de metabolitos secun-
darios, cambios en morfologa, etc.); b)
es posible hallar caracteres genticos
que pueden estar enmascarados en cru-
zamientos normales, dada la incompati-
bilidad que se presenta en algunas espe-
cies; c) es posible diploidizar tejidos o
partes de la planta, obteniendo plantas
doble haploides (homocigotos diploi-
des), con lo cual se pueden seleccionar
directamente pares de genes dominan-
tes o recesivos en una sola generacin y
haciendo posible emplear este material
en cruzamientos posteriores; y d) proce-
der a realizar mutaciones en clulas ha-
ploides, con lo cual se puede generar
material diverso con propiedades gen-
ticas de importancia (Bajaj, 1990). Dada
la mutacin frente a agentes qumicos
(por ejemplo toxinas, pesticidas/herbici-
das, metales pesados, etc.), las clulas
sobrevivientes al expresar dicha toleran-
cia, regeneran plantas tolerantes (Mali-
ga, 1984). La diploidizacin de ellas
conlleva a genotipos dobles haploides
(ambos genes dominantes o recesivos).
El cambio de la informacin conducen-
te a la induccin de respuestas androg-
nicas, puede ser inducido slo bajo con-
diciones in vitro. El cultivo de anteras
con sus microsporas en fase uninuclear;
o usando microsporas directamente, de-
be ser, por lo general, mantenido en pre-
sencia de los reguladores del tipo auxina
y citoquininas. Niveles de cido naftale-
nactico (ANA) con benciladenina (BA)
de 1,0 mg/L, permiten dichas respuestas
en varias especies. El proceso de induc-
cin consiste en que a partir de la pri-
mera gran mitosis conducente a un n-
cleo clula vegetativa y un ncleo o
clula generativa (o clula espermtica),
la ontogenia se desarrolla en forma di-
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS

ferente. En condiciones normales, slo el mando un grano de polen multicelular.

ncleo generativo se divide una vez ms,
conformando as los tres ncleos para el
desarrollo del tubo polnico, la formacin
del zigoto y del endosperma. En el caso
de la induccin andrognica, la clula ge-
nerativa, por lo general no se divide ms;
en cambio, el ncleo o clula vegetativa,
constituye divisiones repetitivas confor-
Esta estructura se organiza posteriormen-
te en forma de un pro-embrin y la mani-
festacin de la polaridad conduce a un
embrin gamtico al cabo de 4-5 sema-
nas (Figuras 3.1 a 3.4). Las respuestas
andrognicas de algunas especies frutales
estudiadas y sus condiciones de induccin
estn resumidas en la Tabla 3.2.

Figura 3.1. Desarrollo de la microesporognesis

normal y andrognesis in Vitro.

Figura 3.2. Polen multicelular (pro-embrioides) de peral (Pyrus sp.)

finalizadas tres semanas de cultivo in vitro, mostrando
dos planos (A y B) de la tabicacin celular interna.

65
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Figura 3.3. Figura 3.4. Emergencia de una plntula

Algunos estados de desarrollo en la haploide de tabaco (Nicotiana tabacum) a
andrgenesis de lcumo (Pouteria lucuma) partir de polen despus de 35 das de cultivo.

Tabla 3.2. Diferentes condiciones inductivas de la

andrognesis en varias especies frutales.
Respuestas
Morfognicas/ Carica Pouteria Cyphomandra Prunus X Prunus Solanum Annona
Condiciones pubescens lucuma betacea Pandora avium muricatum cherimola

% Generacin
de Embrioides() 6,5 3,7 0,0 39,7 3,1 0,0 0,0
% Formacin de callo 91,1 80,0 <5,0 100 100 <5,0 <5,0
% Pardeamiento 5,7 51,9 90,0 <5,0 95,0 95,0 100
Medio de
Cultivo MS-mod(2) NN(3) MS,NN,G(1) NN NN NN NN
Reguladores de AIA 1.0 ANA 1.0 Diferentes ANA 1.0 ANA 1.0 Diferentes Diferentes
Crecimiento (mg/L) BA 1.0 BA 1.0 combin. BA 1.0 BA 1.0 combin. combin.
Conc. de 60 40 Diferentes 20 20 20 20
Sacarosa (g/L) niveles
Requerimientos Ninguno 8 das Ninguno Ninguno
de bajas temp. a 8C
()
Porcentaje estimativo de induccin respecto a anteras sembradas [Gamborg et al., 1968 (1); Murashige y Skoog,
1962 (2); Nitsch y Nitsch, 1969 (3)].

66
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
Finalmente, es importante considerar
que los mecanismos que inducen la di-
visin asimtrica para la diferenciacin
de la clula generativa durante la
ontogenia normal, pueden ser alterados
in vitro mediante aplicacin de colchici-
na, que inhibe la formacin del huso mi-
ttico. Al contrario del efecto de altas
dosis de colchicina, que inhibe total-
mente la divisin celular, bajos niveles
de colchicina, an permisivos para la di-
visin de la microspora uninucleada,
provocan divisiones simtricas confor-
mando dos clulas vegetativas, como
ocurre durante la induccin de la an-
drognesis de la microspora uninucle-
ada. Alternativamente, existe la posibi-
lidad de obtener tambin plantas
haploides, no a partir de gametos, sino
del tejido megagametofito femenino pre-
sente en gimnospermas, ofreciendo
igualmente un gran herramienta en el
mejoramiento gentico particular de
conferas. El gametofito femenino de
gimnospermas est constituido por c-
lulas haploides genticamente idnticas
y que constituyen este tejido de funcin
nutricional para el embrin (Cardemil y
Jordan, 1982; Chavez y Litz, 1999).
ENRAIZAMIENTO In vitro
El enraizamiento in vitro depende del
potencial de la especie, del tipo de
explante y de las condiciones de culti-
vo y del tipo y niveles de reguladores
que son usados. Muchas especies tien-
den a enraizar fcilmente; otras, como
algunas trepadoras, lo realizan con mu-
cha dificultad o manifiestan escasa fre-
cuencia. El pardeamiento del material
puede provocar tambin falta de res-
puestas. En general, la norma es que in
vitro, el grado de facilidad de induccin
es semejante al de las plantas bajo con-
diciones de campo. A veces, el material
denota intensa proliferacin de brotes
pero no de races o viceversa. En la prc-
tica, se procede a usar mayormente el
cido indolbutrico (AIB) como nico
regulador, aunque tambin se ha citado
de usarse junto con AIA u otros regula-
dores, como ANA. Varias condiciones
del medio tambin aparecen como id-
neas; entre ellas, el uso de soluciones
nutritivas de baja tonicidad, la reduccin
del contenido de azcar (sacarosa) de
2% a 1%, aumento de pantotenato de
calcio (5 mg/L), tiamina y la adicin de
otros compuestos pueden ser tiles. Por
ejemplo el carbn activado, que junto
con prevenir un excesivo crecimiento de
callo puede condicionar la promocin
de races.
ACLIMATACIN
Las plntulas que se desarrollan bajo
condiciones in vitro, lo hacen con altos
contenidos de humedad tanto en el me-
dio como en su microambiente. Las
adaptaciones endgenas no consideran
entonces, en fases tempranas, la forma-
cin de cutcula en las hojas ni los me-
canismos regulatorios del control esto-
mtico, vinculados a la retencin de
agua e intercambio gaseoso. Por un lado,
aunque el nmero de estomas puede
variar en las hojas de las plantas in vitro
comparado con plantas en condiciones
de crecimiento externas, ms relevante
es el hecho que su forma sea diferente y
estn situados en zonas superficiales de
la hoja, en vez de encontrarse ms bien
67

sumergidos bajo la capa epidrmica,
aparte de su incapacidad en el funcio-
namiento de cierre en respuesta de estrs
hdrico.
En mayor medida, el efecto ms perju-
dicial en la deshidratacin de una hoja
es la falta de produccin de cera
epicuticular. Su carencia implica que el
total de la superficie de las hojas permi-
ta la libre entrega de agua de la planta
al ambiente, efecto causado por diferen-
cia de potenciales hdricos en el siste-
ma. El resto de la planta recin desarro-
llada es tambin un material muy deli-
cado, que recin est generando las es-
tructuras con sus sistemas enzimticos
que le permiten su vida. Especficamen-
te, las plntulas, de condicin mixotr-
fica o heterotrfica, recin estn comen-
zando a entrar a la fase de autotrofa.
Ello implica la generacin de pigmentos
y organelos, pasando de una fase de con-
sumo de nutrientes orgnicos del medio
(por ejemplo sacarosa como fuente de
carbono) a su sntesis a travs de la fo-
tosntesis. Al respecto, se han estudiado
estas primeras fases de aclimatacin y
se ha visto que, aunque durante la pri-
mera semana la fotosntesis neta bajaba
al detectarse alta fluorescencia, exista
recuperacin posterior.
Por otro lado, los niveles de sacarosa du-
rante el cultivo in vitro son relevantes,
puesto que concentraciones de 6% en
el medio, dificultan ms la capacidad
adaptativa a plena fotosntesis y auto-
trofa. Igualmente, la condicin lumnica
es crtica en esta fase; mientras que una
intensidad de luz baja promueve la acli-
matacin, los flujos de luz muy inten-
68
BIOTECNOLOGA VEGETAL
sos provocan fotoinhibicin y severo es-
trs en este estado. Adicionalmente,
existe un problema de generacin de
enzimas antioxidantes. La catalasa y la
superxido-dismutasa son las enzimas
antioxidantes ms eficientes en las plan-
tas, que evitan la formacin de espe-
cies de oxgeno activadas, cuya resul-
tante es la formacin de radicales de O 2 ,
d e O H y d e H 2O 2. A m b a s e n z i m a s
incrementan su contenido en los teji-
dos a medida que aumenta el grado de
estrs de plantas creciendo en su hbi-
tat natural.
Plntulas recin transferidas de la fase in
vitro a la de aclimatacin, expresan es-
casa actividad de ambas enzimas, la cual
se incrementa posteriormente (a partir de
2 4 semanas), efecto dependiente de
las condiciones favorables de adaptacin
en esta fase, especialmente de acuerdo a
los niveles adecuados de humedad rela-
tiva y luz del invernadero. Cabe desta-
car que an a condiciones de muy alta
humedad en el medio, por ejemplo HR
de 99%, las tensiones ejercidas por la at-
msfera ya son muy altas correspondien-
do a aproximadamente 1.38 MPa (Me-
gapascal) mientras en condiciones ms
normales aun, por ejemplo de HR 50%,
el potencial asciende a aproximadamente
93.6 MPa. El hecho de no poder regular
entonces la demanda de agua, an exis-
tiendo sta en el nuevo substrato, puede
conducir a un alto porcentaje de prdi-
da del material. En estos casos se usa una
estrategia intermedia que depender nue-
vamente del tipo de planta, por ejemplo,
induciendo un lento endurecimiento de la
planta mediante el traspaso a etapas par-
ciales antes de su paso a invernadero.
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
En algunas condiciones se usan osm-
ticos e inhibidores in vitro, que desenca-
denan por s algunas respuestas. Por
ejemplo, altos niveles de sacarosa apli-
cados durante la fase de germinacin de
embriones somticos han estimulado la
sntesis de antocianinas, de lpidos y de
alcaloides. Los cambios en los niveles
de CO 2 en envases hermticos de los cul-
tivos en la fase previa al transplante,
pueden afectar las densidades estomata-
les, el ndice estomtico y la apertura y
cierre de estomas de acuerdo al cultivo,
efecto tambin influenciado por la inten-
sidad lumnica (Ross-Karstens et al.,
1998). Sin embargo, a nivel de inverna-
dero, una accin benfica importante se
ha encontrado mediante el uso de com-
puestos diversos de accin antitranspi-
rante, que se aplican por aspersin so-
bre la superficie de las hojas. Con ello
se puede crear una pelcula muy fina,
que acta como reflectora de luz, redu-
ciendo de esta manera, la prdida de
agua por evapotranspiracin, mientras
se genera la cutcula y operen los me-
canismos de apertura y cierre estomatal.
Se debe tener especial cuidado con la
seleccin y preparacin de dichos pro-
ductos pues pueden generar toxicidad.
Uno de los compuestos usados ha sido
una resina polivinlica, el polivinilace-
tato o combinaciones de parafina de
bajo punto de fusin y/o grasa de petr-
leo con 50% glicerol acuoso, disuelto en
dietilter. Otro problema frecuente vin-
culado con la adaptacin, pero tambin
con respuestas morfognicas, es el efec-
to llamado vitrificacin o condicin
hiperhdrica que se presenta en teji-
dos de algunas especies bajo condicin
in vitro y que se analiza ms adelante.
La aclimatacin en ambientes controla-
dos tambin est vinculada a mejorar el
desarrollo y funcionamiento de rganos.
En muchos casos, las races formadas in
vitro no prosperan en condiciones de
substrato. Sin embargo, explantes enrai-
zados fcilmente regeneran nuevas ra-
ces. Con respecto a esto, se ha reportado
que niveles altos de CO 2 (aproximada-
mente 750 ppm) en presencia de ciertos
niveles lumnicos (80 mol m -2 s -1), favo-
recen el desarrollo radicular, al mismo
tiempo que condicionan una mejor acli-
matacin de las plntulas en tiempos me-
nores (George, 1993). A fin de lograr la
mejor aclimatacin ambiental de las
plntulas a condiciones ex vitro, se de-
ben tener adems presentes los siguien-
tes factores/condiciones: a) alta hume-
dad, sombra, asepsia; b) eliminacin de
agar con el objeto de eliminar la presen-
cia de azcar disuelta; c) uso de subs-
tratos porosos, empleando en mezclas:
perlita, arena, vermiculita, pumicita, tur-
ba y suelo; desinfectados con fungicidas
entre ellos Benomil, Propamocarb, Cap-
tan, Thiram, Mancozeb, etc. y sus combi-
naciones, en concentraciones bajas cada
dos semanas; d) segn sea el caso de la
especie y substrato y una vez formadas
las races (y follaje), aplicacin de macro
y micronutrientes mediante soluciones
nutritivas concentradas o diluidas que in-
cluyan elementos menores en forma so-
luble.
69

REFERENCIAS
Attre, S., Pomeroy, M. y Fowke, L. 1995.
Development of white spruce (Picea glau-
ca [Moench.] somatic embryos during
culture with abscisic acid and osmoticum,
and their tolerance to drying and frozen
storage. J. Exp. Bot. 46:433-439.
Bajaj, Y. 1990. Haploids in crop improvement
I. pp. 3-44. In: Bajaj, Y. (ed.). In vitro pro-
duction of haploids and their use in cell
genetics and plant breeding, Biotechnology
in Agriculture and Forestry 12. Springer-
Verlag, Berlin-Heidelberg, Germany.
Bonga, J. 1982a. Tissue culture techniques. pp.
4-35. In: Bonga, J. y Durzan, D. (eds.),
Tissue Culture in Forestry. Martinus Nijhoff/
Dr. W. Junk Publishers, Dordrecht, The
Nederlands.
Bonga, J. 1982b. Vegetative propagation in re-
lation to juvenility, maturity and rejuve-
nation. pp. 387-412. In: Bonga, J. y Durzan,
D. (eds.). Tissue Culture in Forestry,
Martinus Nijhoff / Dr. W. Junk Publishers,
Dordrecht, The Nederlands.
Cardemil, L. y Jordan, M. 1982. Light and
electron microscopic study of in vitro
cultured female gametophyte of Araucaria
araucana (Mol.) Koch seeds. Z. Pflanzen-
physiologie 107:329-338.
Chavez, V. y Litz, R. 1999. Organogenesis from
megagametophyte and zygotic embryo
explants of the gymnosperm Dioon edule
Lindley. Plant Cell Tissue and Organ Culture
58:219-222.
Fraga, M., Caal, M. y Rodrguez, R. 2002. In
vitro morphogenic potential of different aged
Pinus radiata trees correlates with polya-
mines and DNA methylation levels. Plant
Cell Tissue and Organ Culture 70:139-145.
Fowke L. y Attre, S. 1996. Conifer somatic
embryogenesis: studies of embryo develop-
ment and the cell biology of conifer cells
and protoplasts. Plant Tissue Culture and
Biotechnology 2:124-130.
70
BIOTECNOLOGA VEGETAL
Gamborg, O., Miller R. y Ojima, O. 1968.
Nutrient requirements of suspension cultures
of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50:151-
158.
George, E. 1993. Plant Propagation by Tissue
Culture, Part 1. Part 1: the technology. Exe-
getics Exegenetics Ltd. Edington, Reading,
England.
Guha, S. y Maheshwari, S. 1964. In vitro pro-
duction of embryos from anthers of Datura.
Nature 204:497.
Guha, S. y Maheshwari, S. 1966. Cell division
and differentiation of embryos in the pollen
grains of Datura in vitro. Nature 212:97-98.
Guha, S. y Maheshwari, S. 1967. Development
of embryos from pollen grains of Datura in
vitro. Phytomorphology 17:454-461.
Gupta, P. y Durzan, D. 1986. Somatic polyem-
bryogenesis from callus of mature sugar
pine embryos. Biotechnology 4:643-645.
Jordan, M. 1975. Histologische und physio-
logische Untersuchungen zur Kapazitt der
Androgenese bei in vitro kultivierten
Prunus-Pyrus-Ribes- und Nicotiana-
Antheren. Ph.D. Thesis, Justus-Liebig Uni-
versity, Giessen, Germany.
Jordan, M. y Feucht, W. 1977. Differenzierun-
gsprozesse und Phenolstoffwechsel bei in
vitro kultivierten Antheren von Prunus
avium und Prunus x Pandora. Angew.
Botanik 51:69-76.
Jordan, M., Montenegro, G. y Apablaza, G.
1983. Regeneracin de plntulas de seis
cultivares de papa libres de virus X por cul-
tivo de pices caulinares y tratamientos de
Virazole in vitro. Ciencia e Investigacin
Agraria 10:249-256.
Jordan, M., Iturriaga, L., Roveraro, C. y Goreux,
A. 1991. Promotion of Annona cherimola
in vitro shoot morphogenesis as influenced
by antioxidants. Gartenbauwissenschaft 56:
224-227.
ESTADIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
Jordan, M., Obando, M, Iturriaga, L., A. Goreux
y Velozo, J. 1993. Organogenesis and rege-
neration of some Andean fruit species. Acta
Horticulturae 336:279-284.
Jordan, M. y Piwanski, D. 1997. Regeneration
of babaco (Carica pentagona [Heilborn]
Badillo) using leaf explants and shoot-tip
culture. Phyton 61:109-115.
Joyce, S. y Cassells, A. 2002. Variation in potato
microplant morphology in vitro and DNA
methylation. Plant Cell Tissue and Organ
Culture 70:125-137.
Koblitz, H. 1972. Zell- und Gewebezchtung
bei Pflanzen. Gustav Fischer Verlag, Stut-
tgart, Germany.
Lane, W. 1990. Micropropagation of apple
(Malus domestica Barkh.). pp. 229-243. In:
Bajaj, Y. (ed.). Biotechnology in Agriculture
and Forestry 18, High-Tech and Micropropa-
gation II. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg,
Germany.
Litz, R. y Gray. D. 1992. Organogenesis and
somatic embryogenesis. pp. 3-34. In: Ham-
merschlag F, y Litz, R. (eds.). Biotechnology
of Perennial Fruit Crops, Biotechnology of
Agriculture Series N 8. CAB International,
Wallingford, United Kingdom.
Maliga, P. 1984. Isolation and characterization
of mutants in plant cell culture. Ann. Rev.
Plant Physiol. 35:519-542.
Mihaljevic, S., Peric, M. y Jelaska, S. 2001. The
sensivity of embryogenic tissue of Picea
omorika (Panc.) Purk. to antibiotics. Plant
Cell Tissue and Organ Culture 67:287-293.
Mohr, H. 1976. Pflanzenphysiologie. Springer-
Verlag, Heidelberg, Germany.
Murashige, T. y Skoog, F. 1962. A revised
medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue culture. Physiologia
Plantarum 15:473-497.
Nitsch, J. y Nitsch, C. 1969. Haploid plants
from pollen grains. Science 163:85-87.
Obando, M. y Jordan, M. 2001. Regenerative
Responses of Cyphomandra betacea (Cav.)
Sendt. (tamarillo) cultivated in vitro. Acta
Horticulturae 560:429-432.
Pierik, R., Oosterkamp, J, Manschot, G., Barth,
T. y Scholten, H. 1997. Agar brand, a
dominating factor for shoot growth of
juvenile and adult Quercus robur L.
Fastigiata in vitro. Plant Tissue Culture and
Biotechnology 3:27-31.
Ross-Karstens, G., Ebert, G. y Ldders, P. 1998.
Influence of in vitro growth conditions on
stomatal density index and aperture of
grape, coffee and banana plantlets. Plant
Tissue Culture and Biotechnology 4:21-27.
Santos, D. y Fevereiro, P. 2002. Loss of DNA
methylation affects somatic embryogenesis
in Medicago trunculat. Plant Cell Tissue and
Organ Culture 70:155-161.
Skoog, F. y Miller, C. 1957. Chemical regulation
of growth and organ formation in plant
tissues cultured in vitro. Symposia of the So-
ciety for Experimental Biology 11:118-130.
Taiz, L. y Zeiger, E. 2002. Plant Physiology.
Sinauer Associates Inc. Publishers, Massa-
chusetts, USA.
Yeoman, M. 1973. Tissue (callus) culture-
techniques. pp. 31-58. In: Street, H. (ed.).
Plant Tissue and Cell Culture. Blackwell Sci.
Publ., Oxford, England.
71
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

72
APLICACIONES DE LA TCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS

CAPTULO 4

APLICACIONES DE LA TCNICA
DE CULTIVO DE TEJIDOS Miguel Jordan Z.

PROPAGACIN CLONAL De acuerdo a varios autores, las venta-

jas de la micropropagacin son varias,

L as plantas pueden propagarse me-

diante dos ciclos de vida; la va
sexual y la asexual. En la va asexual o
entre ellas: necesidad de contar slo
con pequeos explantes (Figura 4.1) pa-
ra producir grandes cantidades de mate-
vegetativa, los caracteres individuales de rial lite en tiempos relativamente cor-
las plantas madres son mantenidas en tos; posibilidad de multiplicacin du-
sus descendientes, dado que el proceso rante todo el ao; escasos requerimien-
ocurre a travs de clulas somticas que tos de espacio y energa; posibilidad de
se copian exactamente y no recombinan obtencin de plantas libres de patge-
ni segregan como ocurre en la va sexual nos o de eliminar estos de madres infec-
(semillas). Muchas selecciones se han tadas; y reduccin de costos cuando
obtenido sobre la base de mutaciones otros mtodos aparecen excesivamen-
espontneas que han ocurrido en algu- te costosos, dependiendo de la especie.
nos tejidos. Tales caractersticas pueden La micropropagacin es, adems, la he-
igualmente perpetuarse, usando estos rramienta central en la amplificacin de
como material madre. Al grupo de plan- material gentico de alta calidad, per-
tas reproducidas a partir de esta mane- mitiendo adems, el establecimiento y
ra, se denomina clon. perpetuacin de germoplasma o genoti-
pos modificados a travs de la ingenie-
Las tcnicas de micropropagacin, no ra gentica.
slo permiten mantener la homogenei-
dad o constancia del genotipo (salvo
excepciones), sino que tambin perpe-
tan la condicin fisiolgica de los
explantes. Por ejemplo, expresar y man-
tener la condicin de juvenilidad o ma-
durez existentes en los explantes mater-
nos, o de poder mantener o de capturar
rasgos poco comunes en una poblacin
(Maynard, 1988). Igualmente por ejem-
plo, perpetuar hbitos arbustivos o de
tronco en poblaciones de ambas carac-
tersticas. De igual manera, material en
floracin o con yemas florales, genera-
Figura 4.1. Organognesis caulinar
r material con expresin inmediata de (formacin de brotes) en una seccin de hoja
caractersticas adultas. de pepino (Solanum muricatum) de 1 cm2.

73

CULTIVO DE EMBRIONES
En diversos programas de mejoramiento
gentico, es conveniente combinar ca-
ractersticas genticas importantes que
se encuentran en variedades, como tam-
bin en especies afines, mediante la ob-
tencin de material hbrido. Ello puede
realizarse mediante cruzamientos intra
e interespecficos. Sin embargo, la ferti-
lidad puede ser extremadamente baja
por problemas de incompatibilidad
gentica, lo que provoca la muerte de
los embriones en desarrollo, o bien, per-
mite completar slo parte de su desarro-
llo (Raghavan y Srivastava, 1982). La in-
compatibilidad gentica puede darse a
nivel de la polinizacin (no penetra el
polen por el estigma), a nivel del estig-
ma y durante la fecundacin.
Existen genes de incompatibilidad que
operan evitando los cruzamientos inter-
especficos naturales entre especies. En
otros casos, el problema puede darse
igualmente entre variedades que son in-
compatibles. Se pueden distinguir dos
tipos de infertilidad:
a) Incompatibilidad pre-cigtica, en la
cual no ocurre la germinacin del po-
len y/o crecimiento del tubo polnico,
por lo cual el cigoto no se forma.
b) Incompatibilidad post-cigtica, en
que se produce el cigoto, pero ste
no es aceptado por el endosperma.
La falta de nutricin del cigoto por par-
te del endosperma, provoca su desinte-
gracin o aborto (Dimantoglou y Bani-
las, 1996). En algunos casos, la polini-
zacin y desarrollo de embriones pue-
74
BIOTECNOLOGA VEGETAL
de darse extrayendo los ovarios de las
flores, despus de unos pocos das ocu-
rrida la fertilizacin y cultivndolos in
vitro despus de polinizar estos y pre-
via escisin del estilo (polinizacin o fer-
tilizacin in vitro).
Se ha visto que bajo estas circunstancias,
es posible promover el desarrollo de di-
chos embriones subcultivndolos (reti-
rndolos de los factores inhibitorios pre-
sentes en el tejido placental materno) en
estadios tempranos de su ontogenia
(Raghavan y Srivastava, 1982). De esta
manera, es posible realizar el rescate de
embriones derivado de combinaciones
que no hubiesen sido posibles en la na-
turaleza.
Una segunda utilidad, consiste en lograr,
a travs del rescate de embriones, la ob-
tencin de material con caractersticas
juveniles, el que tiene mayor potencial
regenerativo para multiplicacin clonal.
Lo mismo tambin para el material libre
de patgenos, dado que la frecuencia de
transmisin a travs de gametos es slo
de un 5%. Tambin es una estrategia efi-
ciente de obtencin de mutaciones, pues
es posible someter polen (haploide) a
tratamientos mutagnicos (radiacin
ionizante, UV y productos qumicos) y
polinizar posteriormente los ovarios.
Adicionalmente, se ha visto que embrio-
nes generados de esta manera pueden
obviar la demanda de dormancia.
De acuerdo a su estadio de desarrollo
al momento de extraccin, los medios
cambian en cuanto a complejidad de
composicin. Estadios tempranos de cul-
tivo requieren de vitaminas, aminoci-
dos, reguladores, agua de coco y otros
APLICACIONES DE LA TCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
compuestos naturales. En cambio em-
briones ms desarrollados crecen en pre-
sencia slo de sales inorgnicas y saca-
rosa. Los parmetros que afectan las fa-
ses conducentes a la obtencin de em-
briones somticos y de ellas, plantas,
est bastante conocida en diferentes es-
pecies, lo que permite automatizar el sis-
tema de cultivo en biorreactores (Ibaraki
y Kurata, 2001).
OBTENCIN
DE HAPLOIDES
La generacin de haploides (por ejem-
plo genes A B C d), tiene gran importan-
cia en el mejoramiento gentico de plan-
tas dado que:
a) Es posible, en la prctica, usar direc-
tamente la planta de caractersticas
haploides, a travs de la variacin ga-
metoclonal (ejemplo patrones de in-
jerto enanizantes);
b) Es posible hallar caracteres genticos
que pueden estar enmascarados en
cruzamientos normales dada la in-
compatibilidad que se presenta en
algunas especies;
c) Es posible diploidizar tejidos o par-
tes de la planta, obteniendo homoci-
gotos diploides, con lo cual se pue-
den seleccionar directamente pares
de genes dominantes o recesivos en
una sola generacin, haciendo posi-
ble emplear este material en cruza-
mientos posteriores; y
d) Proceder a realizar mutaciones en c-
lulas haploides, con lo cual se puede
generar diverso material con propie-
dades genticas de importancia.
Dada la mutacin frente a agentes qu-
micos (por ejemplo, toxinas, pesticidas/
herbicidas, metales pesados etc.); las c-
lulas sobrevivientes al expresar dicha to-
lerancia regeneran plantas tolerantes. La
diploidizacin (Ejemplo AA BB CC dd)
de ellas, conlleva a genotipos homocigo-
tos dominantes (dobles haploides).
a) Andrognesis.
Anteriormente se present el potencial
morfognico existente en gametos a tra-
vs de la andrognesis, que manifiestan
microsporas conducente a la produccin
de plantas haploides. Junto a la condi-
cin del genoma, la ventaja de su uso
implicaba aprovechar la variabilidad
gametoclonal en la deteccin y selec-
cin de varios caracteres agronmicos
de inters. De acuerdo a la expresin de
estos, la condicin haploide permite evi-
denciar tempranamente mutantes y, en
el caso de la manipulacin gentica, los
protoplastos haploides y sus productos
de fusin interespecfica o intergen-
rica, representan el material ms apro-
piado en el estudio de la inestabilidad
cromosomal en trabajos de mejoramien-
to gentico basado en cruzamiento ge-
ntico convencional o en fusiones som-
ticas bajo condiciones in vitro. Una se-
rie de cambios que implican variacin
gentica, pueden ocurrir en cultivos de
origen haploide combinados. Estos co-
rresponden a variacin cromosomal, al-
teraciones moleculares del genoma nu-
clear y cambios citoplasmticos (Ziau-
ddin y Kasha, 1990). Dentro de los pri-
meros, se pueden citar translocaciones,
deficiencias y nmeros irregulares de
cromosomas (Chen y Chen, 1980;
DAmato, 1977); las segundas pueden
estar relacionadas con amplificacin de
75

secuencias repetitivas (De Paepe et al.,
1982) y las terceras, con prdidas de
genes en el DNA-plastidial, causante de
la condicin albina en muchas gram-
neas (Day y Ellis, 1984). Tales variacio-
nes, permiten que con el uso de haploi-
des, la metodologa de obtencin de
mutantes resistentes a varias pestes, a
patotoxinas, herbicidas y tolerancia a
sales y estrs, se vea altamente facilita-
da y de hecho, gran cantidad de nuevas
lneas y variedades de carcter produc-
tivo, han sido generadas en varias espe-
cies de importancia agronmica (Bajaj,
1990). Igualmente, clulas y protoplas-
tos de carcter haploide, son una herra-
mienta de especial inters en trabajos de
transformacin gentica (Zhang y
Lespinasse, 1992).
b) Ginognesis.
La informacin concerniente a esta mo-
dalidad de generacin de haploides es
muy escasa. El cultivo in vitro de ova-
rios no polinizados, vulos aislados o en
conexin con tejido placental, se reali-
za preferentemente en el momento en
que el saco embrionario cuenta con
ocho ncleos haploides. Los resultados
no son tan generalizados como a travs
de la andrognesis, en menor parte atri-
buible a la dificultad de determinar el
estado del saco embrionario. En plantas
leosas, las respuestas son an ms limi-
tantes; a la fecha, se ha reportado la for-
macin de callo con estructuras de as-
pecto de embrin, pero que no condu-
jeron a la formacin de plantas. Sin em-
bargo, el potencial de esta tcnica es alto
por el tipo de material generado de ori-
gen materno, como se indic anterior-
mente (Yang y Zhou, 1990). Frente a las
76
BIOTECNOLOGA VEGETAL
limitaciones actuales, una estrategia
para generar material de caractersticas
genticas importantes de condicin ha-
ploide, sera la de generar plntulas de
material fecundado cuyo polen hubiese
sido irradiado con altos niveles de ra-
yos X o radiacin gamma, o polinizar
con polen infrtil de carcter triploide
(German y Chiancone, 2001). La gino-
gnesis es relevante en aquellos casos
de genotipos no andrognicos o con es-
terilidad masculina (Zhang y Lespinasse,
1992). En particular, la posibilidad de
obtener haploides a travs de ginogne-
sis en Citrus clementina, aparece como
la nica estrategia viable en diferentes
especies de ctricos dado que, por lo
general, diferentes genotipos ensayados
no desarrollan andrognesis (German
y Chiancone, 2001).
c) Potencial del megagametofito fe-
menino de gimnospermas.
El gametofito femenino de gimnospermas
es de relativo gran tamao y facilidad de
manipulacin. Este tejido haploide, con-
formado enteramente por clulas ha-
ploides idnticas entre s (rico en almi-
dn), nutre y rodea el embrin de las co-
nferas. En el caso de Araucaria araucana
(Cardemil y Jordan, 1982), se presenta
con clulas que corresponden a un ce-
nocito; es decir, clulas con varios n-
cleos haploides sin tabicacin interior.
Intentos de cultivar ste han conducido
a la formacin de callo con proliferacin
celular y formacin de clulas delimita-
das por pared. Sin embargo, a pesar de
no encontrar respuestas morfognicas en
A. araucana, se ha reportado morfogne-
sis conducente a la formacin de brotes
en gametofitos de Larix sp. (Nagmani y
APLICACIONES DE LA TCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
Bonga, 1985) y en varias Cycadales del
gnero Zamia spp., Ceratozamia spp. y
Dioon sp. (Chvez y Litz, 1999).
d) Haploida por cruzamientos
interespecficos incompatibles co-
rrespondientes al gnero Hordeum.
En este caso, durante el cruzamiento de
H. vulgare con H. bulbosum (Konzak et
al., 1951; Kasha y Kao, 1970; Bajaj,
1990), una mitad cromosomal de la
recombinacin se pierde (H. bulbosum)
quedando el embrin cigtico F1 en con-
dicin haploide, el cual debe ser recu-
perado mediante el cultivo de embriones
poco despus de la polinizacin. Tal es-
trategia es importante en programas de
mejoramiento, dado que puede incluirse
igualmente en cruzas de trigo (Triticum
aestivum) con maz (Zea mays), de las
cuales se han podido generar embriones
de trigo dobles haploides (Bajaj, 1990).
PRODUCCIN DE PLANTAS
LIBRES DE VIRUS.
Las virosis son enfermedades bastante
frecuentes en vegetales. Aunque por se-
millas se transmiten solamente un 5% de
ellas, los problemas por contaminacin
son muy importantes en especies que se
propagan vegetativamente. El uso de
bulbos, tubrculos, rizomas, estacas y
otro material posible de multiplicar, (jun-
to a injertos), derivado de plantas con-
taminadas, conlleva dichas infecciones.
En algunos casos, el uso de la propaga-
cin vegetativa es ineludible, puesto que
un cultivo determinado corresponde a
variedades y clones cuya homogeneidad
gentica se perdera por uso de semillas.
Por otro lado, el empleo de semillas de-
rivadas de polinizacin cruzada, por la
variabilidad que expresan, no sera id-
nea para efectos de mantener la homo-
geneidad y/o productividad de un culti-
vo. Frente a cada caso, debe conside-
rarse que, para muchas comunidades
agrcolas las metodologas ancestrales
de cultivo son mantenidas todava por
tradicin y que cambios por moderniza-
cin, seran socialmente poco viables al
haber hecho uso del mismo recurso es-
pecfico por generaciones.
La propagacin vegetativa conlleva di-
chos riesgos, con lo cual una atencin
especial debe ser dedicada a la manten-
cin de la calidad clonal y el control
fitosanitario de las plantas madres y des-
cendencia. Al mismo tiempo, la posibi-
lidad de erradicar contaminantes de
material de alto valor cultural debe ser
una constante con este propsito.
Las infecciones de tipo viral son transmi-
tidas principalmente a la planta por in-
sectos ya sea de tipo picador-chupador
(fidos) o nemtodos a nivel del suelo,
que llevan los patgenos en su sistema
digestivo, adquirindolo de otras plan-
tas contaminadas. A medida que la plan-
ta va completando sus fases de desarro-
llo y durante toda su ontogenia, la in-
feccin transmitida puede incrementarse
en los tejidos. Aparte de eso, nuevos fo-
cos de infeccin, con la misma u otras
virosis, pueden aparecer con el tiempo.
En el caso de papayas (Carica papaya);
al cabo de unos aos, las plantas deben
ser reemplazadas dado que, por presen-
cia de virus (en este caso Papaya ring-
spot virus, PRV), su productividad baja
considerablemente (Manshard, 1992).
Dado que en este o en otros cultivos se
77

tienen formas ms productivas desea-
bles, por ejemplo, (formas florales/plan-
tas masculinas, femeninas, hermafro-
ditas), plantas polinizadoras, o resisten-
tes a varios tipos de estrs bitico o
abitico, a partir de ellas es posible su
propagacin y la obtencin de material
libre de patgenos mediante tcnicas de
cultivo de tejidos.
Los tejidos meristemticos en activo cre-
cimiento se encuentran generalmente
libres de diferentes tipos de patgenos,
an en plantas contaminadas. Dicho po-
tencial es explotable puesto que, de ser
posible su cultivo y conduccin a res-
puestas morfognicas, es de esperar po-
der generar plantas idnticas sanas. Esta
condicin est dada porque el movi-
miento transcelular de patgenos, a tra-
vs de las vas simplsticas (ms frecuen-
tes en clulas jvenes de tejidos meris-
temticos), aparece como temporal-
mente demorado con respecto a la ve-
locidad de crecimiento de zonas api-
Figura 4.2. Obtencin de pices caulinares libres de
patgenos en papa (Solanum tuberosum) mediante
brotacin mltiple de secciones nodales y quimioterapia.
78
BIOTECNOLOGA VEGETAL
cales. De all que en las zonas de activa
divisin (y elongacin), ms distales,
pueden encontrarse temporalmente li-
bres de contaminacin (Figura 4.2). Otra
causa posible es la competitividad por
sntesis de protenas y cidos nucleicos
entre patgenos y tejido meristemtico,
competitividad que no ocurre en clu-
las ms adultas en fase de diferencia-
cin. Finalmente, se postula que la auxi-
na es una hormona determinante que
inicia la sntesis de muchas protenas,
entre ellas las que otorgaran caracters-
ticas de resistencia a algunos virus.
El meristema es un centro principal de
sntesis de auxina para la planta. A fin
de lograr por tanto el escape, es co-
mn mantener plantas a altas tempera-
turas, segn su grado de tolerancia (30-
40C, por das o semanas, con alta hu-
medad relativa en el ambiente), lo cual
promueve gran actividad meristemtica
y crecimiento. Conjuntamente, puede
darse la condicin de oscuridad, la cual
APLICACIONES DE LA TCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
promueve la etiolacin del eje central
(y el crecimiento) de las plantas en su
regin de elongacin celular, localiza-
da debajo del meristema.
Con el aislamiento y cultivo in vitro de
estos tejidos, se pueden obtener plantas
totalmente libres de patgenos. La tc-
nica consiste en aislar y extraer el con-
junto de clulas o tejidos que conforman
exclusivamente la regin meristemtica,
del orden de 0.1 mm de dimetro. Como
ello implica un trabajo lento, muchas
veces se cultivan los pices enteros (con
mayor riesgo de contaminacin/menor
erradicacin de patgenos), pero se em-
plean posteriormente tcnicas de detec-
cin rigurosas para evaluar la calidad
fitosanitaria del explante; por ejemplo,
ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent
Assay), de sensibilidad mil veces mayor
en comparacin con tcnicas conven-
cionales (por ejemplo, Ltex) (Wood,
1985). El grado de confianza de usar esta
metodologa, est dado tambin por el
hecho de que, en algunos casos, la mul-
tiplicacin de patgenos en los tejidos
mantenidos in vitro se ve inhibida con
el tiempo y que explantes de mayor ta-
mao (virtualmente contaminados), apa-
recen igualmente libres despus de un
perodo largo de cultivo. Existen estu-
dios especficos realizados en meriste-
mas y callos (tejidos no organizados),
que demuestran una reduccin de
patgenos en el tiempo, bajo condicio-
nes in vitro (Ingram, 1973). Varios tra-
bajos en tejidos meristemticos han em-
pleado compuestos de posible accin
antiviral con respuestas diversas. Entre
ellas, bases anlogas (por ejemplo, 8-
azaguanina, 2-tiouracilo), se han mos-
trado eficientes en el control del virus Y
(PVY) de la papa, o verde malaquita
(diaminotrifetilmetano), etc.; especial-
mente Virazole ha mostrado en el tiem-
po, tener efecto antiviral en una serie de
especies. La ventaja de su empleo e in-
clusin in vitro, es que se trata de un
producto estable a altas temperaturas
(autoclavable) y que posee escasa toxi-
cidad en los tejidos. En papas se logr
control de PVX en dosis de Virazole de
5-25 mg/L (Jordan et al., 1983), aunque
niveles de 50 mg/L o mayores, provoca-
ron cierto grado de toxicidad en los pi-
ces cultivados in vitro, afectando su cre-
cimiento y rizognesis. Virazole tambin
fue aplicado directamente a la planta,
previo al cultivo, consiguindose erra-
dicacin de PVX, bajo ciertas concen-
traciones (Figura 4.2).
Las tcnicas anteriores contemplan igual-
mente la termoterapia. Con ella fue posi-
ble eliminar la presencia de un viroide de
la papa (PSTV) y lograr la obtencin de
explantes potencialmente libres de
patgenos (Roca, comunicacin personal).
CRIOPRESERVACIN
Se refiere a la posibilidad de preservar
en el tiempo, el germoplasma existente
en la forma de clulas u rganos a bajas
temperaturas. El trmino criopreserva-
cin se refiere mayormente a tempera-
turas cercanas a 196 C. Esta metodo-
loga consiste en transferir material bio-
lgico a almacenamiento en nitrgeno
lquido, temperatura a la cual todo el
metabolismo es suspendido. Terica-
mente, no existen daos biolgicos en
el procedimiento, salvo posibles cam-
bios que involucran radiaciones ioni-
zantes naturales.
79

En la prctica, en la criopreservacin
existe la ventaja de poder conservar ma-
terial de valor, de manera que los gastos
operacionales in vivo e in vitro pueden
ser omitidos por perodos prolongados.
Esto es relevante en programas de me-
joramiento gentico de especies
arbreas o material forestal (Smith,
1997), donde se requiere superar un
perodo de larga juvenilidad y/o esperar
la expresin de caractersticas
fenotpicas de las plantas sujetas a su
conservacin y propagacin sexual pro-
gramada (Haines, 1994). Otro inters de
esta tcnica consiste en la posibilidad
de conservar material en inminente pe-
ligro de extincin. Ello es especialmen-
te relevante en reas poco exploradas
cientficamente, donde la explotacin
desmedida, por ejemplo, en vastas re-
giones de bosques tropicales, y donde
la maquinaria avanza ms rpidamente
que la descripcin taxonmica, se sacri-
fica la existencia de especies sin siquie-
ra ser descritas o ser conocida su impor-
tancia para el hombre y cuya elimina-
cin las har irrecuperables para la hu-
manidad (Raven et al., 1999).
La tcnica de conservacin es igualmen-
te de utilidad, puesto que bajo algunas
condiciones in vitro, se produce variabi-
lidad por inestabilidad gentica; como
ocurre por variacin somaclonal, otros
tipos de alteraciones en callo, o suspen-
siones celulares de carcter endgeno o
producido por algunos factores (ejemplo
2,4-D). Por criopreservacin se mantie-
ne al alcance inmediato el material ori-
ginal invariable a lo largo del tiempo. En
trminos prcticos, la ventaja tambin re- de lograrse con combinaciones de varios
side en poder conservar y usar material
o germoplasma que es altamente hetero-
cigoto y donde, por causa de la propaga-
80
BIOTECNOLOGA VEGETAL
cin por semillas, pueden ser perdidas las
combinaciones deseables de genes.
Igualmente, es importante para aquellas
semillas de especies que son poco tole-
rantes a las condiciones ambientales, de
escasa viabilidad y en peligro de extin-
cin (Maynard, 1988). La conservacin
de polen es una de las alternativas afines
posibles para conservar dicha biodiversi-
dad, al contar solamente con un repre-
sentante de cada cromosoma maximizan-
do su estabilidad gentica y tiempo de
almacenamiento (Grout y Roberts, 1995).
Salvo algunas excepciones, especialmen-
te en el caso de semillas o yemas en con-
dicin de dormancia, donde se coloca di-
rectamente el material a temperaturas
criognicas, el proceso es comnmente
gradual y requiere satisfacer ciertas eta-
pas. Una de ellas es el acondicionamien-
to previo, que puede inducirse mediante
el cultivo de explantes en presencia de
altos niveles de osmticos y el uso de
crioprotectores. Los primeros, estn indi-
cados para reducir el contenido de agua
intracelular de los explantes; los segun-
dos, para impedir la formacin de crista-
les de agua que puedan daar la estruc-
tura celular.
Este proceso de desecacin permite re-
ducir gradualmente la temperatura del ex-
plante por debajo del punto de congela-
cin sin mayor dao. A continuacin, el
proceso puede ser ms rpido colocndo-
se el material ya protegido directamente
en el N 2 lquido. En algunos casos, se ha
procedido a una interfase de desecacin
previa mediante encapsulado del material
en alginato de Ca. La crioproteccin pue-
compuestos; por ejemplo, dimetilsulfoxi-
do (DMSO) al 0,5 M hasta 15%, en presen-
cia de glicerol o con combinaciones que
APLICACIONES DE LA TCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS

pueden incluir uno o varios de los siguien- SUSPENSIONES CELULARES

tes compuestos: polietilenglicol (PEG)
10%, sorbitol 0,4-0,5 M, etilenglicol 10-
15%, sacarosa 2-3%, glucosa 6-10%, pro-
lina 0,5%. Bajo estas condiciones comn-
mente se baja la temperatura a razn de
0,5-1,0C por minuto hasta -40C; para su-
mergir luego directamente en nitrgeno l-
quido. Alternativamente, la descongela-
cin puede ser ms bien rpida hasta
aproximadamente los -40C para luego, en
presencia de algunos criopreservantes,
ascender gradualmente hasta el punto de
congelacin. A continuacin, se transfie-
re el material a medios sin criopreservantes
y se establece la temperatura usual de cul-
tivo (por ejemplo 20-25C). En esta fase,
varias modificaciones especficas han con-
tribuido a mejorar la eficiencia en algunos
cultivos; por ejemplo, la substitucin de
nitrato por amonio y el empleo de carbn
activado. Detalles sobre metodologas para
criopreservar diferentes rganos de plan-
tas, callos y suspensiones celulares, test de
viabilidad de los explantes y aspectos de
estudio bajo microscopa electrnica, es-
tn igualmente descritos (Withers, 1985).
Dado el potencial morfognico de algu-
nas clulas, es posible obtener gran efi-
ciencia en la regeneracin de plantas
mediante embriognesis somtica. Cada
clula en cultivo es, de por s, poten-
cialmente capaz de regenerar una plan-
ta completa. La eficiencia de este siste-
ma es superior a la regeneracin a tra-
vs de organognesis, con diferencia-
cin secuencial de brotes y races, me-
diante subcultivo. En condiciones apro-
piadas, se requiere solamente de uno o
dos subcultivos para lograr la induccin
embriognica de numerosas clulas, que
se mantienen por lo general en matraces
(Figura 4.3). La eficiencia en la multipli-
cacin puede ser aumentada, dada la ca-
racterstica que muchos embriones du-
rante su ontogenia, expresan la forma-
cin de embriones adventicios; ello fren-
te a posibles desbalances hormonales y
condiciones del medio (Jordan y Velozo,
1996). Estos embriones pueden ser se-
parables y aumentar la biomasa resul-
tante. El uso de suspensiones celulares

Figura 4.3. Suspensiones celulares conducentes a la

embriognesis somtica en papaya (Carica pubescens).

81

ha sido relevante en la metodologa con-
ducente a la poliembriognesis y, en al-
gunos casos, ha servido directamente en
regeneracin clonal de algunas especies
de Pinus (Dimantoglou y Banilas, 1996;
Fowke y Attre, 1996).
Entre las muchas otras ventajas de usar
suspensiones, est la de generar produc-
tos metablicos, compuestos secunda-
rios y/o estructuras qumicas activas
biolgicamente, que no pueden ser sin-
tetizados qumicamente. Ha sido posi-
ble derivar en lneas y condiciones de
cultivo que puedan maximizar la pro-
duccin de metabolitos especficos.
Igualmente, ha sido posible generar
compuestos metablicos que no han
sido sintetizados bajo condiciones na-
turales y que pueden tener gran impor-
tancia a nivel medicinal (apoatropina).
De entre los ejemplos de metabolitos se-
cundarios cuya concentracin produci-
da in vitro es mayor que en tejidos in-
tactos, se puede citar a: antraquinonas,
berberina, cafena, saponinas de Gin-
seng, cido rosmarnico, shikonina, ubi-
quinona 10 (Matsumoto et al., 1982).
Mediante cultivo de races se han pro-
ducido tambin nicotina, atropina, esco-
polamina e hiosciamina; igualmente en
concentraciones mayores que las races
in situ.
Con excepcin de lo anterior, por lo ge-
neral la metodologa es dirigida no tan-
to a la regeneracin de clulas u rga- encuentran temporalmente desprovistas
nos a plantas, sino ms bien dando prio-
ridad a la mantencin del metabolismo
secundario, lo cual no favorece necesa-
riamente la regeneracin. En estos ca-
sos, nuevamente, el uso de biorreactores
homologando condiciones in vitro apa-
recen de gran utilidad. La metodologa
82
BIOTECNOLOGA VEGETAL
de uso de clulas como fuente de pro-
ductos bioqumicos de diferente natura-
leza, ha sido de gran aplicacin biotec-
nolgica y est profusamente descrita en
la literatura (Staba, 1980).
Las suspensiones celulares se han usa-
do tambin profusamente como unida-
des de seleccin in vitro a diversos pro-
ductos como toxinas, herbicidas y me-
tales pesados. Se postula que aquellas
clulas que son tolerantes a ciertos ni-
veles de compuestos txicos para la
planta madre de la cual provienen, pue-
den generar material ms resistente y
conducir a plantas adultas con dicha
caracterstica.
Una ltima ventaja del cultivo de clu-
las en suspensin, reside en el hecho
que las condiciones definidas para la re-
generacin de clulas de una especie a
plantas, pueden ser aplicadas a aquellas
demandadas por protoplastos. Por nor-
ma general, transcurridos los procesos
crticos en cuanto a la viabilidad de pro-
toplastos, las condiciones definidas para
clulas pueden ser satisfactorias en la
fase de multiplicacin celular de proto-
plastos, tratndose de material afn.
PROTOPLASTOS
Corresponden a clulas vegetales aisla-
das bajo condiciones de cultivo, que se
de su pared celular. La posibilidad de
obtener, mantener y cultivar protoplastos
parti en la poca de los aos 1960
(Cocking, 1960) y en la dcada siguien-
te, ya estaban establecidos grandes
avances sobre aspectos bsicos de ais-
lamiento y cultivo. (Cocking y Evans,
APLICACIONES DE LA TCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
1973). La viabilidad de protoplastos resi-
de mayormente en las condiciones del
medio de cultivo, su tonicidad y compo-
sicin. La delgada membrana plasmtica
unitaria, bajo condiciones ptimas, man-
tiene la integridad de los organelos que
contiene; as como de sus funciones me-
tablicas. Los protoplastos pueden rege-
nerar su pared si parte de sus compo-
nentes nutritivos estn presentes o pue-
den ser resintetizados; por ejemplo, en
presencia de un conjunto de pentosas.
La importancia de los protoplastos es do-
ble; por un lado, son una evidencia adi-
cional de la totipotencia celular, pues
virtualmente pueden regenerarse plan-
tas a partir de cada protoplasto en parti-
cular, por lo que se les ha designado
como protoclones. En segundo lugar,
la posibilidad de usarlos como mtodo
para lograr recombinaciones genticas,
algunas no ocurrentes en la naturaleza
por incompatibilidad gentica (Shiva-
nna, 1982). Ms all, est la posibilidad
de recombinar genes pertenecientes a
otras variedades, especies y plantas de
otro gnero o familia (fusiones interes-
pecficas). La forma final aleatoria de re-
combinacin gentica, determina el pro-
ducto de fusin alcanzado.
Los productos de fusin, cuanto ms cer-
canos en parentesco, tienen mayores
probabilidades de expresarse como c-
lulas totipotentes, y emprender respues-
tas morfognicas conducentes a plantas.
Sin embargo, es frecuente la inestabili-
dad cariotpica de los productos de fu-
sin (Chaleff, 1981).
Dado que es tcnicamente factible jun-
tar dos protoplastos y fusionar estos, lo
que implica la mantencin de las estruc-
turas y propiedades contenidas en el
citoplasma (aparte de mitocondrias y
plastidios), se crean fusiones con pro-
ductos diferentes a las fusiones gam-
ticas; stas se denominan fusiones so-
mticas. Cabe destacar que en las fusio-
nes gamticas solo el vulo participa
con su contenido citoplasmtico; en fu-
siones somticas el aporte es de ambas
clulas. De mayor importancia an es la
situacin de protoplastos haploides, los
cuales sirven como excelentes herra-
mientas para inducir mutaciones con o
sin fusin de otro material recombinante.
El aislamiento de protoplastos se logra a
partir de tejidos en activo crecimiento,
siendo igualmente importante contar
con material que provea de protoplastos
de tamao homogneo. Otro factor a
considerar es la presencia de ciertas ca-
ractersticas como tamao o pigmenta-
cin como por ejemplo, las antociani-
nas; su presencia es prctica ya que pue-
den servir como indicador al fusionar
con protoplastos derivados de otra plan-
ta. El tejido u rgano elegido, primera-
mente se desinfecta y se coloca en solu-
ciones estriles, en presencia de agen-
tes osmticos (manitol, sacarosa) en alta
concentracin. El tratamiento consiste
en lograr plasmolizar el protoplasma,
contrayendo la plasmalema y separn-
dola de la pared celular. Bajo estas con-
diciones, se procede a subcultivar los te-
jidos en un medio similar, pero que con-
tiene las enzimas celulasa, pectinasa y
en algunos casos hemicelulasas (Ishii,
1989). Las primeras, proceden principal-
mente de Trichoderma viride, (con dife-
rentes nombres comerciales) junto a la
driselasa (derivada de Irpex lacteus). Las
pectinasas son obtenidas de Rhizopus
arrhizus, Aspergillus japonicus o Bacillus
83

polymyxa, mientras que las hemicelula-
sas provienen del caracol Helix pomatia
o de Aspergillus niger.
En cuanto a sus concentraciones, combi-
naciones de uso y tiempos de accin p-
timos, junto a temperaturas y tipos de
explantes a tratar, son todas variables que
deben ser evaluadas. Existen diferencias
a considerar segn sea el material, por
ejemplo, en gramneas, a diferencia de
dicotiledneas, donde las paredes con-
tienen adems glucoarabinoxilanos, las
mezclas de celulasas con xilanasas y pec-
tiliasas fueron ms eficientes para varios
cultivos (Ishii, 1989). La incubacin con
enzimas resulta en la degradacin de la
pared, cuyos restos son eliminados me-
diante centrifugacin; as como posterior-
mente los remanentes de enzimas me-
diante varios subcultivos.
Con el objeto de efectuar la fusin y ob-
tencin de recombinantes intraespecfi-
cos o interespecficos, se procede en for-
ma paralela para los protoplastos de la
otra especie o planta a combinar. Finali-
Figura 4.4. Protoplastos de Carica pubescens y
C. papaya, previa fusin (izquierda) y fusionados (derecha).
84
BIOTECNOLOGA VEGETAL
zada esta etapa, se subcultivan ambas
alcuotas en forma separada, con un os-
mtico en menor concentracin. Esto
permite regenerar la forma globular de
los protoplastos, a niveles de turgencia
que deben ser muy exactos, para as im-
pedir la ruptura celular por ingreso ex-
cesivo de agua y ruptura de la plasma-
lema (Figura 4.4).
Finalmente, se mezclan los medios fusio-
nantes con los protoplastos, pudiendo
aplicar las siguientes tecnologas pobla-
cionales o especficas para inducir su
fusin.
1. Electroporacin y electrofusin, con la
cual se descarga temporalmente la car-
ga negativa interna debajo la membra-
na, la cual impide la fusin natural.
2. Agregando CaCl 2 , PEG Ca(NO 3 ) 2
con lo cual se logra agregacin celu-
lar y fusin al azar.
3. Mediante mtodos ms especficos
como microinyeccin; que inmovili-
APLICACIONES DE LA TCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS

za un protoplasto por su superficie, (Jordan et al., 1986). En caso de que no

se procede a inyectar DNA, organelos
o ncleos de clulas deseadas, a tra-
vs de la plasmalema, bajo observa-
cin microscpica.
Otros mtodos se indican en la Tabla 4.1.
La regeneracin a partir de protoplastos,
procede en primer lugar, con la forma-
cin de la pared celular antes de que ocu-
rra una primera mitosis, e independien-
temente de que se haya procedido a la
modificacin del genotipo mediante in-
sercin de genes o cromosomas. Sin em-
bargo, dicha capacidad depende de las
compatibilidades derivadas del proceso
de arreglos y reintegracin cromosomal
y de la capacidad de su expresin poste-
rior.
Es conocido el fenmeno que cuanto
ms distante es el parentesco del mate-
rial a fusionar, existir una menor pro-
babilidad de viabilidad y respuestas mor-
fognicas. En algunos casos, como lo
han sido cruzamientos entre especies del
mismo gnero, incompatibles sexual-
mente, la fusin de protoplastos permi-
te la formacin de estructuras globula-
res, semejante a embriones, pero que no
son capaces de continuar su desarrollo
existan limitaciones morfognicas, la
regeneracin a plantas completas pue-
de proceder. Lo ms usual es a travs de
organognesis expresada en un conjun-
to celular o callo.
Durante las primeras fases de cultivo los
factores ms importantes a ser conside-
rados son: la densidad de plaqueo, la
composicin nutritiva del medio y tipo
de substrato (generalmente agarosa o
medio lquido en suspensin), las fito-
hormonas, la presin osmtica, la luz y
la temperatura. Para la induccin de em-
briognesis u organognesis es igualmen-
te importante: contar con un medio re-
generativo, provocar un descenso en la
osmomolaridad y cambios sucesivos de
medios y sus hormonas. En algunos ca-
sos se debe acompaar a los protoplastos
con clulas nodrizas (nurse cultures),
a modo de condicionar el medio nutri-
tivo con clulas en activo crecimiento,
(lo que la literatura ha indicado como
requerimiento metodolgico en algunos
casos (Reinert y Yeoman, 1982; Kyozuka
et al., 1990)). Bajo condiciones adecua-
das, normalmente los protoplastos empie-
zan a dividirse a los 3-4 das, formando
colonias compactas con pequeas clu-
las ricas en material citoplasmtico.

Tabla 4.1. Tcnicas de fusin de protoplastos y sus efectos principales.

Espontnea Degradacin enzimtica de protoplastos (clulas) multinucleadas.

Medios mecnicos Por presin o compresin (microinjeccin).
Sales/Shock osmtico Na2NO3 a conc. 0,025 M provoca shock desplasmolizante
Ac. grasos y steres Fosfolpidos cargados positivamente atraen membranas.
Iones Ca y alto pH Provocan leve lisis a membranas que no daa a los protoplastos.
Dextran y D. sulfato Dextran de alto PM agrega y fusiona protoplastos.
Alcohol Polivinlico Adhiere protoplastos sin afectar viabilidad.
Polietilenglicol Adhiere protoplastos, usado para diferentes gneros y familias.
Electrofusin Campos elctricos de 5-10V, 500Hz y pulsos de 15V, 50 seg.

85
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Para aumentar la eficiencia en algunas tes. La incorporacin de DNA de organe-

especies, el acompaamiento de las clu-
las nodrizas debe prolongarse hasta 10
das. La primera etapa de crecimiento
tambin es afectada por la densidad de
protoplastos, siendo la eficiencia de pla-
queo en el rango de 5 x 10 4 a 10 6.. Con-
centraciones inferiores reducen notable-
mente la eficiencia de plaqueo y desa-
rrollo posterior. A partir de 3-8 semanas,
es comn ver la formacin de nuevos
brotes a partir de callo, siendo kinetina y
zeatina importantes en esta respuesta.
Existen numerosas ventajas de la regene-
racin a partir de protoplastos recombi-
nados a fin de aumentar la variabilidad.
Por ejemplo, es tambin posible la gene-
racin de cbridos en los cuales la recom-
binacin de protoplastos no slo conside-
ra recombinar material nuclear, sino tam-
bin posibilita optar por la incorporacin
del DNA de cloroplastos y/o mitocondras
de una o de las dos clulas recombinan-
los (como cloroplastos o mitocondrias),
hace factible manejar la expresin de di-
chos genes insertos en ellos. Por ejem-
plo, la obtencin de esterilidad masculi-
na, factor importante en programas de
mejoramiento en maz; resulta del con-
trol de un gen ubicado en mitocondrias.
A travs del cultivo de protoplastos ha-
ploides (derivados de plantas haploides),
es posible tambin inducir mutaciones,
las cuales pueden derivar en plantas ho-
mocigotas (2n) en una sola generacin.
Protoplastos y clulas haploides tambin
pueden ser usados en procesos de selec-
cin in vitro para determinar tolerancia
a toxinas de algunos microorganismos o
frente a metales pesados y diversos pro-
ductos qumicos. Las principales fuentes
y tcnicas conjuntas posibles de aplicar
para lograr aumentar la variabilidad ge-
ntica en plantas, se encuentran resumi-
das en la Tabla 4.2.

Tabla 4.2. Metodologas aplicables a la obtencin de variabilidad en plantas.

Mutaciones inducidas (Rayos X, rayos gamma, radiacin UV; mutgenos qumicos.

Variabilidad inherente detectable por cultivo de tejidos (variacin somaclonal).
Variacin gametoclonal () mediante induccin de andrognesis y ginognesis.
Efectos combinados de caracteres de plantas haploides junto a mutagnesis.
Cruzamientos dirigidos usando polen mutado (in vivo o in vitro).
Cruzamientos con eliminacin natural de cromosomas.
Fusin simtrica de protoplastos (intraespecfica e interespecfica) in vitro.
Cibridizacin (fusin asimtrica con eliminacin de uno de los ncleos).
Cibridizacin (fusin asimtrica con incorporacin/eliminacin de mitocondrias
y/o cloroplastos).
Microinyeccin.
Electroporacin.
Transferencia de genes (A.tumefaciens, A. rhizogenes, Biobalstica).

()
La variacin gametoclonal no aade nuevos genes al conjunto existente en la especie. La existencia de un solo juego
cromosomal (en plantas haploides), hace posible la expresin de algunos de ellos (normalmente recesivos), al ser elimi-
nado el efecto del alelo. De esta manera, la o las caractersticas de la expresin de variabilidad de algunos genes de-
seables, puede ser conservada por autoduplicacin, siendo posible de su incorporacin ms fcilmente en programas
de mejoramiento.

86
APLICACIONES DE LA TCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS

SEMILLAS SINTTICAS Bajo condiciones ptimas, la tcnica

Corresponde a embriones generados por
tcnicas de embriognesis somtica que
a partir de cierto grado de desarrollo, son
encapsulados en compuestos gelifican-
tes que les aportan nutrientes y protec-
cin al desecamiento y de factores bi-
ticos/abiticos (Figura 4.5). Estas semi-
llas pueden tratarse, posteriormente,
como semillas naturales, procedindose
a una siembra con desarrollo de plntu-
las en condiciones de vivero o de cam-
po. Las cubiertas gelificantes se refieren
principalmente a alginatos, que corres-
ponden a cido algnico derivado de al-
gas (cido manurnico y cido glucur-
nico), en forma de sal de sodio. Las so-
luciones de alginato gelifican posterior
aplicacin de iones calcio, protegiendo
al embrin. En esta fase de gelificacin,
es posible incorporar diversos produc-
tos fitosanitarios y/o nutrientes que esti-
mulan el crecimiento durante la germi-
nacin (Redenbaugh et al., 1988).
permite el almacenaje de material selec-
cionado por perodos de tiempo consi-
derables sin que exista prdida de via-
bilidad; ello de acuerdo a las caracte-
rsticas genticas y metablicas de la es-
pecie vegetal usada (Redenbaugh et al.,
1988). Las semillas sintticas tambin
tienen la propiedad de proporcionar un
sistema rpido, barato y universal para
propagar material lite. Con igual obje-
tivo, ha sido tambin posible la encapsu-
lacin con alginatos de pices caulinares
de varias especies, que se mantienen
viables por perodos prolongados, utili-
zando para ello bajas temperaturas
(Lisek y Orlikowska, 2004). Con este
propsito, la encapsulacin puede ser
complementada con posterior criopre-
servacin en N 2 lquido, que en el caso
de suspensiones celulares embriognicas
de cultivares y patrones de injerto de
Vitis spp., dan respuestas de sobreviven-
cia muy satisfactorias (Wang et al.,
2004).

Figura 4.5. Encapsulacin de embriones somticos de

C. pubescens en alginato. Izquierda, mantenidos a 25C
en placas tapadas con agar. Derecha, mantenidos a 4C
por 30 das. La baja temperatura deshidrata los geles y
reduce la viabilidad de los embriones encapsulados.

87

LIMITACIONES DE LA TCNICA
Variacin somaclonal
La variacin somaclonal es un fenme-
no que se ha observado en protoplastos,
clulas en suspensin y explantes de ho-
jas, junto a otros tipos de material. Con-
siste en el aparecimiento, sin mediar
causa conocida, de efectos diversos que
pueden ser tanto heredables como no
heredables. Comnmente, la variacin
fenotpica y genotpica en las plantas re-
generadas, se observa al derivar de al-
gn cultivo celular (Larkin y Scowkroft,
1981). Se asume que pueden acontecer
cambios de carcter gentico y epigen-
tico leves, en uno o ms cromosomas.
Los cambios genticos asociados con va-
riacin somaclonal, corresponden a mu-
taciones de punto, cambios en el
cariotipo, cambios crpticos asociados
con rearreglos cromosomales, secuencia
alterada del nmero de copias, de ele-
mentos transposables, crossing-over so-
mtico, intercambio de cromtidas her-
manas, amplification de DNA y delecin
(Jain y De Klerk, 1998). Al respecto, los
cambios de algunos caracteres en algu-
nas variantes, han sido referidos a
locus particulares con cambios en un
solo gen (Dennis et al., 1987). La res-
puesta puede ser diversa, pudiendo ma-
nifestarse tan simplemente en cambios
de expresin de pigmentacin, o en for-
ma de una alta frecuencia de variacin
en varias caractersticas hortcolas, co-
mo de resistencia a enfermedades. As,
variantes somaclonales en el cv. de papa
Russet Burbank, presentan diferencias en
el crecimiento (de tipo compacto), cam-
bios en la fecha de floracin y madura-
cin del tubrculo, en las caractersti-
88
BIOTECNOLOGA VEGETAL
cas del tubrculo y requerimientos de
fotoperodo del cultivo. Igualmente, al-
gunos variantes somaclonales evidencia-
ron resistencia a pestes como Alternaria
solani y a Phytophtora infestans (Shep-
pard et al., 1980). En lamos, variantes
somaclonales de rboles hbridos mostra-
ron tolerancia aumentada al herbicida
solfometuron-metil (Michler y Haissig,
1988). Cambios en filotaxis han sido atri-
buidos igualmente a variacin somaclo-
nal en olivo (Caas et al., 1992). A pesar
de que el concepto de variacin soma-
clonal apareci en la literatura en el ao
1980, en el perodo de 10 aos, numero-
sos reportes referidos a especies frutales,
evidenciaron la generalizacin de este fe-
nmeno como una nueva fuente de va-
riabilidad (Hammerschlag, 1992).
El material derivado con caractersticas
diferentes al material donante, se ha de-
nominado como protoclones y si deri-
van de callo, como calliclones. Es
comn encontrar variacin en la capa-
cidad morfognica en callos que se han
mantenido por largo tiempo en subculti-
vo; el riesgo de induccin de variacin
somaclonal en las plantas derivadas de
estos es bastante frecuente, afectando
tambin el origen del explante (Negrutiu
y Jacobs, 1978) y tratamientos iniciales
de 2,4-D en su condicin embriognica.
En callos de algunas especies manteni-
dos en forma indiferenciada (sin hormo-
nas), puede ocurrir mayor inestabilidad
gentica (Orton, 1984). La variacin
somaclonal tambin se observa en las
clulas provenientes de una misma hoja
(Brand y Lineberger, 1992), las cuales al
ser tratadas con enzimas degradativas de
la pared celular, presentan volmenes
diferentes en suspensin, debiendo ser
APLICACIONES DE LA TCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
idnticos (Larkin y Scowkroft, 1981;
Hammerschlag, 1992). Es comn que los
brotes de novo regenerados a partir de
dichas clulas, muestren las diferencias
atribuibles a variacin somaclonal, con-
sistente en la variacin del patrn isoen-
zimtico de varias enzimas, entre ellas,
peroxidasas, aminoaspartato-transami-
nasas, como se ha reportado en papas
(Figura 4.6) (Jordan et al., 1991). Como
resultante de la variacin somaclonal,
existen regenerantes y productos varia-
dos como ser, plantas de tomate con fru-
tos de color amarillo o naranja, con re-
sistencia al hongo Fusarium y con cam-
bios estructurales morfolgicos a nivel
del pedicelo. Dichas respuestas estn
adscritas a cambios en los cromosomas
N 3 y 10 para la pigmentacin y N 11
para los otros dos caracteres (Evans, co-
municacin personal). Existen muchas
especies donde igualmente se ha demos-
trado la existencia de variacin somaclo-
nal; especialmente en tabaco, caa de
azcar, banana y Pelargonium, donde se
gener a travs de esta va una variedad
Figura 4.6. Variacin somaclonal mediante
formacin de brotes a partir de hojas en dos
clones de papa (Solanum tuberosum).
nueva. La seleccin y deteccin de va-
riantes somaclonales, especialmente en
especies leosas, puede ser realizada en
microsporas o clulas haploides en caso
que los genes de utilidad sean expresa-
dos a nivel celular; entre ellos, aquellos
que codifican para tolerancia al estrs,
resistencia a algunos herbicidas y fito-
toxinas (Bonga et al., 1987).
Hiperhidratacin (Vitrificacin).
Como se ha advertido anteriormente, por
diversas razones del medio y del tipo de
explante, un desorden fisiolgico de
"hiperhidratacin" se produce en las c-
lulas del explante, con lo que aumenta
la presin de turgencia celular. Adi-
cionalmente, tambin ocurre la ligni-
ficacin y menor pigmentacin de rga-
nos, como por ejemplo, de nuevos bro-
tes (Kevers et al., 2004). El fenmeno se
asocia a un mal funcionamiento de las
clulas estomatales y defectos en la
constitucin de las paredes celulares
de las clulas epidrmicas. Al mismo
tiempo, estomas hiperhdricos eviden-
cian la presencia del polisacrido callo-
sa, que tambin se presenta en callos y
tejidos heridos, pero que no est presen-
te en estomas de hojas normales (Ziv y
Ariel, 1992). Lo contrario ocurre con el
nivel de inositol (Zimmerman y Cobb,
1989). El exceso de agua en las clulas
provoca comnmente problemas en res-
puestas de diferenciacin y deformacio-
nes a nivel tisular (Debergh et al., 1992;
Kevers, et al. 2004). Este tipo de plantas
son extremadamente difciles de mani-
pular para su adaptacin a condiciones
de vivero y ha significado prdidas de
hasta un 60% en algunos cultivos duran-
t e l a m i c r o p r o p a g a c i n c o m e rc i a l
(Paques, 1991). El funcionamiento
89

estomatal tiende a normalizarse a medi-
da que se produce la aclimatizacin,
aunque en algunos casos, las hojas no
son funcionales y debe esperarse la
brotacin de yemas con nuevo desarro-
llo foliar expresando endurecimiento
adaptativo al ambiente (Hammerschlag,
comunicacin personal). Para evitar este
fenmeno, varios factores deben consi-
derarse y ser evaluados para cada culti-
vo, entre ellos: evitar condiciones de
cultivo deficientes, ajustar la humedad
relativa ptima alrededor del explante,
favorecer la transpiracin del explante,
ajustar los potenciales hdricos del me-
dio y evaluar la composicin de macro
y micronutrientes en el medio, junto con
la concentracin de agar. Se han usado
con xito varios productos comerciales
que inhiben fuertemente este efecto,
como lo son el agente anti-vitrificante
EM2, un gel que contiene pectina (M-
Gel) y extractos de polisacridos en al-
gas marinas, algunos muy eficientes en
el cultivo de varias especies/hbridos de
Eucalyptus spp. normalmente muy afec-
tados por este fenmeno (Whitehouse et
al., 2002). La aclimatacin implica ade-
ms, correcto funcionamiento fotosint-
tico, metabolismo de carbono y aumen-
to de enzimas de accin antioxidante
contra especies activadas de oxgeno,
t a l e s c o m o H 2 O 2 , O 2 * - y O H * ( Va n
Huylenbroeck y Debergh, 1996).
OBSERVACIONES FINALES
Paralelamente al avance del conoci-
miento sobre el potencial morfognico
y capacidad regenerativa de diferentes
tipos de explantes de variadas especies,
se evidenci un substancial progreso
con el desarrollo de la tecnologa del
DNA recombinante. Con ello, se esta-
90
BIOTECNOLOGA VEGETAL
blecieron bases fundamentales sobre la
regulacin, expresin y recombinacin
de genes. Lo anterior posibilitara, que
a mediados de la dcada del 80, la
aplicacin de la ingeniera gentica, pu-
diera vincularse y emplearse directa-
mente con el mejoramiento no conven-
cional en especies vegetales de impor-
tancia econmica. Sin embargo, cabe
destacar que si bien hoy da es posible
insertar y expresar un sinnmero de
genes forneos en plantas y modificar
stas genticamente en forma permanen-
te, la tcnica de transformacin y su xi-
to, sigue dependiendo de la expresin
de la totipotencia celular del explante
experimental usado (protoplasto, clula
en suspensin, explante multicelular), y
de su potencial morfognico in vitro, se-
gn la especie, conducente a la regene-
racin exitosa de una planta frtil y/o
que mantenga estables durante su
ontogenia y descendencia los caracte-
res de los genes insertos y/o modifica-
dos. Dichos aspectos no siempre han
sido resueltos sin necesidad de estudios
particulares, por ejemplo, se requiri de
un largo perodo de investigacin para
hacer exitosa la transformacin en va-
rias gramneas (Vasil, comunicacin per-
sonal) y otro tanto en lo concerniente a
especies leosas, forestales y/o recalci-
trantes. En los captulos siguientes, se
muestra el potencial de las herramien-
tas que ofrece la tecnologa de DNA
recombinante, la posibilidad de insertar
genes junto a su deteccin a travs de
i n g e n i e r a g e n t i c a y m a rc a d o r e s
moleculares en plantas superiores.
Un segundo punto que es importante
resaltar, se refiere al hecho que los par-
metros generales conducente al creci-
miento, diferenciacin, morfognesis y
APLICACIONES DE LA TCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
regeneracin establecidos sobre la base
de algunas soluciones nutritivas, de re-
laciones hormonales entre unos pocos
compuestos y la adicin de suplemen-
tos a los medios, es suficiente o tan uni-
versal en cuanto a requerimiento
metablico. Ello permite alcanzar res-
puestas regenerativas en clulas, tejidos
y rganos de las especies ms diversas,
especficas y particulares, sobre las cua-
les no se tienen a priori, mayores ante-
cedentes fisiolgicos. As, han sido
exitosos esfuerzos particulares realiza-
dos en diferentes pases a fin de lograr
definir condiciones para iniciar respues-
tas inductivas y regenerativas de espe-
cies relevantes a su flora endmica en
particular. La composicin de los varios
medios nutritivos y addenda hormo-
nales sustentan as la regeneracin/pro-
pagacin y saneamiento exitoso de mu-
chas especies, gneros o familias que
hasta ahora han sido de menor inters y
por ello menos conocidas en sus reque-
rimientos y respuestas. As pueden ser
recuperadas a tiempo varias especies, las
que adems de su endemismo, poseen
valor intrnseco como germoplasma,
condicin de extincin, importancia
cultural y/o comercial y que a veces tan
escasa y nicas en el mundo. Ello es
particularmente frecuente en varios pa-
ses del continente americano, donde
ocurre sobreexplotacin descontrolada
con prdida irreversible de especies ape-
nas descritas. Tomando como un ejem-
plo la condicin de Chile, consideran-
do una extensin longitudinal de 4000
Km. (diferentes latitudes), con grandes
variaciones altitudinales y aislamiento
geogrfico, se tiene una flora con un alto
grado de endemismo. De all, resulta
que, muchas especies relevantes, nicas
de la Regin, son recursos valiosos con
propiedades medicinales, ornamentales,
frutales, forestales y/o culturales, que
han formado parte de la cultura y vida
de los habitantes pre-colombinos. Con
dicha valoracin, se han emprendido a
la fecha, varios estudios conducentes a
obtener respuestas regenerativas en ta-
les especies, asociado al inters en el
patrimonio gentico, recuperacin de
germoplasma olvidado y material vege-
tal de gran valor, por hoy ya considera-
do en programas de mejoramiento a ni-
vel nacional e internacional.
Entre los gneros y/o especies chilenas
relevantes, donde ya se cuenta con an-
tecedentes de respuestas regenerativas
se han reportado las siguientes: Allium
spp. (Muoz, et al., 1988; Tapia, 1996),
Aloysia spp. (Arancibia, 2002), Alstroe-
meria spp. (Lyon, 1991), Annona cheri-
mola (Jordan et al, 1990; 1991, Cama-
cho, 1991), Brassica spp. (Campos et al.,
1993), Corynabutilon spp. (Rodriguez,
1997), Cyphomandra betacea (Obando
et al., 1992; Obando, 1995, Obando y
Jordan, 2001), Drimys winteri (Jordan y
Corts, 1981; Jordan, 1999), Euphorbia
spp. (Mancinelli et al., 1993), Fabiana
imbricata (Schmeda, et al., 2004),
Fragaria chiloensis (Mieres, 1997),
Fuchsia spp. (Banda, 1998; Chvez,
2002), Gevuina avellana (Grinbergs et
al., 1986), Gomortega keule (Caldern-
Baltierra et al., 1993), Haplopappus spp.
(Norambuena, 2001), Ipomoea batatas
(Tapia et al., 1997), Jubaea chilensis (Ca-
bello, 1990), Lapageria rosea (Jordan et
al., 1983; Seeemann, 1983), Leuco-
coryne spp. (Briones, 2003), Nothofagus
spp. (Jordan y Velozo, 1996; Pedraza,
2000; Cardemil, 2002), Pitavia punctata
(Araneda, 2002), Pouteria lucuma
(Jordan y Oyanedel, 1992; Jordan et al.
91

1994), Prosopis spp. (Jordan y Balboa,
1985); Puya spp. (Campos,1995),
Quillaja saponaria (Jordan y Roveraro,
2004), R h o d o p h i a l a s p p . ( B a s u a l t o ,
2001; Lever, 2001; Ferrando, 2002),
Solanum muricatum (Jordan, 1996),
Solanum tuberosum (Jordan et al., 1991;
Leppe, 1993), Solidago chilensis
(Schmeda et al, 2005), Sophora toromiro
(Iturriaga et al, 1994; Jordan et al.,
2001), Triticum aestivum (Hewstone et
al., 1990; 1992), Ugni molinae (Aven-
dao, 1998; Martnez, 2002), Ullucus
tuberosus (Jordan, et al. 2002).
Se asume que la comunidad cientfica
reconoce la importancia de este patri-
monio y concuerda que es necesario
conservar la biodiversidad, protegiendo
los recursos nativos a la par del proceso
productivo.
92
BIOTECNOLOGA VEGETAL
REFERENCIAS
Arancibia, E. 2002. Evaluacin de la capaci-
dad rizognica in vitro de cedrn (Aloysia
tripilla (LHerit) Britt.). Tesis Ingeniero Agr-
nomo. Universidad de Talca, Talca, Chile.
Araneda, M. 2002. Alternativas de recuperacin
de una especie en peligro de extincin me-
diante cultivo y multiplicacin in vitro. El
caso de Pitavia punctata (R. et P.) Mol.
[pitao]. Tesis Ingeniero Forestal, Universidad
de Concepcin, Concepcin, Chile.
Avendao, C. 1998. Multiplicacin por esta-
cas y cultivo in vitro de murtilla (Ugni
molinae Turcz). Tesis Ingeniero Agrnomo,
Universidad Santo Tomas, Santiago, Chile.
Bajaj, Y. 1990. Induction of haploids, pollen
embryogenesis, ultrastructure, and genetic
stability. pp. 3-44. In: Bajaj, Y. (ed.). Ha-
ploids in crop improvement I, Biotechnology
in Agriculture and Forestry 12. Springer-
Verlag, Berlin-Heidelberg, Germany.
Banda, J. 2001. Propagacin por estacas y cul-
tivo in vitro de chilco (Fuchsia magellanica
Lam. var. magellanica). Tesis Ingeniero
Agrnomo, Universidad Santo Tomas, San-
tiago, 1998.
Basualto, A. 2001. Propagacin vegetativa in
vitro de Rhodophiala montana (Phil.) Traub.
Tesis Ingeniero Agrnomo, U. de Talca,
Talca, Chile.
Bonga, J., von Aderkas, P. y James, D. 1987. Po-
tential application of haploid cultures of tree
species. pp. 57-77. In: Hanover, J. y Keathley,
D. (eds.). Genetic Manipulation of Woody
Plants, Plenum Press, New York, USA.
Brand, M. y Lineberger, R. 1992. Micropropa-
gation of american sweetgum (Liquidambar
styraciflua L). pp. 3-24. In: Bajaj, Y. (ed.).
Biotechnology in Agriculture and Forestry
18, High-tech and Micropropagation II.
Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, Ger-
many.
APLICACIONES DE LA TCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
Briones, C. 2003. Mtodos de esterilizacin y
efectos ambientales sobre el crecimiento de
bulbos Leucocoryne sp. en cultivo in vitro.
Tesis Ingeniero Agrnomo, Pontificia Uni-
versidad Catlica de Chile, Santiago, Chile.
Cabello, A. 1990. Antecedentes sobre la germi-
nacin y el cultivo in vitro de la palma chi-
lena (Jubaea chilensis (Mol.) Baillon). Cien-
cias Forestales 6:3-21.
Caldern-Baltierra, X., Perez, F. y Rotella, A.
1993. Micropropagacin de una especie
chilena en peligro de extincin Gomortega
keule (Mol.) Baillon (Magnoliopsidae,
Gomortegaceae). Bosque 14:23-28.
Camacho, H. 1991. Evaluacin de cuatro pro-
tocolos de desinfeccin del material vege-
tal para el establecimiento in vitro de pi-
ces de chirimoyo (Annona cherimola Mill.),
sobre dos medios basales y dos combina-
ciones hormonales. Tesis Ingeniero Agr-
nomo, Pontificia Univerdidad Catlica de
Valparaso, Quillota, Chile.
Campos, H., Muoz, C. y Ohkawa, Y. 1993.
Cultivo in vitro de microsporas y produc-
cin de embriones andrognicos en raps
(Brassica napus) [genotipos: Rapanui,
Gulliver, Mikado]. Agro Sur 21:10-18.
Campos, J. 1995. Cultivo in vitro en el gnero
Puya [Bromeliaceae]. Tesis Ingeniero Agr-
nomo, Universidad de Concepcin,
Chilln, Chile.
Caas, L., Avila, J., Vicente, M. y Benbadis. A.
1992. Micropropagation of olive (Olea eu-
ropea L). pp. 493-505. In: Bajaj, Y. (ed.).
Biotechnology in Agriculture and Forestry
18, High-tech and Micropropagation II.
Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Ger-
many.
Cardemil, L. y Jordan, M. 1982. Light and elec-
tron microscopic study of in vitro cultured
female gametophyte of Araucaria araucana
(Mol.) Koch seeds. Z. Pflanzenphysiologie
107:329-338.
Cardemil, C. 2002. Enraizamiento in vitro de
tres especies de Nothofagus endmicas
[ruil, hualo, huala] de la zona mesomrfica
de Chile. Tesis Ingeniero Agrnomo, Uni-
versidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
Chaleff, R. 1981. Genetics of Higher Plants.
Cambridge University Press, Cambridge,
England.
Chavez, V. y Litz, R. 1999. Organogenesis from
megagametophyte and zygotic embryo
explants of the gymnosperm Dioon edule
Lindley. Plant Cell Tissue and Organ Culture
58:219-222.
Chavez, V. 2002. Cultivo in vitro y aclimatiza-
cion de Fuchsia magellanica. Lam y Fucsia
lycioides Andr.. Tesis Ingeniero Agrnomo,
U. Santo Tomas, Santiago, Chile.
Chen, C. y Chen, C. 1980. Changes in chromo-
some number in microspore callus of rice
during successive subcultures. Can. J.
Genet. Cytol. 22:607-614.
Cocking, E. 1960. A method for the isolation
of plant protoplasts and vacuoles. Nature
187:927-929.
Cocking, E. y Evans, P. 1973. The isolation of
protoplasts. pp. 100-120. In: Street, H. (ed.).
Plant Tissue and Cell Culture. Blackwell Sci.
Publications, Oxford, England.
DAmato, F. 1977. Cytogenetics of
differentiation in tissue and cell cultures.
pp. 334-357. In: Reinert J. y Bajaj Y. (eds.).
Applied and fundamental aspects of plant
cell, tissue, and organ culture. Springer-
Verlag, Berlin-Heidelberg. New York, USA.
Day, A. y Ellis, T. 1984. Chloroplast DNA dele-
tions with wheat plants regenerated from
pollen. Possible basis for maternal inheri-
tance of chloroplasts. Cell 30:359-368.
Debergh, P., Aitken-Christie, J., Cohen, D.,
Grout, B. Von Arnold S., Zimmerman, R. y
Ziv, M. 1992. Reconsideration of the term
vitrification as used in micropropagation.
Plant Cell Tissue and Organ Culture 30:135-
140.
93

Dennis, E., Bretell, R. y Peacock, W. 1987. A
tissue culture induced Adh 1 null mutant
maize results from a single base change.
Molec. Gen. Genet. 210: 181-183.
De Paepe, R., Prat, D. y Huget, T. 1982.
Heritable nuclear DNA changes in doubled
haploid plants obtained by pollen culture
of Nicotiana sylvestris. Plant Sci. Lett. 18:
11-28.
Dimantoglou, S y Banilas, G. 1996. Pinus pinea
L. (stone pine) and Pinus halepensis Mill.
(Aleppo pine). pp. 389-406. In: Bajaj, Y.
(ed.). Biotechnology in Agriculture and
Forestry 35. Trees IV. Springer-Verlag,
Berlin-Heidelberg, Germany.
Ferrando, M. 2002. Multiplicacin in vitro de
las especies Rhodophiala montana (Phil.)
Traub.[aauca de las montaas],
Rhodophiala rhodolirion (Baker) Traub.
[aanuca de la cordillera] y Rhodophiala
splendens (Rengifo) Traub [aauca
esplendorosa]. Tesis Ingeniero Agrnomo,
U. Austral de Chile, Valdivia, Chile.
Fowke, L. y Attree, S. 1996. Conifer somatic
embryogenesis: studies of embryo develop-
ment and the cell biology of conifer cells
and protoplasts. Plant Tissue Culture and
Biotechnology 2:124-125.
German, M. y Chiancone, B. 2001. Gynoge-
netic haploids of Citrus after in vitro polli-
nation with triploid pollen grains. Plant
Cell, Tissue and Organ Culture 66:59-66.
Grinbergs, J., Valenzuela, E. y Ramirez, C. 1986.
Germinacin in vitro de Gevuina avellana
Mol. (Proteacea). Bosque 7:95-101.
Grout, B. y Roberts, A. 1995. Storage of free
pollen, pollen embryos and the zygotic
embryos of seed by criopreservation and
freeze drying. pp. 63-75. In: Grout, B. (ed.).
Genetic Preservation of Plant Cells in Vitro.
Springer-Verlag, Berlin, Germany.
Haines, R. 1994. Biotechnology in Forest Tree
Improvement. FAO Forestry Paper 118,
Rome, Italy.
94
BIOTECNOLOGA VEGETAL
Hammerschlag, F. 1992. Somaclonal Variation.
pp. 35-55. In: Hammerschlag, F. y Litz, R.
(eds.). Biotechnology of perennial fruit crops.
CAB - International, Wallingford, U.K.
Hewstone, N., Muoz, C. y Cortzar, R. 1990.
Mtodo de cultivo de anteras y capacidad
andrognica de germoplasma chileno de
trigo. Agricultura Tcnica 50:130-138
Hewstone, N., Nitsch, C., Hewstone, C. y
Muoz, C. 1992. Uso del gametocida
Hybrex para aumentar la andrognesis en
trigo. Agricultura Tcnica 52:101-104.
Ibaraki, Y. y Kurata, K. 2001. Automatization
of somatic embryo production. Plant Cell
Tissue and Organ Culture 65:179-199.
Ingram, D. 1973. Growth of plant parasites in
tissue culture. pp. 392-421. In: Street, H.
(ed.). Plant Tissue and Cell Culture.
Blackwell Scientific Publications, Oxford,
England.
Ishii, S. 1989. Enzymes for the isolation of
protoplasts. pp. 23-33. In: Bajaj, Y. (ed.).
Biotechnology in Agriculture and Forestry 8.
Plant Protoplasts and Genetic Engineering I.
Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, Germa-
ny.
Iturriaga, L., Jordan, M., Roveraro, C. y Goreux,
A. 1994. In vitro culture of Sophora toro-
miro (Papilionaceae), an endangered spe-
cies. Plant Cell, Tissue and Organ Culture
37:201-204.
Jain, S. y De Klerk, G. 1998. Somaclonal va-
riation in breeding and propagation of or-
namental crops. Plant Tissue Culture and
Biotechnology 4:63-75.
Jordan, M. y Corts, I. 1981. Shoot organoge-
nesis in tissue culture of Drimys winteri.
Plant Sci. Letters 23:177-180.
Jordan, M., Corts, I. y Montenegro, G. 1983.
Regeneration of Lapageria rosea plantlets
through tissue culture (Family Philesiaceae).
Gartenbauwissenschaft 48:97-100.
APLICACIONES DE LA TCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
Jordan, M., Montenegro, G. y Apablaza, G.
1983. Regeneracin de plntulas de seis cul-
tivares de papa libres de virus X por cultivo
de pices caulinares y tratamientos de Vira-
zole in vitro. Ciencia e Investigacin Agra-
ria 10:249-256.
Jordan, M. y Balboa, O. 1985. In vitro regene-
ration of Prosopis tamarugo Phil. and Proso-
pis chilensis (Mol.) Stuntz from nodal sec-
tions. Gartenbauwissenschaft 50:138-142.
Jordan, M., Ciudad, G., Rojas, M. y Valverde,
F. 1986. Isolation, culture and fusion of Ca-
rica candamarcensis and C. papaya proto-
plasts. Gartenbauwissenschaft 51:175-178.
Jordan, M., Arce, P. y Roveraro, C. 1990. Micro-
propagacion in vitro de algunas especies
frutcolas de Chile. Ciencia e Investigacin
Agraria 17:111-116.
Jordan, M., Roveraro, C., Stipo, A., Aguirre, J.,
Velsquez, L., y Tesser, B. 1991. Induccin
de variantes somaclonales y transformacin
en papa (Solanum tuberosum) empleando
Agrobacterium tumefaciens. Ciencia e In-
vestigacin Agraria 18:129-136.
Jordan, M., Iturriaga, L., Roveraro, C. y Goreux,
A. 1991. Promotion of Annona cherimola
in vitro shoot morphogenesis as influenced
by antioxidants. Gartenbauwissenschaft
56:224-227.
Jordan, M. y Oyanedel, E. 1992. Regeneration
of Pouteria lucuma (Sapotaceae) plants in
vitro. Plant Cell Tissue and Organ Culture
31:249-252.
Jordan, M., Valenzuela, M. y Velozo, J. 1994.
Respuestas andrognicas en anteras de
lcumo (Pouteria lucuma (T. et Pav.) O. Kze.
Ciencia e Investigacin Agraria 21:53-58.
Jordan, M. 1996. Respuestas morfognicas y
de transformacin en pepino dulce (Sola-
num muricatum). Ciencia e Investigacin
Agraria 23:47-52.
Jordan, M. y Velozo, J. 1996. Improvement of
somatic embryogenesis in Highland-Papa-
ya cell suspensions. Plant Cell Tissue and
Organ Culture 44:189-194.
Jordan, M., Velozo, J. y Sabja, A. 1996. Orga-
nogenesis in vitro of Nothofagus alpina (P.et
E.)Oerst. Fagaceae. Plant Cell Reports
15:795-798.
Jordan, M. 1999. Morphogenic responses and
in vitro regeneration of canelo (Drimys
winteri J.R. et Forster), a forest species used
in chilean traditional medicine. Acta
Horticulturae 502:289-294.
Jordan, M., Larran, M., Tapia, A. y Roveraro,
C. 2001. In vitro regeneration of Sophora
toromiro using seedling explants. Plant Cell
Tissue and Organ Culture 66:89-95.
Jordan, M., Amenbar, A. y Roveraro, C. 2002.
Rapid in vitro propagation and microtuber
production in Ullucus tuberosus (Basella-
ceae). Gartenbauwissenschaft 67:50-54.
Jordan, M. y Roveraro, C. 2004. In vitro culture
of Quillaja saponaria Mol. (Soap-Bark Tree),
Rosaceae. Europ. J. Hort. Sci. 69:73-78.
Kasha K. y Kao, K. 1970. High frequency
haploid production in barley (Hordeum
vulgare L.). Nature 225:874-876.
Kevers, C., Frank, T., Strasser, R., Dommes, J. y
Gaspar, T. 2004. Hyperhydricity of micro-
propagated shoots: a typically stress-
induced change of physiological state. Plant
Cell Tissue and Organ Culture 77:181-191.
Konzak, C., Randolph, L. y Jensen, L. 1951. Em-
bryo culture of barley species hybrids. Cyto-
logical studies of Hordeum sativum x Hor-
deum bulbosum. J. Heredity 42:125-134.
Kyozuka, J., Shimamoto, K. y Ogura, H. 1990.
Regeneration of plants from rice protoplasts.
pp. 109-123. In: Bajaj, Y. (ed.). Biotech-
nology in Agriculture and Forestry 8. Plant
protoplasts and genetic engineering I. Springer
- Verlag, Berlin - Heidelberg, Germany.
95

Larkin, P. y Scowkroft, W. 1981. Somaclonal
variation- a novel source of variability from
cell cultures for plant improvement. Theor.
Appl. Genet. 60:197-214.
Leppe, A. 1993. Produccin de plantas transg-
nicas de papa (Solanum tuberosum) resis-
tentes a Erwinia sp. mediante tcnicas de
ingeniera gentica con Agrobacterium
tumefaciens. Tesis Ingeniero Agrnomo.
Pontificia Universidad Catlica de Chile,
Santiago, Chile.
Lever, C. 2001. Propagacin in vitro de Rhodo-
phiala splendens (Phil.) [aauca] una
bulbosa nativa de Chile, en condiciones
mixotrficas. Tesis Ineniero Agrnomo.
Universidad de Talca, Talca, Chile.
Lisek, A. y Orlikowska, T. 2004. In vitro storage
of strawberry and raspberry in calciumalgi-
nate beads at 4C. Plant Cell Tissue and
Organ Culture 78:167-172.
Lyon, G. 1991. Bases biolgicas para la rege-
neracin in vitro de Alstroemeria. Tesis In-
geniero Agrnomo. Pontificia Universidad
Catlica de Chile, Santiago, Chile.
Mancinelli, P., Gnecco, D., Pooley, T. , Cama-
o, D. y Beratto, V. 1993. Cultivo in vitro
de Euphorbia lactuflua Phil. y Euphorbia
copiapina Phil. (Euphorbiaceae). Gayana
Botanica 50:41-46.
Manshardt, R. 1992. Papaya, In: Hammer-
schlag, F. y Litz, R. (eds.). Biotechnology of
Perennial Fruit Crops. Biotechnology in
Agriculture N 8, CAB-International.
Wallingford, UK.
Martinez, M. 2002. Comparacin de dos m-
todos de transmisin in vitro del fitoplasma
causante de escoba de bruja en plantas de
murta (Ugni molinae Turcz). Tesis Ingenie-
ro Agrnomo, Universidad Austral de Chi-
le, Valdivia, Chile.
96
BIOTECNOLOGA VEGETAL
Matsumoto, T., Ikeda, T., Okimura, C., Obi, Y.,
Kisaki, T. y Noguchi, M. 1982. Production
of ubiquinone 10 (UQ-10) by UQ highly
producing strains selected by a cell cloning
technique. pp. 275-276. In: Fujiwara, A.
(ed.). Plant Tissue Culture 1982, 5th
International Congress of Plant Tissue and
Cell Culture. Maruzen Co., Tokyo, Japan.
Maynard, C. 1988. Interaction between cloning
success and forest tree improvement, pp.
335-347. In: Valentine, F. (ed.). Forest and
Crop Biotechnology. Springer- Verlag, New-
York, USA.
Michler C. y Haissig, B. 1988. Increased herbi-
cide tolerance of in vitro selected hybrid
poplar. pp. 183-189. In: Ahuja, M. (ed.).
Somatic Cell Genetics of Woody Plants.
Kluver, Dordrech, The Netherlands.
Mieres, M. 1997. Propagacin in vitro de frutilla
blanca chilena (Fragaria chiloensis L.
Duchesne). Tesis Ingeniero Agrnomo, Uni-
versidad de Concepcin, Chilln, Chile.
Muoz, C., Escaff, M. e Izquierdo, J. 1988. Ma-
nual de intercambio y manejo de germo-
plasma in vitro de ajo (Allium sativum L.).
FAO-Oficina Regional para America Latina
y el Caribe. FAO-INIA, Santiago, Chile.
Nagmani R. y Bonga, J. 1985. Embryogenesis
in subcultured callus of Larix deciduas. Can.
J. For. Res. 15:1008-1091.
Negrutiu, I. y Jacobs, M. 1978. Regeneration
of the morphogenetic capacity in long-term
callus cultures of Arabidopsis thaliana: The
origin of the explant. Z. Pflanzenphysiologie
90:363-372.
Norambuena, M. 2001. Propagacin germina-
tiva de Haplopappus multifolius y Haplo-
pappus taeda. Tesis Ingeniero Agrnomo,
Universidad de Talca, Talca, Chile.
Orton, T. 1984. Chapter 9: Celery. pp. 243-267.
In: Sharp et al. (eds). Handbook of Plant Cell
Culture. McMillan, New York, USA.
APLICACIONES DE LA TCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS
Obando, M., Goreux, A. y Jordan, M. 1992.
Regeneracion in vitro de Cyphomandra
betacea (Tamarillo), una especie frutal
andina. Ciencia e Investigacin Agraria
19:125-130.
Obando, M. 1995. Potencial de Regeneracin
in vitro y Transformacin Genetica de
Cyphomandra betacea (Cav.)Sendt. un Fru-
tal Andino. Tesis Magister Sciences, Univer-
sidad Austral, Valdivia, Chile.
Obando M. y Jordan, M. 2001. Regenerative
responses of Cyphomandra betacea (Cav.)
Sendt. (tamarillo) cultivated in vitro. Acta
Horticulturae 560:429-432.
Paques, M. 1991. Vitrification and micropropa-
gation: causes, remedies and prospects.
Acta Horticulturae 319:95-100.
Pedraza, M. 2000. Propagacin in vitro de
Nothofagus alpina (Poepp. et Endl) Oerst.
[raul] a partir de embriones aislados. Tesis
Ingeniero Forestal, Universidad de Concep-
cin, Concepcin, Chile.
Raghavan, V. y Srivastava, P. 1982. Embryo
Culture. pp. 195-230. In: Johri, B. (ed.). Ex-
perimental embryology of vascular plants.
Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, Germany.
Raven, P., Evert, R. y Eichhorn, S. 1999. Biology
of Plants, W.H. Freeman & Company/Worth
Publishers, New York, USA.
Redenbaugh, K., Slade, D., Viss, P. y Kossler, M.
1988. Artificial Seeds: Encapsulation of
somatic embryos. pp. 400-419. In: Valentine,
F. (ed.). Forest and Crop Biotechnology,
Springer-Verlag, New York, USA.
Reinert, K. y Yeoman, M. 1982. Plant Cell and
Tissue Culture. Springer-Verlag, Berlin-
Heidelberg, Germany.
Rodrguez, C. 1997. Cultivo in vitro de especies
vegetales nativas chilenas en peligro de ex-
tincin: Corynabutilon ochsenii Phil., Lobelia
bridgessii Hook. et Arn. y Valdivia gayana
Remy. Tesis Ingeniero Agrnomo. Universi-
dad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
Schmeda, G., Jordan, M., Gerth, D., Wilken,
E., Hormazbal, F. y Tapia, A. 2004.
Secondary metabolite content in Fabiana
imbricata plants and in vitro cultures. Z.
Naturforschung 59c:48-54.
Schmeda, G., Jordan, M., Gerth, A. y Wilken,
D. 2005. Secondary metabolite content in
rhizomes, callus cultures and in vitro
regenerated plantlets of Solidago chilensis.
Z. Naturforschung 60c, 5-10.
Seemann, P. 1983. Propagacion in vitro del
copihue (Lapageria rosea Ruiz et Pav). Agro
Sur 11:130-134.
Sheppard, J., Bidney, D. y Shahin, E. 1980.
Potato protoplasts in crop improvement.
Science 208:17-24.
Shivanna K. 1982. Pollen-pistil interaction and
control of fertilization. pp. 131-174. In:
Johri, B. (ed.). Experimental embryology of
vascular plants. Springer-Verlag, Berlin-
Heidelberg, Germany.
Smith, D. 1997. The role of in vitro methods in
pine plantation establishment: the lesson
from New Zealand. Plant Tissue Culture and
Biotechnology 3:63-73.
Staba, E. 1980. Secondary metabolism and
biotransformation. pp.59-97. In: Staba, E.
(ed.). Plant Tissue Culture as a Source of
Biochemicals. CRC Press, Boca Raton, USA.
Tapia, M. 1996. Induccin de callo, organog-
nesis y regeneracin in vitro de plantas de
ajo (Allium sativum L.). Agro-Ciencia
12:149-154.
Tapia, M., Wilckens, R. y Campos, L. 1997.
Regeneracin y organognesis in vitro de
plantas de camote (Ipomoea batatas L.
(Lam)) presentes en Chile. Agro-Ciencia
13:143-148.
Van Huylenbroeck, J. y Debergh, P. 1996.
Physiological aspects in acclimatization of
micropropagated plantlets. Plant Tissue
Culture and Biotechnology 2:136-141.
97

Wang, Q., Mawassi, M., Sahar,N., Li, P., Colova-
Tsolova, V., Gafny, R., Sela, I., Tanne, E. y
Perl, A. 2004. Cryopreservation of grapevine
(Vitis spp.) embryogenic cell suspensions by
encapsulation-vitrification. Plant Cell Tissue
and Organ Culture 77:267-275.
Whitehouse, A., Marks, T. y Edwards, G. 2002.
Control of hyperhydricity in Eucalyptus
axillary shoot cultures grown in liquid
medium. Plant Cell Tissue and Organ
Culture 71:245-252.
Withers, L. 1985. Cryopreservation and storage
of germplasm. pp.169-191. In: Dixon, A.
(ed.). Plant Cell Culture - A Practical
Approach. IRL Press, Oxford, England.
Wood, K. 1985. Tissue culture methods in
phytopathology I Viruses. pp. 193-214. In:
Dixon, A. (ed.). Plant Cell Culture a Practical
Approach. IRL Press, Oxford, England.
Yang, H. y Zhou, C. 1990. In vitro gynogenesis.
In: Bhojani, S. (ed.). Plant Tissue Culture,
Applications and Limitations. Elsevier
Science Publishers, New York, USA.
98
BIOTECNOLOGA VEGETAL
Zhang, Y. y Lespinasse, Y. 1992. Haploidy. pp.
57-75. In: Hammerschlag, F. y Litz, R. (eds.).
Biotechnology of Perennial Fruit Crops,
Biotechnology of Agriculture Series N 8.
CAB International, Wallingford, U.K.
Ziauddin, A. y Kasha, K. 1990. Genetic stability
in haploid cell cultures. pp. 83-98. In: Bajaj,
Y. (ed.). Biotechnology in Agriculture and
Forestry 12. Haploids in crop improvement
I. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg,
Germany.
Zimmerman, T. y Cobb, B. 1989. Vitrification
and soluble carbohydrate levels in Petunia
leaves as influenced by media, Gelrite and
glucose concentrations. Plant. Cell Rep.
8:358-360.
Ziv, M. y Ariel, T. 1992. On the relation between
vitrification and stomatal cell wall deformity
in carnation. Acta Horticulturae 314:121-
129.
TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE

CAPTULO 5

TECNOLOGA DEL DNA

RECOMBINANTE Humberto Prieto E.

INTRODUCCIN EL FUNCIONAMIENTO
BSICO DE UN GEN.

L a dcada de los setenta represent

una revolucin en todos los labora-
torios del mundo. Fue durante esta po-
Estructura del material gentico.
En 1953, James Watson y Francis Crick
ca, en la que todos los conocimientos
publican un detallado modelo de la es-
de la biologa molecular surgieron rpi-
tructura del DNA, la molcula heredita-
damente a su aplicacin masiva. Todo
ria de la vida. Se saba, por trabajos ya
esto, debido al inmenso fondo de cono-
realizados por Phobeus Levene, que el
cimientos que se vena generando des-
DNA estaba compuesto por grupos fosfa-
de los aos de la post-Segunda Guerra
to unidos a grupos de azcar del tipo de-
mundial. El avance cientfico en reas
soxirribosa, los que a su vez estaban uni-
como la gentica, bioqumica, biologa
dos a una base nitrogenada. Esta base
celular y la fsico-qumica, convergieron
puede ser de un grupo de cuatro posi-
en la aparicin de la tecnologa del DNA
bles: dos del tipo purina (adenina (A) y
recombinante. Esta tecnologa, se esta-
guanina (G)) y dos del tipo pirimidina (ti-
bleci cooperativamente en los laborato-
mina (T) y citocina (C)). El conjunto cons-
rios de Stanley Cohen, Paul Berg y Her-
tituido por un grupo tri-fosfato, un az-
bert Boyer. De esta forma, genes espec-
car y una base nitrogenada, se denomi-
ficos comenzaron a ser aislados (lo que
na nuclesido. Para formar una cadena
se conoce como clonamiento) y manipu-
de DNA, los nuclesidos son unidos en-
lados (proceso de sub-clonamiento), de
tre s, en serie. Esto quiere decir, desde
forma tal de hacerlos funcionales fuera
un fosfato hacia un azcar y luego al
de su fuente de origen, lo que se logra-
fosfato siguiente, enlace repetido a tra-
ba generalmente en esa poca, en bac-
vs de toda la cadena y denominado
terias.
fosfodister, formando una hebra simple
del DNA. Una vez insertados y forman-
Para entender cmo se lleg a esta re-
do esta cadena simple, los nuclesidos
volucin, revisaremos algunos elemen-
tri-fosfato se denominan nucletidos, o
tos que sern clave para entender la tec-
simplemente bases nucleotdicas (Figura
nologa del mejoramiento gentico por
5.1). Comnmente, el tamao o largo del
transgenia en plantas.
DNA es referido en trminos de bases de
nucletidos o simplemente bases. De esta
forma, el DNA puede variar su tamao
desde unas pocas bases, algunos miles de
nucletidos (kilobases) o megas de
nucletidos (megabases).

99

O O
H3C
O P O CH2
O TIMINA
H H
FOSFATO
H H
OH H
AZCAR
Figura 5.1. Nuclesidos tri-fosfato: Adenina, Timina, Guanina y Citosina
se unen al grupo azcar en la estructura bsica del DNA. A su vez, estos
se unen con unidades similares mediante el grupo fosfato.
Inicialmente, Levene predijo que el DNA
tena una secuencia repetitiva de nu-
cletidos, por ejemplo AGTCAGTC. Sin
embargo, se intua que el DNA deba ser
inteligente y este ordenamiento repeti-
tivo no cumplira con la misin de lle-
var toda la informacin que necesita la
clula y los organismos vivos. Adems,
ya se haba demostrado por Erwin Char-
gaff, que las abundancias relativas de los
cuatro nucletidos en distintas clulas,
tanto eucariontes como procariontes, no
estaban en una razn estequiomtrica
(1:1:1:1). Ms bien, estos resultados in-
dicaban que, sorprendentemente, el
contenido de G era similar al de C y,
correspondientemente, el contenido de
A era muy prximo al contenido de T.
En forma casi simultnea, Linus Pauling,
trabajando en el Cal Tech, desarrolla una
poderosa herramienta: la cristalografa
de rayos X. Watson y Crick tomaron los
procedimientos que Pauling utilizaba en
sus estudios de estructura de las prote-
nas cristalizadas y los aplicaron al DNA.
Cuando un grupo de rayos X son dirigi-
dos hacia un conjunto de tomos crista-
lizados y chocan con ellos, estos son
desviados de forma tal que colisionan
entre s, generando puntos de diferentes
intensidades al ser colectados en una
100
BIOTECNOLOGA VEGETAL
NH 2
N
N
N N O
NH
ADENINA N
NH
O
N
N NH 2
NH2 GUANINA
N
N O
CITOSINA
pelcula fotogrfica. Maurice Wilkins y
Rosalind Franklin realizaron este tipo de
experimentos con preparaciones de
DNA semi-cristalino, obteniendo imge-
nes claves para que Watson y Crick in-
terpretaran los patrones de difraccin de
estas molculas. Ellos realizaron medi-
ciones y clculos desde estas fotografas
(autorradiografas), fascinados por la si-
metra que ellas mostraban. As final-
mente, se aventuraron a postular que el
DNA tena una estructura de doble hli-
ce (dos hebras de DNA), con los grupos
fosfato orientados hacia fuera de esta
hlice. Tambin, determinaron las di-
mensiones bsicas de esta estructura,
como ancho y ngulo de alguno de los
enlaces entre los grupos que componan
los nucletidos.
Pese a estos resultados, estos estudios no
podan informar cmo ambas hebras de
DNA estaban unidas. Pauling, con gran
conocimiento de qumica orgnica y de
estructura de protenas, haba propuesto
el modelo de una triple-hlice. Sin em-
bargo, este modelo no era compatible
con los resultados inferidos de los estu-
dios de difraccin de rayos X. Fue enton-
ces cuando Watson lig los anteceden-
tes de la existencia de los puentes de hi-
drgeno, un tipo de enlace en el que se
TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE

comparte un tomo de hidrgeno en- De esta forma, la estructura del DNA

tre dos tomos con cierta densidad de
electrones, como lo son el nitrgeno (N)
y el oxgeno. l analiz cada posibilidad
de unin entre los nucletidos mediante
estos enlaces. Adems, ya conoca las
medidas bsicas del DNA y, apoyado en
estos antecedentes, concluy que exista
una interaccin de este tipo entre las ba-
ses G (una base fsicamente grande) y C
(una base pequea), mediante tres puen-
tes de hidrgeno entre tomos de los ani-
llos de las bases nitrogenadas, y entre A
(base grande) y T (base pequea), me-
diante dos puentes de hidrgeno entre los
tomos del anillo de las bases. Este mode-
lo se llam de apareamiento de bases y
estaba en completo acuerdo con las pro-
porciones estequiomtricas obtenidas por
Chargaff y con las medidas deducidas de
la difraccin de rayos X (Figura 5.2).
basa su estabilidad en dos tipos de en-
laces bsicos: a) el enlace fosfodister
del grupo azcar con el grupo fosfato en
la cadena lineal de una hebra del DNA
y b) la interaccin mediante puentes de
hidrgeno entre las bases nitrogenadas
de cada nucletido de dos hebras de
DNA. El nmero de puentes de hidrge-
no es proporcional a la fuerza con que
ambas bases interactan, por lo que la
interaccin GC es ms fuerte que la
interaccin AT. Crick postul que, segn
la estructura observada, haban ciertos
ngulos y distancias entre los grupos
qumicos, que sugeran que en la doble
hlice ambas hebras deban orientarse
en forma antiparalela. Es decir, la orien-
tacin qumica entre los enlaces forma-
dos por los grupos fosfato y los grupos
OH del azcar del esqueleto lineal de

N
-H
O H-N
PUENTES DE
HIDRGENO
N N
N-H CITOSINA
N N
C

N O
-H N
3
H

H-
H N-
GUANINA H
O

N N TIMINA
N

N
H

ADENINA N
O

Figura 5.2. Enlaces de hidrgeno formados por los grupos N, H y O. En estas

interacciones, el hidrgeno est en realidad siendo "compartido" por los otros
dos tomos. Las dimensiones obtenidas en la difraccin de Rayos X fueron
coincidentes con las distancias que tericamente ofrecen los puentes de
hidrgenos entre G (una base grande) y C (una base pequea). De la misma
forma, estas medidas coincidan para enlaces entre A (base grande) y
T (base pequea). De esta forma, entre G y C existen tres nubes
electrnicas tipo puente de hidrgeno y entre A y T, dos.

101

una hebra, deba ser inversa a la que tie-
nen las bases en la hebra complementa-
ria. As, el DNA es un riel de trenes que
se ha torcido, con los grupos azcar y
fosfato formado los rieles y con las ba-
ses nitrogenadas y sus puentes de hidr-
geno formando los durmientes. Ambos
rieles son opuestos en direccin y los
durmientes siempre son complementa-
rios: A aparea con T y G aparea con C.
Flujo de la informacin biolgica.
Una vez conocida su estructura, la
replicacin del DNA pas a ser la siguien-
te pregunta. Ya Watson y Crick haban
adelantado la idea de que cuando una
clula se divide, su material gentico es
replicado y para esto, la doble hebra de
DNA deba separarse. Este modelo se lla-
m de replicacin semiconservativa.
Meselson y Stahl, en 1958, realizaron im-
portantes experimentos para demostrar la
forma en la que el DNA se replica. Ellos
hicieron crecer en un tubo, bacterias
Escherichia coli (E. coli) en presencia de
15
N, un istopo pesado del N, para que
incorporaran este elemento en sus bases
A, T, G y C; a este llamaron tubo de expe-
rimentacin #1 (tubo #1). Posteriormen-
te, trasladaron una fraccin de bacterias
a un nuevo medio (tubo #2), el cual slo
contena N y no el istopo pesado. Espe-
raron el crecimiento de las bacterias y re-
pitieron la operacin anterior dos veces
ms, generando un tubo #3 y un tubo #4,
siempre utilizando N (Figura 5.3). Extra-
jeron muestras de DNA de las cuatro pre-
paraciones bacterianas y evaluaron el con-
tenido de nitrgeno en el DNA de stas.
Este anlisis se realiz mediante la forma-
cin de gradientes de sedimentacin en
soluciones salinas, las que se generaron
por centrifugacin a alta velocidad. La
102
BIOTECNOLOGA VEGETAL
idea fue separar este DNA segn su peso
o densidad, debido a la incorporacin de
15
N y su reemplazo con N. El DNA extra-
do del tubo #1, mostr que todo este ma-
terial era ms pesado que aquel DNA ais-
lado de las bacterias crecidas en el tubo
#4. Aquellas bacterias que crecieron ini-
cialmente en 15N y que luego se cambia-
ron a un medio sin istopo (tubo #2),
mostraron tener una banda intermedia a
las dos primeras preparaciones (tutbo #1y
tubo #4). El tubo #3, mostr poseer tanto
bandas livianas (al igual que el tubo #4) y
bandas intermedias (similar al tubo #2) (Fi-
gura 5.4). Estos resultados engranaron per-
fectamente con el modelo semicon-
servativo propuesto por Watson y Crick
para la replicacin del DNA, en donde
ambas hebras son separadas y cada una
sirve de molde para su hebra complemen-
taria, generando dos dobles hebras, don-
de una hebra de cada par es sintetizada
de novo y la otra es mantenida. Fue Arthur
Kornberg quien encontr, en forma casi
simultnea a los experimentos de
Meselson y Stahl, la enzima (una protena
con actividad biolgica) encargada de
hacer este trabajo dentro de la clula, a la
que llam DNA polimerasa (DNApol).
Kornberg desarroll sistemas in vitro de
replicacin del DNA, con extractos de E.
coli y los cuatro nucletidos; eso s, utili-
zando uno de ellos, T, marcado con tritio
(3H, un istopo radiactivo del hidrgeno).
De este modo, l pudo medir la radiacti-
vidad incorporada en forma de 3H, al DNA
que se iba sintetizando por accin espe-
cfica de la DNApol. Posteriormente, este
mismo investigador descubri que en es-
tas bacterias, la DNApol no era una sino
tres, siendo la DNApol III la encargada
preferentemente de la replicacin
semiconservativa del genoma de la bac-
teria.
TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE

Figura 5.3. La replicacin del DNA es semiconservativa. Primero se hizo

crecer bacterias en nitrgeno 15 (tubo # 1), desde donde se tom una al-
cuota y se sembr en el tubo #2 que tena nitrgeno 14. Este se dej crecer
nuevamente y de l se sac una nueva alcuota para sembrar en el tubo #3.
Finalmente, se hizo lo mismo para terminar con el tubo #4, tambin en
nitrgeno 14.

Figura 5.4. Gradientes de sedimentacin de DNA . Las bacterias que crecieron

en los tubos con nitrgeno 15 y 14 se lisaron y su DNA se deposit en una
gradiente de cloruro de cesio. Se centrifug y as el DNA lleg a su punto de
equilibrio de densidad. El DNA extrado de las bacterias del tubo#1 se ubic
en un punto ms abajo que en el resto de los DNAs de los otros tubos. En el
tubo#4, el DNA se ubic por encima de las otras preparaciones. El DNA del
tubo#2, se ubic exactamente en la mitad de #1 y #4. Y el DNA del tubo#3,
present dos bandas, la media y la superior. Con esto, se demostr que el
nitrgeno 15 en el DNA bacteriano se fue "diluyendo" a travs de las
generaciones. Las ubicaciones equidistantes, permitieron inferir
que el modelo de replicacin era semiconservativo.

La transmisin de la informacin desde surgi de inmediato debido a su abun-

la molcula de DNA hacia molculas
efectoras como las protenas, fue tam-
bin establecida por Francis Crick, bajo
la idea de un Dogma Central para el flu-
jo de la informacin a travs de una
molcula transportadora. Tal mediador
dancia en el citoplasma celular, el ci-
do ribonucleico (RNA). Al igual que el
DNA, el RNA posee un esqueleto otor-
gado esencialmente por enlaces entre un
grupo azcar y un grupo fosfato, pero
esta vez las azcares provienen de un

103

grupo llamado de las ribosas, en vez de
las desoxirribosas, como en el DNA. El
RNA utiliza las mismas bases nitroge-
nadas, excepto que T es reemplazada
por uracilo (U). Como se mencion, el
DNA es una macromolcula doble he-
bra, en contraste, el RNA es usualmente
hebra simple. La existencia del RNA
como molcula transportadora de la in-
formacin planteaba la existencia de
otras molculas accesorias, que realiza-
ran funciones de adaptadores molecu-
lares. En efecto, para cada aminocido,
debera existir un adaptador especfico.
Esta idea, se desarroll en forma parale-
la e independiente de Crick por Paul
Zamecnik, quien en 1953 desarroll un
sistema in vitro para sintetizar protenas
a partir de extractos de hgado de rata.
En estos sistemas, Zamecnik fue capaz
de distinguir cuerpos voluminosos
adosados a las cadenas peptdicas (se
llama pptido a una cadena de hasta 20
aminocidos) que se estaban sintetizan-
do. Estos cuerpos se llamaron posterior-
mente ribosomas. Con la ayuda de
Mahlon Hoagland, este mismo grupo
encontr enzimas asociados a los
ribosomas y en 1955, se pudo definir
que los aminocidos eran unidos prime-
ro a otro RNA antes de ir a formar una
protena. Estos RNAs solubles se llama-
ron RNA de transferencia (tRNA).
Inicialmente se pens que el RNA aso-
ciado a los ribosomas era la molcula
utilizada como molde para la sntesis de
protenas. Pero el grupo formado por
S y d n e y B r e n n e r, F r a n c o i s J a c o b y
Mathews Meselson, descartaron pronto
al tRNA como molcula de la informa-
cin y demostraron la existencia de un
tercer tipo de RNA, altamente inestable,
que llevara esta informacin desde el
104
BIOTECNOLOGA VEGETAL
DNA. Ellos evaluaron la replicacin de
un bacterifago (virus que infecta bac-
terias) en bacterias, utilizando la idea de
poder distinguir entre los ribosomas y
tRNA aportados por las bacterias y el
nuevo material generado por el fago para
su replicacin (aqu es necesario recal-
car que la replicacin de los fagos im-
plica la sntesis de sus protenas utilizan-
do la maquinaria de la misma bacteria).
Los experimentos de este grupo consis-
tieron en hacer crecer bacterias en un
medio con istopos pesados de C y N
( 13C y 15N). Luego, estas bacterias se sa-
caron de estos medios y se infectaron
con fagos en presencia de un tercer
nucletido, 32 P. Una vez producida la
infeccin y un tiempo antes de la lisis
de las bacterias por parte del fago, se
procedi a la extraccin de RNAs y
ribosomas y su separacin por gradientes
de densidad. Las fracciones correspon-
dientes a ribosomas completos y a
ribosomas desmantelados en sus sub-
unidades (producto de la separacin),
mostraron todas poseer los istopos 13C
y 15N pero no 32P (Figura 5.5). Esto im-
plicaba que los ribosomas haban sido
sintetizados antes de la infeccin con el
fago. Al analizar la existencia de 32P en
las fracciones observadas, ste se detec-
t en la zona donde se encontraban los
ribosomas completos y tambin en el
fondo del tubo (Figura 5.7, derecha); este
ltimo material, al ser estudiado, se des-
cribi como un RNA distinto a los co-
nocidos, el que se llam RNA mensaje-
ro (mRNA). El mRNA vino a ser la pieza
faltante del rompecabezas que era el
Dogma propuesto por Francis Crick y se
reconoci como la molcula molde para
la sntesis de protenas, la que adems,
estaba de alguna forma interactuando
con ribosomas completos (Figura 5.6).
TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE

Figura 5.5. Descubrimiento del RNA mensajero. Se hizo crecer bacterias

en un medio con istopos pesados de C y N (13C y 15N). Luego, stas se
sacaron de estos medios y se infectaron con fagos en presencia de un ter-
cer nucletido, 32P. Luego se procedi a la extraccin de RNAs y ribosomas
y su separacin por gradientes de densidad. Las fracciones
correspondientes a ribosomas completos y a sub-unidades ribosomales
(artefacto tcnico de la separacin), mostraron poseer 13C y 15N pero
no 32P. As, los ribosomas haban sido sintetizados antes de la infeccin
con el fago. El 32P se encontr en la zona correspondiente a los
ribosomas completos y tambin en el fondo del tubo (tubo a la
derecha). Al ser estudiado, ste se describi como RNA mensajero.

Figura 5.6. Dogma Central. El RNA es transcrito a RNA, del cual existen tres
tipos: rRNA, RNA ribosomal que participa en la estructura de los ribosomas y
tambin tiene funciones en la traduccin; tRNA, RNA de transferencia, que
posibilita la traduccin a protenas mediante el acoplamiento de
aminocidos; y mRNA, RNA que contiene el mensaje para la
sntesis de la protena en el proceso de traduccin.

105

As, el Dogma Central estableci que la
informacin para generar una protena
estaba codificada en el DNA, el cual
utilizaba como molcula mediadora al
mRNA, la que con ayuda del tRNA y
ribosomas, generara finalmente las pro-
tenas. La codificacin utilizada por el
DNA para informar de la formacin de
una protena especfica vendra a ser
dilucidada en 1961, cuando Marshall
Niremberg y Johann Matthaei, demues-
tran que un aminocido es codificado
por tres nucletidos ledos en el mRNA manipulacin de la temperatura, se pue-
por las molculas de traduccin. Al or-
denamiento y uso de esos grupos de tres
nucletidos del mRNA para ubicar un
aminocido especfico se llam codn, hibridacin entre mRNA y DNA
generndose de este modo el cdigo
gentico, en donde grupos de codones
serviran para posicionar determinados
aminocidos. Finalmente, fue Phil Leder,
quien demostr que cada codn es re-
conocido en el mRNA utilizando para
ello el tRNA, el cual proporciona a tra-
vs de su estructura, tres bases comple-
mentarias a dicho codn. Entonces en
el tRNA existen los anticodones, que
reconocen especficamente un codn en
el mRNA, existiendo un tRNA especfi-
co para cada uno de los 20 aminocidos.
Partes de un gen.
En 1950 Fred Sanger fue el primero en
determinar la secuencia de aminocidos
de una protena, demostrando que los
51 aminocidos de la insulina, siguen un
orden especfico. Sin embargo, para po-
der entender cmo esta secuencia orde-
nada de aminocidos derivaba de su
molde, el DNA, se requiri de 27 aos
ms. En la dcada de 1970, el grupo de
Rich Roberts en el Cold Spring Harbor
Laboratory, se dedic a trabajar activa-
106
BIOTECNOLOGA VEGETAL
mente en el desarrollo de nuevas herra-
mientas para la tecnologa del DNA
recombinante. Ellos realizaron importan-
tes experiencias basados en la capaci-
dad de separacin y re-asociacin de las
hebras de DNA, debido a la ruptura y
generacin de los puentes de hidrgeno
entre las bases complementarias. Las
cadenas simples de DNA son posibles de
separar y unir nuevamente en virtud de
la temperatura. Segn esto, si se tuviera
hebras simples de DNA, mediante la
de hacer que hebras complementarias se
unan nuevamente. El grupo de Roberts
desarroll importantes experimentos de
bacterianos. Estos experimentos, permi-
tieron establecer que para un gen
bacteriano, el mRNA y el DNA que lo
sintetizan son colineales, es decir, se
aparean o hibridan completamente,
siendo la secuencia del DNA exacta-
mente complementaria a la del mRNA
generado por sta. Sin embargo, al rea-
lizar los mismos estudios de re-
asociatividad en eucariontes, observaron
la formacin de estructuras de lazo en-
tre un mRNA y su correspondiente pre-
paracin de DNA. Estos lazos mostraron
corresponder a zonas en el DNA que ya
no existan en el mRNA. En 1977, se
determin que en eucariontes no todas
las secuencias del DNA son transcritas
a mRNA para que este genere una pro-
tena. De este modo, los genes en
eucariontes estn compuestos por dos
tipos de secuencias: a) secuencias que
codifican efectivamente para la prote-
na que se expresa, llamadas exones y b)
secuencias que son procesadas y
escindidas en el mRNA, llamadas
intrones. Los exones corresponden a se-
cuencias que generarn directamente la
TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE

cadena de aminocidos correspondien- cleo de la clula, para formar un mRNA

tes a la protena o pptido y los intrones que generar finalmente la protena. Un
son secuencias que se presentan en el gen original, es decir, con intrones y
gen originalmente, intercaladas entre los exones, se denomina gen genmico (Fi-
exones y que son procesadas en el n- gura 5.7).

Promotor Exn 1 Intrn 1 Exn 2 Intrn 2 Exn 3 Terminador

Figura 5.7. Un gen eucarionte est constituido tanto por secuencias que no
codifican finalmente para una protena (intrones), como para aquellas que
lo hacen (exones). Adems, existen secuencias que ordenan que un gen
active su transcripcin (produccin de RNA), denominadas secuencias
promotoras y, por contrapartida, secuencias que ordenan que se
termine esta expresin, denominadas secuencias terminadoras.

TECNOLOGA DEL DNA

RECOMBINANTE.

Herramientas para manipular genes:

Los plasmidios.

La posibilidad de aislar un determinado

fragmento de DNA y manipularlo, es el
final de dcadas de estudio en distintas
reas de la ciencia. El conjunto de estos
aportes es conocido hoy como biologa
molecular. Una herramienta important-
sima en biologa molecular la constitu-
yen DNAs circulares extracromosomales
(no genmicos) bacterianos, denomina-
dos plasmidios (Figura 5.8). Los plasmi-
dios poseen un sistema de replicacin
de su DNA que es autnomo, por lo que
se pueden multiplicar independiente-
Figura 5.8. Un plasmidio. DNA circular
mente de cmo lo hace el genoma de la extracromosomal que se utiliza en biologa
misma bacteria en que se encuentran. A molecular como herramienta de multiplicacin
diferencia de los experimentos de Mesel- de genes. En determinadas secuencias de estos
son y Stahl, quienes aislaron y evalua- plasmidios (denominados sitios mltiples de
ron la integracin de 15N a purificaciones clonamiento), se pueden introducir secuencias
o genes de inters, los que sern multiplicados
de DNA total de bacterias, los plasmidios por las bacterias que lo posean, de forma
presentan una ventaja tcnica en extre- independiente de su genoma, por poseer
mo importante para su trabajo en labo- un origen de replicacin autnomo.

107

ratorio, como lo es la posibilidad de
purificarlos para trabajarlos de una for-
ma independiente del DNA genmico.
En general, los plasmidios son entidades
genticas con un tamao molecular re-
lativamente pequeo, alcanzando slo
unos pocos miles de nucletidos de DNA
(alrededor de 3.000 bases), en compa-
racin con los cientos de miles de bases
que pueden alcanzar los cromosomas o
genomas bacterianos. Esta posibilidad
de purificacin y su tamao reducido,
los hacen excelentes herramientas para
introducir, en determinadas regiones de
ellos, fragmentos especficos de DNA
que sean de inters. De esta forma, los
plasmidios son estructuras circulares dis-
cretas de DNA, que se multiplican den-
tro de las bacterias y que pueden servir
como un sistema de amplificacin de
genes que son introducidos dentro de
ellos, debido a su tamao apropiado.
Clonamiento.
En la dcada de 1970, Rich Roberts y
Phil Sharp, del Cold Spring Harbor
Laboratory, desarrollaron las primeras
herramientas de la biologa molecular
moderna, las endonucleasas de restric-
cin o enzimas de restriccin. En lneas
generales, el aislamiento de un gen o un
segmento especfico de DNA se realiza
mediante protenas que son capaces de
cortar especficamente el DNA. Estas
protenas se conocen con el nombre de
enzimas de restriccin, las que recono-
cen secuencias blanco que se denomi-
nan secuencias palindrmicas o
palndromes (Figura 5.9).stas, en lneas
generales, corresponden a secuencias de
4 6 nucletidos que son reconocidas
y cortadas en el enlace fosfodister. De
esta forma, la doble hebra de DNA pue-
108
BIOTECNOLOGA VEGETAL
de ser cortada por estas enzimas, pro-
duciendo dos tipos de productos: a) frag-
mentos cuyos extremos generados en el
sitio de corte son adhesivos ("sticky") (Fi-
gura 5.9a) y b) fragmentos cuyos extre-
mos generados en el sitio de corte pue-
den ser romos o planos ("blunt") (Figura
5.9b). El corte de un fragmento de DNA
con una enzima de restriccin especfi-
ca, generar siempre los mismos frag-
mentos tras su digestin, con el mismo
tipo de extremo en la zona de corte y
siempre en la misma secuencia
palindrmica. Por ejemplo, una enzima
de restriccin llamada EcoRI, cortar
siempre cualquier fragmento de DNA
que tenga la secuencia GAATTC, rom-
piendo el enlace entre los nucletidos
G-A y generando fragmentos adhesivos.
XXXX G A T A T C XXXX
XXXX C T A T A G XXXX
a
XXXX G A T A T C XXXX
XXXX C T A T A G XXXX
b
XXXX G A T A T C XXXX
XXXX C T A T A G XXXX
Figura 5.9. Secuencia palindrmica.
Secuencia de reconocimiento para enzimas
de restriccin. stas, luego de detectar
secuencias especficas de este tipo, cortan
el DNA con dos posibilidades: a) generando
dos fragmentos escalonados con extremos
cohesivos o b) generando dos fragmentos
con extremos lisos o romos. Cada enzima
de restriccin reconoce solo un sitio
palindrmico especfico.
TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE

Estos fragmentos de DNA que son di-
geridos, pueden volver a ser pegados
por otra enzima, que se llama DNA
ligasa. Esta ligasa de DNA unir frag-
mentos correspondientes a DNAs dige-
ridos que sean adhesivos complementa-
rios, vale decir, cortados con una mis-
ma enzima de restriccin. En el caso de
fragmentos romos, la ligasa los pegar
tambin, pero en esta operacin no se
requiere que los fragmentos hayan sido
producidos por la misma enzima de res-
triccin, sino slo que sean romos o pla-
nos. En la prctica, la ligacin mediada
por la DNA ligasa es ms eficiente para
DNAs con extremos adhesivos que la de
DNAs con fragmentos romos.
Si en dos reacciones por separado se
digieren, con una misma enzima de res-
triccin, un DNA genmico y un DNA
plasmidial (de forma tal que el plasmidio
es cortado slo en un sitio), se puede
mezclar estos DNAs digeridos y la mez-
cla someterse a una reaccin de ligacin
con la enzima DNA ligasa. Producto de
esto, se tendr mltiples posibilidades de
la reaccin de ligacin, siendo la de in-
ters aquella en donde el plasmidio ha
insertado un fragmento genmico, gene-
rando as lo que se llama plasmidio re-
combinante y que se refiere a un plasmi-
dio en el que se insert efectivamente
el fragmento de DNA de inters (Figura
5.10)(Buchanan et al., 2001).
Genes quimricos y cassettes de
expresin.
Discutamos ahora el uso de los genes en
biotecnologa. El aislamiento o clona-
miento de un gen y su uso, necesitan no
slo tener un plasmidio recombinante
con un gen genmico, o un gen com-
plementario al mRNA (llamado gen
cDNA, el que considera slo la informa-
cin lineal de todos los exones). Cada
plasmidio posee elementos adicionales
que permiten la multiplicacin del gen
de inters y su expresin, ya sea en bac-

Figura 5.10. Plasmidio recombinante.

Plasmidio en el que se ha insertado una o varias secuencias (mostradas en
rojo) de inters para multiplicar. Las flechas indican el sentido en el que
el gen se lee (o transcribe) por la RNA polimerasa.

109

terias, animales o plantas, segn sea el
objetivo final de uso del gen. La secuen-
cia que contiene los codones necesarios
para que un gen origine una protena,
necesita ser activada transcripcional-
mente, para que ese DNA se transcriba
a mRNA y luego se traduzca a protena.
Para esto, el extremo 5 del gen debe
tener, a una distancia adecuada (entre
20 a 100 nucletidos), una secuencia
que informe a la RNA polimerasa que
debe transcribir ese gen. Esa secuencia
se denomina promotor y posee toda la
informacin para este proceso y tambin
para la traduccin del mRNA (Goodrich
et al., 1996; Sambrook et al., 1989) (Fi-
gura 5.7). Existen promotores que son es-
pecficos para bacterias, para animales
y para plantas (Busbry y Ebright, 1994;
Odel et al., 1985; Buchanan et al.,
2001), por lo que un aspecto importan-
te para expresar un gen en una clula
especfica, es insertar un promotor ade-
cuado segn el sistema. Adems, de es-
tas secuencias promotoras, un gen debe
poseer en su otro extremo, el 3, nucle-
tidos que informan a las enzimas celu-
lares del trmino de la transcripcin de
un gen, estas se denominan terminado-
res (Goodrich et al., 1996) (Figura 5.7).
Tambin se debe considerar que el co-
rrecto funcionamiento de los termina-
dores depender del sistema en donde
se quiera expresar el gen. Cuando se
transforma plantas, las secuencias acce-
sorias (intrones, promotores y termina-
dores) tienen por funcin asegurar una
correcta expresin del gen (Goodrich et
al., 1996; Buchanan et al., 2001). Los
intrones son secuencias propias de los
organismos eucariontes, cuya utilizacin
en genes quimricos para transforma-
110
BIOTECNOLOGA VEGETAL
cin de plantas, ha demostrado aumen-
tar la estabilidad y expresin del trans-
gn. De este modo, un gen mnimo debe
tener, adems de sus exones, un promo-
tor y un terminador transcripcional apro-
piado segn el sistema. El conjunto de
estos elementos que permiten la correc-
ta expresin de un gen, se denomina
cassette de expresin. Usualmente, los
plasmidios comercialmente disponibles
estn desarrollados de forma tal que el
gen a clonar es directamente insertado
entre un promotor y un terminador. Esto
quiere decir que el sitio de insercin est
generalmente predefinido y correspon-
de a una serie de sitios palindrmicos,
denominndose sitio mltiple de
clonamiento (Sambrook et al., 1989).
Dentro de los promotores ms utilizados
hasta hoy en la transformacin gentica
de plantas, est aquel que proviene del
RNA 35S del virus del mosaico de la
coliflor (cauliflower mosaic virus,
CaMV). Este promotor, llamado simple-
mente 35S 35S CaMV, ha mostrado ser
especialmente fuerte en casi todos los
tejidos de las plantas transgnicas que
se han generado a la fecha. Del mismo
modo, una de las secuencias terminado-
ras ms utilizadas en el desarrollo de
plantas transgnicas, aunque no con la
omnipresencia del 35S CaMV, es el ter-
minador del gen de la enzima nopalina
sintetasa (nos-ter) de Agrobacterium
tumefaciens. Sin embargo, la gran mayo-
ra de los clonamientos de genes, inde-
pendiente de su uso final, requiere su
paso por un sistema bacteriano, por lo
que el manejo de plasmidios de clona-
miento en bacterias, es un requisito b-
sico de laboratorio.
TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE
Transformacin bacteriana.
Una vez ligados los fragmentos de DNA,
dentro de los que se encuentra nuestro
plasmidio recombinante con el gen de
inters, estos son introducidos nueva-
mente a las bacterias mediante un pro-
ceso denominado transformacin bacte-
riana. La transformacin bacteriana es
un mtodo de fcil desarrollo en el la-
boratorio, existiendo mltiples procedi-
mientos para hacerlo. Dos de los ms
utilizados son:
a) Transformacin mediante CaCl 2 : en
el que bacterias tipo E. coli son lava-
das exhaustivamente primero con
H 2 O estril y finalmente con una so-
lucin de CaCl 2. Este tratamiento se
conoce como elaboracin de bacte-
rias competentes y son bacterias que
estn en una curva ascendente de
crecimiento. De esta forma, las bac-
terias competentes son puestas en
contacto con el DNA ligado (la mez-
cla de ligacin anterior en donde in-
teresa slo el plasmidio con el DNA
forneo insertado) y mediante un gol-
pe trmico, generalmente de 42C por
un tiempo breve (por ejemplo 90 seg),
stas incorporan este DNA mezclado.
Si el plasmidio es funcional, es de-
cir, est cerrado, permitir que las
bacterias que lo incorporaron puedan
seguir creciendo en medios selecti-
vos. Para esto, un nuevo factor entra
aqu en juego, los genes de resisten-
cia para la seleccin de las bacterias
efectivamente transformadas. Los
genes de resistencia vienen incorpo-
rados en los plasmidios comercial-
mente disponibles para clonamiento
y sirven como indicador de la incor-
poracin del plasmidio por parte de
la bacteria, pues slo aquellas que in-
corporan el plasmidio funcional pro-
liferarn en medios selectivos con
antibiticos (Figura 5.5).
b) Electroporacin: en este sistema tam-
bin se preparan clulas competen-
tes (se les llama en este caso electro-
competentes). Esta vez se utiliza una
solucin de glicerol en lugar de
CaCl 2. As, las bacterias electrocom-
petentes son una solucin de bacte-
rias resuspendidas en glicerol, un
agente que se intercalar en las mem-
branas facilitando la penetracin de
macromolculas, como lo es el DNA
ligado. Una preparacin de bacterias
electrocompetentes es mezclada con
la ligacin de DNA y entonces se
aplica sobre esta mezcla una cada
de tensin, durante un tiempo del or-
den de los milisegundos. El resulta-
do son bacterias que incorporaron el
plasmidio recombinante, las que tam-
bin son llevadas a seleccin como
sucede con la transformacin por
CaCl 2 .
Deteccin de clones recombinantes.
Como se mencion, las bacterias incor-
porarn distintos DNAs forneos ligados,
generando diversos clones bacterianos.
Solamente proliferarn aquellos clones
que hayan incorporado plasmidios con
genes de resistencia a antibiticos, lo
que implica que se tendrn poblaciones
de bacterias tanto con el plasmidio origi-
nal como con el plasmidio recombi-
nante. Para buscar qu clones bacteria-
nos poseen plasmidios recombinantes,
existen varias tcnicas, dentro de las que
111
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

destaca la deteccin por hibridacin de REFERENCIAS.

cidos nucleicos. Al tener una colonia
de bacterias que poseen un plasmidio Buchanan, B., Gruissem, W. y Jones, R. 2001.
Biochemistry & Molecular Biology of Plants.
con el inserto, sta puede adherirse a un
John Wiley & Sons, Somerset, New Jersey,
filtro y una vez all, ser lisada para as USA.
dejar el plasmidio expuesto. Si se apli-
ca temperatura y/o agentes desnaturali- Busbry, S. y Ebright, R. 1994. Promoter
zantes sobre este filtro (por ejemplo structure, promoter recognition, and
transcription activation in prokaryotes. Cell
NaOH), se inducir a que el plasmidio 79:743-746.
recombinante se separe en cada una de
sus hebras complementarias. Si enton- Goodrich, J., Cutler, G. y Tjian, R. 1996.
ces este filtro se incuba con una solu- Contacts in context: promoter specificity
cin en donde se encuentre el mismo and macromolecular interactions in
transcription. Cell 84:825-830.
gen de inters (o una parte de l) tam-
bin desnaturalizado, pero que ha sido Odell, J., Nagy, F. y Chua, N. 1985. Identi-
marcado con algn istopo (como por fication of DNA sequences required for
ejemplo 32P), al volver a bajar la tempe- activity of the cauliflower mosaic virus 35S
ratura se re-asociarn las dobles hebras promoter. Nature 313:810-812.
de DNA, pero esta vez se ver favoreci- Sambrook, J., Fritsch, E. y Maniatis, T. 1989.
da la unin entre el gen marcado o son- Molecular cloning: a laboratory manual.
da (agregado en exceso para producir Nolan, C. (ed). 2a edicin. Cold Spring
esta condicin) y la hebra complemen- Harbor Lab. Press., New York, USA.
taria fijada al filtro, proveniente de la
bacteria. Luego este filtro hibridado se
expone a una pelcula sensible a la ra-
diactividad, generndose las manchas
tal como se obtiene en el proceso de
difraccin de rayos X, pero esta vez in-
dicando zonas en donde ha ocurrido la
hibridacin entre el gen marcado y DNA
plasmidial adherido al filtro.

112
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS
TRANSFORMACIN
GENTICA DE PLANTAS
INTRODUCCIN
H ace aproximadamente 150 aos
que Gregor Mendel realiz sus tra-
bajos destinados a establecer cmo de-
terminados caracteres eran traspasados
entre distintas generaciones de plantas
de arvejas. Sin embargo, pasaron ms de
50 aos para que los resultados de
Mendel fueran redescubiertos y explica-
dos de forma tal que as permitieran for-
mular las que hoy se conocen como Le-
yes de Mendel. Sus experimentos se ba-
saron en la emasculacin de flores de
arveja, lo que consiste en eliminar es-
tambres de stas para poder polinizarlas
manualmente. Esta tcnica es exacta-
mente la misma que desde comienzos
del siglo XX viene siendo utilizada, en
lo que es conocido como mejoramiento
convencional de plantas.
El mejoramiento convencional de plan-
tas utiliza varias metodologas para la
generacin de mejores individuos apro-
vechables para el ser humano. Estas
metodologas pueden clasificarse en dos
grupos, segn su grado de profundidad
en cuanto a la manipulacin del mate-
rial gentico. El primer grupo se refiere
a tcnicas en las que no hay un intento
de modificacin de los cromosomas de
los individuos que son utilizados, salvo
la utilizacin sexual de sus gametos. Pa-
ra que esto sea posible, las especies a
mezclar en busca de mejores indivi-
duos, deben ser sexualmente compati-
CAPTULO 6
Humberto Prieto E.
bles. El segundo grupo de tcnicas,
involucra mtodos que inducen modifi-
caciones del material gentico propia-
mente tal, ya sea generando algn tipo
de mutaciones en los nucletidos del
genoma de una especie parental, o cam-
biando en la cantidad original de DNA
de ste.
Cada vez que se aplica la manipulacin
sexual a los cromosomas mediante el uso
de los gametos en cruzamientos sexual-
mente compatibles, estos aportan el 50
por ciento de material gentico. Esto
genera lneas de plantas hijas, que a
su vez pueden ser retrocruzadas varias
veces ms, para enriquecer en un fondo
gentico deseable (por ejemplo el del
parental A), pero adems de mantener
el carcter de inters (por ejemplo el
parental B). De hecho, los experimen-
tos de Mendel jams hubieran tenido los
resultados obtenidos si l no hubiera de-
sarrollado un gran trabajo previo a tra-
vs de la generacin de parentales con
un genoma estable y bien conocido en
cuanto al fenotipo que genera (lo que
se denomina lnea pura). Dentro de esta
categora de tcnicas de mejoramiento
tenemos:
a) La seleccin de lneas puras: que con-
siste en la seleccin de determinados
caracteres que sern retenidos en una
planta individual, procurando un es-
tado homocigoto (presente en ambos
cromosomas) tras varias retrocruzas.
113

b) La hibridacin: en donde diferentes cro-
mosomas son combinados para gene-
rar un individuo en un estado heteroci-
goto. sta es, por lejos, la tcnica de ms
amplio uso en mejoramiento conven-
cional de plantas, pero requiere tener
lneas puras como punto de partida.
Por contrapartida, el otro grupo de tc-
nicas involucra la modificacin directa
del genoma de una especie de inters,
implica generalmente un proceso al azar.
As, los nuevos individuos son general-
mente utilizados, por ejemplo, como da-
dores de gametos sexuales o, simplemen-
te, son propagados clonalmente a travs
de las tcnicas de cultivo de tejidos (re-
pique simple), vista en los captulos an-
teriores. Para este segundo tipo de
metodologas, tenemos como ejemplos:
c) La mutagnesis: en donde mediante
la aplicacin de agentes exgenos
(los que pueden ser qumicos o fsi-
cos), se procura el cambio en la in-
formacin gentica del cromosoma.
d) La poliploida: en donde la aplicacin
de agentes qumicos lleva a un cam-
bio en el juego de cromosomas de una
clula, generalmente aumentndolo.
Lejos es la hibridacin de variedades, la
tcnica de mayor utilizacin en mejora-
miento convencional de plantas y por
ejemplo, ha impulsado el crecimiento en
la produccin de maz entre 1930 a la
actualidad, en ms de un 600%. La ins-
tauracin de lneas parentales puras es
de tal importancia que, notablemente y
como se mencion, Mendel debi gene-
rar lneas puras de arvejas con caracte-
rsticas bien definidas, tales como color
de flor, forma de semilla, aspecto de se-
114
BIOTECNOLOGA VEGETAL
milla, etc., para luego hibridarlas. De
otra forma, sus resultados jams hubie-
ran sido tales y por ende, nunca expli-
cados.
La aparicin de la tecnologa del DNA
recombinante, presentada en el captu-
lo anterior, permiti ya en 1980, descri-
bir y clonar los primeros genes de plan-
tas. Poco despus, se comenzaron a en-
tender las bases moleculares de la inte-
raccin entre bacterias como Agrobac-
terium tumefaciens y algunos de sus
huspedes vegetales (plantas que lo alo-
jan), interacciones antes hasta entonces
ignoradas. La disposicin de genes ais-
lados, su manipulacin y el entendi-
miento del sistema de infeccin por A.
tumefaciens, permitieron que en 1983,
se generara la primera planta transfor-
mada genticamente, la que expres un
gen de resistencia a un antibitico.
Si bien es cierto que la transformacin
utilizando A. tumefaciens ofreca una
gran herramienta para la introduccin de
genes en plantas, su espectro de accin
se limitaba, en esa poca, al rango de
plantas huspedes al que la bacteria na-
turalmente poda transferir su DNA a la
planta, es decir, infectar. Debido a esto,
diversas tcnicas se desarrollaron desde
mediados de la dcada de 1980. Entre
ellas, la que ms destac fue una en que
los genes a introducir son depositados
sobre partculas metlicas microscpicas,
las que son dirigidas a una alta veloci-
dad para impactar las clulas blanco
(objetivo). Este sistema de transformacin
se llam gene-gun, pistola gnica o sis-
tema de biobalstica. En las clulas que
sobreviven al impacto, el DNA puesto en
la superficie de las partculas llega al n-
cleo celular y se incorpora a su genoma.
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS

De esta forma, a comienzos de la dca-

da de 1990, ya se poda postular que se
contaba con sistemas de transformacin
gentica de potencialmente todas las
plantas de inters agronmico y de for-
ma cotidiana, de plantas consideradas
como modelo para la expresin y estu-
dios de las secuencias externas introdu-
cidas, como lo son tabaco y Arabidopsis
thaliana.

Agrobacterium tumefaciens.

A. tumefaciens es una bacteria del suelo

causante de la enfermedad de la agalla de
la corona (o cuello) (crown gall disease)
(Figura 6.1). El estudio a un nivel molecu-
lar de la interaccin planta-Agrobacte-
rium, permiti determinar que entre los
numerosos eventos que ocurren en esta
interaccin, uno de los pasos ms impor-
tantes es la transferencia de un trozo de
DNA desde la bacteria hacia el ncleo de
las clulas vegetales que son infectadas.
Para entender cmo es este paso de un
trozo de DNA hacia la planta, empeza-
remos por describir que A. tumefaciens
posee un plasmidio gigante, si se com-
para con el de bacterias utilizadas en la
tecnologa del DNA recombinante (E.
coli). Este DNA plasmidial se denomina
plasmidio Ti (Figura 6.2), por inductor
de tumores (tumor inducing) y contie-
ne todos los genes responsables de la
enfermedad de la corona de agallas, de
su fenotipo y de este proceso de transfe-
rencia de un trozo de DNA a la planta.
Sin embargo, vale la pena sealar que
slo una pequea porcin de DNA del
plasmidio Ti es transferido a la planta,
ste es llamado DNA de transferencia o
simplemente T-DNA.
Figura 6.1. Aspecto de la enfermedad
de la agalla de la corona.
Manifestacin fenotpica de la interaccin
entre A. tumefaciens y una planta
dicotiledonea, sta se debe a la sntesis de
opinas (que proveen una ventaja competitiva
para la bacteria) y fitohormonas (auxinas y
citoquininas, que inducen la proliferacin
celular aumentando el nmero de clulas
que sintetizan opinas).
Genes vir
Borde
derecho
Plasmidio Ti T-DNA
Borde
izquierdo
Figura 6.2. Plasmidio inductor de tumores o
Ti. Se muestran los cuatro elementos
fundmentales de este DNA circular:
Los genes vir, que aportan toda la maquinaria
de transporte del DNA de transferencia o T-
DNA. El T-DNA es transportado en forma de
DNA hebra simple, para esto es reconocido
en dos zonas claves, que son repetidas
imperfectas, llamadas bordes
(derecho e izquierdo).

115

Gracias al plasmidio Ti, la bacteria pue-
de sintetizar compuestos aminoacdicos
derivados de arginina, que le permiten
una mejor interaccin con la planta. Es-
tos compuestos se llaman genricamen-
te opinas, las que se pueden clasificar
en: nopalina, octopina y agropina. Cada
plasmidio Ti contiene los genes de sn-
tesis para una clase de opina. Por lo tan-
to, existen plasmidios Ti con los genes
para la sntesis de nopalinas, otros para
la sntesis de octopinas y otros para la
sntesis de agropinas. De este modo, la
idea de Agrobacterium en su proceso de
infeccin natural de plantas, es sinteti-
zar las opinas que le son tiles para su
desarrollo y esto ocurre en convivencia
plena con la planta infectada. De ello,
se deduce que los genes de sntesis de
opinas estn ubicados en el T-DNA y son
naturalmente transferidos a la planta, de
forma de asegurar la convivencia de esta
interaccin planta-patgeno.
Otra regin de gran importancia dentro
del plasmidio Ti, es la que contiene los
g e n e s q u e o t o rg a n l a v i r u l e n c i a o
infectividad de la bacteria, esta se deno-
mina regin vir (con los genes virA, virB,
virG, virC, virD y virE). Estos genes estn
involucrados especficamente en el me-
canismo de activacin de la infeccin
bacteriana y de la transferencia del T-
DNA a la clula husped (o infectada).
Los genes vir representan la base de la
maquinaria de infeccin de la bacteria,
siendo fundamentales en gatillar la trans-
ferencia del T-DNA hacia la planta.
Existe una variante de la enfermedad de
la corona de agalla: la generacin de
pelos radiculares; que es causada por
otra clase de Agrobacterium, el A. rhizo-
genes. A. rhizogenes posee un plasmidio
116
BIOTECNOLOGA VEGETAL
denominado plasmidio Ri (por root in-
ducing), cuyos genes tambin producen
opinas (preferentemente del tipo agro-
pinas) y tambin posee un sistema de
transferencia de DNA a la clula hus-
ped, generando pelillos en la mayora de
las infecciones resultantes, aunque tam-
bin se han visto ejemplos en que este
tipo de Agrobacterium causa agallas del
cuello.
Mecanismos biolgicos involucrados
en la transformacin por
A. tumefaciens.
a) El proceso de activacin y transferen-
cia del T-DNA.
Tal vez uno de los aspectos ms intere-
santes de la transformacin gentica se
relaciona con los procesos biolgicos
involucrados en la transferencia e incor-
poracin del DNA exgeno a la clula
vegetal. Como se mencion anterior-
mente, Agrobacterium tumefaciens po-
see en su plasmidio Ti un opern (con-
junto de genes) denominado vir. Este es
un conjunto de seis grupos de genes que
codifican para todos los productos re-
queridos en las distintas etapas de la in-
feccin: a) activacin de la bacteria, b)
generacin del T-DNA apropiado para
ser transferido (formacin del comple-
jo T), c) traspaso del complejo T, d)
ingreso a la clula husped y finalmen-
te su integracin al genoma de ella.
El proceso comienza cuando la bacteria
detecta ciertas seales en su medioam-
biente y transmite esta informacin ha-
cia su interior. Este paso de informacin
se conoce como transduccin de sea-
les y en general, utiliza dos componen-
te moleculares, una protena sensora en
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS

la superficie de la bacteria y una prote-

na que modula o traduce de la res-
puesta hacia adentro. En Agrobacterium,
Vir A y Vir G, respectivamente, son las
protenas sensora y moduladora (Figura
6.3). De esta forma, cuando se produce
una herida o dao mecnico en la pa-
red celular vegetal (requisito mnimo pa-
ra la induccin), se liberan compuestos
fenlicos con un esqueleto carbonado
de un tamao especfico, siendo uno de
ellos el clave: la acetosiringona. Esta
molcula es detectada y sensada en la
bacteria, lo que hace que ella se ligue
frreamente a la clula vegetal utilizan-
do protenas ubicadas en su membrana
(como las protenas ChvA, ChvB, PscA y
Att entre otras propuestas) y por contra-
parte, reconociendo ligandos de la c-
lula vegetal, los que quedan expuestos
por la herida producida. Los ligandos de
la clula vegetal se denominan com-
puestos smiles de la vitronectina, por
su estructura similar a este compuesto Figura 6.3. Mecanismo de activacin del
conocido en mamferos. La acetosiringo- Agrobacterium tumefaciens.
Fragmentos de la pared celular de la
na generada por el vegetal induce en el
clula vegetal, son reconocidos por la
receptor VirA una reaccin denominada protena VirA. Esta activacin, causa la
de autofosforilacin (reaccin tpica de fosforilacin de otra protena ubicada en
sistemas de la transduccin de seales la parte interior de la membrana de la
biolgicas), la que hace que un grupo bacteria, VirG. VirG activa la transcripcin
del opern vir, el que permite la sntesis
fosfato se transfiera luego a la prote-
de varias protenas, como VirD2, la que
na VirG (Figura 6.3, paso 1). VirG es un reconoce el borde derecho del T-DNA y lo
factor transcripcional, es decir, que es- corta en esa zona. En seguida se produce
timula la transcripcin de un gen a tra- la separacin de la hebra cortada (a la vez
vs de su unin a una zona promotora. se va volviendo a sintetizar la hebra
desplazada), la que es protegida por VirE2
As, los promotores del opern vir en el
para evitar su degradacin. Este complejo
plasmidio Ti son activados, generando T es transportado finalmente a la clula
la transcripcin del resto de los genes vegetal, a travs de un canal constituido
vir (Figura 6.3, pasos 2 y 3). Al sinteti- por otras protenas Vir, como son las del
zarse (transcribirse y traducirse) las pro- grupo VirB. En la clula vegetal, VirD2 y
VirE2 sern reconocidas por protenas
tenas VirD2 y VirD1 (productos de la
receptoras y as, el complejo T llegar
familia de genes virD), ms VirC1 (pro- al ncleo y se integrar al genoma.
ducto de la familia virC), cortan una sola
hebra del T-DNA y comienzan a sepa-

117

rarla de su hebra complementaria,
unindose covalentemente a sus extre-
mos (Figura 6.3, paso 4). Al mismo tiem-
po que se produce la separacin y des-
plazamiento de la hebra simple de T-
DNA, se replica y reemplaza una nueva
hebra en el plasmidio Ti, quedando ste
intacto hacia el final del proceso de for-
macin del T-DNA hebra simple (T-
DNAss). El T-DNAss que se va generan-
do, es rpidamente cubierto y protegido
por mltiples unidades de la protena
VirE2 (Figura 6.3, paso 5), de manera de
evitar su degradacin ocasional (Figura
6 . 3 , p a s o 6 ) . E s t a h e b r a d e T- D N A
recubierta con VirE2, se conoce como
complejo T. Durante todo el proceso,
VirD2 permanece unida covalentemente
al extremo 5 del T-DNA, sirviendo de
mquina de conduccin, ayudada ade-
ms por VirE1, para el paso del comple-
jo a travs de un canal intercelular que
une a Agrobacterium con la clula ve-
getal que va a ser transformada. Este
canal est conformado por principal-
mente por protenas de la familia VirB
(VirB4 y VirB11) y VirD4.
Figura 6.4. Bordes derecho e izquierdo del T-DNA. Secuencia de estas zonas repetidas
imperfectas. El borde derecho es reconocido por VirD2, activando todo el proceso de
transferencia e integracin al genoma vegetal.
118
BIOTECNOLOGA VEGETAL
Una de las caractersticas ms importan-
tes del T-DNA es que est flanqueado por
dos zonas nucleotdicas especficas, que
son secuencias repetidas y directas (Fi-
gura 6.4). Es precisamente gracias a es-
tas zonas, comnmente denominadas
brazo izquierdo (ubicado en el extremo
3) y brazo derecho (ubicado en el extre-
mo 5) (Figura 6.2), que las protenas
VirD2 y VirD1 reconocen dnde cortar
el T-DNA para comenzar a formar el com-
plejo T. Uno de los aspectos ms intere-
santes en la transferencia del T-DNA, es en
la transferencia del T-DNA, donde VirD2
permanece siempre ligada al extremo 5 del
complejo T, haciendo entonces que el bra-
zo derecho del T-DNA sea la zona que se
ve integrada en un cien por cien de las
plantas transformadas. Por el contrario,
existe variada evidencia de que el brazo
izquierdo del T-DNA no es tan perfecta-
mente integrado en el genoma de las
plantas infectadas. Pese a esta falta de
perfeccin en la integracin del extremo
izquierdo, la correcta expresin de los
genes que se desea introducir a una plan-
ta especfica no se ha visto alterada.
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS
b) El paso del T-DNA hacia la clula
vegetal.
No est claro qu protenas acompaan
al T-DNA en su viaje a la clula vegetal
y finalmente al ncleo. Como se advir-
ti ms arriba, un modelo an vlido es
que el complejo T (compuesto por T-
DNA, VirD2 y VirE2) viaja por el canal,
guiado por VirD2 (Ward y Barnes, 1988).
El rol de VirE2 es menos claro, aunque
es claro que puede unirse a T-DNA he-
bra simple y protegerlo (Sen et al., 1989).
Existen numerosos experimentos que
han demostrado que el T-DNA slo ne-
cesitara ir unido a VirD2 y que podra
pasar en forma separada de VirE2 hacia
la clula vegetal (Gelvin, 2000). En este
sentido, la transferencia del T-DNA ha-
cia la clula vegetal, sera un proceso
bastante parecido a lo que es la conju-
gacin bacteriana, donde la transferen-
cia de DNA desnudo entre bacterias a
travs de un pili, permite al mismo tiem-
po la regeneracin del material gentico
en la bacteria de origen, (lo que ocurri-
ra fsicamente cerca del pili (Stachel y
Zambryski, 1986)). Existe una tercera
protena que tambin pasara hacia la
clula vegetal que est siendo infecta-
da: VirF. Su funcin especulativa sera
interactuar con otras protenas de la c-
lula vegetal, para inducir la divisin ce-
lular de sta, en conjunto con las fito-
hormonas producidas por los genes
acarreados en el mismo T-DNA. Este
es un evento sumamente necesario en
los primeros estados de desarrollo de la
infeccin, generando as el fenotipo de
la corona de la agalla. Como puede infe-
rirse, esto es tambin fundamental para
la transformacin con fines biotecnol-
gicos (Regensberg -Tuink y Hooyas,
1993).
c) Integracin al genoma vegetal.
El proceso de integracin del T-DNA al
genoma vegetal es un ejemplo especfi-
co de un proceso biolgico en el cual
las hebras de DNA dentro de un ncleo,
son intercambiadas o recombinadas; de-
bido a esto, el proceso se llama recombi-
nacin del DNA. La recombinacin for-
ma parte de procesos tan importantes
como la mantencin y divisin celular
(Nam et al., 1998)
- Recombinacin del DNA. Sin duda,
que la supervivencia de las especies est
influenciada por factores tales como una
cuidadosa replicacin del DNA, la re-
paracin del mismo y su variabilidad. La
recombinacin gentica tiene un rol
muy importante en la evolucin de las
especies, debido al proceso de reordena-
miento en las secuencias del DNA para
generar nuevas combinaciones de genes
(Puchta y Hohn, 1996). Estos nuevos
genes permitiran generar nuevos
mRNAs y protenas, y por lo tanto, nue-
vos y mejores fenotipos. Una etapa muy
activa en cuanto a recombinaciones,
ocurre en la meiosis (etapa del crossing
over), donde la recombinacin del DNA
puede resultar en gametos gentica-
mente distintos, que permitan la produc-
cin de genotipos variados que pueden
ser ms adecuados a un medioambiente
cambiante. Un aspecto esencialmente,
relevante es el rol inmediato que signi-
fica la recombinacin del DNA en las
clulas: la reparacin de segmentos da-
ados. Gracias a la recombinacin, una
hebra de DNA (o las dos) que ha sido
daada (en algn segmento del genoma
de cualquier organismo), por ejemplo
por radiacin UV, ser rpidamente de-
tectada y reemplazada por una hebra
119
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

completamente nueva. Este sistema es tion), donde RecA es la ms conocida

conocido como de recombinacin-repa-
racin del DNA (Britt, 1996).
Existen tres tipos de recombinacin:
a) Homloga.
b) Sitio especfica.
c) Ilegtima.
- Recombinacin homloga: es aquel
proceso en el que se intercambian do-
bles hebras de DNA en zonas donde
existe una similitud substancial de las
secuencias (es decir, homologa). Mien-
tras ms largo sea el segmento homlo-
go, ms posibilidad de recombinacin
habr (Puchta y Hohn, 1996) (Figura
6.5). La recombinacin homloga ha si-
do explotada ampliamente por el hom-
bre en sus programas de mejoramiento
gentico tradicional de los cultivos (por
ejemplo, en la hibridacin de lneas pu-
ras). La recombinacin tanto en clulas
meiticas como mitticas, requiere de
sistemas de protenas que an no son del
todo aclarados. En bacterias, este con-
junto de protenas se agrupa con el nom-
bre de protenas Rec (de recombina-
(Buchanan et al., 2001). En plantas, ya
se han descrito genes homlogos al que
codifica para RecA (o sea, gen recA),
stas se han llamado protenas RAD. En
Arabidopsis thaliana, mutantes que no
reproducen RAD (o rad si se habla del
gen) funcional, no pueden reparar su
DNA cuando se someten a radiaciones
UV (Buchanan et al., 2001, Nam et al.,
1998) (ver ms abajo).
- Recombinacin sitio especfica: este
mecanismo se ha identificado especial-
mente en E. coli. El DNA de E. coli po-
see zonas con secuencias que son hom-
logas al bacterifago . Tras la infeccin,
el fago logra insertarse en el genoma
bacteriano mediante el reconocimiento
de estos sitios homlogos. Las secuen-
cias especficas de reconocimiento y re-
combinacin se denominan zonas att
(por attachment). Si se habla de las se-
cuencias att del fago , se denominan
zonas attP y si stas son de la bacteria,
se denominan zonas attB. Para la inser-
cin, el fago codifica una protena lla-
mada integrasa (Int), que interacta en

GACTTTAGCACC
CTGAAATCGTGG

GACTTTAGCACC
CTGAAATCGTGG

GACTTTAGCACC
CTGAAATCGTGG
Figura 6.5. Recombinacin homloga. Es el intercambio de dobles hebras
de DNA en zonas donde existe una similitud substancial de las secuencias
(es decir, una homologa). Mientras ms largo sea el segmento homlogo
(mostrado aqu por las secuencias), mayor es la posibilidad de
recombinacin.

120
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS

forma conjunta con un factor bacteriano
de integracin (IHF, integration host
factor). As, todo el DNA comprendido
entre las zonas attP del fago, se integran
entre las zonas attB de la bacteria
(Gardner y Nash, 1986) (Figura 6.6).
- Recombinacin ilegtima: donde se in-
cluyen todos los eventos de recombina-
cin que no caen en las categoras an-
teriores. En esencia, este tipo de recam-
bio o integracin entre hebras de DNA
no requiere homologa de secuencias, o
si lo hace, estas son zonas de unos po-
cos nucletidos de largo. Se postula que
en plantas, existe una importante pro-
porcin de re-ordenamientos del DNA,
que no pueden ser explicados por homo-
logas entre secuencias, asumindose
que la recombinacin ilegtima en plan-
tas en bastante alta (Buchanan et al.,
2001). Un gran ejemplo de recombina-
cin ilegtima en plantas el la integra-
cin del T-DNA en el genoma de las
plantas transformadas. El proceso de in-
tegracin del T-DNA al genoma vegetal
tiene sus bases en nuestras ya conoci-
das protenas de Agrobacterium VirD2 y
VirE2, las que en algunos sectores de su
secuencias, poseen sitios que sirven co-
mo seales para que se dirijan hacia el
ncleo (Gelvin, 2000), y con ello aca-
rrear al T-DNA unido. Se postula que el
mecanismo de trfico al ncleo vegetal
estara mediado por la interaccin de es-
tas dos protenas bacterianas, proceso
que sera apoyado por protenas de la
planta. Se sabe que VirD2 es fosforilado
en un residuo de serina cercano a su do-
mino de sealizacin nuclear, teniendo
esta fosforilacin un gran efecto en la
eficiencia de transporte al ncleo de la
planta (Gelvin, 2000). VirD2 desfos-
forilada prcticamente no tendra capa-
cidad de conducir al T-DNA al ncleo.

DNA fago
Secuencia attP Secuencia attP

DNA E. coli
Secuencia attP Secuencia attP

Factor de
integracin Integrasa del fago
bacteriano

DNA E. coli
Secuencia attP Secuencia attP
Figura 6.6. Recombinacin sitio especfica. El DNA de E. coli posee se-
cuencias que son homlogas al DNA del bacterifago . Tras la infeccin
por parte de este ltimo, las secuencias especficas de reconocimiento y
recombinacin (secuencias attP del fago y attB de la bacteria), son reco-
nocidas por una protena integrasa (Int) del fago, la que interacta con un
factor bacteriano de integracin (IHF) para que todo el DNA comprendido
entre las zonas attP, se integre entre las zonas attB de la bacteria.

121

Se asume que VirD2 juega algn rol en
el proceso de integracin al genoma,
debido a que mutaciones en su estruc-
tura alteran la eficiencia de este proce-
so (Gelvin, 1998; Mysore et al., 2000).
En el caso de VirE2, su rol sera menor,
dado que se ha demostrado que cepas
de A. tumefaciens mutantes que no sin-
tetizan esta protena, muestran una dis-
minucin en su tumorigenicidad (Gel-
vin, 2000; Yusirov et al., 1994), lo que
sin embargo, no descarta del todo la exis-
tencia de problemas en etapas anteriores
a la integracin.
d) Protenas de la planta involucradas en
la integracin.
Debido a que la integracin del T-DNA
involucra un proceso de recombinacin
ilegtima, es esperable encontrar que
enzimas vegetales involucradas en el
proceso normal de recombinacin/repa-
racin del DNA puedan tener participa-
cin en la integracin. Este pensamien-
to ha llevado a utilizar plantas mutantes
de Arabidopsis thaliana que muestren
una deficiencia en sus sistemas de repa-
racin de DNA frente a radiaciones. Es-
tas plantas se denominan mutantes rad
(Nam et al., 1998). Se ha descubierto
que histonas (protenas que intervienen
activamente en la formacin de los
cromosomas), especficamente la H2A,
tienen una directa influencia en el pro-
ceso de integracin de fragmentos linea-
les de DNA hacia los cromosomas
(Mysore et al., 2000). Mutantes rad, de-
ficientes en H2A, muestran una eficien-
cia reducida en la integracin del T-
DNA, pero no as en la expresin transi-
toria de genes del cassette contenido
en el vector de transformacin que po-
see un gen reportero. Como se sabe, la
122
BIOTECNOLOGA VEGETAL
expresin transitoria de estos cassettes,
no requiere la integracin al genoma,
sino slo su presencia dentro del ncleo,
de forma de tener acceso a la maquina-
ria de expresin de dicho cassette
(protenas nucleares de transcripcin).
Recientemente, algunos experimentos
estudiando la interaccin protena-pro-
tena, denominados sistemas de doble
hbridos en levadura, han demostrado
una interaccin fsica entre H2A y VirD2
(Gelvin, 2000, Mysore et al., 1998).
Plasmidios binarios.
Debido a su gran tamao, el plasmidio
Ti es en s inmanejable en el laboratorio
y difcilmente podra utilizarse para
clonar directamente genes en l. As,
para transformar una planta mediante A.
tumefaciens, se utilizan plasmidios de-
sarmados tipo Ti. Esto da origen, gene-
ralmente, a un sistema en el que dos
plasmidios complementan sus funcio-
nes, uno aportando con el opern vir y
el otro aportando el cassette con el gen
de inters. De esta forma, ambos plas-
midios en conjunto, complementan las
funciones de un plasmidio Ti normal (Fi-
gura 6.7). Estos plasmidios con funcio-
nes complementarias se llaman plasmi-
dios binarios. El plasmidio que lleva los
elementos relacionados con el T-DNA,
no posee los grupos de genes encarga-
dos de la sntesis de opinas ni los de la
sntesis de fitohormonas (citoquininas y
auxinas). En l se han reemplazado es-
tos, por "cassettes" de expresin de los
genes de inters. Como se ve, existe un
proceso de complementacin de funcio-
nes entre ambos plasmidios binarios, los
que en su conjunto, equivalen a tener
un plasmidio Ti funcional, (sin formar el
tumor) y con la ventaja de hacerlos ms
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS
Figura 6.7. Racional del uso de A.
tumefaciens en el laboratorio.
Sistema de plasmidios binarios.
Para evitar la manifestacin de la
enfermedad de la agalla de la corona
(producida por la sntesis de opinas),
en el laboratorio se usan plasmidios Ti
desarmados. Esto quiere decir que, se
han desarrollado cepas de
Agrobacterium que tienen un plasmidio
que aporta slo las funciones vir. El
plasmidio con la regin de T-DNA
es manipulado separadamente en el
laboratorio, utilizando todas las tcnicas
del DNA recombinante para introducir
entre ambos brazos, los genes de inters
a expresar en la planta. As, en la zona
del T-DNA, se ponen los cassettes de
expresin de protenas externas y se han
abolido los genes de opinas y
fitohormonas, que propician la
formacin del tumor observado
en la Figura 6.1.
pequeos en tamao, de forma de po-
der manipularlos adecuadamente en el
laboratorio. Esta estrategia ha permitido
disear cepas comerciales de A. tume-
faciens que traen incorporadas el plas-
midio que contiene las funciones de vi-
rulencia (vir), como ocurre con la cepa
LBA4404, la ms conocida y utilizada
hasta hoy para transformacin de plan-
tas. Esta bacteria posee el plasmidio de-
nominado pAL4404 (al que se llama,
plasmidio Ti residente), con todos los ge-
nes vir necesarios para activar un even-
tual T-DNA que pudiera ser incorpora-
do a la bacteria. El T-DNA es aportado
entonces por otro plasmidio, el que ade-
ms posee elementos que le permiten
funcionar como plasmidio lanzadera, es
decir, que funciona tanto en A. tumefa-
ciens como en E. coli. Esta caractersti-
ca, permite que todas las operaciones de
clonamiento de un gen de inters y su
manipulacin para que se exprese co-
rrectamente en la planta, son posibles
de realizar en este plasmidio utilizando
bacterias tipo E. coli, tal como si fuera
un plasmidio pequeo y con todas las
herramientas que se pueden aplicar con
la tecnologa del DNA recombinante.
Dentro de las seales necesarias para
este vector binario lanzadera, se encuen-
tran los cassettes de seleccin para
antibiticos y secuencias que permiten
que dicho plasmidio se pueda replicar,
tanto en bacterias tipo E. coli como en
bacterias tipo A. tumefaciens. Tambin
en este plasmidio, se suele incluir el
cassette de seleccin para el proceso
de transformacin propiamente tal, es
decir, la seleccin de las clulas que
efectivamente se han transformado.
Un sistema similar, pero menos usado en
la actualidad, es el denominado de plas-
123

midios integrativos. Este sistema explota
tambin un sistema dual de plasmidios,
con las funciones separadas de la misma
forma anterior. La diferencia con el siste-
ma binario radica en que esta vez se bus-
ca reconstituir un plasmidio Ti dentro de
Agrobacterium, a travs de la recomb-
inacin de secuencias homlogas entre
el plasmidio que porta la zona T-DNA y
el plasmidio que tiene la zona vir.
1. Genes reporteros y marcadores.
Cuando se realizan experimentos de trans-
formacin, los explantes (o tejido que se
transforma) que son sujetos al evento, se
conforman por clulas que han sido efec-
tivamente transformadas (las menos) y c-
lulas que no se transformaron eficien-
temente. Esto ltimo puede deberse a
muchas razones, tales como que en efec-
to no son clulas transformadas o como
clulas que a pesar de ser transformadas,
es decir que el DNA entr a su interior,
nunca ingresar a su ncleo ni ser incor-
porado definitivamente a su genoma.
Existen eventos de transformacin en los
que los genes son ingresados al ncleo,
pero estos nunca sern integrados en el
genoma. En este tipo de ensayos, los genes
incluidos en los cassettes de transforma-
cin, son expresados de manera tempo-
ral, denominndose eventos de expresin
transitoria y que generalmente duran slo
unos pocos das (por ejemplo, hasta 9
das) para ser finalmente eliminados de la
clula, generalmente por maquinarias de
degradacin cidos de nucleicos que le
resulten extraos.
Cuando se busca generar una nueva va-
riedad de plantas a travs de transgenia,
se busca un evento de transformacin
124
BIOTECNOLOGA VEGETAL
permanente, es decir, la transformacin
estable del tejido blanco. Una forma de
aumentar la certeza de que se ha obte-
nido clulas establemente transforma-
das, es el crecimiento selectivo de las
clulas sometidas a transformacin. Este
proceso de seleccin obliga a la utiliza-
cin de cassettes adicionales al de in-
ters, que expresan genes que confieren
alguna caracterstica metablica a la
planta, lo que hace que ella pueda cre-
cer en medios selectivos. Estos casset-
tes para los genes de seleccin, slo
deben permitir la expresin de dichos
genes en la clula blanco (eucarionte) y
no en microorganismos contaminantes,
como el mismo A. tumefaciens, u otros
que pudieran estar presentes en la trans-
formacin (ex profeso o casualmente).
Los marcadores de seleccin, son genes
que confieren un fenotipo dominante a
las clulas transformadas en comparacin
a aquellas que no lo poseen. Los marca-
dores de seleccin pueden agruparse en
dos grandes tipos: a) aquellos que con-
fieren ya sea viabilidad o letalidad en
presencia de un agente selectivo en el
medio de cultivo (medio de seleccin) y
b) aquellos que no tienen un efecto evi-
dente en la supervivencia celular, pero
confieren alguna caracterstica fsica
distinguible a las clulas transformadas.
a) Marcadores que confieren viabilidad
o letalidad a las clulas transformadas.
i. Genes de resistencia a antibiticos o
herbicidas: Una de las caractersticas
ms empleadas es la resistencia a anti-
biticos (por ejemplo kanamicina e hi-
gromicina), herbicidas (por ejemplo
Basta) u otras fitotoxinas. En general,
la resistencia conferida a la clula por
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS
este tipo de genes de seleccin, se de-
be a la codificacin de una enzima
que permite la destoxificacin por
modificacin qumica del txico, a la
sntesis de un agente blanco del txi-
co que sea menos sensible que el sil-
vestre o; a la sobre-expresin de la
protena blanco, haciendo poco sig-
nificativo el efecto del txico en el me-
dio. El proceso de seleccin de las
plantas efectivamente transformadas,
consiste simplemente en hacer crecer
los explantes transformados en medios
conteniendo estos agentes selectivos
(txicos para clulas normales) en
concentraciones adecuadas. En la ac-
tualidad, la utilizacin de genes de re-
sistencia a antibiticos es muy discu-
tida, debido a los posibles efectos se-
cundarios que estos genes pueden
producir al ser ingeridos en alimentos
que utilizan como materia prima a cul-
tivos transgnicos. Esto ha llevado a
la bsqueda y utilizacin de nuevos
genes y estrategias.
ii. Marcadores de letalidad: Ms que en
aplicaciones biotecnolgicas, el uso
de este tipo de marcadores correspon-
de a ciencia bsica. Un ejemplo de
esto puede ser utilizar un gen que co-
difique para una protena txica bajo
las rdenes de un promotor que sea
activado slo bajo ciertas condicio-
nes. De esta forma, al darse dicha
condicin fisiolgica o estmulo ex-
terno, se producir la muerte celular.
Este tipo de marcadores ha permitido
establecer la tecnologa terminator,
en la que expresando el gen de la bar-
nasa (una ribonucleasa inductora de
macho-esterilidad, originalmente exis-
tente en Bacillus amyloliquefaciens;
Denis et al., 1993) en clulas trans-
formadas, la planta transgnica gene-
re una progenie infrtil, eliminando la
posibilidad de escapes, flujo gnico e
incluso de la formacin de progenie.
b) Marcadores visibles.
i. Marcadores histolgicos: Ellos confie-
ren un fenotipo visible en presencia de
un sustrato aplicado exgenamente.
Esto ha dado origen a la utilizacin de
los llamados genes reporteros, los cua-
les al expresarse dentro de la planta
transgnica, expresan una actividad
biolgica que es fcilmente evaluable
e incluso cuantificable. Dos son las
principales protenas utilizadas; la pri-
mera de ellas es la enzima -glucuro-
nidasa (GUS), que utiliza un sustrato
llamado -glucurnido que es incolo-
ro y lo trasforma a un producto colo-
reado azul, que precipita sobre la mis-
ma enzima (Figura 6.8). La desventaja
de utilizar este gen reportero, es que
para realizar la deteccin de GUS, se
debe destruir el tejido transformado,
perdiendo el evento transgnico. En los
ltimos doce a quince aos, ha apare-
cido un segundo gen, cuya ms impor-
tante caracterstica es no requerir esta
destruccin del tejido transformado.
ste codifica para la denominada pro-
tena verde fluorescente (green
fluorescent protein, GFP), que se ais-
l de Aquorea victoria y que tiene la
particularidad de emitir una luz verde
nen cuando es excitada con luz
ultravioleta (Figura 6.9). La utilizacin
de GFP ha permitido generar incluso
procedimientos de obtencin de plan-
tas transgnicas sin la utilizacin de ge-
nes de seleccin metablica o resisten-
cia a antibiticos, como los anterior-
mente mencionados.
125
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Figura 6.8.
Genes reporteros.
Expresin de
- glucuronidasa.
La enzima -glucu-
ronidasa (GUS) uti-
liza un sustrato lla-
mado -glucurni-
do, que es incolo-
ro y lo trasforma a
un producto colo-
reado azul que pre-
cipita sobre la misma enzima. Cuando una planta es transformada con este gen, el
tejido al ser incubado con el sustrato en las condiciones adecuadas, se tornar azul en
el lugar donde se expresa. En la fotografa izquierda, se muestran embriones de poroto
disparados con partculas de oro recubiertas con DNA que codifica para la enzima
reportera (izquierda misma fotografa) y sin DNA (derecha misma fotografa). La barra
corresponde a 1 milmetro. A la derecha, vista de una semilla de pepino (Solanum
muricatum) despus de ser disparada, observndose los pellets de partculas (ver
biobalstica).

Figura 6.9.
Genes reporteros. Expresin
de protena verde fluorescente.
El gen de la "green fluorescent protein" o
GFP, que se aisl de la medusa Aquorea
victoria y que tiene la particularidad de
emitir una luz verde nen cuando es
excitada con luz ultravioleta. GFP ha
permitido generar incluso procedimientos
de obtencin de plantas transgnicas sin la
utilizacin de genes de seleccin
metablica o resistencia a antibiticos,
como los mencionados en el texto. En las
fotografas se muestra una hoja de pepino
que ha sido infectada con A. tumefaciens
(arriba, la expresin de GFP (emisin en
verde nen) en las zonas cercanas al dao
mecnico generado y el color rojo causado
por la excitacin de la clorofila por luz UV).
Al medio, se ve un acercamiento a esta
situacin, definindose claramente los
bordes de las clulas transformadas.
Abajo, expresin estable de GFP en hojas
de plantas de vid obtenidas en INIA - La
Platina. Al ser iluminadas con luz UV,
la clorofila emite color rojo (izquierda).
Sin embargo, en clulas transformadas,
la emisin de GFP logra sobreponerse con
su tpico color verde nen (derecha).

126
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS
ii. Marcadores morfolgicos: Corres-
ponden a genes que codifican para
protenas que generan, en las clulas
transformadas, un cambio fenotpico
fcilmente evaluable. Si estos marca-
dores se ubican bajo las rdenes de
un promotor que responde a un est-
mulo qumico del medio (un agente
inductor), la aplicacin de este agen-
te permitir la seleccin de las clu-
las transformadas. Este inductor pue-
de ser luego quitado y as las clulas
seleccionadas pueden recobrar su
morfologa normal. Actualmente, es-
tos sistemas son de amplio uso bio-
tecnolgico y se conocen con el nom-
bre de MAT (del ingls multi-auto-
transformation). Son sistemas que
utilizan genes metablicos que per-
miten seleccionar positivamente las
clulas o el tejido transformado. Los
sistemas MAT de uso cada vez ms
popular (Ebinuma et al., 2001; Endo
et al., 2002), se pueden agrupar se-
gn el tipo de enzima o elemento
metablico de seleccin: a) aquellos
que usan el gen de la enzima isopen-
tenil transferasa (ipt) (Kunkel et al.,
1999; Wabico et al., 1989) y b) aque-
llos que usan los genes rol A, B y C
de A. rhizogenes (Kiyokawa et al.,
1994). Al ser transformadas con ipt,
las clulas que incorporan el gen en-
tran en una activa proliferacin, debi-
do a que la enzima cataliza la snte-
sis de citoquininas. Por otro lado, las
Figura 6.10. Principio de la biobalstica. Consiste en precipitar DNA sobre la superficie de par-
tculas, las que sern lanzadas luego a alta presin sobre tejidos o explantes, de forma que el
DNA llegue al ncleo de las clulas que los constituyen.
clulas transformadas con los genes
rol, son capaces de inducir la forma-
cin de pelillos radicales areos, de-
bido a un aumento en la sensibilidad
a auxinas. De esta forma, ambas plan-
tas o clulas transformadas, podrn
ser distinguidas fenotpicamente de
sus contrapartes no transformadas.
Los sistemas MAT poseen adems,
elementos que permiten su escisin
del genoma de las clulas o plantas
transformadas (ver ms abajo).
BIOBALSTICA
La interaccin natural entre Agrobacte-
rium y las plantas, inicialmente se crey
limitada al espectro de las dicotiled-
neas. Debido a esto, en 1991, John San-
ford y su grupo, en el Campus Geneva
de la U. de Cornell, crearon un sistema
de alta presin que fuera capaz de impul-
sar pequeas partculas de metales consi-
derados inertes para la clula, como oro
o tungsteno. Estas partculas se recubren
con genes quimricos, de forma que ellos
lleguen al ncleo y se incorporen al geno-
ma de la clula (Figura 6.10). Se asume
que las partculas, una vez ingresadas a
la clula, desprenden el DNA que se ha
depositado sobre su superficie, debido a
la accin de los lquidos intracelulares.
Este proceso esencialmente fsico, permi-
ti superar el inicial impedimento prc-
tico de transformar especies monocotile-
dneas en un laboratorio.
127

Una de las ventajas del sistema de
biobalstica, es que prcticamente se
puede utilizar en cualquier sistema ve-
getal, quedando as abierta la posibili-
dad de transformacin in situ de clulas
diferenciadas, sin necesidad de un culti-
vo in vitro previo o de regeneracin pos-
terior, como lo requiere la metodologa
a travs de A. tumefaciens. Esto ha per-
mitido, por ejemplo, la transformacin
de clulas meristemticas apicales con
una eficiencia aceptable (0,007 a 0,003
%). Sin embargo, esta eficiencia se pue-
de aumentar (por ejemplo hasta 1%) a
travs de la induccin de procesos de
organognesis en la regin transforma-
da, mediante la utilizacin de citoquini-
nas (por ejemplo bencilaminopurina)
para generar multibrotacin (Ver Cap-
tulos 2-4).
METODOLOGAS
DE TRANSFORMACIN
1. Transformacin mediada por
Agrobacterium tumefaciens.
Como se mencion anteriormente, la
factibilidad de instaurar sistemas de trans-
formacin utilizando A. tumefaciens ge-
neralmente involucran un gran esfuerzo
en desarrollar lneas celulares con alta
capacidad de regeneracin. Una vez ob-
tenida una lnea celular especfica, se
desarrollan los experimentos de transfor-
macin, los que en trminos generales
constan de tres etapas bsicas (Figuras
6.11a y 6.11b):
a) Infeccin: en la que se ponen en con-
tacto los explantes celulares con la so-
lucin de bacteria. Esta etapa es de
una duracin variable en la que se
128
BIOTECNOLOGA VEGETAL
procura el reconocimiento entre las
protenas receptoras de la bacteria y
los ligandos de la pared celular vege-
tal. Para la infeccin se pueden reque-
rir tiempos breves de slo algunos se-
gundos (como por ejemplo para taba-
co), tiempos intermedios de un par de
minutos (como por ejemplo para vi-
des) o, tiempos bastante prolongados
(como por ejemplo para durazno). De
la misma forma, la concentracin p-
tima de bacteria (medida como OD600)
vara entre 0,1 y 1,0. Una vez realiza-
da la infeccin, los explantes son ex-
trados de las solucin bacteriana y el
exceso de bacterias es eliminado cui-
dadosamente mediante un papel fil-
tro. Entonces ya se puede dar paso a
la segunda etapa.
b) Co-cultivo: se denomina as a la eta-
pa que implica todos los eventos de
generacin del complejo-T y trasla-
do a la clula vegetal. El tiempo sufi-
ciente para el co-cultivo es depen-
diente del modelo de trabajo, encon-
trndose generalmente suficiente
unas 48 horas, en medios propicios
para que ambos componentes, bac-
teria y explante, interacten efectiva-
mente generando la transformacin.
c) Seleccin y regeneracin del explan-
te transformado: esta es la etapa ms
larga de todo el proceso de transfor-
macin, pudiendo durar tantos me-
ses como el sistema de regeneracin
de la clula vegetal disponga. Una
vez pasado el tiempo de co-cultivo,
ya no interesa ms la presencia de
Agrobacterium en el mismo medio en
que estn las clulas transformadas.
Para eliminarlo, se utilizan antibiti-
cos (usualmente cefotaxime), aplicn-
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS

dolos por un determinado tiempo
hasta que ya no existen evidencias de
la bacteria en el medio de seleccin
y regeneracin. Como este nombre lo
indica, tambin es un medio de se-
leccin, por ello, junto con eliminar
al Agrobacterium, se pretende no es-
timular la multiplicacin y regenera-
cin de clulas no transformadas.
Hasta la fecha, los agentes de selec-
cin ms utilizados los constituyen
antibiticos como la kanamicina,
cuyo efecto final es precisamente eli-
minar todas las clulas vegetales que
no hayan incorporado los genes de-
seados desde el plasmidio. Sin embar-
go, la aparicin de nuevos agentes de
seleccin, como la misma GFP (Figu-
ra 6.11b) o genes que confieren ca-
ractersticas metablicas especficas
a la planta, han permitido la genera-
cin de nuevos vectores de transfor-
macin en los que se excluyen genes
de resistencia a antibiticos, cuya uti-
lizacin se ha cuestionado debido a
sus posibles efectos en el humano.

Figura 6.11a. Transformacin mediada por Agrobacterium tumefaciens.

En la etapa de infeccin, se ponen en contacto los explantes celulares con la
solucin de bacterias, para dejarse en este estado por un perodo de tiempo
denominado co-cultivo (usualmente entre 48 y 72 horas). Esto da tiempo para
la infeccin y transformacin propiamente tal. Luego viene una etapa de se-
leccin y regeneracin del explante transformado, en donde se permitir el
desarrollo slo de las clulas efectivamente transformadas, lo que se evala
utilizando diversos genes marcadores, ya sea de resistencia a antibiticos,
metablicos o reporteros (ver texto). Luego de la seleccin, las plntulas
promisorias son traspasadas a tierra y finalmente recuperadas.

Figura 6.11b. Sistema de regeneracin de Nicotiana benthamiana. Utilizando GFP (protena

fluorescente verde) es posible hacer el seguimiento de la transformacin por visualizacin del
verde nen en los callos transformados (1). Luego, estos son rescatados (2) y llevados a re-dife-
renciar nuevamente, hasta la obtencin de plntulas (3), que son finalmente enraizadas (4).

129
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

2. Transformacin mediada por a) Preparacin de las partculas: donde

biobalstica.
El sistema de biobalstica consta esen-
cialmente de una cmara de vaco y un
sistema de acumulacin de presin, para
el que se utiliza un gas inerte para las
clulas (por ejemplo helio) (Figura 6.12).
Esta presin ser la que impulsar las
partculas que han sido recubiertas con
el plasmidio o cassette de inters (Fi-
gura 6.10). Las etapas ms importantes
en el proceso de biobalstica son:
se precipita el DNA de inters en in-
troducir a la planta, utilizando para
ello CaCl 2 , espermidina y etanol. To-
dos estos elementos corresponden, en
esencia, a elementos que desplazan
agua desde las hebras de DNA pro-
duciendo as la precipitacin sobre la
superficie de las partculas.
b) Preparacin de las membranas por-
tadoras: stas son membranas circu-
lares de aproximadamente 1,5 cm de
dimetro sobre las que se deposita

Figura 6.12. Principio del sistema de biobalstica.

Las partculas con DNA precipitado en su superficie, son depositadas sobre una membrana
transportadora (1). Esta membrana es invertida, de modo que las partculas quedan mirando
hacia abajo (2). De esta forma, son posicionadas en la pistola (4). Para hacer el disparo,
se acumula presin en el cilindro del sistema (3). Esta presin es rota mediante la ruptura
de membranas que especficamente retienen el gas dentro del cilindro (barra negra en (3)).
As, cuando se decide, stas se rompen, generando la onda expansiva que acelera la
membrana portadora de las partculas. Este viaje dura hasta que la membrana es detenida
por una rejilla de detencin, pero que permite el paso de las partculas con el DNA,
de modo que stas llegan a impactar al tejido blanco (5).

130
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS

una cantidad adecuada de partculas por la rejilla de parada y las partculas

preparadas (con DNA en su superfi-
cie) (Figura 6.12, paso 1). El material
de estas membranas es extremada-
mente resistente, comercialmente
conocido como Kapton (de Dupont).
c) Preparacin del dispositivo porta
membrana: que corresponde a un
anillo que tiene como objetivo rete-
ner a la membrana portadora, de
manera invertida (exponiendo las
partculas hacia abajo (Figura 6.12,
paso 2) y adaptarla al sistema de in-
yeccin de gas (Figura 6.12, paso 4).
d) Armado del sistema de retensin: tras
ubicar las membranas portadoras del
DNA, a una distancia que puede va-
riar entre 0,5 a 1,5 cm, se ubica una
rejilla de parada para la membrana
portadora. La idea es que, tras el im-
pulso dado por la presin de gas, la
membrana portadora acelere esta dis-
tancia y se detenga sbitamente. De
este modo, la membrana ser retenida
seguirn su viaje hasta impactar con el
tejido blanco (Figura 6.12, paso 5).
e) Produccin de la onda de impulso:
Como se mencion, se utiliza un gas
considerado inerte para la clula, el
helio. Para generar la presin de gas,
ste se acumula en un cilindro en el
que uno de sus extremos est abierto y
habilitado para poner membranas de
ruptura. La funcin de estas membra-
nas de ruptura es retener la presin de-
seada de trabajo y luego, al inducir su
ruptura por accin mecnica (por
ejemplo con una aguja), liberarla ge-
nerando la onda expansiva necesaria
para impulsar las membranas portado-
ras (Figura 6.12, paso 3).
Existen numerosos sistemas y variantes
comercialmente disponibles en cuanto a
biobalstica. El costo aproximado de este
tipo de equipos puede ascender a US$
5.000 US$ 10.000, dependiendo de su
automatizacin y origen (Figura 6.13).

Figura 6.13. Vista externa de sistemas comerciales de biobalstica.

Vista exterior del aspecto que tienen dos aparatos de biobalstica. Izquierda,
pistola desarrollada por DuPont semiautomatizada. Derecha, sistema
desarrollado por EMBRAPA-CENARGEN, Brasil. Ambos sistemas se encuentran
en distintos laboratorios de nuestro pas, como son INIA, PUC y Bioforest.

131

ELIMINANDO
LOS GENES INDESEADOS
La mayora de las tcnicas de transfor-
macin introducen un gen de seleccin
que confiere resistencia a antibiticos,
junto con el gen de inters. Una de las
metas ms deseadas en el camino del
mejoramiento de plantas mediado por
transgenia, es la obtencin de nuevos
cultivos con un mnimo de modificacin
de su fondo gentico, siendo en efecto
sta una de las grandes ventajas de la
transgenia en comparacin con los cul-
tivos mejorados sexualmente (mejora-
miento convencional).
En casi todos los casos, el gen de resis-
tencia incorporado en forma accesoria
ya no es til una vez que se ha supera-
do la etapa de seleccin de los clones
transformados, siendo deseable eliminar-
lo desde las plantas transformadas y se-
leccionadas. En el caso de los genes in-
sertados en el genoma nuclear de las
plantas, se han ideado varias aproxima-
ciones para retirar estos genes de resis-
tencia al antibitico.
1. Sistemas de remocin de los genes
de resistencia.
i. Co-transformacin: consiste en la
transformacin en paralelo de dos loci
distintos y lejanos, uno conteniendo el
cassette para el gen de inters y el
otro, conteniendo el cassette con el
gen de resistencia a antibitico. Ambos
cassettes se insertan en estos sitios dis-
tantes, pudiendo ser separados posterior-
mente por segregacin de las progenies
de las transformantes, mediante mejora-
miento convencional (retrocruzas).
132
BIOTECNOLOGA VEGETAL
Existen tres formas de generar la co-
transformacin:
Utilizando dos plasmidios binarios,
cada uno en una cepa de A. tumefa-
ciens distinta (De Neve et al., 1997).
Utilizando dos plasmidios binarios,
ambos presentes en una sola clula de
A. tumefaciens (Daley et al., 1998).
Utilizando un plasmidio binario, con
dos T-DNAs distintos, uno para cada
cassette (Komari et al., 1996).
Aunque la eficiencia de estos sistemas
est dada por muchas variables, se ha
observado un amplio rango de variacin
entre la frecuencia de transformacin
con uno y otro cassette. Existen nu-
merosos factores que pudieran explicar
esta diferencia de efectividad, como el
estado de los explantes vegetales y su
efecto sobre la adhesin de la bacteria
a su superficie, en el caso de dos bacte-
rias y dos cassettes. Sin embargo, la
utilizacin de dos T-DNAs o dos plasmi-
dios binarios dentro de una misma c-
lula de A. tumefaciens, ha rendido bue-
nos resultados.
Por otra parte, se ha observado que exis-
ten diferencias entre los niveles de se-
gregacin que se obtienen en las plan-
tas transgnicas al utilizar cepas de A.
tumefaciens sintetizadoras de nopalinas
o de octopinas. Las primeras, son bac-
terias que propician la insercin de T-
DNAs ms ligados genticamente o, lo
q u e e s l o m i s m o , e n l o c i c e rc a n o s
(Ebinuma et al., 2001).
ii. Recombinacin sitio-especfica: este
proceso explota un fenmeno descrito
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS

en el bacterifago llamado P1, que fun- cruzamiento de la lnea de plantas

ciona de un modo bastante similar a lo
descrito para la recombinacin de se-
cuencias att del bacterifago y E. coli.
En el caso de P1, tenemos la existencia
de sitios especficos en un DNA, deno-
minadas secuencias loxP, los que son re-
conocidos por una enzima que los corta
y promueve su escisin, la recombinasa
Cre. Por lo tanto, cualquier secuencia
que est rodeada de dos sitios loxP, ser
escindida si existe en forma paralela la
expresin de Cre (Odell et al., 1990). Si
un cassette de expresin de resisten-
cia a antibiticos es flanqueado por dos
sitios loxP, bastar la expresin de la
protena Cre en la misma planta para
producir la salida de dicho cassette
(Figura 6.14). En mejoramiento vegetal,
esto se realiza mediante dos formas: a)
la re-transformacin con un cassette
de expresin de Cre de una planta ya
transgnica (Dale y Ow, 1991), b) por
transgnicas con una lnea que previa-
mente ha sido transformada con el cas-
sette Cre (Ebinuma et al., 2001). La efi-
ciencia de este sistema es relativa, ob-
servndose que es la lnea portadora de
Cre el factor que otorga esta variabili-
dad de resultados (Russel et al., 1992).
En similitud al sistema Cre/lox, el ya des-
crito sistema de recombinacin basado
en zonas attP de fago y attB de E. coli,
tambin tiene su aplicacin en plantas
transgnicas. Recientemente se ha gene-
rado un sistema de plasmidios binarios
que explotan la recombinacin homloga
entre dos sitios attP, prescindiendo abso-
lutamente de los elementos Int e IHF, pero
incluyendo en forma adicional en dicho
plasmidio, una secuencia de nucletidos
estimuladora de eventos de recombina-
cin (Zubko et al. 2000).

Secuencia Secuencia
lox lox
T-DNA insertado
al genoma vegetal
Promotor Resistencia a Terminador Cassette de inters
antibitico
(ej. Kanamicina)
Cre

Secuencia
lox
T-DNA insertado
al genoma vegetal
Cassette de inters

Figura 6.14. Sistemas de eliminacin de genes marcadores o de resistencia a

antibiticos. Sistema Cre/lox. Es un sistema descrito en el bacterifago P1. ste
tiene sitios especficos en su DNA, denominadas secuencias loxP, que son recono-
cidas por una enzima (codificada por el mismo fago) que las corta y promueve su
escisin, la recombinasa Cre. Al insertar un cassette de resistencia a antibitico
flanqueado por estas secuencias, una planta que tenga la capacidad de producir la
recombinasa Cre, escindir dicho cassette del genoma de la planta transgnica.

133
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

iii. Sistema de elementos transposables: denominan transposasas. De esta forma,

que utiliza elementos genticos salta-
rines que explotan la recombinacin ile-
gtima. Estos elementos especficos se
llaman secuencias mviles o transposo-
nes, descritos por primera vez en euca-
riontes por Barbara McClintock a travs
de sus trabajos en maz. Ella identific
este tipo de secuencias y las denomin
Ds (del ingls dissociation)(Rhoades,
1984). Los elementos Ds, son secuencias
repetitivas invertidas y se pueden escin-
dir de un sitio genmico y ubicarse en
otro espontneamente. Eso s, bajo la
presencia de otro elemento, denomina-
do Ac (del ingls activator). Ac pro-
porciona las actividades enzimticas
necesarias para este salto de un lugar a
otro (Fedorof, 1989). Estas enzimas se
cassettes flanqueados por secuencias
Ds, en presencia de los genes de trans-
posasa ubicados en Ac, generarn el
salto de dicho cassette hacia un
locus distante del originalmente utiliza-
do para la transformacin (Figura 6.15).
As, se permite realizar la segregacin
de ambos cassettes mediante retrocru-
zas posteriores (Goldsbrough et al.,
1993), de la misma forma como se hara
en un sistema de co-transformacin.
Todos estos sistemas tratan de remover
los genes de seleccin utilizados. Sin
embargo, como contrapartida, se han ge-
nerado tambin sistemas que utilizan la
incorporacin de un marcador metabli-
co positivo.

Secuencia Secuencia
Ds Ds
T-DNA insertado
Promotor Resistencia Terminador Cassette de inters al genoma vegetal
a antibitico
(ej. Kanamicina)
Ac

Cassette de inters
T-DNA insertado

Resistencia
Secuencia a antibitico Secuencia
Ds (ej. Kanamicina) Ds
Transposn que
Promotor Terminador sali a otro locus

Figura 6.15. Sistemas de eliminacin de genes marcadores o de resistencia

a antibiticos. Sistema con elementos transposables de maz Ac/Ds. Los
transposones Ds son secuencias repetitivas invertidas y se pueden escindir
de un sitio genmico y ubicarse en otro espontneamente. Esto requiere
la presencia de otros elementos proteicos, que se encuentran en genes
denominados Ac. De esta forma, un casete de resistencia a antibiticos
flanqueado por secuencias Ds, en presencia de los genes de transposasa
ubicados en Ac, harn que dicho cassette salte hacia un locus distante
del originalmente utilizado para la transformacin, y que permitir
entonces realizar la segregacin de los cassettes de inters
y de resistencia mediante retrocruzas.

134
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS
2. Sistemas que incorporan un
marcador positivo.
Como se mencion anteriormente, el uso
de marcadores de seleccin positiva (sis-
temas MAT) ha despertado gran inters,
considerando su potencialidad con res-
pecto a la obtencin de plantas trans-
gnicas libres de "cassettes" de selec-
cin. Todos los MAT utilizan, en adicin
a los genes o grupo de genes de selec-
cin, los elementos transposables de
maz Ac/Ds o bien secuencias de recom-
binacin sitio especficas denominadas
R/RS (que provienen de un plasmidio lla-
mado pRS1 de Zygosaccharomyces rouxi
(Ebinuma et al., 2001)). En ambos casos,
los elementos Ac y R/RS se usan para
flanquear el "cassette" de expresin del
gen marcador metablico, el que es es-
cindido luego de la seleccin primaria,
al expresar la recombinasa respectiva.
El elemento transposable Ac ha mostra-
do poseer la capacidad de re-ubicarse
en el genoma en el 90% de los eventos
de transformacin, mientras que en el
10% de los eventos restantes, no se re-
inserta, generando la eliminacin per-
manente del cassette de seleccin. En
el caso del sistema de recombinacin R/
RS, la recombinasa R reconoce dos se-
cuencias especficas contiguas RS, ha-
ciendo posible la eliminacin de un
cassette de seleccin flanqueado por
estos elementos.
PLANTAS TRANSGNICAS
DE PRIMERA GENERACIN.
Las pasadas dcadas han marcado un
hito en la aplicacin de la ingeniera
gentica de plantas y por ende en la agri-
cultura. La primera generacin de plan-
tas obtenidas por biotecnologa, por le-
jos, se concentr en la incorporacin de
genes de resistencia a insectos y genes
de tolerancia a herbicidas (Chua y Sun-
daresan, 2000). Estos rasgos incorpora-
dos, han permitido la reduccin de pr-
didas por aparicin de malezas y de pes-
tes, as como una disminucin en la can-
tidad de qumicos utilizados en su pre-
vencin. Se estima que el primer pas en
comercializar cultivos GM fue China, a
principios de la dcada de 1990. En
1994, la empresa Calgene comercializ
el tomate Flavr-Savr, con maduracin
retardada debido a la introduccin, en
forma antisentido, del gen de la poliga-
lacturonasa, enzima encargada del me-
tabolismo de la pared celular. Ya en
1995, se haban otorgado nueve conce-
siones para la comercializacin de es-
tos cultivos, siendo Canad y Estados
Unidos los principales pases en apro-
barlas. El xito de estos cultivos GM ha
sido tal, que ya en el ao 2000 se supe-
r los 40 millones de hectreas, tenien-
do como pases ms importantes, por su
rea total sembrada, a Argentina y Esta-
dos Unidos (James, 2000).
En el caso de las plantas con tolerancia
al herbicida glufosinato de amonio (Bas-
ta), destaca como cultivo la soya, repre-
sentando ms de la mitad del total de
cultivos GM sembrados en el mundo
hacia fines de la dcada pasada (James,
1998). Con este mismo carcter, le si-
guieron canola y maz en este mismo pe-
rodo de tiempo. Casi todos los eventos
disponibles o comercializados con este
rasgo en la actualidad, utilizan como
fuente de resistencia el gen pat, de la
bacteria Streptomyces viridochromoge-
nes cepa Tu494, que codifica para la
enzima fosfinotricin-acetil transferasa
135

(protena PAT). Al estar presente en las
plantas, PAT permite que stas desacti-
ven a la fosfinotricina, principio activo
de los herbicidas de este tipo.
Hacia fines de la dcada de 1990 desta-
c el conocido maz Bt (James, 1998),
que utiliza diferentes genes de la fami-
lia cry de Bacillus thuringiensis subsp.
kurstaki cepa HD-1, para expresar la
protena CRY que confiere resistencia
aumentada a insectos (Prieto-Samsonov
et al., 1997). El mecanismo de accin
de esta protena es formar agrupaciones
cristalinas en los aparatos digestivos de
lepidpteros, es decir, verdaderos cana-
les o perforaciones el tracto digestivo de
los insectos, generando su muerte. Este
tipo de cultivo lleg a ser un 25 por cien-
to del total de los transgnicos sembra-
dos en el mundo en ese perodo.
Un tercer cultivo de importancia por su
volumen de rea sembrada para comer-
cializacin, ha sido la produccin ma-
siva de algodn GM (James, 1998), el
que se ha modificado con ambas carac-
tersticas, es decir, resistencia a insec-
tos y a herbicidas. A fines de la dcada
pasada, su siembra ocupaba el 10 por
ciento del total de cultivos GM sembra-
dos en el mundo.
PLANTAS TRANSGNICAS
DE SEGUNDA GENERACIN
Y POSTERIORES.
a) Plantas con contenido nutricio
mejorado.
Uno de los hitos en el desarrollo de las
plantas genticamente modificadas lo
constituy el denominado arroz dora-
136
BIOTECNOLOGA VEGETAL
do. En 1990, un grupo de investigado-
res, liderados por Ingo Potrykus (ETH-
Zurich, Suiza), propuso a la Fundacin
Rockefeller y a su Programa de Biotec-
nologa en Nueva York, desarrollar un
proyecto para introducir una va meta-
blica que permitiera la produccin de
provitamina-A en el endosperma del gra-
no de arroz. Se sabe que la deficiencia
de vitamina A en dietas de pases de es-
casos recursos, incide en enfermedades
como la ceguera nocturna, xeroftalmia
y keratomalacia, pudiendo generar final-
mente ceguera total (Sommer, 1989). Fue
as como este proyecto, a pesar de ser
concebido como de difcil viabilidad
tcnica, comenz su ejecucin median-
te la fusin de ncleos de cientficos con
variadas habilidades. Un grupo que es-
taba trabajando en la va del metabolis-
mo de los terpenos en endosperma de
arroz (grupo de Peter Beyer, University
of Freiburg, Alemania), se uni con otro
grupo de gran dominio en la ingeniera
gentica (grupo de Ingo Potrikus, ETH-
Zurich, Suiza). Estudios preliminares
permitieron a este ncleo de investiga-
dores determinar que, gracias a la fun-
cin de cuatro enzimas: fitoeno sin-
tetasa, fitoeno desaturasa, -caroteno
desaturasa y licopeno -ciclasa; se po-
dra en teora, producir -caroteno, o
provitamina-A (Burkhardt et al., 1997;
Ward y Barnes, 1988). La metodologa
de obtencin de esta nueva variedad de
arroz, consisti en la co-transformacin
con dos cepas de A. tumefaciens portan-
do todos los genes necesarios para la
ruta metablica ms el cassette con el
gen de seleccin. Un plasmidio binario
contena los genes necesarios para la
produccin de licopeno en los plastidios
del endosperma de arroz: el gen de la
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS
fitoeno sintetasa de narciso (Narcissus
pseudonarcissus) y el gen de la fitoeno
desaturasa de una bacteria (Erwinia
uredovora). El otro plasmidio contena
otros dos genes: el de la licopeno -
ciclasa de narciso y el cassette para
resistencia a higromicina. De esta for-
ma, el segundo plasmidio permitira la
sntesis completa hasta -caroteno.
Como se habr notado, se utilizaron slo
tres de los cuatro genes anteriormente
mencionados como necesarios en la ruta
sinttica completa. Esto debido a que el
uso de una caroteno desaturasa de ori-
gen bacteriano, permiti prescindir del
uso de las desaturasas vegetales, las que
en su conjunto tienen el mismo rol que
la enzima bacteriana (introducir dos
dobles enlaces en la estructura del
fitoeno). As, tras ocho aos de trabajo,
se obtuvo una planta de arroz, fenot-
picamente normal, frtil y con buen con-
tenido de -caroteno en su endosperma
(1,6 mg/g) (Ye et al., 2000). Desafortu-
nadamente, no se han podido llevar a
cabo los ensayos a nivel de campo, de-
bido a la moratoria de 10 aos que exis-
te en Suiza para las pruebas de campo
con cultivos GM.
Debido a esto, la actual estrategia de los
generadores del arroz dorado es inte-
grarse activamente con sus lneas trans-
gnicas, a programas de mejoramiento y
evaluacin locales, para la introduccin
de este rasgo a especies localmente adap-
tadas y ecotipos propios de los pases
productores de arroz. Todo esto bajo las
premisas y regulaciones que existen en
los diversos pases para el empleo de cul-
tivos GM. Un claro ejemplo de esto, re-
presenta la decisin del Consejo Indio
para la Investigacin Agrcola, quienes
han decidido evaluar detalladamente es-
tas variedades, tanto desde el punto de
vista biolgico como su impacto econ-
mico-social (Potrykus, 2001).
b) Plantas como agentes productoras
de vacunas.
Durante la dcada de 1980, el avance en
el conocimiento de aspectos moleculares
genticos del sistema inmune y su apli-
cacin a la patologa humana, permitie-
ron sentar las bases para nuevos sistemas
de elaboracin de anticuerpos (como lo
es la produccin de anticuerpos mono-
clonales) o generacin de vacunas. De
esta forma, la posibilidad de expresar en
plantas, determinadas secuencias nucleo-
tdicas con capacidad de expresar pp-
tidos claves que son capaces de inducir
una respuesta inmune, ha sido de gran
inters. Estos pptidos reciben el nombre
de eptopes o determinantes antignicos,
siendo una cadena lineal de entre 7 y 15
aminocidos especfica del agente infec-
cioso (Arakawa et al., 1998; Haq et al.,
1995; Thanavala et al., 1995).
Uno de los aspectos ms atractivos del
uso de plantas tansgnicas que expre-
san eptopes especficos (o plantas pro-
ductoras de vacunas), es que, a diferen-
cia de los sistemas animales utilizados
para este mismo fin, las plantas slo re-
quieren agua, luz solar y sales minera-
les para su mantencin, siendo un siste-
ma mucho ms barato. Adems, la pro-
duccin de este tipo de pptidos en
plantas, se ofrece como un sistema mu-
cho ms limpio que el animal, si se pien-
sa en los diversos contaminantes biol-
gicos que acompaan a estos ltimos
(especialmente otros patgenos asocia-
137

dos al animal productor). Tambin resal-
ta que, por sus caractersticas de produc-
cin, las plantas proveen anticuerpos
estables a temperatura ambiente y, final-
mente, la produccin de vacunas en
plantas, facilita la obtencin de produc-
tos administrables por va oral (Walmsley
y Arntzen, 2000).
El xito de la produccin de vacunas en
plantas implica desarrollar un producto
que sea capaz de inducir una respuesta
inmune a nivel de la mucosa gstrica.
Una vez en el tracto digestivo, el antgeno
suministrado por va oral ser reconoci-
do las clulas M de la mucosa linftica
del tracto. Estas clulas dirigirn el
antgeno hacia otro tipo de clulas, de-
nominadas clulas presentadoras del
antgeno (del ingls antigen presenting
cell, APS). stas internalizarn, proce-
sarn y finalmente mostrarn en su mem-
brana plasmtica, los eptopes especfi-
cos asociados a dicho patgeno para que
los linfocitos T de ayuda (linfocitos T
helper del sistema inmune celular) ac-
tiven a los linfocitos B (del sistema in-
mune humoral, productor de anticuer-
p o s ). A s , e s t o s m i g ra r n h a c i a l o s
ndulos linfticos mesentricos, donde
madurarn a clulas plasmticas que
migrarn a la mucosa gstrica para pro-
ducir anticuerpos del tipo inmunoglobu-
lina A (IgA), especficos contra el
antgeno.
Uno de los primeros ejemplos de vacu-
nas en plantas los constituy, en 1990,
la expresin de una protena de superfi-
cie de Streptococcus mutans en tabaco
(Curtiss y Cardineau, 1990). La inclusin
de estas plantas de tabaco en la dieta de
ratones, demostr que efectivamente
138
BIOTECNOLOGA VEGETAL
estos produjeron IgA anti-S. mutans,
aunque los animales vacunados no se
sometieron a experimentos de desafo
con la bacteria. Posteriormente, han
existido algunos ejemplos, siendo la ex-
presin de molculas llamadas antgenos
de superficie correspondientes al virus
de la hepatitis B, uno de los ms recu-
rrentes (Richter et al., 2000). Los prime-
ros experimentos con este patgeno ex-
presando estos antgenos en papas, mos-
traron una dbil respuesta inmune en ra-
tones alimentados con tubrculos crudos
de papas transgnicas. Sin embargo, es-
tos resultados han mejorado reciente-
mente, cuando en el ao 2001, se trans-
form papas con un plasmidio binario
multicomponente, es decir, que conte-
na los cassettes de expresin para dos
antgenos de la toxina del clera
(antgenos de las toxinas B y A2), un
antgeno de la enterotoxina fimbrial de
E. coli enterotoxignico y un antgeno
de la enterotoxina de rotavirus (Yu y
Langridge, 2001). Los ratones alimenta-
dos con los tubrculos de estas papas,
mostraron inducir no slo buenos nive-
les de IgA y recuperarse ms rpido de
los efectos de la exposicin a rotavirus,
sino tambin, ser capaces de presentar
una respuesta inmune ms generalizada
mediante la sntesis de interleuquinas,
(molculas potenciadoras de la respues-
ta inmune celular). Interesantemente,
cuando una camada de ratones que se
aliment de leche de madres que fue-
ron alimentadas con estas papas, esta
progenie tambin mostr recuperarse
ms rpido de los efectos del rotavirus.
Hasta la fecha, los datos obtenidos en es-
te mbito no permiten observar un buen
grado de proteccin inmune, debido a
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS
que muchas veces el animal utilizado
como modelo no es susceptible al pat-
geno o porque las normativas de mani-
pulacin de estos patgenos en el labo-
ratorio son tan estrictas, que no hacen f-
cil la instauracin en experimentos de
prueba.
Una de las principales preocupaciones
de los investigadores es cmo aumentar
la expresin de los genes utilizados
como determinantes antignicos en este
tipo de alimentos-vacuna. Esto ha dado
paso a la idea de modificar los genes o
secuencias nativas de los pptidos anti-
gnicos, generando genes sintticos ms
potentes en su expresin, debido a que
las modificaciones introducidas han au-
mentado su estabilidad, tanto en la plan-
ta como tras ser ingeridos por los ani-
males modelo (Richter et al., 2000). En
1997, se aprob la primera prueba bio-
lgica en humanos de una vacuna de
planta transgnica (Tacket y Mason,
1999). Esto consisti en utilizar como
alimento en un grupo de voluntarios,
papas que constitutivamente expresaban
una sub-unidad sinttica (modificada) de
la toxina B del E. coli enteropatgeno.
Cada uno de los 11 voluntarios recibi
como alimento, una mezcla de cubos de
papas transgnicas y no transformadas,
en una cantidad de entre 50 y 100 gra-
mos de papa cruda. En 10 de los 11 parti-
cipantes hubo un aumento en anticuer-
pos anti-toxina B. Esta respuesta inmu-
ne fue similar a la observada cuando a
una persona se le desafa con un milln
de bacterias E. coli enterotoxignicos. A
la fecha, se estn desarrollando ensayos
similares de evaluacin en humanos,
para vacunas orales contra la hepatitis
B (Walmsley y Arntzen, 2000).
c) Plantas como productoras de pro-
ductos biofarmacuticos.
Los productos biofarmacuticos (insulina,
eritropoyetina, hormona de crecimiento,
etc.), histricamente se han obtenido a
travs de organismos genticamente mo-
dificados, utilizando para ello bacterias,
levaduras y clulas mamferas en cultivo
(Ganz, 1996; Pen, 1996; Ma y Vine,
1999). Sin duda que la demanda crecien-
te de este tipo de compuestos genera un
punto de colapso en trminos de suplir
la necesidad por ellos, repercutiendo esto
en el costo que los pacientes deben so-
portar por sus tratamientos. La produc-
cin de protenas con capacidad terapu-
tica en plantas, se vislumbra como una
posibilidad real, de costos realmente in-
feriores a los de los actuales sistemas de
produccin y generadora de productos
libres de contaminantes patgenos
(Kusnadi et al., 1997).
Dos aproximaciones de transformacin
de plantas se utilizan comnmente en
los sistemas de produccin de biofarma-
cuticos en plantas: a) la ya conocida y
detallada transformacin por A. tumefa-
ciens o biobalstica y b) la utilizacin
de virus vegetales recombinantes (Della-
Cioppa y Grill, 1999). En el ltimo caso,
la estrategia consiste en utilizar virus que
infectan plantas y de los que se conoce
completamente su genoma y funciona-
miento molecular in vivo. As, se pue-
den reemplazar partes prescindibles del
genoma de estos virus por los casset-
tes de expresin del pptido con activi-
dad farmacutica. Con esto, slo basta-
r la infeccin con este virus recombi-
nante para que dicho pptido sea pro-
ducido in planta. Desafortunadamente,
139

el uso de virus recombinantes se limita
al conocimiento biolgico del virus uti-
lizado y a su rango de hospederos, lo
que ha limitado mucho su utilizacin
masiva. De esta forma, los virus ms co-
rrientemente utilizados son el virus del
mosaico del tabaco (Kumagai et al.,
1993) y el virus del mosaico de la haba
(Brennan, 1999). Ejemplos en donde se
han utilizado plantas infectadas con vi-
rus recombinantes son tabaco y tomates
que expresan el pptido inhibidor de la
enzima convertidora de angiotensina-1
(Hamamoto et al., 1993) y el pptido
inhibidor de la replicacin viral del vi-
rus de la inmunodeficiencia humana (a-
tricosantina) en la hierba Nicotiana
benthamiana (Kumagai et al., 1993).
Ejemplo de sistemas de investigacin en
donde se ha aplicado transformacin
gentica son la expresin de encefalinas
en canola (Brassica napus)(Godgjin y
Pen, 1995), interfern en arroz (God-
gjin y Pen, 1995), seroalbmina huma-
na en papa y tabaco (Godgjin y Pen,
1995), glucocerebrosidasa en tabaco
(Cramer et al., 1999) y factor estimulador
de colonias de granulocitos y macrfa-
gos en tabaco (Godgjin y Pen, 1995). En
1998 se comenzaron pruebas en huma-
nos para la utilizacin de arroz transg-
nico que expresa la protena -1-anti-
tripsina (Giddings et al., 2000); de gran
potencial teraputico en el tratamiento
de enfermedades hepticas, de hemorra-
gias y de fibrosis qustica. Otro ejemplo
de la utilizacin a una escala ms avan-
zada de esta estrategia proviene de la
expresin de hirudina, un compuesto na-
tural con actividad antitrombosis. Cano-
la y tabaco han sido los cultivos transg-
nicos utilizados para la expresin de este
140
BIOTECNOLOGA VEGETAL
pptido que, en sus fases iniciales mos-
tr problemas para su purificacin des-
de la planta (Chaudray et al., 1998). Sin
embargo, trabajos fusionando el gen de
hirudina a genes de oleosinas, compo-
nentes que habitualmente se encuentran
en los aceites de canola (Boothe et al.,
1997), han permitido soslayar estos pro-
blemas y ha permitido la siembra en
campos comerciales en Canad de es-
tos cultivos, para la produccin masiva
del compuesto antitrombtico (Boothe et
al., 1997).
TRANSFORMACIN
DE ORGANELOS
Una de las tcnicas de mayor proyec-
cin en la transformacin gentica ve-
getal es la transformacin especfica de
organelos, con especial relevancia la
ingeniera gentica de cloroplastos. Las
plantas transgnicas que poseen el
transgn insertado en el genoma cloro-
plstico se denominan plantas transplas-
tmicas (Bogorad, 2000). La ventaja de
este tipo de alternativas en la transfor-
macin de plantas reside en que sta es
precisamente una de las formas de eli-
minar el fenmeno denominado flujo
gnico entre cultivos genticamente
modificados y parientes silvestres o cul-
tivados. As, la produccin de plantas
transplastmicas es de gran inters en es-
pecies con alto potencial de cruzamien-
to con- e inter-especfico. Del mismo
modo, el flujo de polen y su efecto no
deseado frente a insectos no blanco, por
ejemplo en el caso de los cultivos Bt, es
tambin eliminado utilizando este tipo
de estrategia (Daniell, 2002). Estas ven-
tajas provienen del hecho de que, aun-
que el polen de algunas pocas plantas
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS
pueda contener plastidios metabli-
camente activos, el DNA de estos es
perdido durante su proceso de madura-
cin, impidiendo su transmisin a la
prxima generacin de plantas. A ma-
nera de ejemplo, se ha visto que an
cuando plantas transplastmicas para el
gen cry llegaron a poseer un 47% de
protena CRY del total de protenas so-
lubles, sta no se encontr en el polen
de estas plantas (De Cosa, 2001).
La transformacin de cloroplastos tiene
su base en un proceso totalmente dis-
tinto a la recombinacin ilcita que ex-
plotan los plasmidios binarios: la recom-
binacin homloga (ver Figura 6.5).
Como se mencion, la recombinacin
homloga es un sistema normal de las
plantas, mediante el cual secuencias que
son idnticas entre s son recombinadas,
generando el reemplazo de una hebra
de DNA por otra idntica, con el fin de
reparar hebras daadas de DNA o de
generar simplemente variabilidad
gentica. Para procurar recombinacin
homloga en el cloroplasto, entonces,
se debe tener conocimiento del genoma
en dnde se desea insertar el o los cas-
settes de expresin de los genes de in-
ters. De esta forma, los plasmidios uti-
lizados en la transformacin de cloro-
plastos no tienen los elementos descri-
tos anteriormente para los plasmidios
binarios desde el punto de vista de los
bordes T, sino que, en adicin a los cas-
settes normales de expresin, poseen
segmentos bastante significativos (des-
de 400 pares de bases a varios kilobases)
de genes plastidiales, los que al ser ho-
mlogos al genoma cloroplstico, son
reconocidos por las maquinarias inter-
nas de recombinacin y reparacin del
DNA en la clula de la planta, llevando
a la insercin de los cassettes de inte-
rs entre dichas secuencias, pero en el
genoma plastidial (Lamtham y Day,
2000).
El tamao de los genomas plastidiales
vara entre 120 y 160 kilobases y codifi-
ca para los genes involucrados en la man-
tencin del propio plstido y en la foto-
sntesis. Adems de su rol en la fotosn-
tesis, los plastidios sirven como compar-
timentos para la biosntesis de amino-
cidos y lpidos, siendo la mayora o to-
dos los genes involucrados, sintetizados
en el ncleo (Gray et al., 2003).
Como en una clula vegetal existen mu-
chos cloroplastos, los sistemas de selec-
cin deben propiciar la obtencin de
clulas con todos sus plastidios transfor-
mados. Para esto, los sistemas de selec-
cin deben tambin estar dirigidos al
cloroplasto. Inicialmente, la seleccin
de plantas transplastmicas utiliz una
mutante en el RNA ribosomal 16S, que
no una el antibitico espectinomicina
y as confera resistencia a ste (Daniell
et al., 1998). Posteriormente, se ha uti-
lizado el gen de la aminoglicsido 3-
adenil transferasa (aad), enzima que in-
activa este mismo antibitico mediante
la transferencia de la porcin adenil del
trifosfato de adenosina (ATP), hacia la
espectinomicina o su smil estreptomi-
cina (Daniell et al., 1998). Desafortuna-
damente, estos antibiticos tambin
controlan las infecciones bacterianas en
humanos y animales, por lo que la posi-
bilidad terica de transferencia de este
gen de resistencia hacia bacterias en los
tractos digestivos, aunque remota, est
abierta a discusin (Chambers et al.,
141

2002). Recientemente, se han desarro-
llado sistemas metablicos de seleccin,
como los descritos anteriormente para
eliminar el uso de genes reporteros que
confieren resistencia a antibiticos. En el
caso de la transformacin de plastidios,
se ha utilizado el gen de la enzima
betana-aldehdo deshidrogenasa (BADH)
de espinaca (Ratinasabapathi, 1994). Esta
enzima est presente slo en los
cloroplastos de un nmero muy reduci-
do de especies con alta resistencia a se-
quedad y salinidad, por lo que al intro-
ducirla en plantas transplastmicas, per-
mite la seleccin de plantas en medios
con el agente txico betana-aldehdo
(BA), las que gracias a la BADH, lo trans-
forman en glicina-betana, compuesto
que es adems, un reconocido metabolito
osmoprotector (Daniell et al., 1998;
Daniell et al., 2001).
Una caracterstica adicional observada
tras el uso de BADH-BA como sistema de
seleccin de plantas transplastmicas, es
la rpida regeneracin de los explantes
que lo utilizan. En lneas generales, se ha
visto que este sistema permite una rege-
neracin casi tres veces ms veloz que
el uso del sistema de antibiticos
espectinomicina-estreptomicina (Daniell
et al., 2001).
En teora, la seleccin utilizando BA se
muestra como una herramienta muy po-
derosa y de amplio espectro de aplica-
cin, siempre que los cultivos o espe-
cies a transformar no posean este siste-
ma expresado en muy altos niveles,
como por ejemplo la familia de las
Chenopodiaceae y Poaceae.
142
BIOTECNOLOGA VEGETAL
PERCEPCIN PBLICA
Sin duda que el avance de las nuevas
tecnologas es hoy en da de muy difcil
asimilacin para cualquier persona, aun-
que est sta vinculada a la ciencia. Esto
ha contribuido a ahondar la brecha en-
tre los cientficos y la persona comn
(Daniell, 1999). Sin embargo, no ha sido
difcil advertir que el debate sobre la
incorporacin y uso masivo de los cul-
tivos GM en el mundo, ha sido prefe-
rentemente controversial y manejado de
una forma visceral ms que tcnica y
con distintos intereses.
El mal manejo informativo causado por
la ausencia de una prensa especializa-
da, ha llevado a generar una gran canti-
dad de movimientos pblicos con cierta
orgnica, conocidos como grupos ver-
des o ecologistas. Aqu, podemos dis-
tinguir varios estratos o tendencias, b-
sicamente agrupables en dos: a) aque-
llos que buscan alcanzar una moratoria
el desarrollo de cultivos GM hasta que
los hechos tcnicos demuestren una to-
tal certeza de su seguridad y b) aquellos
grupos que quieren incluso detener su
desarrollo, bajo este mismo argumento
de riesgo cero.
Dentro del grupo reivindicativo de un
mayor anlisis de los cultivos GM y sus
productos alimenticios derivados de
ellos, encontramos el uso de argumen-
taciones como que la tecnologa es
mala, ejemplificndose con accidentes
tecnolgicos histricos como el efecto
del uso del DDT y otros qumicos de la
revolucin verde, de la talidomida, del
asbesto o de las dioxinas. Yendo ms
all, se incluyen ejemplos como los ac-
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS
cidentes nucleares de Chernobyl y Three
Miles Island. En una forma an ms re-
currente y preocupante, se ha utilizado
el desconocimiento de una sociedad
sobre sistemas o procesos biolgicos que
efectivamente pueden deber su origen a
deficiencias en el marco regulatorio de
las nuevas tecnologas, como lo son la
encefalopata espongiforme bovina (co-
mnmente llamado mal de las vacas lo-
cas) y la enfermedad de Kreutzfel-Jacobs
(enfermedad neurodegenerativa debida
a priones) o las dioxinas en el ambiente
y los alimentos. Sin duda, en ninguno
de estos ejemplos citados, existi un cul-
tivo GM involucrado, ni tampoco un ali-
mento derivado de ellos.
La misma falta de prensa cientfica, ha
contribuido enormemente a la agrupa-
cin de este tipo de organismos gen-
ticamente modificados (conocidos aho-
ra como OGMs) y alimentos derivados
de ellos, bajo nombres o denominacio-
nes que muchas veces pueden dar paso
a la discriminacin comercial, siendo
sta la verdadera razn por la que se
debe estudiar en detalle una poltica de
rotulado que incluya un anlisis deteni-
do en los requisitos de dicha etiqueta.
Por ejemplo, adems de llamrseles ali-
mentos transgnicos, muchas publica-
ciones se refieren a alimentos biotec-
nolgicos, aunque vale la pena recal-
car que los OGMs no han cambiado (sal-
vo casos ex profeso, como la produccin
de una vitamina C por microorganismos
modificados o la misma insulina, sin ser
este un alimento) las tecnologas de pro-
duccin de alimentos. Otras denomina-
ciones son las de alimentos genti-
camente modificados, bioproductos,
alimentos modificados mediante inge-
niera gentica, alimentos recombi-
nantes y alimentos obtenidos mediante
la biotecnologa (este ltimo emplea-
do en el Codex Alimentarius). Aqu, es
necesario decir que la ingeniera gen-
tica, la tecnologa del DNA recombi-
nante y sus distintas etapas, no consti-
tuyen por s solas, metodologas para el
desarrollo de alimentos y por lo tanto,
mal pueden producirlos. Como se men-
cion, este punto es de vital importan-
cia a la hora de la presentacin de los
diferentes productos al consumidor final,
sea este un mercado de un pas determi-
nado o una persona enfrentada a los
anaqueles de un supermercado nacional.
Es adems y sin ninguna duda, un punto
neurlgico del etiquetado que se les dar
a estos nuevos productos, donde se de-
bera compatibilizar el nivel de conoci-
miento real del consumidor y el tipo de
informacin que se le entrega. Ante esto,
surge el cuestionamiento sobre qu tan
urgente debe ser una poltica de rotula-
do en nuestro pas, si no existe una so-
ciedad con un conocimiento adecuado
del tema.
1. Factores a tener en cuenta
en el Marco Regulatorio Nacional
aplicable a los OGMs.
En virtud de la complejidad del tema,
de los mbitos involucrados y de los sec-
tores afectados (positiva y negativamen-
te), un marco regulatorio nacional para
los OGMs debe armonizar los requeri-
mientos y normas impuestos por los tres
componentes involucrados en su gene-
racin: a) Ministerio de Agricultura, b)
Ministerio de Salud y c) Ministerio de
Economa. No parece razonable la ge-
neracin de un marco regulatorio eficaz
y contingente excluyendo a alguno de
estos tres actores.
143

En trminos generales, la normativa de-
biera considerar aspectos intrnsecos del
alimento u OGM (segn corresponda)
tales como: el tipo de alimento, modifi-
cacin gentica del OGM y tecnologas
de procesamiento de las materias primas
utilizadas. Tambin debieran tenerse en
cuenta aspectos tcnicos contingentes;
vale decir, debe ser un reglamento pro-
activo que considere los cambios en los
conocimientos sobre la ciencia y tecno-
loga de los alimentos, tipo de informa-
cin al consumidor, percepcin pbli-
ca, posible manejo con identidad pre-
servada y reales objetivos mayores de la
salud pblica. El tipo de informacin al
consumidor debera generar la posibili-
dad de evaluar correctamente, compa-
rar y decidir sobre su opcin por un ali-
mento transgnico.
En la actualidad, los principios genera-
les se basan esencialmente en la aplica-
cin del Enfoque Precautorio y en la
Evaluacin de Riesgo Previa del OGM.
El Enfoque Precautorio se basa en un
marco regulatorio que necesariamente
va acompaado de la generacin de
nuevo conocimiento, siendo proactivo,
aplicando dudas razonables y significa
que ante la ausencia de fundamentos
cientficos completos, no se acepta el
riesgo o no se puede evaluar. Esto im-
plica una bsqueda de informacin
faltante en plazos de tiempo razonables.
Aqu resulta de gran importancia el he-
cho de que argumentos tcnicos dbiles
no sean utilizados como barreras al co-
mercio. Esto ltimo ha representado la
constitucin de ejes de opinin diver-
gentes incluso entre distintas agrupacio-
nes de pases.
144
BIOTECNOLOGA VEGETAL
La Evaluacin de Riesgo Previa del OGM,
implica un anlisis del impacto ambien-
tal, un anlisis de seguridad para los
operadores, un planteamiento ante el
consumo furtivo y el escalamiento en
etapas de flexibilizacin (cadena labo-
ratorio-invernadero-campo de bioseguri-
dad, etc.). Un componente estratgico
de esta evaluacin, es la comprendida
por el anlisis cuantitativo y cualitativo
de Equivalencia Substancial del nuevo
alimento, en funcin de su similitud con
plantas no modificadas. El anlisis de
todos los aspectos en que el nuevo ali-
mento puede diferir del tradicional in-
cluye, por ejemplo: modificaciones en
el contenido de txicos y alergenos, toxi-
cidad y alergenicidad, estructura de los
componentes macromoleculares, diges-
tibilidad y metabolismo, biodisponibili-
dad de nutrientes y micronutrientes,
toxicidad aguda y crnica, formulacin
y ensayo de alimentos para animales y
necesidad de informacin para el con-
sumidor.
Al respecto, es necesario decir que un
an-lisis de equivalencia substancial no
es un parmetro de evaluacin masiva
aplicable por ejemplo, a embarques de
semillas rutinarios. As, el hecho de la
aprobacin de comercializacin para un
evento transgnico, presupone que ha
existido ya una rigurosa evaluacin de
riesgo previa, con su correspondiente y
detallado anlisis de equivalencia subs-
tancial, entre muchos otros.
2. Marco Regulatorio Internacional.
Desde 1970 muchos pases han instau-
rado marcos regulatorios oficiales para
el control de las diversas aplicaciones
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS
de la biotecnologa. De manera particu-
lar, los esfuerzos se han concentrado en
aspectos de seguridad de la aplicacin
de la tecnologa teniendo como sujetos
de impacto al hombre, los animales y el
medioambiente. Las Directrices de la
Unin Europea 219/90 y 220/90, cons-
tituyen un conjunto de normas para la
liberacin al medioambiente de OGMs.
Por el contrario, las agencias regulato-
rias de Estados Unidos (el ms grande
exportador de cultivos genticamente
modificados), consideran a estas nuevas
tcnicas de modificacin gentica como
una extensin de otros procesos biotec-
nolgicos. Esto es, que los nuevos pro-
ductos (plantas transgnicas) obtenidos
a travs de esta tecnologa, son evalua-
dos segn los mismos marcos regula-
torios de evaluacin de riesgos disea-
dos previamente. As, en Estados Unidos
existen tres agencias gubernamentales:
agricultura, salud y medioambiente, en-
cargadas conjuntamente de la regula-
cin, pruebas de campo y control del
uso de la tecnologa del DNA recombi-
nante. Los criterios utilizados por la Di-
rectriz Europea 220/90 y por la Agencia
de Agricultura y Salud Estadounidense,
en cuanto a salud humana y medioam-
biente, son bsicamente los mismos. Es-
tos difieren slo en que la agencia euro-
pea establece los requisitos a cumplir
por el aplicante para una liberacin a
campo; mientras que en EE.UU. los cri-
terios son bsicamente formulados por
el mismo generador del OGM, en acuer-
do con la agencia del estado.
De forma similar, en Sudamrica, pases
como Brasil y Argentina han implemen-
tado sistemas de trnsito, siembra y vi-
gilancia de material transgnico. En Ene-
ro de 1995, Brasil public la Ley 8.974
y el Decreto 1725/95, estableciendo el
Comit Tcnico Nacional de Bioseguri-
dad (CTNBio), agencia gubernamental
responsable de las regulaciones a cam-
po de plantas transgnicas y de la ela-
boracin de normas para el uso conte-
nido y la liberacin al medioambiente
de OGMs. El esqueleto normativo y fun-
cional brasileo es muy parecido al es-
quema europeo, pues considera el con-
trol de la tecnologa del DNA recombi-
nante en forma distinta de otros proce-
sos biolgicos. Sin embargo, desde el
punto de vista de los procedimientos de
inspeccin y evaluacin, Brasil sigue el
modelo implementado por EE.UU., en el
cual cada autorizacin es seguida por
una examinacin local crtica, para ase-
gurar que las principales medidas de
evaluacin de riesgo que presenta el
aplicante, sean llevadas a cabo correc-
tamente. Argentina define las condicio-
nes que deben reunir los OGMs para ser
liberados al medio en las Resoluciones
N 656 (de la SAGyP del 30 de Julio de
1992) y N 837 (de la SAGyP del 9 de
Septiembre de 1993). Estas Resoluciones
se suman a las normativas existentes en
materia de proteccin vegetal (Decreto
Ley de Defensa Sanitaria de la Produc-
cin Agrcola 6704/66), de semillas y
creaciones fitogenticas (Ley de Semi-
llas y Creaciones Fitogenticas 20247/
73) y de sanidad animal (Ley de Produc-
tos Veterinarios). De manera similar a
Brasil, la estrategia de Argentina se basa
en la aprobacin para liberacin a cam-
po, esencialmente de los mismos even-
tos transgnicos que estn siendo apro-
bados en Europa, de manera de no afec-
tar su fuerte posicin exportadora.
145

3. Situacin de Chile.
La legislacin sobre proteccin agrcola
se encuentra contenida en el Decreto
Ley N 3557 de 1980, en donde hay dis-
posiciones genricas que facultan al Ser-
vicio Agrcola y Ganadero (SAG), enti-
dad dependiente del Ministerio de Agri-
cultura, para dictar resoluciones espe-
cficas que establezcan requisitos, pro-
cedimientos y normas particulares para
la internacin y manejo del material
transgnico. La Resolucin Exenta 1927
de 1993, establece normas para la in-
ternacin de material vegetal transgni-
co de reproduccin a Chile, creando en
Octubre de 1993 el Comit Asesor para
la Liberacin de Organismos Transgni-
cos (CALT). Este comit est constituido
por representantes del Ministerio de
Agricultura y de Salud, de institutos de
investigacin agrcola y de varias uni-
versidades; tiene el carcter de comit
permanente y est facultado para incor-
porar, cuando las circunstancias as lo
aconsejen, a otros especialistas. La Pre-
sidencia y la Secretara Tcnica del CALT
son ejercidas por el Departamento de
Proteccin Agrcola del SAG.
En la actualidad, la Evaluacin de Ries-
go Previa es aplicada en Chile por el
CALT, la que se basa en un formulario
tipo Declaracin Jurada, completado por
el solicitante, sea este un importador o
el obtentor de un cultivo GM. En este
formulario se vierte una completa des-
cripcin a nivel botnico, agronmico
y molecular de los diversos componen-
tes del nuevo cultivo. Tambin se inclu-
yen todos los ensayos y evaluaciones
tcnicas realizadas al cultivo en el pas
de origen. De esta forma, todo el mate-
146
BIOTECNOLOGA VEGETAL
rial GM ingresado al pas debe hacerlo
bajo las premisas de: a) cada internacin
de material transgnico debe ser previa-
mente autorizada por el Departamento
de Proteccin Agrcola del SAG, b) slo
se autorizar la internacin del material
vegetal transgnico cuyo objetivo sea la
multiplicacin para ser reexportado (es
decir, slo semillas para multiplicacin),
c) el material de internacin debe cum-
plir cuarentena, d) debe contar con in-
formes que acrediten que en liberacio-
nes a campo, en el pas de origen, el
material mostr ser inocuo al medio
ambiente y a la agricultura, e) se debe
presentar la solicitud de internacin en
la forma de la Declaracin Jurada ya
descrita, y e) la internacin slo podr
hacerse por el aeropuerto Comodoro
Arturo Merino Bentez, con el objeto de
facilitar el seguimiento del material.
Como se mencion, el CALT basa sus de-
cisiones en esta informacin, pero no
posee una capacidad de evaluacin in
situ del efecto o nivel de interaccin con
el medioambiente, la salud animal o la
salud humana. Sin embargo, podemos
decir que en Chile ya se est comenzan-
do la formacin de ncleos tcnicos para
el anlisis de la incorporacin e interac-
cin de cultivos GM con la flora nativa,
es decir, la formacin de centros de es-
tudios de bioseguridad y de personal con
conocimiento en el rea, con participa-
cin de personal del Instituto de Inves-
tigaciones Agropecuarias y del SAG.
Desde la dcada de 1990, Chile comen-
z su incursin tcnica en el desarrollo
de plantas GM, debido a esto, el CALT
dict una nueva resolucin, la Resolu-
cin 1523 de 2001, en donde los culti-
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS
vos GM desarrollados en el pas se so-
meten a las mismas normas que rigen
para los cultivos GM desarrollados fue-
ra del pas e importados. Esto obliga a
todo nuevo material transgnico gene-
rado en el pas a someterse a las evalua-
ciones y regulaciones del CALT. Antes
de la publicacin de esta Resolucin,
slo se haca sometimiento voluntario de
los cultivos GM producidos en Chile,
como efectivamente sucedi con los
nicos dos trabajos realizados en esa
poca: papas resistentes a Erwinia
carotovora y melones resistentes al vi-
rus del mosaico de la sanda tipo II, el
primero desarrollado por investigadores
de la Pontificia Universidad Catlica de
Chile e INIA - La Platina y el segundo,
desarrollado ntegramente en INIA - La
Platina.
El 30 de Noviembre de 2000, se publi-
c en el Diario Oficial la creacin de
los Comits Asesores en Materias Am-
bientales Internacionales. Esto incluy el
Comit Asesor en Materias de Biosegu-
ridad. Este organismo, bsicamente con
centro de coordinacin en la Comisin
Nacional del Medio Ambiente (CONA-
MA), ejercer la articulacin de las dis-
tintas organizaciones nacionales ligadas
a la bioseguridad, incluyendo al CALT,
Ministerio de Relaciones Exteriores y a
la CONAMA misma. Bajo este marco, el
comit se plantea con una composicin
multisectorial de las instancias ya men-
cionadas, ms Aduanas y Ministerios de
Economa, Agricultura, Salud y Sub-Pes-
ca. La idea de esta instancia es, en base
a la pronta entrada en vigencia de acuer-
dos internacionales como el Protocolo de
Cartagena sobre Bioseguridad en Biotec-
nologa, generar en el pas todas las ca-
pacidades necesarias para el anlisis po-
ltico en base a informacin tcnica, pro-
cedente desde un Comit Asesor Tcni-
co, sobre el movimiento de material
genticamente modificado tanto en el
pas como a travs de sus fronteras.
4. Protocolo de Cartagena sobre
Bioseguridad en Biotecnologa.
El Protocolo de Cartagena sobre Biose-
guridad en Biotecnologa tiene sus ra-
ces en la Conferencia de las Naciones
Unidas de Medio Ambiente y Desarro-
llo, celebrada en 1992 en Ro de Janeiro.
Este Convenio acord tres reas primor-
diales: la conservacin de la biodiversi-
dad, el uso sustentable de sus compo-
nentes (plantas, microorganismos, ani-
males, cromosomas, genes, etc.) y el
equilibrio en la reparticin de los bene-
ficios de la utilizacin de los recursos
genticos.
El Protocolo representa un acuerdo le-
galmente vinculante, para proteger el
medioambiente de los eventuales ries-
gos que podra ocasional el movimiento
transfronterizo de organismos vivos mo-
dificados (OVMs). El objetivo es que los
pases tengan la oportunidad de realizar
el anlisis de riesgo que involucra la in-
ternacin de los productos obtenidos
mediante la biotecnologa moderna. De
esta forma, se persigue que cada pas
pueda tomar decisiones de manera in-
formada, con respecto a estos organis-
mos y sus contenedores (alimentos, gra-
nos, materias primas, etc.)
Este sistema de anlisis de riesgo nacio-
nal o local, fuerza a cada pas a generar
una capacidad tcnica especializada.
147

As, los gobiernos podrn indicar a la co-
munidad internacional si aceptan o re-
chazan las importaciones de commodi-
ties agropecuarios que incluyan OVMs,
mediante un conjunto de instancias co-
nocidas como Clearing House de Biose-
guridad. Esto es, la instauracin de una
red o sistema de informacin del cono-
cimiento cientfico, tcnico, medioam-
biental y legal, sobre los eventos de
OVMs en cuestin e implica tambin un
derecho a asistencia tcnica si hubiera
necesidad. Finalmente, con todos estos
antecedentes, los estados debern tomar
una decisin.
Para esto, los embarques con commodi-
ties con contenido de OVMs debern ser
identificados como tales y para otros ti-
pos de OVMs, como semillas y peces
que vayan a ser introducidos intencio-
nalmente al medioambiente, se aplica-
r un conjunto de etapas tcnicas deno-
minadas Acuerdo Fundamentado Previo
(AFP). El AFP prev la provisin de in-
formacin en forma detallada al Estado
del pas en donde se interna el OVM, en
una forma anterior al primer embarque.
As, con todos los antecedentes en
mano, el Estado importador deber res-
ponder a dicha aplicacin.
En todo caso, el Protocolo contiene en
su referencia bsica, el establecimiento
de un Enfoque Precautorio para el ma-
nejo de este tipo de importaciones. Esto
es, ante dudas razonables, lo aconseja-
ble es la abstencin.
Un poco de historia.
En conformidad con los artculos del
Convenio sobre la Biodiversidad Biol-
148
BIOTECNOLOGA VEGETAL
gica, se estableci un grupo de trabajo
ad hoc para el tema de bioseguridad.
Este grupo, con carcter de ampliable,
mantuvo seis reuniones entre Julio de
1996 y Febrero de 1999, producto de las
cuales se desarroll un borrador en el
que se incluy las mayores preocupacio-
nes de las partes participantes. Este tex-
to se discuti en lo que se llam la Pri-
mera Reunin Extraordinaria, desarrolla-
da a fines de Enero de 2000 en Montreal
(Canad). All se convino la adopcin de
un Protocolo de Bioseguridad dentro del
marco de la Convencin, que ya se ha-
ba escrito en Cartagena (Colombia), en
Febrero de 1999, pero que no se pudo
acordar su entrada en vigencia en esa
misma oportunidad.
La aprobacin del documento en Mon-
treal implic, dejar abierta la posibili-
dad de realizar modificaciones hasta su
entrada en vigor y a una ratificacin de
su firma por parte de los pases repre-
sentados. Para esto, existira una instan-
cia denominada Comit Interguberna-
mental para el Protocolo de Cartagena
sobre Bioseguridad (Intergovernmental
Comitee for the Cartagena Protocol,
ICCP), que ya se ha reunido en Montpe-
llier (Francia) en Diciembre de 2000, en
Nairobi (Kenia), en Octubre de 2001 y
en La Haya (Holanda), en Abril de 2002.
Las posturas de los distintos pases tras
estas reuniones, en forma muy sintti-
ca, es que existen dos agrupaciones:
Unin Europea ms frica y Pases
Exportadores (ex Grupo de Miami, del
cual Chile formaba parte). Una gran di-
ferencia entre estas dos posturas es que,
con respecto a los embarques de com-
modities, sean indiscutiblemente iden-
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS
tificables y trazables, en lo posible me-
diante una metodologa tcnica en co-
mn, siendo la postura ms estricta la
europea. Para los exportadores, el sello
de puede contener OVM sera sufi-
ciente. Tambin existen notorias diferen-
cias, an menos trabajadas que el pun-
to anterior, sobre los procesos adminis-
trativos o legales a seguir en cuanto al
cumplimiento de responsabilidades co-
munes, a la responsabilidad y formas de
compensacin que existira entre los
pases miembros, debido al movimiento
transfronterizo de estos productos.
En forma adicional, el Protocolo estable-
ce la generacin de redes de intercam-
bio de informacin y la generacin de
capacidad tcnica en cada uno de los
pases. Puntos que estn en distinto es-
tado de avance.
Finalmente, podemos decir que la posi-
cin chilena tras esta ltima ronda de
discusiones es mantener una equidistan-
cia de los dos bloques, en espera de defi-
nir internamente una poltica nacional
en materia de OVMs.
As, es necesario recalcar que el estado
de negociaciones internacionales, la po-
ltica interna y la percepcin pblica aqu
expuesta, representan slo una fotogra-
fa de un sinnmero de eventos que an
estn sucediendo, por lo que es proba-
ble que esta situacin ya sea obsoleta en
el momento de su lectura. Sin embargo,
pensamos que representa una buena for-
ma de informar el cun complejo y cmo
se han sucedido los hechos con respecto
a los OGMs (u OVMs), tanto en los pa-
ses ms directamente involucrados (pa-
ses desarrollados), como en Chile.
REFERENCIAS
Arakawa, T., Chong, D. y Langridge, W. 1998.
Efficacy of a food plant-based oral cholera
toxin B subunit vaccine. Nat. Biotechnol.
16:292-297.
Bogorad, L. 2000. Engineering chloroplasts: an
alternative site for foreign genes, proteins,
reactions, and products. Trends Biotechnol.
18:257-263.
Boothe, J., Parmenter, D. y Saponja, J. 1997.
Molecular farming in plants: oilseeds as
vehicles for the production of phar-
maceutical proteins. Drug Develop. Res.
42:172-181.
Brennan, F. 1999. Chimeric plant virus particles
administered nasally or orally induce
systemic and mucosal immune responses in
mice. J. Virol. 73:930-938.
Britt, A. 1996. DNA damage and repair in
plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.
Biol. 47:75-100.
Buchanan, B., Gruissem, W. y Jones, R. 2001.
Biochemistry & Molecular Biology of Plants.
John Wiley & Sons, Somerset, New Jersey,
USA.
Burkhardt, P., Beyer, P., Wnn, J., Klti, A.,
Armstrong, G., Schledz, M., von Lintig, J. y
Potrykus, I. 1997. Transgenic rice (Oriza
sativa) endosperm expressing daffodil
(Narcisus pseudonarcisus) phytoeno
synthase accumulates phytoene, a key
intermediate of provitamin A biosynthesis.
Plant J. 11:1071-1078.
Chambers, P., Duggan, P., Heritage, J. y Forbes,
J. 2002. The fate of antibiotic resistance
marker genes in transgenic plant feed ma-
terial fed to chickens. J. Antimicrob.
Chemother. 49:161-4.
Chua, N. y Sundaresan, V. 2000. Plant Bio-
technology. The ins and outs of a new green
revolution. Curr. Op. Biotech. 11:117-119.
149

Cramer, C., Boothe, J. y Oishi, K. 1999. Trans-
genic plants for therapeutic proteins: linking
upstream and downstream strategies. Curr.
Topics Microbiol. Immunol. 240:95-118.
Curtiss, R. y Cardineau, C. 1990. Oral immuni-
sation by transgenic plants. World Patent
Application WO 90/02484.
Dale, E., y Ow, D. 1991. Gene transfer with
subsequent removal of the selection gene
from the host genome. Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 88:10558-10562.
Daley, M., Knauf, V., Summerfely, K. y Turner, J.
1998. Co-transformation with one Agrobac-
terium tumefaciens strain containing two
binary plasmids as a method for producing
marker-free transgenic plants. Plant Cell Rep.
17:489-496.
Daniell, H. 1999. GM crops: public perception
and scientific solutions. Trends Plant Sci.
4:467-469.
Daniell, H. 2002. Molecular strategies for gene
containment in transgenic crops. Nat.
Biotechnol. 20:581-586.
Daniell, H., Datta, R., Varma, S., Gray, S. y Lee,
S. 1998. Containment of herbicide resistance
through genetic engineering of the chloro-
plast genome. Nat Biotechnol. 16:345-348.
Daniell, H., Wiebe, P. y Fernndez-San Milln,
A. 2001. Antibiotic-free chloroplast genetic
engineering an environmentally friendly
approach. Trends Plant Sci. 6:237-239.
De Cosa, B. 2001. Overexpression of Bt
Cry2Aa2 operon in chloroplast leads to
formation of insecticidal crystals. Nat.
Biotechnol. 19:71-74.
Della-Cioppa, G. y Grill, L. 1999. Production
of novel compounds in higher plants by
transfection with RNA viral vectors. pp.
777-783. In: Collins, G. y Sheperd, R. (eds.).
Engineering plants for commercial products
and applications. New York Academy
Sciences, New York, USA.
150
BIOTECNOLOGA VEGETAL
De Neve, M., De Buck, S., Jacobs, A., Van Monta-
gu, M. y Depicker, A. 1997. T-DNA integration
pattenrs in co-transformed plant cells suggest
that T-DNA repeats originate from co-inte-
gration of separate T-DNA. Plant J. 11:15-29.
Denis, M., Delourme, R., Gourret, J., Mariani,
C. y Renard, M. 1993. Expression of enginee-
red nuclear male sterility in Brassica napus.
Genetics, morphology, cytology, and sensiti-
vity to temperature. Plant Physiol. 10:1295-
1304.
Ebinuma, H., Sugita, K., Matsunaga, E., Endo,
S., Yamada, K. y Komanine, A. 2001. Systems
for the removal of a selection marker and
their combination with a positive marker.
Plant Cell Rep. 20:383-392.
Endo, S., Sugita, K., Sakai, M., Tanaka, H. y
Ebinuma, H. 2002. Single-step transformation
for generating marker-free transgenic rice
using the ipt-type MAT vector system. Plant J.
30:115-122.
Fedorof, N. 1989. Maize transposable elements.
pp 375-411. In: Berg, D. y Howe, M. (eds.).
Mobile DNA. Am. Soc. Microbiol., Washing-
ton, D.C., USA.
Ganz, P. 1996. Expression of human blood
proteins in transgenic plants: the citokine
GM-CSF as a model protein. pp. 149-167.
In: Owen, R. y Pen, J. (eds.). Transgenic
plants: a production system for industrial
and pharmaceutical proteins. John Wiley &
Sons, London, England.
Gardner, J. y Nash, A. 1986. Role of Escherichia
coli IHF protein in lambda site specific
recombination. J. Mol. Biol. 191:181-189.
Gelvin, S. 1998. Agrobacterium VirE2 proteins
can form a complex with T strands in the
plant citoplasm. J. Bacteriol. 180:4300-4302.
Gelvin, S. 2000. Agrobacterium and plant
genes involved in T-DNA transfer and
integration. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant
Mol. Biol. 51:223-256.
Giddings, G., Allison, G., Brooks, D. y Carter, A. 2000.
Transgenic plants as factories for biopharma-
ceuticals. Nature Biotechnol. 18:1151-1155.
TRANSFORMACIN GENTICA DE PLANTAS
Goddjin, O. y Pen, J. 1995. Plants as bioreactor.
Trends Biotechnol. 13:379-387.
Goldsbrough, A., Lasterella, C. y Yoder, J. 1993.
Transposition mediated re-positioning and
subsequent elimination of marker genes
from transgenic tomato. Biotechnology
11:1286-1292.
Gray, J., Sullivan, J., Wang, J., Jerome, C. y
MacLean, D. 2003. Coordination of plastid
and nuclear gene expression. Philos. Trans.
R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358:135-44.
Hamamoto, H., Sugiyama, Y., Nakagawa, N.,
Hashida, E., Matsunaga, Y., Takemoto, S.,
Watanabe, Y. y Okada, Y. 1993. A new tobacco
mosaic virus vector and its use for the systemic
production of angiotensin-I-converting
enzyme inhibitor in transgenic tobacco and
tomato. Biotechnology 11:930-932.
Haq, T., Mason, H., Clements, J. y Arntzen, C.
1995. Oral immunization with a recom-
binant bacterial antigen produced in
transgenic plants. Science 268:714-716.
Lamtham, S. y Day, A. 2000. Removal of anti-
biotic resistance genes from transgenic toba-
cco plastids. Nat. Biotechnol. 18:1172-1176.
James, C. 1998. Global Status of commercialized
transgenic crops: 1998. International Service
for the Acquisition of Agribiotech Appli-
cations, Ithaca N.Y., USA ISAAA Briefs No.
8. http://www.biotech-info.net/global_re-
view.html
James, C. (2000). Global Status of commercia-
lized transgenic crops: 2000. International
Service for the Acquisition of Agribiotech
Applications, Ithaca, N.Y., USA ISAAA Briefs
N o . 21. http://www.biotech-info.net/glo-
bal_status_2000.html
Kiyokawa, S., Kobayashi, K., Kikuchi, Y., Kamada,
H. y Harada, H. 1994. Root-inducing region
of mikimopine type Ri plasmid pRi724. Plant
Physiol. 104:801.802.
Komari, T., Hiei, Y., Saito, Y., Murai, N. y Kuma-
shiro, T. 1996. Vectors carring two separate
T-DNAs for co-transformation of higher plants
mediated by Agrobacterium tumefaciens and
segregation of transformants free from
selection markers. The Plant J. 10:165-174.
Kumagai, M., Turpen, T., Weinzettl, N., Della-
Cioppa, G., Turpen, A., Donson, J., Hilf, M.,
Grantham, G., Dawson, W., Chow, T.,
Piatak, M. y Grill, L. 1993. Rapid, high-level
expression of biologically active alpha-
trichosanthin in transfected plants by an
RNA viral vector. Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 90:427-30.
Kunkel, T., Niu, Q. Can, Y. y Chua, N. 1999.
Inducible isopentenil transferase as high-
eficiency marker for plant transformation.
Nat. Biotechnol. 17:916-919.
Kusnadi, A., Nikolov, Z. y Howard, J. 1997.
Production of recombinant proteins in
transgenic plants: pracical considerations.
Biotechnol. Bioeng. 56:473-484.
Ma, J. y Vine, N. 1999. Plant expression systems
for the production of vaccines. Curr. Opin.
Topics Microbiol. Immunol. 236:275-292.
Mysore, K., Bassumer, B., Deng, X., Darbinian, N.,
Motchoulski, A., Ream, W. y Gelvin, S., 1998.
Role of Agrobacterium tumefaciens VirD2
protein in T-DNA transfer and integration. Mol.
Plant-Microbe Interact. 11:668-683.
Mysore, K., Nam, J. y Gelvin, S. 2000. An Arabi-
dopsis histone H2A mutant is deficient in
Agrobacterium T-DNA integration. Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) 97:948953.
Nam, J., Mysore, K. y Gelvin, S. 1998. Agrobac-
terium tumefaciens transformation of the
radiation hypersensitive Arabidopsis thaliana
mutants uvh1 and rad5. Mol. Plant Microbe
Interact. 11:1136-1141.
Odell, J., Caimi, P., Sauer, B. y Russel, S. 1990.
Site-directed recombination in the genome
of transgenic tobacco. Mol. Gen. Genet.
223:369-378.
Pen, J. 1996. Comparison of host systems for
the production of recombinant proteins. pp.
149-167. In: Owen, R. y Pen, J. (eds.).
Transgenic plants: a production system for
industrial and pharmaceutical proteins.
John Wiley & Sons, London, England.
151

Potrykus, I. 2001. Golden rice and beyond.
Plant Physiol. 125:1157-1161.
Prieto-Samsonov, D., Vazquez-Padron, R.,
Ayra-Pardo, C., Gonzalez-Cabrera, J. y Riva,
G. 1997. Bacillus thuringiensis: from
biodiversity to biotechnology. J. Ind.
Microbiol. Biotech. 19:202-219.
Rhoades, M. 1984. The early years of maize
genetics. Annu. Rev. Genet. 18:1-30.
Puchta, H. y Hohn, B. 1996. From centimorgan
to base pairs: homologous recombination
in plants. Trends Plant Sci. 1:340-348.
Ratinasabapathi, B. 1994. Metabolic engineering
of glycine betaine snythesis: plant betaine
aldehyde dehydrogenase lacking typical
transit peptides are targeted to tobacco
chloroplasts where they confer aldehyde
resistance. Planta 193:155-162.
Regensberg-Tuink, A. y Hooykaas, P. 1993.
Transgenic N. glauca plants expressing
bacterial virulence gene virF are converted
into hosts for nopaline strains of A.
tumefaciens. Nature 363:69-71.
Richter, L., Thanavala, Y., Arntzen, C. y Mason,
H. 2000. Production of hepatitis B surface
antigen in transgenic plants for oral
immunization. Nat. Biotech. 18:1167-1171.
Russel, S., Hoopes, J. y Odell, J. 1992. Directed
excision of a transgene from the plant
genome. Mol. Gen. Genet. 234:49-59.
Sen, P., Pazour, G., Anderson, D. y Das, A. 1989.
Cooperative binding of Agrobacterium
tumefaciens VirE2 protein to single-stranded
DNA. J. Bacteriol. 171:2573-2580.
Sommer, A. 1989. New imperatives for an old
vitamin (A). J. Nutr. 119:96-100.
Stachel, S. y Zambryski, P. 1986. virA and virG
control of the plant-induced activation of the
T-DNA transfer process of A. tumefaciens.
Cell 46:325-333.
152
BIOTECNOLOGA VEGETAL
Tacket, C. y Mason, H. 1999. A review of oral
vaccination with transgenic vegetables. Mi-
crobes and Infection 1:777-783.
Thanavala, Y., Yang, Y., Lyons, P., Malson, H. y
Arntzen, C. 1995. Immunogenicity of
transgenic plant-derived hepatitis B surface
antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
92:3358-3361.
Wabico, H., Kagaya, M., Kodama, I., Masuda,
K., Kodama, Y., Yamamoto, H., Shibano, Y.
y Sano, H. 1989. Isolation and characte-
rization of diverse nopaline type Ti plasmids
of Agrobacterium tumefaciens from Japan.
Arch. Microbiol. 152:119-124.
Walmsley, A. y Arntzen, C. 2000. Plants for
delivery of edible vaccines. Curr. Opinion
Biotechnol. 11:126-129.
Ward, E. y Barnes, W. 1988. VirD2 protein of
Agrobacterium tumefaciens very tightly
linked to the 5 end of T-strand DNA.
Science 242:927-930.
Ye, X., Al-Babili, S., Klti, A., Zhang, J., Lucca,
P., Beyer, P. y Potrykus, I. 2000. Engineering
the provitamin A (b-carotene) biosynthetic
pathway into (carotenoid-free) rice
endosperm. Science 287:303-305.
Yu, J. y Langridge, H. 2001. A plant-based
multicomponent vaccine protects mice
from enteric diseases. Nat. Biotechnol.
19:548-552.
Yusirov, V., Steck, T., Grupta, V. y Gelvin, S.
1994. Association of single-stranded
transferred DNA from Agrobacterium
tumefaciens with tobacco cells. Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA) 91:2994-2998.
Zubko, E., Scutt, C. y Meyer, P. 2000.
Intrachromosomal recombiantion between
attP regions as a tool to remove slectable
marker genes from tobacco transgenes. Nat.
Biotech. 18:442-445.
MARCADORES MOLECULARES
MARCADORES
MOLECULARES
INTRODUCCIN
L os marcadores moleculares son pro-
tenas o fragmentos del DNA que di-
ferencian a un ser de otro; a una especie
de otra. Estas diferencias eran tomadas
en otros tiempos, simplemente como las
encontradas en el mbito morfolgico (en
plantas: presencia de flores, tipo de ho-
jas, races, frutos, etc; en animales: pre-
sencia de antenas, pelos, color de los
ojos, etc.). Pero, Cmo eran distingui-
das dos especies con una similitud muy
grande? No se poda diferenciar. Esto es
ahora posible, gracias al uso de los mar-
cadores moleculares y al desarrollo de
tcnicas que permiten su anlisis.
Tipos de Marcadores Moleculares
Los primeros marcadores moleculares
conocidos y utilizados fueron las isoen-
zimas; por eso, son tambin conocidas
como marcadores bioqumicos. Estas
enzimas pueden presentar ms de una
forma pues, son constituidas por ms de
un tipo de cadena de polipptidos (pro-
tenas multimricas) o tambin se pue-
de decir, que corresponden a polppti-
dos diferentes con la misma funcionali-
dad. Estos marcadores pueden represen-
tar los dos alelos de los genes que cons-
tituyen las enzimas, llamndose por ello,
marcadores co-dominantes, al poder dis-
tinguir genticamente una especie con
expresin gnica en homocigosis o en
CAPTULO 7
M. Cristina Rocha C.
heterocigosis de estos genes. Como
ejemplos de este tipo de marcadores po-
dramos mencionar a las siguientes en-
zimas: aconitasa, adenilato quinasa, al-
cohol deshidrogenasa, glutamatoxalo-
acetato transaminasa, fosfoglucomutasa,
triosafofato isomerasa, leucina amino-
peptidasa, isocitrato deshidrogenasa,
shikimato deshidrogenasa y otras
(Ellstrand y Lee, 1987).
As, ahora pueden ser distinguidas espe-
cies que no podran diferenciarse por as-
pectos morfolgicos, pero que tenan di-
ferencias al nivel de las isoenzimas. Para
efectuar un ensayo con isoenzimas (Fi-
gura 7.1), es necesario extraer la prote-
na (enzima) del tejido que la contiene,
separarla en un gel a travs de una
electroforesis y finalmente, hacer una
reaccin enzimtica para distinguirla
por medio de la formacin de un produc-
to coloreado, en condiciones apropia-
das de pH y temperatura, pues como
buena enzima, esta molcula presenta-
r dichos requisitos para revelar su fun-
cin. En la Figura 7.2 se puede observar
que dos especies de Penaeus (conocidas
como gambas); se distinguien por un en-
sayo de actividad de la isoenzima
adenilato quinasa. Esto se realiza deter-
minando en un gel al que se ha adicio-
nado almidn. Este ensayo es relativa-
mente sencillo y de bajo costo, siendo
por ello empleado en diversos sistemas
animales y vegetales.
153

Extraccin de la enzima
del tejido apropiado
Anlisis de electroforesis
en gel de almidn
Figura 7.2. Anlisis de polimorfismo de la isoenzima
A B
(fotografa gentilmente cedida por Dr J.Gusmo, UFRJ)
Reaccin de la enzima con un sustrato
apropiado y revelado de actividad por
formacin de un producto coloreado
Figura 7.1 Esquema demostrativo de
las principales etapas para anlisis de
polimorfismos utilizando isoenzimas.
De esta forma, muchos estudios vincu-
lados con caracterizacin de plantas
anuales o perennes y tambin de anima-
les, se han basado en la utilizacin de
este tipo de marcadores, los que incluso
se utilizan hasta hoy (Ellstrand y Lee,
1987; Degani et al., 1990; Gusmo,
2000; Huamn et al.,2000; Gusmo,
2001;). Otra aplicacin del estudio con
isoenzimas, es identificar cambios
genticos producidos en plantas propa-
gadas in vitro (nuestro ya conocido tr-
mino variacin somaclonal). Ese ensa-
yo fue utilizado con este objetivo en
papas propagadas a travs de cultivo de
tejidos.
El principal problema con los marcado-
res bioqumicos es que representan so-
lamente unos pocos genes de todo el
genoma, existiendo casos en que no se
puede distinguir bien algunas especies
que son muy semejantes. Otro proble-
ma frecuente es que, en la preparacin
154
BIOTECNOLOGA VEGETAL
adenilato quinasa entre:
1 Penaeus subtilis M I; 2 P. subtilis M II.
(Gusmo, 2001).
de las muestras proteicas, se tiene que
partir de material vegetal exactamente
en el mismo estado de desarrollo fisio-
lgico, pues pueden haber diferencias
de expresin de las isoenzimas durante
distintas etapas. As, para que los ensa-
yos sean reproducibles, es necesario ob-
tener tejidos en la misma etapa del de-
sarrollo. Sin embargo, los marcadores
bioqumicos siguen siendo tiles, pues
algunas veces son marcadores prximos
a genes importantes en programas de
mejoramiento. Por ejemplo, el gen de re-
sistencia del tomate al nemtodo Meloi-
dogyne incognita, se encuentra prximo
a un gen de una isoenzima de fosfatasa
cida y eso ayud en la seleccin de
plantas resistentes a ese nemtodo
(Medina-Filho, 1980).
Con el desarrollo de diversas herramien-
tas modernas de la biologa molecular
(Tecnologa del DNA recombinante, ca-
ptulo 5), aparecieron otras estrategias
para analizar marcadores moleculares.
Todas esas tcnicas permiten establecer
diferencias evaluando directamente el
material gentico contenido en la mo-
lecula del DNA. Una de esas tcnicas,
se basa en el corte del DNA genmico
MARCADORES MOLECULARES
con enzimas de restriccin seguida de
electroforesis en gel de agarosa, transfe-
rencia hacia un filtro de nylon, hibri-
dacin con fragmentos de genes cono-
cidos o no, marcados con radioactividad
seguida de autorradiografa (Figura 7.3)
(ver tambin Deteccin de clones re-
combinantes, capitulo 5). Esta tcnica
se llama Polimorfismo del Largo de Frag-
mentos de Restriccin (Restriction
Fragment Length Polymorphism - RFLP).
Adems de RFLP, tambin existen otras
metodologas que utilizan como base la
Reaccin en Cadena de la Polimerasa
(Polymerase Chain Reaction - PCR). Esas
otras tcnicas son conocidas como la del
DNA Polimrfico Amplificado al Azar
(Random Amplified Polymorphic DNA -
RAPD), Repeticiones de Secuencia Sim-
Corte del DNA
genmico
con enzima
de restriccin
Electroforesis en gel de agarosa
seguido de transferencia para
filtros de Nylon, hibridacin
con secuencias radioactivas y
autorradiografa (Southern blot)
A B C
Figura 7.3. Esquema demostrativo de las
principales etapas para anlisis de
polimorfismos por RFLP.
ple (Simple Sequence Repeats, SSR; tam-
bin conocida como microsatlites),
Repeticiones Inter Secuencia Simple
(Intersequence Simple Repeats, ISSR),
Secuencia Sitio Marcada (Site Tagged
Sequence, STS), Regiones Amplificadas
de Secuencias Caracterizadas (Sequence
Characterized Amplified Regions, SCAR)
y Polimorfismo del Largo de Fragmen-
tos Amplificados (Amplified Fragment
Length Polymorphism, AFLP). Adems
de stas, tambin tenemos las VNTR o
Repeticiones Adjacentes de Nmero Va-
riable (Variable Number of Tandem Re-
peats, tambin llamada de minisatlites).
Todas estas metodologas sern ms de-
talladas a continuacin.
El marcador RFLP, como se indic, tiene
como base el corte del DNA genmico
con una enzima de restriccin. En las di-
ferentes especies pueden ocurrir varia-
ciones genticas puntuales que hacen
variar el sitio de restriccin de una en-
zima. As, se pueden detectar diferen-
cias de tamao en fragmentos de restric-
cin relacionados a un gen o alelo. Esa
tcnica es empleada en pruebas diagns-
tico de enfermedades genticas (Griffiths
et al., 2001) o tambin en anlisis de di-
versidad gentica entre organismos (Liu
y Musial, 1995; Pruvost et al., 1998). Co-
mo los marcadores bioqumicos (isoenzi-
mas), el RFLP tambin es co-dominante,
pues distingue caracteres genticos en
homocigosis y heterocigosis. El costo de
un ensayo RFLP es superior al de las
isoenzimas, siendo tambin ms lento,
adems de demandar entrenamiento es-
pecializado. Como las isoenzimas, tie-
ne la desvantaja de solamente distinguir
variaciones especficas con relacin a
pocas secuencias gnicas. Adems, para
155

realizar el ensayo, es necesario conocer
la secuencia del gen para el anlisis u
obtener secuencias de DNA en una li-
brera genmica o de DNA complemen-
tario (cDNA) (Liu y Musial, 1995) (ver
tambin captulo 8). Una variacin de
esta tcnica utilizada hoy en da, es am-
plificar una secuencia de un gen y en-
seguida hacer digestin con enzima de
restriccin. Esa variacin del RFLP, lla-
mada RFLP/PCR, disminuye el costo del
anlisis, adems del tiempo para la ob-
tencin de los resultados (Gusmo,
2001).
La VNTR es una tcnica donde se hace
hibridacin del DNA genmico con se-
cuencias que son repetidas en el DNA.
La variabilidad encontrada en ese tipo
de marcador, ocurre probablemente por
errores de lectura de la DNA polimerasa
en la clula que no son corregidos (repli-
cation slippage). Tambin es llamada
tcnica de minisatlite y es utilizada
para elaborar fingerprints, que son va-
riables de especie en especie. Los finger-
prints son muy interesantes en el senti-
Desnaturalizacin de la cadena del DNA
Duplicacin
de la cadena
Figura 7.4. Diseo demostrativo de las principales
etapas de la reaccin en cadena de la polimerasa.
156
BIOTECNOLOGA VEGETAL
do de distinguir variedades para prote-
gerlas, como ocurre a travs de las pa-
tentes o registros de obtentor, segn sea
el pas (Sharon et al., 1995).
Marcadores Moleculares
con base en PCR
Antes de comentar las tcnicas de mar-
cadores moleculares que tienen como
base la PCR, es necesario explicar sta.
El PCR es una reaccin in vitro que imi-
ta la replicacin del DNA dentro de las
clulas. Para que ocurra la reaccin de
PCR son necesarias tres etapas funda-
mentales: desnaturalizacin del DNA,
hibridacin de un partidor y extensin
de la nueva cadena del DNA producien-
do dos molculas a partir de una (Figu-
ra 7.4). Esas etapas son repetidas en ci-
clos de 30 o 40 veces. En consecuen-
cia, se produce amplificacin de una se-
cuencia de DNA en progresin geomtri-
ca, que puede ser analizada en un gel
de agarosa teido con bromuro de etidio
(Figura 7.4). La etapa de desnaturaliza-
Hibridacin
del partidor
o primer
Extensin de la
nueva cadena por
la DNA polimerasa
(Taq polimerasa)
MARCADORES MOLECULARES
cin ocurre, en general, a la temperatura
de 92 o C o 95 o C; la etapa de hibridacin
del partidor es variable y depende de la
secuencia a amplificar. Los partidores (se
usan dos por reaccin) son oligonucle-
tidos de secuencia directa (uno) y com-
plementaria (el otro), a aquellas que
flanquean la zona que se quiere ampli-
ficar. El partidor o primer es muy im-
portante, pues es l quien ofrece una
conformacin en la cadena del DNA
desnaturalizada tal que la enzima DNA
polimerasa se acopla y empieza la ex-
tensin de la nueva cadena complemen-
taria.
Esa temperatura (de apareamiento) es
calculada a partir de la cantidad de ade-
nina, timina, guanina y citosina en la se-
cuencia del partidor. Recordemos que
los puentes de hidrgeno entre adenina
y timina y entre guanina y ciotosina, ge-
nerarn fuerzas distintas en la unin de
las cadenas complementarias, haciendo
importante la proporcin de las bases en
el partidor. Cuanto mayor es la tempe-
ratura para la hibridacin del partidor,
ms especfica es su asociacin al DNA
genmico, pudiendo variar entre 35 y
65-68 o C. Cuanto mayor la especificidad
del partidor, mayor es la reproducibili-
dad del ensayo. Y finalmente, la etapa
de extensin de la nueva cadena se da,
en general, a la temperatura de 72 oC.
Esa es la temperatura ptima de la DNA
polimerasa. Todo ese proceso es posible
in vitro gracias a la automatizacin y,
porque la DNA polimerasa utilizada en
l, es resistente a temperaturas altas, ta-
les como aquella de la etapa de
desnaturalizacin. Esta polimerasa fue
encontrada por primera vez en la bacte-
ria Thermus aquaticus y es conocida
como Taq polimerasa (tambin existen
variaciones como la Pfu y el fragmento
de Klenow). La PCR se realiza en equi-
pos que producen un cambio rpido de
temperatura, llamados termocicladores
(Rojo, 1999). Las tcnicas de marcado-
res moleculares que tienen como base
la PCR son: RAPD, Microsatlites, ISSR,
SCAR, STS y AFLP.
RAPD (Figura 7.5) utiliza como partidor
un nico oligonucletido de 10 bases ni-
trogenadas y de secuencia al azar (ines-
pecfica). Ese partidor har asociacin en
cualquier sitio de toda la cadena del DNA
genmico. Por no ser especfico, en el
RAPD suelen ocurrir problemas con la
repetitividad de los ensayos (reproduci-
bilidad). As, es necesario fijar muy bien
los parmetros del trabajo. La verdad, es
que pequeas diferencias de concentra-
cin de los reactivos en la reaccin, pue-
den alterar el resultado; incluso, pueden
ocurrir varaciones por la utilizacin de
diferentes termocicladores. Es la tcnica
ms difcil de reproducir entre los labo-
ratorios y por eso no es recomendada pa-
ra ensayos con objetivo de caracteriza-
cin molecular. Pese a esto, RAPD es la
tcnica de menor costo que tiene como
base la PCR. Adems de un fcil manejo,
detecta polimorfismos dominantes; esto
es, slo detecta estados orgnicos en
homocigosis. En la Figura 7.5 se puede
observar un anlisis en RAPD, donde se
encontr un fragmento marcador relacio-
nado a un gen de resistencia del Phase-
olus vulgaris al hongo Uromyces phaseoli
(Faleiro et al.,2000).
RAPD ya ha permitido muchsimos es-
tudios que van desde identificacin ge-
ntica, anlisis de diversidad, mapeo ge-
ntico en plantas anuales como arroz,
maz, soja (Ferreira y Grattapaglia,
157
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Figura 7.5. Productos de amplificacin en RAPD del DNA genmico de Phaseolus vulgaris
con el partidor OPF10 en gel de agarosa 1,2% teido con bromuro de etidio.
P1 y P2 corresponden a los parentales resistente y susceptible al hongo Uromyces phaseoli
respectivamente y F2 es una poblacin segregante de 27 plantas. M corresponde al
marcador de peso molecular (fago digerido com EcoRI, BamHI y HindIII.
La flecha indica el fragmento marcador relacionado al gen de resistencia.
Fotografa gentilmente cedida por el Dr. Fbio G. Faleiro, EMBRAPA Cerrados.

1998), forrajeras (Kazan et al., 1992) e
incluso en plantas forestales, como el
eucalipto (Grattapaglia y Sederoff, 1994,
Grattapaglia et al., 1995), frutales como
el mango, naranjo, chirimoya (Fang et
al., 1997; Ravishankar et al., 2000;
Ronning y Schnell, 1995; Schnell, 1993)
y nemtodos o microrganismos (Hahn et
al., 1994; Hayden et al., 1994). Otra
aplicacin para RAPD tambin es la de-
teccin de variaciones somaclonales en
plantas micropropagadas en cultivo de
tejidos, pues puede analizar posibles di-
ferencias inducidas genticamente que
pueden ocurrir durante la regeneracin
de las plantas en medio nutritivo (ver
tambin captulo 4).
Aunque RAPD no pueda detectar esta-
dos gnicos en heterocigosis, se puede
aadir informacin por medio del clo-
naje de una banda representativa en el
anlisis que, en seguida, es sometida al
corte con una enzima de restriccin. Si
esta banda contiene una secuencia de
nucletidos distinta entre dos o ms es-
pecies, se observar un patrn diferente
de fragmentos producidos por la accin
de la enzima. De esa manera entonces,
se consigue distinguir las diferentes es-
pecies. Otra alternativa es clonar el frag-
mento polimrfico y transformarlo en un
SCAR. As, el fragmento polimrfico se
estabiliza y se puede aadir informacin
al estudio, como por ejemplo su propie-
dad como carcter gentico en homo-
cigosis o heterocigosis, utilizndosele en
ensayos de RFLP (Fang et al., 1997). Es-
tas estrategias utilizan herramientas de
la tcnica del DNA recombinante, como
el clonamiento y la deteccin de clones
(ver tambin captulo 5).
Los microsatlites son secuencias repe-
tidas en el DNA genmico. Estos marca-
dores son muy polimrficos y pueden

158
MARCADORES MOLECULARES
ocurrir como secuencias perfectas, por
ejemplo (GA) 8 , (TTA) 9 o imperfectas,
como por ejemplo (TC) 4GAATGA(TC) 7 .
Esos marcadores son especficos para
cada especie, por lo cual se hace nece-
sario caracterizar esas secuencias para
cada caso especfico a estudiar. Lo an-
terior implica un costo muy alto. Para
caracterizar las secuencias microsat-
lites, es necesaria la construccin de una
librera genmica (ver captulo 8) y la
seleccin de colonias que contengan se-
cuencias homlogas a las posibles se-
cuencias de microsatlites ya caracteri-
zados (patrn semejante) (Figura 7.6). El
fragmento de DNA de las colonias se-
leccionadas debe ser secuenciado, la
secuencia evaluada y a partir de ellas,
son diseados partidores homlogos a
las zonas flanqueadoras de las posibles
secuencias repetitivas, que corresponde-
ran a los microsatlites encontrados.
Esos partidores deben ser probados en
una PCR. Para cada reaccin son utili-
zados dos partidores. El anlisis del PCR
se hace en geles de poliacrilamida tei-
dos con nitrato de plata o tambin se les
puede hacer en geles de agarosa tei-
dos con bromuro de etidio. El primer tipo
de anlisis tambin eleva mucho el cos-
to de la tcnica. Los microsatlites pro-
ducen polimorfismos del tipo co-domi-
nante, por lo tanto, reconocen expresin
gnica en homocigosis y heterocigosis.
Actualmente, esos marcadores son reco-
mendados principalmente para los en-
sayos de caracterizacin, pues son ellos
los que mejor reproducen resultados
entre los laboratorios de Europa (Jones
et al., 1997). Esos marcadores tambin
sirven para fingerprints y anlisis de di-
versidad gentica (Eiadthong et al.,
1999).
Construccin de
librera genmica
Seleccin de
colonias positivas
para secuencias
relacionadas con
microsatlites
(Hibridacin
en colonia)
Purificacin y secuenciacin
de las colonias
Anlisis de las secuencias y diseo
de partidores de las secuencias
flanqueadoras de microsatlites
Pruebas para seleccionar los mejores
partidores en PCR (polimrficos y
marcadores de carcter gentico)
Figura 7.6. Esquema demostrativo de las
principales etapas para obtencin de
microsatlites especficos.
El ISSR es semejante al microsatlite,
pero lo que se hace es producir un parti-
dor que amplifica la secuencia entre las
secuencias microsatlites. Esa tcnica es
patentada cuando se utiliza el extremo
5 (Deshpande et al., 2001).
La tcnica de STS es aquella que desde
el RFLP, permite clonar el fragmento
marcador (cuando no se conoce) y, a par-
tir de su secuencia, hacer diseos de par-
tidores especficos, para amplificar slo
esa secuencia. De la misma manera,
cuando es clonado un fragmento poli-
mrfico desde RAPD, y es secuenciado
para utilizacin en amplificacin PCR,
se produce un SCAR. Como se comen-
159
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

t, el SCAR estabiliza el fragmento mar- Ambas metodologas utilizan las tcni-

cador de RAPD y esa es una posibilidad cas del DNA recombiante ya menciona-
que puede disminuir la desventaja que das en el capitulo 5.
tiene RAPD con respecto a la repetitivi-
dad. SCAR permite tambin la utiliza- AFLP (Figura 7.7) es una herramienta
cin del fragmento clonado en anlisis donde tambin se emplea el corte del
RFLP y as, ese marcador puede ser eva- DNA genmico con enzimas de restric-
luado en expresin en homocigosis y cin. Pero, en este caso, se hace con dos
heterocigosis. STS y SCAR son herra- tipos de enzimas, una de corte infre-
mientas muy tiles en programas de me- cuente (por ejemplo EcoRI)y otra de cor-
joramiento (Deng et al., 1997; Fang et te frecuente (Msel). Despus de la diges-
al., 1997; Barbosa, 1998; Milach, 1998). tin, se hace ligacin de adaptadores pa-
5 GAATTC TTAA 3
3 CTTAAG AATT 5
Restriccin con EcoRI y Msel
AATTC T
G AAT
C TAC
GTTAA + G
Adaptador EcoRI Adaptador Adaptador Msel
CAATTC TTAC
GTTAAG AATG

Amplificacin con primers

selectivos
3 GTTAAG AATG 5

Con. 1 5 CAATTCC 1/4 de los fragmentos

2 5 CAATTCCG 1/16 de los fragmentos

3 5 CAATTCCGA 1/64 de los fragmentos

Nucletidos selectivos

3 GTTAAGGCT AATG 6
Primers 5 CAATTCCGA
con 3 Amplificacin
nucletidos
selectivos 3 GTTAAGGCT AATG 6
5 CAATTC G
G NO Amplificacin
A

Electroforesis desnaturalizante en acrilamida y

tincin con nitrato de plata

Figura 7.7. Esquema demostrativo de las principales etapas para anlisis AFLP.
El DNA genmico es digerido con las enzimas de restriccin EcoRI y MseI, reaccin a la que
se ligan los adaptadores - EcoRI y - MseI (azul y verde respectivamente). Luego de ligados, estos
mismos sitios sirven como zonas de anclaje para una serie de primers que amplificarn
selectivamente, segn el nucletido adicional a la secuencia del adaptador. Estos pueden ser
con +1 nucletido selectivo, +2 nucletidos o +3 nucletidos (bases en rojo), amplificndose
1/4, 1/16 1/64 de los fragmentos totales. Usualmente, se utiliza una reaccin de pre-amplifi-
cacin con primers +1 nucletido selectivo y luego, desde esta reaccin de PCR,
se reamplifica con primers +3 nucletidos selectivos. Finalmente, los productos
de PCR se resuelven en electroforesis en acrilamida y tincin con plata.

160
MARCADORES MOLECULARES

ra los dos tipos de enzima. Luego, la PCR
se hace en dos etapas que son selecti-
vas. La primera se hace utilizando parti-
dores de secuencia complementaria a
los adaptadores, pero con un nucletido
al azar. En la segunda etapa, se utilizan
partidores complementarios a los
adaptadores pero con dos nucletidos al
azar. Esas distintas etapas de amplifica-
cin son utilizadas para disminuir el
nmero de fragmentos amplificados y
poder resolverlos bien en un gel de
poliacrilamida. Asimismo, en el anlisis
AFLP se produce amplificacin de un
gran nmero de fragmentos. El anlisis
de los fragmentos amplificados se hace
en gel de poliacrilamida teido con plata
o tambin, se suele utilizar fluorescen-
cia y radioactividad (Figura 7.8). Igual-
mente tiene un costo alto, pero es la es-
trategia que produce ms polimorfismos.
Tiene gran potencial para ser utilizada
para producir fingerprints (Figura 7.8)
(Eiadthong et al., 2000; Faleiro et al., en
prensa). De la misma forma que algunas
anteriores, el polimorfismo producido
por AFLP slo analiza estados gnicos
en homocigosis (como RAPD) y tiene
como desventaja, ser una tcnica
patentada.
CARACTERSTICAS
DE LOS MARCADORES
MOLECULARES
Un marcador es evaluado por su capaci-
dad de producir polimorfismos (Conte-
nido de Informacin Polimrfica o PIC)
y Multiplex (nmero de bandas), que co-

Figura 7.8. Patrn de amplificacin AFLP separados

en gel de poliacrilamida y revelado con fluorescencia
obtenidos desde 23 plantas distintas de Theobroma cacao.
(Fotografa gentilmente cedida por el Dr. Fbio G. Faleiro, EMBRAPA Cerrados).

161

rresponde a la cantidad de loci analiza-
dos simultneamente. Esos dos parme-
tros deben ser los ms altos posibles y
representan el ndice del marcador. En
la Tabla 7.1 pueden ser observadas las
diferencias de PIC y Multiplex para los
principales marcadores.
Tabla 7.1.
Comparacin entre Diferentes Marcadores
Moleculares con respecto a la produccin de
informacin polimrfica y loci analizados*
Marcador/Tipo Multiplex
RAPD
RFLP
SSR
AFLP y ISSR
*
Informaciones obtenidas en el Curso Aplicao de
marcadores Moleculares em Programas de
Melhoramento Gentico Vegetal, Programa CABBIO /
CNPq, UFRGS, 2000.
En RAPD, se puede aumentar multiplex
utilizando geles de poliacrilamida y en
microsatlites, con muestras hechas en
geles de manera escalonada (utilizacin
de dos secuencias microsatlites que
producen fragmentos de distintos tama-
os). Adems de esas diferencias, hay
otras con respecto al tipo de ensayo,
deteccin, tiempo, etc., que estn resu-
midas en la Tabla 7.2.
Aspectos importantes al momento de
elegir un marcador son: objetivo del es-
tudio y disponibilidad tcnica y finan-
ciera del laboratorio. Es necesario saber
muy bien el objetivo que se quiere al-
canzar y el perodo de tiempo disponi-
ble para lograrlo, ya sea corto, mediano
o largo.
162
BIOTECNOLOGA VEGETAL
APLICACIONES DE LOS
MARCADORES MOLECULARES
En general, los marcadores moleculares son
utilizados en estudios de enfermedades
genticas, pruebas de paternidad/parentes-
co, tambin como herramientas en la se-
leccin de plantas o animales, en progra-
mas de mejoramiento (Barbosa, 1998;
Milach, 1998; Coutinho y Reginato, 2001;
Griffiths et al., 2001) y finalmente, en es-
tudios cuya finalidad es la caracterizacin
(taxonoma, evolucin, conservacin).
PIC
Aplicacin para estudios
de caracterizacin
Los parmetros ms importantes para uti-
lizar marcadores moleculares en la ca-
racterizacin son: novedad, distiguibili-
dad, homogeneidad y estabilidad. As, de-
ben ser capaces de demostrar pblicamen-
te un alto poder de discriminacin, no
deben presentar interaccin con el am-
biente, deben ser capaces de producir re-
sultados equivalentes entre distintos labo-
ratorios, deben permitir el clculo de dis-
tancias entre genotipos en forma consis-
tente con otros caracteres, como informa-
cin de pedigree. Preferentemente, debe
conocerse el control gentico de los
descriptos, y ser posible su localizacin
cromosmica. Adems, la metodologa de
anlisis de los perfiles generados, debe
ser capaz de traducirlos e interpretarlos.
Entre las principales tcnicas de marca-
dores moleculares, la ms adecuada a esos
parmetros es la de microsatlites. Actual-
mente, este tipo de estudio tiene un gran
impacto, pues son apuntadas como las he-
rramientas ms poderosas para identifica-
cin/caracterizacin de variedades, dan-
do soporte a la propiedad intelectual de
las mismas (Eiadthong et al., 1999).
MARCADORES MOLECULARES

Tabla 7.2. Comparacin entre los principales

marcadores (distintos aspectos)*

Marcador/ RAPD/ISSR RFLP SSR AFLP

Parmetro

Evaluacin Dominante Co-dominante Co-dominante Dominante

expresin
gnica

Ensayo PCR Southern blot PCR Digestin,

e hibridacin ligacin, PCR
Deteccin Gel agarosa o Hibridacin Gel de poliac Gel de
poliacrilamida (quimio- y nitrato de poliacrilamida y
teido con luminescencia, plata o nitrato de plata
bromuro de fluorescencia fluorescencia o fluorescencia
etidio o o radiactividad)
fluorescencia
Cantidad de 20-25 ng 2-20 mg 20-30 ng 0,5 ng
DNA utilizado
Tiempo 1 2 das 4 a 12 das 1 2 das 2 das
Relacin entre Bandas Homologa Se amplifica = RAPD
los genotipos homlogas = X sondas y detecta locus
movilidad
Especificidad No Si Si No
Nivel de Medio Medio Alto Medio
polimorfismo
Costo Bajo Alto Menor que Menor que
RFLP y mayor RFLP y mayor
que RAPD que RAPD y SSR
Patente No No No/ Si para Si
ISSR para el
extremo 5
*
Informaciones obtenidas en el Curso Aplicao de marcadores Moleculares em Programas de Melhoramento
Gentico Vegetal, Programa CABBIO / CNPq, UFRGS, 2000.

Aplicaciones de los marcadores redadas, mapeo comparativo entre dis-

moleculares en programas de
mejoramiento
En programas de mejoramiento, los mar-
cadores moleculares pueden ser utiliza-
dos con finalidad de identificacin de
individuos, anlisis de diversidad g-
nica, mapeo gentico, mapeo de carac-
tersticas cualitativas y cuantitativas he-
tintas especies, estudios de evolucin,
caracterizacin gentica de especies,
gentica de poblaciones y clonaje de
genes (Lee, 1995; Ferreira y Grattapa-
glia, 1998).
La identificacin de plantas puede ser
hecha por medio de VNTR, RAPD, SSR,
ISSR o AFLP. La aplicacin de marcado-

163

res moleculares para identificacin ge-
ntica, permite optimizacin de bancos
de germoplasma y colecciones nuclea-
res para programas de mejoramiento. Ese
tipo de anlisis asociado a evaluacin
en software adecuados, conduce a los
estudios de diversidad gentica que per-
miten al fitomejorador, una base para su
eleccin de individuos como progenito-
res, pues analiza la proximidad o diver-
gencia gentica de los progenitores top
cross del programa. De esa manera, el
fitomejorador puede optimizar los cru-
zamientos y alcanzar individuos hbri-
dos con caractersticas mejoradas en
tiempo ms corto.
El mapeo gentico es un estudio impor-
tante en programas de mejoramiento,
pues es necesario, en un momento dado,
saber en cual cromosoma est la carac-
terstica de inters y cmo sta segrega
en la poblacin (Ferreira y Grattapaglia,
1998). El mapeo gentico que se consi-
gue por medio de trabajos con marca-
dores moleculares (como veremos en el
captulo 8), tambin puede ser utilizado
para ubicar en el genoma de una planta
transgnica, el gen que otorg la carac-
terstica introducida a travs de la trans-
formacin.
La utilizacin de los marcadores mo-
leculares para mapeo de caractersticas
cuantitativas (Quantitative Trait Loci,
QTL), es extremadamente til. Rasgos
tales como resistencia a enfermedades
o produccin, son caractersticas que
dependen de ms de un gen y as son de
difcil evaluacin. Por eso, hacer selec-
cin asistida con marcadores molecula-
res para fragmentos relacionados con
QTL, tiene un gran impacto (Barbosa,
164
BIOTECNOLOGA VEGETAL
1998). Adems de eso, tambin se pue-
de hacer el mapeo de caractersticas
heredadas que sean cualitativas. En esos
casos, la tcnica de SCAR es muy til
para hacer seleccin asistida. La selec-
cin asistida fue sealada como una tc-
nica que disminuye el costo de un pro-
grama de mejoramiento (Deng et al.,
1997, Schneider et al., 1997, Yu et al.,
2000). La seleccin asistida puede tam-
bin ser utilizada para reconocimento de
individuos en una progenie que contie-
ne un gen introducido por transforma-
cin gentica de plantas.
Una tcnica asociada a los marcadores
moleculares que tambin es muy utili-
zada en programas de mejoramiento, es
el anlisis en grupos segregantes (Bulked
Segregant Analysis) (Michelmore et al.,
1991). Esa herramienta, ya permiti la
identificacin de genes o fragmentos
asociados a una caracterstica (Gusmo,
1997), como tambin fue utilizada en
estudios para encontrar fragmentos es-
pecficos entre diferentes especies, uti-
lizndose como tcnica de marcadores
moleculares, el RAPD (Grattapaglia et
al., 1992).
Los marcadores moleculares ya permitie-
ron el clonaje de un gran nmero de ge-
nes (Map-based cloning) (Wing et al.,
1994; Wang et al., 1999). As, la tcni-
ca de los marcadores moleculares pue-
de tambin relacionarse con las del DNA
recombinante y transformacin gentica
de plantas.
Es conveniente indicar que, el estudio
utilizando marcadores moleculares en
programas de mejoramiento con objeti-
vo de anlisis de diversidad gentica,
MARCADORES MOLECULARES
mapeo de caractersticas cualitativas o
cuantitativas o an mapeo gentico, ne-
cesita no slo conocimiento tcnico de
esas metodologas, sino que tambin co-
nocimiento para anlisis estadsticos en
las progenies analizada (mtodos biom-
tricos de evaluacin) y tambin de soft-
wares tales como SAS, NTSYS, Mapma-
ker, Mapmaker-QTL o Linkage.
Actualmente, en la era de la genmica,
los estudios de secuenciacin conducen
al conocimiento de diversas secuencias
gnicas nuevas. La caracterizacin de
nuevos genes, asociados a alguna carac-
terstica de inters, puede ser una herra-
mienta muy poderosa para dar soporte
a los programas de mejoramiento y es-
tn asociadas al anlisis con marcado-
res moleculares (ver Captulo 8). Por me-
dio del conocimiento de sus secuencias,
se pueden hacer diseos con partidores
especficos y as hacer amplificacin es-
pecfica de los genes ms importantes
que se quieren fijar en una poblacin y
analizar su segregacin en sta. An
ms. se puede estudiar su presencia ge-
ntica (homocigosis o heterocigosis). El
mapeo gentico de organismos utilizan-
do los marcadores moleculares, tambin
da soporte a los trabajos de secuen-
ciacin completa de genomas (Ferreira
y Grattapaglia, 1998).
REFERENCIAS.
Barbosa Neto, J. 1998. Seleo assistida por
marcadores moleculares. pp. 7585. In:
Marcadores moleculares em plantas. Ed.
Sandra Milach, Porto Alegre, RS, Brasil.
Coutinho, L. y Regitano, L. 2001. Uso de mar-
cadores moleculares na indstria animal.
biologia molecular aplicada produo
animal. pp. 12 24. In: Correia de Almeida
Regitano, L. y Lehmanm Coutinho, L. Min.
da Agricultura Pecuria e Abastecimento.
EMBRAPA Informao Tecnolgica.
Degani, C., El-Batsri, R. y Gazit, S. 1990.
Enzyme polymorphism in mango. J. Am.
Soc. Hort. Sci. 115:844-847.
Deng, Z., Huang, S., Xiao, S. y Gmitter, F. 1997.
Development and characterization of SCAR
markers linked to the citrus tristeza virus
resistance gene from Poncirus trifoliate.
Genome 40:697-704.
Deshpande, A., Apte, G., Bahulikar, R., Lagu,
M., Kulkarni, B., Suresh, H., Singh, N., Rao,
M., Gupta, V., Pant, A. y Ranjekar, P. 2001.
Genetic diversity across natural populations
of three montane plant species from the
Western Ghats, India revealed by intersimple
sequence repeats. Mol. Ecol. 10:2397-2408.
Eiadthong, W., Yonemori, K., Sugiura, A.,
Utsunomiya, N. y Subhadrabandhu, S.
1999. Identification of mango cultivars of
Thailand and evaluation of their genetic
variation using the amplified fragments by
simple sequence repeat-(SSR-) anchored
primers. Scientia Horticulturae 82:47-56.
Eiadthong, W., Yonemori, K., Kanzaki, S. y
Sugiura, A. 2000. Amplified Fragment
Length Polymorphisms analysis for studying
genectic relationships among Mangifera
species in Thailand. J. Am. Soc. Hort. Sci.
125:160-164.
Ellstrand, N. y Lee, J. 1987. Cultivar
identification of cherimoya (Annona
cherimola Mill.) using isozyme markers.
Scientia Horticulturae 32:25-31.
165

Faleiro, F., Lopes, U., Yamada, M., Pires, J.,
Bahia, R., Santos, R., Gomes, L., Arajo, I.,
Faleiro, A., Gramacho, K., Melo, G., Mon-
teiro, W., Valle, R. Caracterizao molecular
de variedades clonais de Theobroma cacao
L. recomendadas pelo CEPEC/CEPLAC com
base em marcadores RAPD, AFLP e
microsatlites. Agrotpica (en prensa).
Faleiro, F., Vinhadelli, W., Ragagnin, V., Corra,
R., Moreira, M. y Barros, E. 2000. RAPD mar-
kers linked to a block of genes conferring
rust resistance to the common bean. Gene-
tics and Molecular Biology 23:399-402.
Fang, D., Federici, C. y Roose, M. 1997. De-
velopment of molecular markers linked to
a gene controlling fruit acidity in citrus.
Genome 40: 841-849.
Ferreira, M. y Grattapaglia, D. 1998. Introduc-
cin al uso de marcadores moleculares en
el anlisis gentico. EMBRAPA-CENARGEN,
Braslia, D.F., Brasil. 220 p.
Gusmo, J. 1997. Determino de marcadores
moleculares de AFLP estreitamente asso-
ciados ao loco MER que confere a resistn-
cia s raas E1, E2 e E3 do fungo Melamp-
sora larici populina em Populus. Tesis de
Maestra, Inst. Biof. Carlos Chagas Filho, CCS,
UFRJ, Rio de Janeiro, Brasil. 143 p.
Gusmo, J., Lazoski, C. y Sol-Cava, A. 2000.
A new species of Penaeus (Crustacea:
Penaeidae) revealed by allozyme and
cytochrome oxidase I analyses. Marine
Biology 137:435-446.
Gusmo, J. 2001. Sistemtica molecular e
gentica populacional de espcies
brasileiras de camaro (Penaeus: Decapoda:
Penaei-dae). Tesis de Doctorado, Inst. De
Biologia, Depto de Gentica, UFRJ, Rio de
Janeiro. 120 p.
Grattapaglia, D., OMalley, D. y Sederoff, R.
1992. Multiple applications of RAPD mar-
kers to genetic analysis of Eucalyptus sp.
pp. 436-450. In: Proceedings of IUFRO
International Conference Breeding Tropi-
cal Trees Section 2.02-08. Cali, Colombia.
166
BIOTECNOLOGA VEGETAL
Grattapaglia, D. y Sederoff, R. 1994. Genetic
linkage maps of Eucalyptus grandis and
E.urophylla using a pseudo-testcross
strategy and RAPD markers. Genetics
137:1121-1137.
Grattapaglia, D., Bertolucci, F. y Sederoff, R.
1995. Genetic mapping of quantitative trait
loci controlling vegetative propagation in
Eucalyptus grandis and E.urophylla using a
pseudo-testcross mapping strategy and
RAPD markers. Theor. App. Genetics
90:933-947.
Griffiths, A., Gelbart, W., Miller, J. y Lewontin,
R. 2001. Aplicaes da tecnologia do DNA
recombinante Gentica Moderna. p. 309.
Guanabara Koogan S.A., Ro de Janeiro,
Brasil.
Hahn, M., Burrows, P., Gnanapragasam, N.,
Bridge, J., Vines, N. y Wright, D. 1994.
Molecular diversity among Radopholus
similis populations from Sri Lanka detected
by RAPD analysis. Fundamental Applied
Nematology 17:275-281.
Hayden, H., Pegg, K., Aitken, E. e Irwin, J.
1994. Genetic relationships as assessed by
molecular markers and cross-infection
among Strains of Collectotrichum
gloeosporioides. Australian Journal of
Botany 42:9-18.
Huamn, Z., Ortiz, R., Zhang, D. y Rodrguez,
F. 2000. Isozyme analysis of entire and core
collections of Solanum tuberosum subsp.
Andigena potato cultivars. Crop Science
40:273-276.
Jones, C., Edwards, K., Castaglione, S.,
Winfield, M., Sala, F., van de Wiel, C.,
Bredemeijer, G., Vosman, B., Matthes, M.,
Daly, A., Brettschneider, R., Bettini, P.,
Buiatti, M., Maestri, E., Malcevschi, A.,
Marmiroli, N., Aert, R., Volckaert, G., Rue-
da, J., Linacero, R., Vazquez, A. y Karp, A.
1997. Reproducibility testing of RAPD,
AFLP and SSR markers in plants by a
network of European laboratories.
Molecular Breeding 3:381-390.
MARCADORES MOLECULARES
Kazan, K., Manners, J. y Cameron, D. 1992.
Genetic relationships and variation in the
Stylosanthes guianensis species complex
assessed by random amplified polymorphic
DNA. Genome 36:43-50.
Lee, M. 1995. DNA Markers and Plant Breeding
Programs. Advances in Agronomy 55:265-
344.
Liu, C. y Musial, J. 1995. Restriction fragment
length polymorphism detected by cDNA and
genomic DNA clones in Stylosanthes.
Theoretical Applied Genetics 91:1210-1213.
Medina-Filho, H. 1980. Linkage of Aps-1, Mi
and other markers on chromosome 6,
Report. Tomato Genetics Cooperative
30:26-28.
Michelmore, R., Paran, I. y Kesseli, R. 1991.
Identification of markers linked to disease-
resistance genes by bulked segregant
analysis : a rapid method to detect markers
in specific genomic regions by using
segregating populations. Proc. Natl. Acad.
Sci. (U.S.A.) 88:9828-9832.
Milach, S. 1998. Principais tipos de marcado-
res moleculares e suas caractersticas Mar-
cadores moleculares em plantas. pp. 17-29.
Ed. Sandra Milach, Porto Alegre, RS, Brasil.
Pruvost, O., Couteau, A., Perrier, X. y Luisetti, J.
1998. Phenotypic diversity of Xanthomonas
sp. mangiferaeindicae. Journal of Applied
Microbiology 84:115-124.
Rojo, M. 1999. La reaccin en cadena de la
polimerasa Ingenera gentica y transfe-
rencia gnica. pp.85-99. Ediciones Pirmi-
de, S.A., Madrid, Espaa.
Ravishankar, K., Anand, L. y Dinesh, M. 2000.
Assessment of genetic relatedness among
mango cultivars of India using RAPD
markers. Journal of Horticultural Science
& Biotechnology 75:198-201.
Ronning, C. y Schnell, R. 1995. Using randomly
amplified polymorphic DNA (RAPD)
markers to identify Annona cultivars. J. Am.
Soc. Hort. Sci. 120:726-729.
Schnell, R. 1993. Genetic relationships among
Mangifera spp. Based on RAPD. Acta
Horticulturae 341:86-92.
Schneider, K., Brothers, M. y Kelly, J. 1997.
Marker-assisted selection to improve
drought resistance in common bean. Crop
Science 37:51-60.
Sharon, D., Adato, A., Mhameed, S. y Lavi, U.
1995. DNA fingerprints in plants using sim-
ple-sequence repeat and minisatellite
probes. HortScience 30:109-112.
Wang, Z., Yano, M., Yamanouchi, U., Iwamoto,
M., Monna, L., Hayasaka, H., Katayose, Y.
y Sasaki, T. 1999. The Pib gene for rice blast
resistance belongs to the nucleotide binding
and leucine-rich repeat class of plant
disease genes. Plant Journal 19:55-64.
Wing, R., Zhang, H. y Tanksley, S. 1994. Map-
based cloning in crop plants. Tomato as a
model system: I. Genetic and physical
mapping of jointless. Molecular Gene
Genetics 242:681-688.
Yu, K., Park, S. y Poysa, V. 2000. Marker-
assisted selection of common beans for
resistance to common bacterial blight:
efficacy and economics. Plant Breeding
119:411-415.
167
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

168
GENMICA
GENMICA
INTRODUCCIN
L a decodificacin de las secuencias
en que los nucletidos se ordenan
para dar origen a los diversos genomas,
constituye una de las contribuciones ms
espectaculares de los ltimos aos en el
mbito de la ciencia. Esto ha permitido
formular ya variadas teoras acerca de
las relaciones evolutivas de varias espe-
cies vivas, en las que obviamente, se in-
cluye la humana.
En 1965, trabajando con el tRNA de
alanina, Robert Holley (Holley, 1968) por
primera vez obtuvo la secuencia comple-
ta de un cido nucleico. l encontr que plado, la DNA pol ir incorporando
ste estaba constitudo por 76 bases, de
las cuales 10 de ellas estaban modifica-
das qumicamente. Sin embargo, la pro-
puesta de cdigo gentico para la traduc-
cin de secuencias nucleotdicas de
Marshall Nirenberg y Har Khorana, esta-
bleca que esta traduccin se realizaba
bajo la base de la lectura de grupos de
tres nucletidos, llamados codones, pero
adems reconoca la existencia de varios
codones para un mismo aminocido (co-
dones redundantes). As, el ordenamien-
to aminoacdico descubierto por Sanger
slo dio paso a la incgnita de la real
secuencia nucleotdica que deba tener
su gen.
En los aos 70, el mismo Sanger y el
equipo conformado por Alan Maxxam y
Walter Gilbert, implementaron en forma
CAPTULO 8
Humberto Prieto E.
paralela, distintas aproximaciones qu-
micas para acceder al conocimiento del
orden lineal de los nucletidos que con-
forman un gen. De este modo, surge el
mtodo de secuenciacin de los cidos
nucleicos, conocido como de la termi-
nacin de la cadena, utilizando anlo-
gos de los nucletidos que conforman
el DNA (Sanger et al., 1977).
La metodologa propuesta por Sanger, se
bas en trabajos preliminares propues-
tos por Kornberg en base a la replicacin
del DNA a partir de un molde (captulo
5). As, si se utiliza una cadena de
politiminas (poliT) como molde o tem-
adeninas como complemento a este
molde. Si recordamos, la adicin de re-
siduos en la hebra naciente del DNA es
mediante la generacin de un enlace
entre el grupo fosfato unido al C-5 del
grupo azcar del nuclesido entrante y
el OH- del C-3del grupo azcar del
nucletido previo (lo que se conoce
como direccin 5-3 de sntesis). Por lo
tanto, la existencia de este grupo OH-
en el C-3 de la nueva cadena de DNA
(cadena naciente), es fundamental para
la reaccin de polimerizacin. Precisa-
mente, Sanger predijo que si este grupo
OH- no existiera, la polimerizacin no
proseguira. De esta forma, si en vez de
situarse un nucletido con sus grupos
OH- en el C-3 en la cadena que se est
elongando, se situara un nucletido sin
este grupo OH, es decir un anlogo
169

didesoxinuclesido trifosfato (ddNTP), la
polimerizacin o elongacin de la ca-
dena de DNA, se detendr.
En otras palabras, si un DNA molde es
distribuido entre cuatro tubos distintos
y a cada de ellos les adiciona una mez-
cla de los cuatro desoxinuclesidos tri-
fosfato (dATP, dTTP, dGTP y dCTP) con
uno de ellos marcado radiactivamente,
ms la DNA pol y un partidor, la elonga-
cin ocurrir sin ningn problema en
ninguno de estos tubos. Pero Sanger adi-
cion a cada uno de estos tubos, uno de
los ddNTPs (ddATP, ddCTP, ddGTP o
ddTTP). As, cada tubo de Sanger conte-
na los cuatro dNTPs ms un ddNTP es-
pecfico. De esta forma y cuidando una
adecuada razn dNTPs/ddNTP, la elon-
gacin se detuvo cuando ese ddNTP se
incorpor a la cadena naciente de DNA.
Como cada tubo estaba marcado segn
el ddNTP que se haba adicionado, San-
ger saba en dnde estaban parando su
elongacin los fragmentos nuevos de
DNA. As, en cada uno de los tubos ha-
ba una mezcla o poblacin de fragmen-
tos de DNA de distinto tamao, pero que
siempre haban parado en un ddNTP es-
pecfico, el adicionado a ese tubo de-
terminado.
En seguida, Sanger separ cada uno de
los fragmentos amplificados mediante
electroforesis. Deposit el contenido de
cada tubo en un pocillo de un gel de
acrilamida y luego puso en contacto este
gel con una placa tipo fotogrfica, de
manera que las bandas correspondientes
a cada fragmento se hicieron visibles al
revelar dicha placa, pues recordemos que
tambin haba un nuclesido radioactivo
en la mezcla de reaccin. Segn el prin-
cipio de la separacin electrofortica, al
170
BIOTECNOLOGA VEGETAL
someterse a un campo elctrico, las ban-
das ms pequeas se movern ms rpi-
do en la trama del gel, que las ms gran-
des. De esta forma, la placa fotogrfica
tendr marcada una escala de tamaos co-
rrespondiente a los fragmentos generados
por la DNA pol en cada tubo, hasta que
se incorpor un ddNTP y detuvo la elon-
gacin. As, el DNA estaba siendo secuen-
ciado de manera confiable y de una ma-
nera relativamente poco laboriosa.
Con el desarrollo de esta gran herra-
mienta, tambin en 1977, se public la
primera secuencia de un gen humano
(Seeburg et al., 1977). En 1986, Hood y
su grupo (Strauss et al., 1986) publica-
ron un mejoramiento de la metodologa
originalmente propuesta por Sanger. Esta
mejora consisti en no utilizar radioac-
tividad en alguno de los dNTPs que es-
taba siendo incorporado por la DNA pol,
sino emplear ddNTPs fluorescentes co-
loreados de manera distinta segn fue-
ran ddATP, ddCTP, ddTTP o ddGTP. As,
cada fragmento elongado en la polime-
rizacin incorporar un anlogo ter-
minador de la cadena que ser adems
"coloreado", por lo que ser ledo de
manera automatizada por un sistema
detector, sensor de la longitud de onda
o color del respectivo ddNTP. Al mismo
tiempo, la relacin entre el tamao del
fragmento sintetizado y su color, poda
ser fcilmente relacionada por un com-
putador. De esta forma, nace el proceso
conocido como secuenciacin automti-
ca, tenindose como el primer secuen-
ciador automtico aquel desarrollado
por la empresa Applied Biosystems, en
California en el ao 1987.
Se inici as, una carrera que an esta-
mos viviendo, la genmica de los seres
GENMICA
vivos. Es decir, conocer exactamente el
orden que tienen los nucletidos a tra-
vs de todo el genoma de los seres vi-
vientes. A priori, se podra pensar que es-
ta es una misin relativamente sencilla,
pero en realidad el ordenamiento simple
de los nucletidos a travs de un genoma
no se puede evaluar de manera solitaria
y, hoy en da, se sabe que a l deben adi-
cionarse estudios que relacionan este ge-
noma con su funcionalidad y productivi-
dad. Y como se supondr, esto es una fun-
cin del contexto celular. As, en forma
paralela, surgieron reas como la Prote-
mica y Metabolmica. Finalmente, a es-
tas alturas ya es evidente que slo con la
ayuda de los computadores y programas
especficos seremos realmente capaces
de entender toda esta gran cantidad de
informacin que a diario se est generan-
do, surgiendo as la Bioinformtica.
UBICNDONOS
EN UN GENOMA.
Las primeras banderillas, marcadores
moleculares.
De una forma consecuente al descubri-
miento de la nucleina, primera descrip-
cin para los cidos nucleicos, una de
las primeras herramientas para orientar-
nos en los genomas proviene de las tc-
nicas de tincin de DNA, las que en su
mayora lo utilizan en forma de cromo-
somas. La tincin de los cromosomas
genera patrones especficos de bandas,
los que son de gran utilidad en estudios
citogenticos. Sin embargo, estas ban-
das corresponden a millones de nucle-
tidos y miles de genes. Si consideramos
estos cromosomas teidos como un mol-
de de cocina que debe ser llenado con
un delicioso pastel, uno de los primeros
objetivos ser hacer el pastel que se de-
ber cocer. As, una de las primeras
aproximaciones para la elucidacin de
un genoma, es el saturar este complejo
mapa lineal de nucletidos constituyen-
te de los tangibles cromosomas, con
cientos o miles de marcadores molecu-
lares, los que ya conocemos del captu-
lo anterior.
Vayamos a un ejemplo simple pero a la
vez complejo, el desarrollo del Genoma
Humano, proyecto emprendido en 1989.
El primer director del Programa Genoma
Humano, James Watson, plante la es-
trategia de utilizar a los marcadores mo-
leculares como herramientas de aproxi-
macin a los genes de un cromosoma.
Su idea fue ubicar tantos marcadores
como fuera posible, de modo que estos
estuvieran relacionados con secuencias
nicas. De esta forma, uno de los pri-
meros trabajos en el desarrollo del Pro-
yecto Genoma Humano, fue ubicar lo-
tes de marcadores sobre unidades sub-
cromosomales, por ejemplo, de 150.000
nucletidos. Encontrar genes, los cuales
en trminos muy generales tienen unos
10.000 nucletidos en humanos, dentro
de estos segmentos de 150 mil bases es,
en la prctica, mucho ms fcil que en-
contrarlos dentro de un cromosoma
completo. Watson logr ubicar 30 mil
marcadores con secuencias nicas de
entre 100-300 nucletidos de largo, a
travs del genoma humano completo.
Para realizar esto, los cromosomas se
cortaron con enzimas de restriccin de
corte infrecuente, de forma de tener
como resultado estos fragmentos de
150.000 pares de bases aproximadamen-
te (Figura 8.1A). Estos se ligaron y clo-
naron en unas nuevas herramientas mo-
171
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

leculares, pero que manejan los mismos
principios tericos descritos anterior-
mente en el captulo 5: los cromosomas
artificiales de bacterias (BACs, Bacterial
Artificial Chromosomes). Los BACs y los
plasmidios poseen grandes similitudes,
en cuanto a que son DNAs que se utili-
zan en el mesn del laboratorio, a los
que se les puede introducir un segmen-
to de DNA de inters. Ambos son de ori-
gen bacteriano, por lo que podemos tra-
bajarlos con bacterias, pero como se po-
dr ver, un BAC admite 150 mil pares
de bases, fragmento notablemente ma-
yor al que soporta un plasmidio.
Partiendo de estos clones BAC, la estra-
tegia general consisti en cortarlos orde-
nadamente con distintas enzimas de res-
triccin (en digestiones separadas), de
forma de tener varios fragmentos que pu-
dieran se superponibles entre ellos (Fi-
gura 8.1B). Con estos mapas de diges-
tiones de cada clon BAC, se alinearon
zonas consenso de cortes entre varios
clones y se ensamblaron computacio-
nalmente (Figura 8.1C), generando mar-
cadores que en esencia, corresponden
a secuencias nicas de 100 a 300 bases
cada una (Figura 8.1D).

Figura 8.1. Clones BAC para secuenciacin del genoma humano. Watson propuso generar
fragmentos de los cromosomas humanos (de alrededor de 150 mil pares de bases) a travs
de cortes con enzimas de restriccin de corte poco frecuente (A). Estos se clonaron en
cromosomas artificiales de bacterias (BACs) (B) donde nuevamente se cortaron con enzimas
de restriccin, esta vez generando cortes ms frecuentes (C). Finalmente, estos mapas se
reconstituyeron, sobreponiendo segmentos comunes, de manera de ordenarlos de la forma
como deberan estar en su respectivo cromosoma. Al mismo tiempo, se aislaron los
marcadores especficos, los que corresponderan a secuencias nicas representativas
de cada fragmento cromosmico inicial (D).

172
GENMICA
Nuevas marcas, etiquetas de secuen-
cias expresadas.
Considerando que aproximadamente el
3% del genoma humano corresponde
efectivamente a genes, el intentar ubi-
carlos utilizando el mapa de marcado-
res diseado por Watson, se converta
en una misin extremadamente laborio-
sa. De a esto, muchos de los integrantes
de este megaproyecto, saban que sera
necesario reducir el universo sobre el
cual buscar. El DNA recombinante y la
transformacin de plantas nos han mos-
trado que, una de las primeras necesi-
dades en el conocimiento de los genes,
es el poder manejarlos en el laborato-
rio. Como ya hemos visto, una de las
formas de manipular DNA en un tubo de
ensayo es la etapa de clonamiento. En
teora, un investigador puede introducir
o clonar prcticamente cualquier seg-
mento de DNA en un plasmidio. Este
DNA insertado y su significancia biolgi-
ca, es la base de dos tipos de herramien-
tas bsicas de la biologa actual, las
genotecas.
Las genotecas.
stas son colecciones de plasmidios (u
otro vector manipulable de DNAs como
por ejemplo un fago), que tienen inser-
tados fragmentos representativos de
genes de un organismo.
Existen al menos dos vas de tener re-
presentado un gen. Como se discuti en
el captulo 5, en eucariontes un gen est
constituido por exones e intrones. Como
contrapartida, una bacteria no posee
intrones. De esta forma, si se piensa que
se puede tener el genoma de una clula
eucarionte digerido con enzimas de res-
triccin y ligado a plasmidios, estarn
clonados genes con todas sus secuen-
cias, incluyendo las secuencias re-
guladoras, los exones y los intrones. Esto
se conoce como una genoteca genmica
y representa toda la carga informtica de
un individuo, independiente de su me-
dioambiente o de su estado fisiolgico.
Sin embargo, si mediante herramientas
del DNA recombinante extraemos
mRNAs de una clula (eucarionte o pro-
carionte), y utilizando transcriptasas re-
versas generamos una primera hebra de
DNA exactamente complementario al
mRNA aislado, fabricamos lo que se lla-
ma un cDNA hebra simple. Si con ayu-
da de la DNA pol sintetizamos su hebra
complementaria, tendremos un cDNA
doble hebra. Vale la pena referirnos a la
cualidad de este cDNA: en l no estn
representadas secuencias promotoras ni
los intrones. Si clonamos en plasmidios
cDNAs retrotranscritos de una poblacin
representativa de mRNAs de una clula,
tendremos lo que se denomina una
genoteca cDNA (Figura 8.2). Ntese que
por lo general, nuestra poblacin de
mRNAs aislados corresponder a aquel de
clulas bajo un determinado estado fisio-
lgico o ambiental, por lo que guardar
as una relacin funcional respecto de una
situacin especfica. De este modo, las
genotecas cDNA son en su mayora fun-
cionales.
Una aproximacin experimental, a la
vez sencilla y barata para dar con genes
que conforman nuestro genoma, es el
utilizar seales que estn ya situadas
dentro de genes que se expresan. El re-
quisito es que stas, al igual que los
marcadores desarrollados por la estrate-
gia de Watson, deben ser nicas.
173
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Figura 8.2. Genoteca cDNA de cerebro. En un estadio especfico se extrae el mRNA

de estas clulas, el que sirve para ser retrotranscrito a cDNA hebra simple.
Luego, mediante la DNA pol I se sintetiza la segunda hebra de este cDNA y
posteriormente se clonan en un vector apropiado, en este caso, un fago.

Seales etiqueta de genes que se ran etiqueta o marcadoras de genes que

expresan.
Craig Venter, un colaborador y amigo de
Watson, quien trabajaba buscando genes
humanos en el Nacional Institute of
Health (NIH), utiliz una genoteca cDNA
de cerebro humano que estaba hecha con
anterioridad, como base de templados
para buscar secuencias nicas que fue-
estaban representados en esa genoteca de
cerebro. Estas secuencias se denominan
etiquetas de secuencias expresadas (EST,
de Expressed Sequence Tags). La estra-
tegia de Venter fue amplificar por PCR,
zonas de 150 a 400 nucletidos, utilizan-
do como DNA templado esta genoteca
cDNA de cerebro humano (Figura 8.3).
Para esto, utiliz partidores aleatorios,

Figura 8.3. Desarrollo de ESTs. A partir de cDNAs de una genoteca, estos son amplificados
aleatoriamente mediante partidores, generndose amplicones de distinto tamao, representati-
vos de los genes capturados por la genoteca. Los amplicones, representan entonces a genes
especficos, los que pueden ser secuenciados y utilizados como seales de una secuencia
de un gen que se est expresando en un momento especfico de una clula.

174
GENMICA
que permitieron amplificar distintas ban-
das nicas en tamao y secuencia. Estos
ESTs corresponden, entonces, a genes ex-
presados en el cerebro, puesto que ellos
provienen de una genoteca cDNA de ce-
rebro (es decir, de un mRNA de este teji-
do). El resultado final de este grupo fue
la obtencin de 2375 ESTs y sus respecti-
vas secuencias. Increblemente, slo el
17% de stas fue conocida, al comparar-
la con una base de datos que contena la
secuencia de todos los genes conocidos
a la fecha. Algunos de los genes identifi-
cados result ser de distribucin genera-
lizada en el cuerpo humano, como el de
la -actina; pero otros mostraron ser ms
especficos del cerebro, como el gen big-
brain previamente identificado en
Drosophila melanogaster (Rao et al.,
1990).
El 83% de genes deconocidos fue, sin du-
da, el resultado ms excitante a estas altu-
ras. As, pronto este grupo desarroll
30.000 ESTs adicionales en unos pocos
aos, los que estaban obviamente rela-
cionados a genes nuevos. Esto marc el
inicio, tanto de grandes empresas biotec-
nolgicas dedicadas a la genmica (como
Human Genome Sciences e Incyte Geno-
mics), como de la discusin sobre la fi-
nalidad de la carrera por conocer y ma-
nipular genes.
Desde el punto de vista tcnico, uno de
los lados dbiles de esta estrategia es
que, genes con baja expresin de su
mRNA, estarn pobremente o simple-
mente no representados por una colec-
cin de ESTs. Adems, los bancos de
ESTs, no identificaran zonas reguladoras
de los genes que estaban siendo anota-
dos.
ROMPIENDO UN GENOMA
Y ESTUDINDOLO POR PARTES
Consciente de la debilidad de los ESTs,
Watson decide extender la estrategia de
romper el DNA humano para tenerlo
prcticamente por completo, en forma
de pedazos manejables y abordables en
el laboratorio. Esta estrategia recibe el
nombre de mapeo fsico completo.
Mapeo Fsico por ensamblaje de
clones BAC.
Debido al trabajo previo de mapeo con
los clones BAC de 150 mil nucletidos,
se tena toda una librera BAC con mar-
cadores de secuencias nicas de 100-
300 nucletidos anclados o ubicados.
En adicin, a aquellos clones BAC que
no se les pudo relacionar experimental-
mente con un marcador, se les someti
a un estudio ms detallado, digirindo-
lo con enzimas de restriccin adiciona-
les. Esta vez se utilizaron enzimas con
secuencias de corte ms comunes que
las inicialmente utilizadas. Estos sitios
de restriccin, tambin se convirtieron
en seales fsicas tiles como marcado-
res moleculares y permitieron dar cierto
orden a la librera de BACs ya diseada.
Luego de este ordenamiento, se selec-
cionaron los BACs que tericamente se-
ran suficientes para cubrir todo un
cromosoma, segn la comparacin con
los marcadores que originalmente se ha-
ban situado, a razn de uno por cada
150 mil bases. Como trabajar con me-
gaplasmidios como los BACs con inser-
tos de ms o menos 150 mil nucletidos,
es abordable pero no trivial en el labo-
ratorio, estos se digirieron nuevamente
para generar fragmentos de aproximada-
175

mente 1.500 pares de bases, los que se
subclonaron en vectores tipo fago, de
manejo experimental similar a los plas-
midios descritos anteriormente (sobre
todo en lo referente al tamao del DNA
externo insertado). Los fagos tambin
pueden ser utilizados en la elaboracin
de genotecas y, para ser apegados a la
verdad, fue una genoteca elaborada con
fagos, la que utiliz Venter para generar
sus ESTs de cerebro (Figura 8.2).
De este modo, y nuevamente para ase-
gurar la factibilidad de sobreposicin de
fragmentos en el armado final, se digi-
ri cada clon BAC con distintas enzimas
de restriccin.
Los clones de fago (con fragmentos de
DNA genmico humano de aproximada-
mente 1500 nucletidos), se secuencia-
ron individualmente, informacin con la
que luego se debi emprender el cami-
no reverso. Es decir, comenzar a pegar
fragmentos, aunque en forma terica y
con ayuda de programas computacio-
nales. Como podr calcularse, la base
del armado reverso fue la utilizacin de
las secuencias de las zonas que se su-
perponan. Esto se hizo tambin con la
ayuda del conocimiento previo de la po-
sicin relativa de los marcadores mole-
culares generados inicialmente por el
proyecto. De esta forma, se armaron las
secuencias contiguas o simplemente
contigs. Armar nuevamente cada uno
de los fragmentos pequeos, hasta lle-
gar al orden de los fragmentos de 150
mil nucletidos de cada clon BAC, fue
el paso siguiente. Luego, obtenida la in-
formacin para cada clon BAC deriva-
do de cada cromosoma, se armaron los
cromosomas. Al tener la informacin de
la secuencia de cada cromosoma, se
176
BIOTECNOLOGA VEGETAL
haba terminado el secuenciamiento del
genoma humano.
Mapeo por ruptura fsica del DNA.
Venter, en su anhelo por desarrollar for-
mas ms directas para secuenciar geno-
mas, propuso el mtodo de la secuencia-
cin por ruptura del DNA, lo que se cono-
ce como shotgun sequencing. Este mto-
do se inicia con la generacin de peda-
zos de DNA generados al azar, pero que
tengan secuencias que se sobrepongan.
Esto se consigue hacindolo pasar en for-
ma de solucin acuosa, por una jeringui-
lla con aguja (Figura 8.4). Segn la pre-
sin o nmero de veces que esta solucin
se haga pasar por la aguja, ser el tamao
promedio de los fragmentos que se gene-
rarn. De esta forma, Venter obtuvo solu-
ciones con fragmentos promedio de 2.000
bases y otra solucin con fragmento pro-
medio de 10.000 bases. Ambas solucio-
nes de ruptura se clonaron en plasmidios,
a modo de genoteca genmica. Luego, se
secuenciaron los extremos de cada uno
de los clones bacterianos (Figura 8.5A),
puesto que l ya saba que no necesitaba
conocer la secuencia del todo el fragmen-
to. Finalmente, utiliz esta informacin
para que, con ayuda de programas compu-
tacionales desarrollados ex profeso, se
hiciera automticamente el ensamblaje de
los contigs (Figura 8.5B). As, sumando
secuencias que se sobreponan, Venter se
propuso acortar camino sobre el trabajo
que significa el uso de marcadores y
clones BAC, para obtener la secuencia del
genoma humano completo (Figura 8.5C).
Su primer gran resultado vino en 1995,
cuando report la secuencia de los 1,8 mi-
llones de nucletidos de Haemophilus
influenzae (Smith et al., 1995). Un nuevo
resultado vino luego en 1999, cuando des-
GENMICA

de su compaa Celera, inform del geno-

ma completo de Drosophila melanogaster
(Adams et al., 2000), el cual obtuvo en
colaboracin con el ya formado Droso-
phila Genome Project.

Sin duda, estos primeros resultados de

Fragmentos de 2.000 y 10.000 pares de bases.
Figura 8.4. Estrategia de ruptura del DNA
mediante su paso por el orificio de una
jeringuilla. El tamao de los fragmentos
generados depender de la fuerza con que
se hagan pasar estos a travs de la aguja
(mientras ms fuerza, mayor ruptura).
A
AAGACTTATG GGACACAGGTTATGG
GACCTTA CGTTGGA GACACAGGTT
secuenciacin de genomas ya auguraban
un pronto primer anuncio en el conoci-
miento del genoma humano. As, en 26
de Junio del 2000, el mismo Venter y
Francis Collins, reemplazante de Watson
como jefe del Programa Genoma Huma-
no, informaron en la Casa Blanca, el tr-
mino del libro borrador para las secuen-
cias del genoma humano. Un anlisis
funcional-estructural de este borrador
CGTTATAGG

GCACGTT TATGGAC TTATGGACCA GATTAGGCC

TAGGATTA GATTGGG
TAT GGTGC AACGTTATA CCGA
TATGGA GTGCACG
AAGGTGCACGTTG GTTA
TAAGGT GGACACA
GTTGGACA ACCAACGT AGGTGCA
AGGTTATGGA AGGATTAGG
ACCAACG AGGCCCGA
ACACAGGTTATGGACC GGCCCGAGATTGG
AAGGAC TTAAGGTG
B
AAGGAC TTAAGGTG
GACTTAT GGTGC
TATGGA GTGCACG
GACCTTA CGTTGGA
AAGGACTTATC C C A C A C A C C T TAT C C
TTAAGGT GGACACA
AGGTGCA CACAGGTT
GCACGTT TATGGAC
GTTGGACA ACCAACGT
AAGGTGCACGTTG G T TATA G G AT TA G G C
GACACAGGTT CGTTATAGG
AGGTTATGGA AGGATTAGG
TTATGGACCA GATTAGGCC
TGGACCAACG AGGCCCGA
A A C G T TATA CCGAGAT
TAGGATTA GATTGGG
ACACAGGTTATGGACC GGCCCGAGATTGGG
C
AAGGACTTATGGACCTTAAGGTGCACGTTGGACACAGGTTATGGACCAACGTTATAGGATTAGGCCCGAGATTGGG

Figura 8.5. A) Secuenciamiento de los extremos de los fragmentos generados por ruptura
con jeringuilla y luego clonados hacia vectores de manipulacin en el laboratorio. B) Seguida
esta etapa de secuenciacin de los bordes de los fragmentos, computacionalmente se
alinean las secuencias superponibles, de modo de ordenar estos fragmentos, generando
finalmente una secuencia lineal, que corresponde al DNA completo
fragmentado originalmente (C).

177

fue publicado en Febrero de 2001 (Ven-
ter et al., 2001), quedando a la vez de
manifiesto que an quedaba mucho tra-
bajo por realizar. Ejemplo de esto, son
varias de las secuencias correspondien-
tes a las regiones centromricas. stas
contienen una gran cantidad de secuen-
cias repetitivas (repeticiones de unos
pocos nucletidos). Este tipo de secuen-
cias hace muy difcil la tarea de los com-
putadores, puesto que ellos otorgan va-
rias posibilidades de las cuales slo una
es la acertada. As, la tarea est an en
marcha.
GENMICA FUNCIONAL
Induccin diferencial de genes. Hi-
bridacin substractiva.
Qu genes estn involucrados en una
respuesta especfica?. En ciencia, la
comprensin de los eventos moleculares
involucrados en una respuesta por parte
de un organismo o un individuo ante un
estmulo especfico, involucra el tener,
en la medida de lo posible, tanto la situa-
cin de reposo o control, as como la
situacin especfica. Como bien lo dice
nuestra pregunta, los eventos compo-
nentes de la respuesta sern entonces la
diferencia entre estas dos condiciones.
A nivel de genes, aquellos que son apa-
gados o activados durante una respues-
ta, sern evaluables slo si podemos
compararlos con una condicin en la
que no est el agente que produjo tal res-
puesta. Una de las primeras herramien-
tas para estudiar este tipo de procesos,
proviene de la tcnica de hibridacin
substractiva de cidos nucleicos.
Igor David y Thomas Sargent desarrolla-
ron este procedimiento para descubrir
178
BIOTECNOLOGA VEGETAL
aquellos genes que se inducen en una
clula como respuesta a un estmulo me-
dioambiental. Para ello, utilizaron clu-
las de ranas (Xenopus laevis), las que co-
mo sabemos, tienen distintos estados de
desarrollo. Entre estos estados, tambin
se pueden distinguir distintas morfolo-
gas, aunque las clulas siempre tengan
el mismo genoma. En la blstula encon-
tramos un montn de clulas en estado
indiferenciado, pero ya en la gstrula,
encontramos capas celulares como ecto-
derma, endoderma y mesoderma. As,
ellos supusieron que los genes encarga-
dos de esta diferenciacin en capas, de-
ba gatillarse a tiempos terminales del
estado de blstula o muy iniciales de la
gstrula. Para realizar su estudio, extra-
jeron mRNAs desde individuos en am-
bos estados a distintos tiempos de edad
(Figura 8.6). Tal como se realiza en la
elaboracin de una genoteca cDNA, uti-
lizaron transcriptasa reversa para obte-
ner los cDNAs (hebra simple) correspon-
dientes a las distintas muestras del esta-
do gstrula. Luego utilizaron estos
cDNAs para hibridarlos con los mRNAs
procedentes de las distintas muestras de
blstula. Los hbridos formados entre
cDNA-mRNA, correspondieron a genes
que se transcribieron en ambos estados,
quedando en estado de cDNA no hibri-
dados, slo aquellos correspondientes a
transcritos que especficamente se ex-
presaban en los estadios de gstrula.
Para separar esta mezcla de hbridos
cDNA-mRNA de las hebras cDNA no co-
munes, la hicieron pasar por una colum-
na de hidroxiapatita, que une especfi-
camente los cidos hibridados, dejando
pasar los cDNAs hebra simple (no hibri-
dados), correspondientes especfica-
mente a genes expresados en el estadio
gstrula.
GENMICA

Figura 8.6. Genoteca substractiva. . Desde los estadios de blstula y gstrula del embrin
de Xenopus laevis, se aislaron los mRNAs en tubos separados. Luego se retrotranscribieron
aquellos mRNAs correspondientes al estado de gstrula y se mezclaron, de forma de producir
la hibridacin entre mRNA de blstula y cDNAs de gstrula. Los hbridos formados entre
cDNA-mRNA correspodieron a genes que se transcribieron en ambos estados, quedando en
estado de cDNA no hibridado, aquellos correspondientes a transcritos que especficamente
se expresaban en los estadios de gstrula. Para separar esta mezcla de hbridos cDNA-mRNA
de las hebras cDNA no comunes, se le hizo pasar por una columna de hidroxiapatita,
que slo deja pasar los cDNAs hebra simple (no hibridados) que corresponden,
especficamente, a genes expresados en el estadio gstrula.

Estos fragmentos cDNA hebra simple, se El poder acceder a representaciones de

llevaron a cDNA hebra doble para final-
mente utilizarlos en la construccin de
una genoteca, correspondiente a genes
que exclusivamente se expresan duran-
te el estadio de gstrula de Xenopus
laevis. La utilidad de esta tcnica es po-
der conocer y tener representada, una
poblacin especfica de genes corres-
pondientes a un evento fisiolgico, co-
mo lo es un estado de desarrollo de un
individuo. Por ejemplo, David y Sargent
utilizaron estos cDNAs marcados radiac-
tivamente, para hibridarlos a una mem-
brana de nitrocelulosa que tena adheri-
dos en puntos especficos, mRNAs pro-
cedentes de distintos tiempos de cada
uno de los estados de desarrollo de Xe-
nopus (Figura 8.7). As, pudieron detec-
tar cules genes son en verdad claves en
el proceso de desarrollo.
los genes de una especie, abri una nue-
va puerta en la posibilidad de analizar
la respuesta molecular global de un or-
ganismo ante un estmulo determinado.
Esto, a la hora de referirnos a genes, se
conoce como genmica funcional. As,
cuando un organismo es sometido a una
situacin especfica, como bien podra
ser un estado especfico de desarrollo en
el caso de Xenopus, su respuesta final-
mente se reflejar en una modificacin
de la expresin de sus genes.
Los microarreglos.
En el desarrollo de los ESTs, Venter asu-
mi la funcionalidad de las secuencias
de un genoma en un momento determi-
nado. Para esto, l utiliz una genoteca
cDNA de cerebro humano obtenida pre-

179
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Figura 8.7. Experimento de puntos de hibridacin sobre membranas, para el estudio

de la expresin diferencial de genes del desarrollo embrional en Xenopus laevis.
Diez preparaciones de cDNAs, aislados mediante hibridacin substractiva (figura anterior),
se marcaron radioactivamente y se hibridaron sobre un arreglo de mRNAs aislados a distintos
tiempos de desarrollo de cada estado embrional. La intensidad de los puntos est directamente
relacionada con la expresin, en ese tiempo y estado, del cDNA (es decir del gen) especfico.

viamente. La irrupcin de la tecnologa herir varios DNAs ordenadamente en la

en el uso de los estudios genmicos, ha
llevado a una aceleracin en la genera-
cin de resultados. As como Venter y
su criterio prctico llev a modificar
variadas veces la propuesta original del
Programa Gubernamental Genoma Hu-
mano, el principio de mezclar las tcni-
cas de hibridacin substractiva con el de
los ESTs, ha dado paso a una impresio-
nante herramienta: los microarreglos de
DNA, o chips de DNA.
Unos pocos aos antes, Pat Brown ha-
ba desarrollado una tcnica en la que
se pueden fijar cidos nucleicos sobre
una superficie de vidrio. Para ello, utili-
z placas de vidrio a las que recubri
con polilisina, la que confiere una car-
ga positiva al vidrio. El DNA, cargado
negativamente, al ser impreso o pues-
to en contacto con este vidrio activa-
do, se une fuertemente a su superficie
y puede ser utilizado adems, como son-
da de hibridacin (Figura 8.8). La ven-
taja de este sistema es que se pueden ad-
superficie del vidrio. Brown, interesado
en saber qu genes eran responsables de
un linfoma (cncer de ndulos linfticos)
de las clulas B, saba que existan dis-
tintos sub-tipos de esta enfermedad, la
que se relacionaba con distintos grados
de supervivencia del individuo. As, l
construy lo que se denomin el lin-
fochip, un vidrio con 17.856 cDNAs pe-
gados ordenadamente en su superficie
(Alizadeh et al., 2000). Estos cDNAs pro-
venan tanto de preparaciones de ndulos
linfticos como de cDNA de genes
conocidamente involucrados en cncer.
Luego, obtuvo mRNAs desde ndulos
linfticos afectados por dos subtipos de
linfoma (DLBCL1 y DLBCL2) y los retro-
transcribi a cDNAs, marcndolos con un
colorante especfico para cada caso. In-
cub el linfochip con sus cDNAs dife-
rencialmente marcados para que se pro-
dujera la hibridacin y vio cmo se pro-
ducan apareamientos entre el chip y los
cDNA marcados, dependiendo del sub-
tipo de linfoma (Figura 8.9).

180
GENMICA

Figura 8.8. Microarreglo sobre vidrio activado.

Mediante interaccin electrotstica, el vidrio activado
y reforzado en su carga positiva, retiene a los cDNAs
depositados ordenadamente sobre l.

Figura 8.9. Experimentos realizados

por Pat Brown para descubrir la
expresin diferencial de genes
expresados en dos tipos de cncer
de ndulos linfticos de las clulas B
(DLBCL). l saba que existan distintos
sub-tipos de esta enfermedad (DLBCL1
y DCBCL2), la que se relacionaba con
distintos grados de supervivencia del
individuo. As, construy el "linfochip",
un vidrio con 17.856 cDNAs adheridos
ordenadamente en su superficie.
Obtuvo mRNAs desde ndulos
linfticos afectados ambos subtipos de
linfoma y los retrotranscribi a cDNAs,
marcndolos con un colorante para
cada caso (rojo y verde). Incub
el linfochip con sus estos cDNAs
marcados para hibridarlos y evalu
los apareamientos entre el chip y los
cDNA marcados, dependiendo
del subtipo de linfoma.

C o m o s e p u e d e v e r, B r o w n u t i l i z Chip, que es un arreglo mucho ms pe-

cDNAs para pegar a los vidrios que iban
a ser hibridados. Sin embargo, poco pas
para que este chip fuera variado por
Stephen Fodor, quien pens que no era
necesario tener cDNAs para generar es-
tos chips de DNA. l desarroll la tcni-
ca de los arreglos de sondas o Gene-
queo y que utilizan un vidrio especial.
Sobre este mini-vidrio, Fodor fue sinteti-
zando los cidos nucleicos que haran
el trabajo de sonda de hibridacin. Para
ello, utiliz un sistema de sntesis qumi-
ca de DNA dirigida por luz, haciendo
que se pegarn secuencialmente nucle-

181

tidos, uno sobre el otro, en la superficie
de este vidrio especial. Para ello, se pone
primero una capa de nuclesido sobre
el vidrio (por ejemplo A), en seguida se
bloquea esta capa con un agente foto-
sensible. Luego se aplica una mscara,
que contiene orificios en las zonas que
slo se desean desbloquear, es decir,
aquellas en donde se adicionar un nue-
vo nuclesido al anteriormente adheri-
do. Mediante la aplicacin de luz (la que
penetrar por aquellos orificios defini-
dos por la mscara), el protector fotosen-
sible desbloquear el nucletido adhe-
rido al vidrio, dejndolo disponible para
unir otro a l. Luego, nuevamente se
aplica el agente bloqueador/fotosen-
sible, otra mscara especfica (distintos
agujeros por ejemplo), se elimina espec-
ficamente el protector con luz y se adi-
ciona otro nuclesido. Y as, hasta com-
pletar un chip, con oligonucletidos de
unos 20 residuos de largo y con ubica-
ciones especficas. En estos microchips,
se pueden ordenar hasta 65 mil oligonu-
cletidos de secuencia conocida.
As, la revolucin de los microarreglos
de DNA ha comenzado. Estos chips tie-
nen en la actualidad innumerables usos.
Por ejemplo, pueden utilizarse para de-
tectar poblaciones de genes que se ex-
presan en un determinado momento,
para detectar mutaciones puntuales en
alguna secuencia gentica, para carac-
terizar un individuo transgnico, etc.
Genmica de vegetales.
Hasta ahora hemos presentado un sin-
nmero de eventos clave en el desarro-
llo de la genmica como Era. Pero no
hemos dicho que, el Proyecto Genoma
182
BIOTECNOLOGA VEGETAL
Humano en realidad contempl a todos
los organismos modelos mejor conoci-
dos a la fecha, como Escherichia coli,
Drosophila e incluso ratn, pero por ra-
zones desconocidas, no incluy a nin-
gn modelo vegetal. Es as como en
1994, la Comunidad Europea (hoy Unin
Europea), bajo la inquietud de Michael
Bevan, del John Innes Institute, inicia un
programa para secuenciar el cromosoma
4 de Arabidopsis thaliana, una pequea
hierba prcticamente sin significado
agronmico, pero de biologa relativa-
mente fcil y conocida, al grado de ser
la especie modelo en vegetales.
Se implement un Consorcio de Labo-
ratorios Europeos (ESSA), liderados por
Bevan. Al poco andar, Satoshi Tabata del
Kazusa DNA Research Institute, de Ja-
pn, comienza la iniciativa para se-
cuenciar el cromosoma 5 de Arbidopsis.
En 1996, varios de los ncleos involu-
crados en la iniciativa del Proyecto
Genoma Humano, logran consolidar la
Iniciativa Genoma de Arabidopsis (AGI),
conformada por el ncleo europeo, el
japons y un fuerte contingente de gru-
pos estadounidenses, provenientes prin-
cipalmente de la National Science
Foundation, Department of Energy y del
US Department of Agriculture. El objeti-
vo general, secuenciar los 125 mega-
bases de su genoma, con fecha lmite en
2004.
La estrategia seguida por AGI fue la uti-
lizacin de las libreras BAC y el mapeo
fsico, tal como Watson haba empren-
dido la iniciativa humana. En esa po-
ca, el sistema shotgun sequencing,
aunque propuesto, se consider muy
riesgoso. El camino no estuvo exento de
GENMICA

problemas, sobre todo si se considera El genoma posee aproximadamente

que no haban mapas fsicos completos
que apoyaran los resultados que se iban
obteniendo desde los BACs. Tambin
hubo buenas discusiones acerca del por-
centaje de error de secuenciacin que
se admitira y de cmo y cundo liberar
esta informacin a la luz pblica. Con
todo esto, en Diciembre de 1999 se pu-
blica la secuencia de los cromosomas 2
y 4 (Mayer et al., 1999) y un ao des-
pus, se dan a conocer las secuencias de
los restantes cromosomas 1, 3 y 5, junto
con un completo anlisis del genoma de
Arabidopsis.
25.500 genes, en una densidad de 1 gen
por cada 4 kilobases. El tamao prome-
dio de estos es de 2 kilobases, con 5
exones como promedio. Uno de los as-
pectos ms relevantes de los resultados
obtenidos, fue el observar que existe una
gran duplicacin de las secuencias tanto
intra- como inter-cromosomales, alcan-
zando a ser un 60% del genoma total.
Luego de esta iniciativa han surgido nume-
rosos consorcios y proyectos. En la Tabla
8.1 se muestran los programas de genmi-
ca de plantas existentes en la actualidad.

Tabla 8.1. Estado en cifras de ESTs de los diferente programas de

genmica vegetal en el mundo.

Sistema Estado de avance Estado de ESTs

en estudio pblico al: ingresados

Arabidopsis thaliana 12 de enero de 2004 227.670

Algodn 14 de agosto de 2003 52.818
Arroz 16 de enero de 2004 254.916
Caa de azcar 6 de enero de 2004 246.046
Cebada 9 de enero de 2004 341.924
Cebolla 4 de septiembre de 2003 19.553
Centeno 22 de diciembre de 2003 9.119
Chlamydomonas
reinhardtii 5 de enero de 2004 152.263

Ice plant 23 de abril de 2003 25.640

Lechuga 12 de enero de 2004 68.120
Lotus japonicus 21 de abril de 2003 32.881
Maz 23 de diciembre de 2003 377.188
Maravilla 18 de agosto de 2003 59.426
Medicago truncatula 1 de mayo de 2003 189.714
Nicotiana benthamiana 6 de enero de 2004 18.832
Papa 29 de diciembre de 2003 131.750
Pinus 22 de diciembre 2003 125.061
Sorghum bicolor 22 de diciembre de 2003 158.133
Soya 21 de agosto de 2003 333.481
Tomate 17 de abril de 2003 155.317
Trigo 25 de diciembre de 2003 542.781
Vides 13 de noviembre de 2003 132.316

183

Estos proyectos estn en distinto estado
de avance. La mayora de ellos compren-
de iniciativas que no slo involucra el
secuenciamiento e identificacin de
ESTs con el fin de generar bases de da-
tos finales de genes de estas especies,
sino tambin, son trabajos en paralelo
al mapeo fsico y ordenamiento (satura-
cin de los mapas) de marcadores mo-
leculares descritos a travs de mucho
tiempo de trabajo.
Un detalle ms acabado de alguno de
estos proyectos puede observarse en la
Tabla 8.2, la que resume el estado a ene-
ro de 2004 de varias de estas iniciativas.
Genmica funcional en Chile.
A fines del ao 2001, se crea la Iniciati-
va Genoma Chile bajo el contexto del
Programa de Desarrollo e Innovacin
Tecnolgica del Gobierno de Chile 2001-
2004. Esta Iniciativa est dirigida por un
comit formado por representantes de:
Corporacin de Fomento de la Produc-
cin (CORFO), dependiente del Ministe-
rio de Economa; Comisin Nacional
Cientfica y Tecnologa (CONICYT); y
Fundacin para la Innovacin Agraria
(FIA), dependiente del Ministerio de Agri-
cultura. As, en su primera instancia, se
enfatiza el desarrollo de capacidades tc-
nicas en nuestro pas, en el rea de la
fruticultura. Para este plan inicial, se des-
tinan 3 millones de dlares, con los que
se financian tres proyectos de genmica
funcional:
a) Genmica Funcional en Nectarines:
Plataforma para fomentar la competiti-
vidad de Chile en exportacin de fru-
tas. Cuya Institucin Principal es la
Universidad de Chile, teniendo como
184
BIOTECNOLOGA VEGETAL
instituciones beneficiarias y asociadas
a: INIA, Fundacin Chile, Asociacin
de Exportadores de Chile, Fundacin
para el Desarrollo Frutcola.
Proyecto que se centra en estudiar
por genmica funcional, desrdenes
metablicos y fisiolgicos que sufren los
duraznos y nectarines en su almacena-
miento en fro, cuando es transportado
a sus mercados de destino. Este fenme-
no se conoce como dao por fro. De
este modo, la idea es ver qu genes son
alterados en su expresin durante la apli-
cacin por fro. Para ello, este proyecto
plantea la ruta de elaborar genotecas
cDNA y obtener ESTs para utilizarlos en
arreglos que sern hibridados con
mRNAs de duraznos almacenados en fro
y duraznos control.
b) Plataforma cientfico-tecnolgica
para el desarrollo de la Genmica
Vegetal en Chile. Etapa I: Genmica
funcional en vid. Cuya Institucin
Principal es la Universidad Tcnica
Federico Santa Mara, teniendo como
instituciones beneficiarias y asocia-
das a: Universidades de Chile, San-
tiago y de Talca, INIA, Asociacin de
Exportadores de Chile, Fundacin
para el Desarrollo Frutcola, Funda-
cin Chile.
Proyecto de genmica funcional que
est compuesto por tres subproyectos, en
donde se investigar el fenmeno de
generacin de apirenia (falta de semilla)
en el cultivar sultanina, la respuesta de-
fensiva de vid frente al hongo Botrytis
cinerea y finalmente, se caracterizarn
eventos moleculares que generan el fe-
nmeno de corrimiento de la baya en el
emblemtico cultivar Carmenre (este
GENMICA

Tabla 8.2. Estado de algunos proyectos especficos de genmica en el mundo,

presentados en el Plant and Animal Genome 2004.

Iniciativa Contacto o lider Estado a enero 2004

International Perry Gustafson, Programa de dos fases: desarrollo de ESTs en trigo y

Triticaceae USDA/ARS y cebada. 16.000 ESTs de trigo y 6.000 de cebada. Se
Mapping Brian Foster, espera desarrollar 300.000 secuencias para ambos
Initiative Scottish Crop cultivos. De momento, la comparacin entre los
Research Institute. genomas de trigo y arroz, con una estrictez alta han
mostrado una homologa del 80% entre ambas
especies.

Maize Genome Georgia Davis, En l se ha generado una base de datos iMap para
Initiative University of maz. sta tiene como objetivo generar datos,
Missouri validarlos y verificarlos, analizarlos y unirlos e
integrarlos. iMAP posee ya informacin para el
genoma de maz de 2.025 Mbases, 4.443 contigs.
(www.maizemap.org).

Forest Trees Christophe Se ha llegado al establecimiento de diversos tipos de

Genomes Plomion, National marcadores moleculares en distintas especies (Norway
Institute for spruce, Japanese black pine). Tambin se han
Agricultural obtenido ESTs para Norway spruce (4.007) y Loblolly
Research pine (20.337). Tambin ya se ha desarrollado un
poplar-chip, un arreglo tipo cDNA para 15000 ESTs
de hoja y cambium.

International Douglas Cook, En donde destaca el proyecto de University of

Grape Genome University of Nevada-Reno, con una inversin de 3,6 millones de
Project California, Davis. dlares para 4 aos. Es un proyecto sistemtico de
genmica, protemica, metabolmica y bioinformtica.
Se planifica el secuenciamiento de 350.000 ESTs y su
uso en microarreglos para genmica funcional
(especialmente de resistencia a estrs hdrico).
Tambin en este consorcio existen grupos europeos,
australianos y chilenos, dedicados a la obtencin de
marcadores moleculares con vas a generar un mapa
saturado de marcadores moleculares, entre los que
destacan los marcadores de polimorfismos basados en
mutaciones puntuales. En esta iniciativa, ya destaca el
desarrollo de Informa de la construccin de 3 libreras
BAC, de las variedades Syrah, Pinot y Cabernet. Estas
genotecas comprenden tamaos entre 100 y 200 Kbs.
En Chile tambin existe un grupo destinado a la
obtencin de ESTs.

185
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

(Continuacin Tabla 8.2).

Iniciativa Contacto o lider Estado a enero 2004

Internacional Albert Abbott, Sus objetivos son: a) anlisis del grado de macro y
Consortium of Clemson. micro sintenia en el genoma de especies de Rosaceae
Prunus persica y b) genoma de durazno como modelo de Rosaceae.
Estos objetivos incluyen la bsqueda de genes
candidatos mediante ESTs, desarrollo de un mapa
gentico general, construccin de libreras BAC
y desarrollo de mapas fsicos. Hasta el momento
este equipo ha desarrollado 7 genotecas cDNA, en
funcin de los distintos estados de desarrollo. Han
desarrollado 149 marcadores anclados al mapa fsico
y tienen una gran cantidad de ESTs (9984).

Otras iniciativas interesantes:

Papa y Tomate Esther van der Estudios en tomate, Proyecto Genetic, molecular,
Knaap, and developmental anlisis of variation in tomato
Ohio State fruti shape.
University.

Richard Visser, Proyecto Solanaceae for genomics

Center
Biosystems
Genomics,
Wageningen
University.

fenmeno lleva a que en un mismo raci- Universidad de Chile, Fundacin de

mo existan granos semillados y asemilla-
dos, o de calibre notoriamente distinto).
En lneas generales, este proyecto gene-
rar distintas genotecas cDNA para culti-
vares de vid sultanina y carmenre, desa-
rrollar ESTs y los utilizar en el formato
de microarreglos, los que sern hibrida-
dos con mRNAs de distintas muestras pro-
venientes de los tres sub-proyectos.
c) Estudios Genmicos y de expresin
gentica en vides: respuesta a la in-
feccin viral y desarrollo de sistemas
de diagnstico. Su Institucin Princi-
pal es la Pontificia Universidad Ca-
tlica de Chile, teniendo como insti-
tuciones beneficiarias y asociadas a:
Ciencia para la Vida, Bios-Chile In-
geniera Gentica S.A.
Este proyecto plantea el estudio de la
respuesta de vides, frente a virus de im-
pacto sobre su productividad. Para ello,
se plantea un estudio comparativo a tra-
vs del uso de microarreglos de cDNAs
de Arabidopsis thaliana, los que sern
utilizados como fuente de hibridacin
con mRNAs de vides infectadas con vi-
rus como el Grape leaf roll virus. De la
misma forma, plantea conocer variantes
poblacionales locales de virus que in-
fectan vides y tambin el desarrollo de
sistemas de deteccin de estos.

186
GENMICA
REFERENCIAS
Adams M. et al. 2000. The genome sequence
of Drosophila melanogaster. Science
287:2185-2195.
Alizadeh, A., Eisen, M., Davis, R., Ma, C.,
Lossos, I., Rosenwald A., Boldrick, J., Sabet
H., Tran, T., Yu, X., Powell, J., Yang, L.,
Marti, G., Moore, T., Hudson, J., Lu, L.,
Lewis, D., Tibshirani, R., Sherlock, G.,
Chan, W., Greiner, T., Weisenburger, D.,
Armitage, J., Warnke, R., Levy, R., Wilson,
W., Grever, M., Byrd, J., Botstein, D.,
Brown, P. y Staudt, L. 2000. Distinct types
of diffuse large B-cell lymphoma identified
by gene expression profiling. Nature
403:503-511.
Holley, R. 1968. Experimental approaches to
the determination of the nucleotide
sequences of large oligonucleotides and
small nucleic acids. Prog. Nucleic Acid Res.
Mol. Biol. 8:37-47.
Mayer, K., Schuller, C., Wambutt, R., Murphy,
G., Volckaert, G., Pohl, T., Dusterhoft, A.,
Stiekema, W., Entian, K., Terryn, N., Harris,
B., Ansorge, W., Brandt, P., Grivell, L.,
Rieger, M., Weichselgartner, M., de Simone,
V., Obermaier, B., Mache, R., Muller, M.,
Kreis, M., Delseny, M., Puigdomenech, P.,
Watson, M. y McCombie, W. 1999.
Sequence and analysis of chromosome 4 of
the plant Arabidopsis thaliana. Nature
402:769-777.
Rao, Y., Jan, L. y Jan Y. 1990. Similarity of the
product of the Drosophila neurogenic gene
big brain to transmembrane channel
proteins. Nature 345:163-167.
Sanger, F., Nicklen, S. y Coulson, A. 1977. DNA
sequencing with chain-terminating
inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
74:5463-5467.
Seeburg, P., Shine, J., Martial, J., Ullrich, A.,
Goodman, H. y Baxter, J. 1977. Nucleotide
sequence of a human gene coding for a
polypeptide hormone. Trans. Assoc. Am.
Physicians. 90:109-116.
Smith, H., Tomb, J., Dougherty, B., Fleischmann,
R. y Venter, J. 1995. Frequency and
distribution of DNA uptake signal sequences
in the Haemophilus influenzae Rd genome.
Science 269:538-540.
Strauss, C., Kobori, J., Siu, G. y Hood, L. 1986.
Specific-primer-directed DNA sequencing.
Anal Biochem. 154:353-360.
Venter, J. et al. 2001. The sequence of the
human genome. Science 291:1304-1351.
187
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

188
GLOSARIO

GLOSARIO

Acetosiringona. Molcula carbonada derivada de fenol y

producida por dao mecnico en las paredes celula-
res de las plantas dicotiledneas. Activador de las se-
ales de infeccin para Agrobacterium tumefaciens.

cido ribonucleico. Molcula lineal constituida por una ca-

dena nica de ribonucletidos, conteniendo cuatro
monmeros de nucletidos, los monofosfatados de
adenosina (AMP), guanosina (GMP), citosina (CMP) y
uridina (UMP). Estructuralmente, la molcula de RNA
es similar a la de DNA, con la excepcin que en el
RNA el azcar presente es una ribosa. Existen tres ti-
pos de RNAs: ribosomales (rRNA), mensajero (mRNA)
y transferencia (tRNA). El RNA es sintetizado a partir
del DNA mediante la transcripcin.

ADN (o DNA). cido desoxirribonucleico; corresponde a

una macromolcula polimrica formada por los cua-
tro desoxinucletidos monofosfato en una doble he-
bra ligada por enlaces de hidrgeno entre las bases.
sta es portadora de la informacin gentica.

Agrobacterium. a) tumefaciens: bacteria del suelo tipo ba-

cilo, Gram negativo. Sus cepas virulentas poseen, en
adicin al DNA genmico, un plasmidio gigante lla-
mado Ti. Cuando infecta a una clula vegetal, una por-
cin del Ti (el T-DNA) pasa a la clula que es infecta-
da, causando un tumor conocido como la enfermedad
de la agalla de la corona; b) rhizogenes: bacteria del
suelo tipo bacilo, Gram negativo. De igual forma que
A. tumefaciens, las cepas virulentas poseen un plas-
midio Ri el que tambin posee T-DNA que acta de la
misma forma que su congnere. El fenotipo de esta
interaccin es la proliferacin de races; c) cepa des-
armada (comercial): cepa de tumefaciens o rhizogenes
en el que su plasmidio (Ti o Ri) ha sido desarmado,
dejndosele los genes vir y escindindosele los genes
para sntesis de opinas y otros elementos innecesarios

189
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

para la transferencia de T-DNA. Son complementados

con plasmidios binarios, que se trabajan en el mesn
del laboratorio, los que llevan los brazos izquierdo y
derecho, flanqueando el cassette del gen de inters.

Albino. Planta con marcada deficiencia de pigmentacin,

generalmente referida a la falta de color verde por de-
ficiencias de clorofila en cloroplastos .

Alimento transgnico. Alimento de consumo directo, deri-

vado de una planta u otro organismo genticamente
modificado.

Anlogo. Molcula ligeramente diferente de otra y que pue-

de entrar en la composicin de otra, a causa de su pa-
recido. Esto puede acontecer en protenas y cidos
nucleicos.

Antera. Porcin apical de un estambre que produce las mi-

crosporas o polen en una flor.

Antibitico. Molculas orgnicas de origen microbiolgico,

que en trminos generales, inhiben selectivamente el
crecimiento de clulas. Actan a travs de la altera-
cin de algn evento relacionado con la replicacin
del DNA o con la sntesis de protenas. Estos agentes
son txicos para clulas que no poseen sistemas espe-
cficos para eliminarlos, por lo que son utilizados en
la seleccin de clulas que ha sido transformadas. Exis-
ten antibiticos que afectan la vida de clulas proca-
riontes y, otros, que afectan a las clulas eucariontes.

Anticodn. Secuencia trinucleotdica ubicada en el aminoa-

cil-tRNA, encargada de reconocer el codn respecti-
vo en el momento de la traduccin del mRNA.

Anticuerpo. Molcula proteica de las clases de las inmuno-

globulinas, producida por clulas linfocitarias B, en-
cargada de reconocer especficamente secuencias
polipeptdicas en los antgenos. Los anticuerpos se
unen especficamente a los antgenos que inducen su
sntesis, neutralizando toxinas, aglutinando bacterias
o clulas, precipitando antgenos solubles. Un antgeno

190
GLOSARIO

es cualquier molcula que estimula una respuesta in-

mune en la forma de un anticuerpo. Polen y vacunas
son ejemplos de antgenos.

Antgeno. Compuesto extrao que ingresado (inyectado) en

cualquier animal vertebrado, genera una respuesta in-
mune contra l. Los antgenos son reconocidos por los
anticuerpos para su destruccin.

Apareamiento de bases. Tipo de interaccin entre las bases

nucleotdicas descrita por Watson y Crick.

Autotrficos. Organismos que son capaces de producir su

propio alimento. Un ejemplo son las plantas. En opo-
sicin, los hetertroficos no producen su propio ali-
mento, ejemplos: hongos, hombre, etc.

Autorradiografa. Metodologa en la cual se observa en una

pelcula, la radioactividad o marca luminiscente in-
corporada en macromolculas (DNA, RNA, protena).

Auxina. Regulador de crecimiento vegetal que promueve la

elongacin de brotes y formacin de races entre va-
rios otros efectos, en bajas concentraciones. La auxina
natural producida por todas las especies de plantas es
el cido indolactico (AIA o IAA).

Bacteria competente. Clula bacteriana sensibilizada artifi-

cialmente para que sea capaz de captar DNA del me-
dio.

Bacterifago. Virus que infecta bacterias.

Base nitrogenada. Molcula qumica que posee un anillo

heterocclico con tomos de carbono y nitrgeno. En
la constitucin de cidos nucleicos, existen aquellas
del tipo purinas (adenina y guanina) y del tipo pirimi-
dinas (citosina, timina y uracilo).

Biobalstica. Sistema de transformacin gentica (de plan-

tas) alternativo a A. tumefaciens. Surgi como necesi-
dad de sistemas capaces de transformar plantas mono-
cotiledneas.

191
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Bioinformtica. Se refiere al campo de estudio que extrae

informacin biolgica de un gran nmero de bases
tales como secuencias, interacciones entre protenas,
microarreglos, etc. Este campo tambin incluye el rea
de visualizacin de datos.

Biommica. Se refiere a lo que es el rea de simulacin del

diseo biolgico en procesos manufacturados.

Brazos izquierdo y derecho del plasmidio Ti. Secuencias

repetidas directas de 25 nucletidos que bordean el
DNA de transferencia en el plasmidio Ti.

Bromuro de Etidio. Qumico utilizado para observar mol-

culas de cidos nucleicos (DNA y RNA) por su capa-
cidad de intercalarse en las bases nitrogenadas y
fluorescer bajo luz ultravioleta.

Cadena peptdica. Secuencia de aminocidos de no ms de

20 unidades.

CALT. Comit Asesor para la Liberacin de Transgnicos,

creado en 1991. Organismo multidisciplinario depen-
diente del SAG, encargado de la aprobacin o recha-
zo de nuevos eventos transgnicos en nuestro pas.

Caracteres cuantitativos de locus (QTL). Genes que codifi-

can fenotipos que pueden ser medidos en una escala
cuantitativa. Cada gen tiene un pequeo efecto sobre
el fenotipo, siendo atribuible al ambiente un gran efec-
to. Muchos caracteres de inters econmicos son in-
fluenciados por muchos genes.

Cassette de expresin. Conjunto de seales necesarias en

una hebra de DNA sea capaz de expresar correctamen-
te una enzima o protena especfica. Contiene todos
los elementos promotores y terminadores de la trans-
cripcin para que esto ocurra.

cDNA. Secuencia de DNA que corresponde, complementa-

riamente segn reglas de Watson y Crick, al mRNA de
una protena.

192
GLOSARIO

Ciclo de Krebs. Tambin llamado ciclo de los cidos tricar-

boxilicos, es un conjunto de reacciones enzimticas
que comienzan con la condensacin de la Acetil CoA
con el oxalato, liberando CO 2 e H + en la medida que
el ciclo va girando. En los eucariontes, estas reaccio-
nes acontecen en el interior de la mitocondria.

Clivaje poliembriognico. Cuando ms de un embrin es

formado por divisin del cigoto, en dos o ms unida-
des, cada una desarrollndose en un embrin. Los em-
briones resultantes son monocigticos en cuanto a su
origen e idnticos genticamente.

Clon bacteriano. Conjunto de bacterias que poseen un fon-

do gentico comn. En trminos prcticos, en el labo-
ratorio, un clon corresponde por ejemplo, a una colo-
nia de bacterias creciendo en placas nutritivas sli-
das, o a un cultivo lquido sembrado con un solo tipo
de bacterias; todo esto tras haber sido transformadas
con un plasmidio de inters.

Clonamiento. Conjunto de pasos que involucran la manipu-

lacin de un gen o un segmento de DNA y su intro-
duccin a bacterias competentes para su multiplica-
cin o mantencin.

Co-cultivo. Etapa de la transformacin de plantas mediada

por A. tumefaciens en la que, luego de la infeccin
propiamente tal, los explantes son incubados en con-
junto con las bacterias que han quedado adheridas a
su superficie. En general, esta etapa suele durar un par
de das.

Cdigo gentico. Todo el conjunto de informaciones ge-

nticas de un ser dado. Sistema en que los nucletidos
permiten indicar la correspondencia de aminocidos.
Cada tres nucletidos, se seala un aminocido espe-
cfico, existiendo en todo caso, para casi todos los
aminocidos, ms de un triplete (codn) posible. Tam-
bin existen tripletes que indican el comienzo y el tr-
mino de una protena. Puede definirse por un conjun-
to de 64 codones y se dice que es degenerado, debido
a que la mayor parte de los aminocidos es codificada
por ms de un codn.

193
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Co-dominante. Un marcador molecular que expresa los dos

alelos del gen.

Codn. Ordenamiento de tres nucletidos de DNA que indi-

can correspondencia con un aminocido especfico.

Colchicina. Alcaloide usado en la duplicacin artificial del

nmero de cromosomas, pues impide la separacin de
los cromosomas despus de la mitosis.

Commoditie. En el caso de las plantas transgnicas, trmi-

no referido a granos y otros elementos producidos por
ellas y que posee una comercializacin interfronteriza
muy comn.

Complejo T. Conjunto molecular consistente de T-DNA he-

bra simple, una protena VirD2 unida a su extremo 5
como conductora y varias protenas VirE2 con funcin
protectora, conocida como actividad de protenas de
unin a hebra simple. Este complejo viaja desde A.
tumefaciens hasta la clula vegetal blanco que se quie-
re transformar.

Co-transformacin. Accin de co-cultivar, seleccionar y re-

generar un explante que ha sido infectado con dos
clones de A. tumefaciens. Frecuentemente cada uno
de los clones lleva cassettes de expresin distintos.

DNA ligasa. Enzima que se encarga de unir dos fragmentos

de DNA hebra doble (DNA normal) a travs del grupo
fosfato 5 de un extremo y del grupo OH-3 del otro.
Esta enzima puede o no requerir adenosina trifosfato
(ATP) para esta actividad, dependiendo de su origen
(por ejemplo de un fago o de una bacteria, respectiva-
mente).

DNA polimerasa. Enzima encargada de la sntesis de cade-

nas nucleotdicas, utilizando un DNA como molde y
un RNA como partidor o primer. Las ms utilizadas
en biologa molecular son la DNA pol I de Escherichia
coli y el fragmento Klenow.

194
GLOSARIO

DNA polimerasa I. Primera DNA polimerasa aislada de E.

coli, que posee actividad exonucleasa (degradadota
de nucletidos) 5-3 y 3-5. Su principal funcin bio-
lgica es durante la reparacin del DNA.

DNA polimerasa III. Polimerasa de DNA encargada de la

sntesis de fragmentos largos de DNA de una clula,
es decir, la primera responsable de la copia del genoma
de una clula (es de E. coli). Esta actividad es comple-
mentada por la DNA polimerasa I, quien rellena los
sitios vacos dejados por la degradacin de los
primers.

Dogma Central de la biologa molecular. Principio ordena-

do de eventos postulado por Watson y Crick, de forma
de predecir que el DNA se replica, transcribe a RNA y
que este ltimose traduce a protenas.

Dominante. Marcador molecular que expresa slo un alelo

del gen.

Dormancia. Fase de inactividad comn en semillas, esporas

y yemas en los cuales el crecimiento y desarrollo es
retardado o frenado.

Electroforesis. Metodologa de separacin de macromolcu-

las en un soporte slido (tambin se puede hacer en
papel, acetato de celulosa) que es sometido a un cam-
po elctrico.

Electroporacin. Tcnica de transformacin de bacterias me-

diante la cual, a travs de un pulso elctrico de mili-
segundos de duracin, se fomenta la captura de DNA
por parte de una clula. Esto sucede debido a la gene-
racin momentnea de heridas o poros en la membra-
na de dichas clulas.

Embriognesis. El desarrollo de un embrin normalmente

cigtico a partir de un tejido cualquiera. Cuando exis-
te desarrollo embrionario de otra forma, se obtiene
embrioides.

Embrin cigtico. Es el embrin resultante de la fecunda-

cin sexual.

195
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Embrin somtico. No es resultante de la fecundacin sexual,

sino de la manipulacin de condiciones in vitro. Se
puede originar a partir de un callo o directamente del
explante. Ejemplo: hoja. Es generado a partir de una
clula somtica, generalmente bajo condiciones in vitro.

Endosperma. Tejido nutritivo triploide que se encuentra en

el saco embrionario de las plantas con semilla.

Enfermedad de la agalla de la corona. Fenotipo producido en

el cuello de plantas dicotiledneas tras la infeccin por
A. tumefaciens. Esto se debe a que, en forma original, el
T-DNA posee genes que codifican enzimas para la snte-
sis de opinas y fitohormonas que, entre otros procesos,
promueven la divisin de las clulas husped.

Enfoque precautorio. Sistema de operacin entre los distin-

tos gobiernos que se han acogido al Protocolo de Car-
tagena, en el que ante dudas razonables de la interna-
cin de un evento transgnico (alimento o commoditie,
ver arriba), ste no ingresa a las fronteras de dicho pas.

Enlace fosfodister. Enlace O-P-O esqueleto del DNA. Este

se realiza entre el grupo OH 3 de la base nucleotdica
previamente adicionada en la hebra y el grupo PO 4 5
del nucletido entrante.

Enzima. Protena con alguna funcin biolgica de catlisis

de una reaccin especfica. Tambin se ha descubier-
to ltimamente, que existen algunos RNAs (en algu-
nos organismos inferiores) que tienen actividad catal-
tica, como Tetrahymena.

Enzimas de restriccin. Proteinas capaces de romper los

enlaces fosfodister entre diferentes nucletidos en una
misma cadena de ADN doble hebra en sitios especfi-
cos.

Epistasis. Representa una forma de interaccin gnica, don-

de un gen interfiere con la expresin fenotpica de otro
gen o genes no-allico (s).

196
GLOSARIO

Eptopes. Secuencia lineal de 7 a 9 aminocidos en el antge-

no, que son los responsables del reconocimiento por
parte del anticuerpo.

Etiolacion. Caractersticas que evidencian las plantas cuan-

do crecen en condiciones deficitarias de luz, elongn-
dose excesivamente y mostrando desarrollo anormal
de cloroplastos, que no sern funcionales.

Evaluacin de riesgo previa del OGM. Conjunto de opera-

ciones tanto prcticas como tericas, tendientes a eva-
luar la factibilidad de internar o no un evento trans-
gnico al pas. Este anlisis es fundamental para una
aprobacin en este sentido y requiere que el importa-
dor entregue gran cantidad de informacin cientfica,
esencialmente basada en los ensayos tcnicos reali-
zados en otros pases.

Exones. Nucletidos encargados de informar la secuencia

primaria de aminocidos de una protena. Los exones
estn separados por los intrones y despus del proce-
samiento del RNA, quedan ubicados linealmente para
que los ribosomas puedan comenzar la lectura del
mensaje que generar la protena.

Expresin transitoria. Expresin eventual de un gen que est

en el ncleo, a travs de la generacin efectiva de su
protena, sin la necesidad de que est incorporado es-
tablemente al DNA de la clula que ha sido transfor-
mada.

Explante. Trmino referido a una clula, tejido u rgano se-

parado de la planta madre y que se cultiva aislada-
mente bajo condiciones in vitro.

Factor transcripcional. Protena con capacidad de unin a

zonas especficas del DNA (promotores transcripcio-
nales), que fomentan la transcripcin de ciertos genes.
Los factores transcripcionales, en trminos prcticos,
corresponden al ltimo paso de una informacin del
mensaje que una clula recibe de su entorno y que
permiten a sta responder apropiadamente a dicho
mensaje.

197
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Fenogentica. Rama de la gentica que estudia las relacio-

nes entre el genotipo y fenotipo (sus manifestaciones).

Filotaxis. Forma de arreglo o disposicin de las hojas alre-

dedor del tallo.

Fitocromo. Pigmento proteico que media respuestas fotope-

ridicas y algunas otras reacciones gatilladas por pre-
sencia de la luz.

Fotosntesis. Proceso por el cual las plantas captan la ener-

ga solar para producir poder reductor (ATP, NADPH),
fijar CO 2 y sintetizar carbohidratos.

Gen cDNA. Gen cuya secuencia nucleotdica proviene de

la secuencia del mRNA, por lo tanto es equivalente a
la informacin aportada slo por los exones del gen.

Gen de resistencia a antibitico. Gen utilizado como marca-

dor o informador de la transformacin gentica, apor-
tando la propiedad de resistencia a un antibitico es-
pecfico a la clula que lo contiene y expresa correcta-
mente.

Gen genmico. Secuencia nucleotdica que codifica una

protena, que contiene tanto exones como intrones.

Gen marcado o sonda. Copia complementaria de la secuen-

cia templado, en que a travs de su sntesis con una
DNA polimerasa in vitro (generalmente la polimerasa
Klenow), se ha incorporado un nucletido marcado (ya
sea con radioactividad u otro compuesto qumico) que
servir para detectarlo mediante pelculas fotogrficas
o procesos de tinciones. Tambin se puede incorporar
marca a un DNA a travs de fosforilaciones especfi-
cas en sus extremos mediante kinasas terminales.

Gen reportero y marcador. Gen utilizado para evidenciar el

hecho que una clula lo ha incorporado correctamente.
Esto se utiliza normalmente en experimentos de transfor-
macin de clulas, ya sean procariotes o eucariotes.

198
GLOSARIO

Genes de resistencia. Gen reportero que especficamente

permite a las clulas transformadas crecer en medios
suplementados con antibiticos. Estos genes son es-
pecficos para cada antibitico o familias de ellos y
permiten resistir a las clulas sobrellevar dosis que en
circunstancias de no transformacin, seran letales.

Genes vir. Conjunto de genes de Agrobacterium encargados

de la virulencia de cepas especficas. Sus productos
gnicos se encargan de activar y transferir el comple-
jo T desde la bacteria hacia la planta.

Genoma. Conjunto de todos los genes de un ser vivo. Juego

completo de cromosomas que se hereda en forma de
unidad proveniente de un solo progenitor diploide.

G e n m i c a . Trmino vago relacionado con el estudio

referencial de secuencias genmicas, variaciones den-
tro de un genoma especfico, microarreglos de DNA,
circuitos y sistemas biolgicos. Se considera tambin
el transcriptoma, la protemica y la metabolmica,
etc., bajo el concepto de genmica.

Glucolisis. Va metablica en que la glucosa es degradada

hasta dos molculas de piruvato en el citosol.

Grupo azcar. Grupo ribosa o desoxirribosa presente en los

nuclesidos.

Grupo fosfato. Grupo encargado de enlazar, a travs de

interaccin con oxgeno 3 de la base siguiente, a los
nucletidos en los cidos nucleicos.

Haploide. Nmero reducido de cromosomas que se presen-

tan en las clulas germinales maduras de organismos
sexuales. Individuo conteniendo solo un representan-
te de cada par de cromosomas.

Hebra complementaria. Hebra correspondiente al molde,

segn la complementariedad propuesta por Watson y
Crick (A-T y G-C) .

199
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Heterocigosis. Carcter gentico que presenta los dos alelos

del gen diferentes.

Hidrlisis. Ruptura de una molcula en dos mediante la adi-

cin del agua.

Histonas. Protenas de carcter bsico (H1, H2A, H2B, H3 y

H4), ricas en arginina y lisina, que se unen al DNA
aportando a su estructura a travs de la formacin de
los nucleosomas y posteriormente, cromosomas.

Homocigosis. Carcter gentico que presenta los dos alelos

del gen iguales (puede ser dominante o recesivo).

Husped. Clula u organismo que hace la funcin de alojar

a otro organismo o molcula.

Infeccin. Interaccin entre Agrobacterium y el explante ve-

getal sometido a la transformacin. Requiere una eta-
pa de reconocimiento y unin, para luego gatillar even-
tos especficos de cada interaccin.

Integracin del T-DNA. Proceso por el cual el T-DNA se in-

tegra al genoma de una clula vegetal. El mecanismo
propuesto para este evento es el denominado como
recombinacin ilegtima.

Introgresin. Incorporacin gradual de genes de una espe-

cie a otra, mediante el cruzamiento entre dos progeni-
tores, generando un hbrido que es retrocruzado, suce-
sivamente, con una de las especies parentales.

Intrones. Secuencias nucleotdicas espaciadoras entre

exones, que son transcritas hacia el transcrito prima-
rio y que son escindidas por el proceso de madura-
cin del RNA, para generar el mRNA.

In vitro. Literalmente en el tubo de ensayo.

In vivo. Literalmente en la clula o en un organismo.

Isopreno. Es una unidad de 5 carbonos producidos por las

plantas. Una de las caractersticas de ellos es su gran
capacidad de polimerizacin, pudiendo formar com-

200
GLOSARIO

puestos qumicos como C 10 y C 15 llamados terpenos,

los cuales, explican la fragancia de muchas plantas.
Entre ellos pueden citarse: limoneno, mentol, etc. Los
isoprenos tambin se encuentran en la va metablica
de sntesis de las citoquininas.

Juvenilidad vs Madurez: En las plantas corresponden a teji-

dos y rganos que evidencian hbitos, formas y zonas
asociadas a tal carcter en la planta. La condicin ju-
venil se da en la zona ms basal e incide notablemen-
te en la capacidad reproductiva del material bajo con-
diciones in vivo e in vitro. La madurez es la condicin
alternativa que expresa otra caracterstica funcional
de parte de la planta.

Lincaje gentico. Situacin en que dos genes estn locali-

zados cerca en el mismo cromosoma.

Lnea hbrida. Lnea vegetal producida por la cruza sexual

entre dos lneas puras (u homocigotos para algn ras-
go determinado).

Lnea pura. Lnea vegetal producida por continuas

retrocruzas de filiales sucesivas procurando el enri-
quecimiento de un rasgo.

Marcador histolgico. Marcador que confiere un fenotipo

visible en presencia de un substrato aplicado
exgenamente.

Marcador morfolgico. Gen que codifica para una protena

que genera, en las clulas transformadas con l, un
cambio fenotpico fcilmente evaluable.

Marcador de letalidad. Gen que al ser activado mediante la

induccin de su promotor, induce la muerte de la c-
lula que lo ha incorporado.

Marcador de seleccin. Gen marcador que, en forma simi-

lar a la resistencia a antibiticos, al ser expresado en
una clula que lo posee, permite ser detectado fcil-
mente en dicha clula, ya sea a travs de tinciones
especficas o por alguna caracterstica de la protena
que produce.

201
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Medio Selectivo. Medio que permite el desarrollo selectivo

de ciertas clulas, inhibiendo el de otras. Estos pueden
ser por ejemplo, medios suplementados con antibiti-
cos, qumicos txicos, suplementos metablicos, etc.

Membrana de parada. Rejilla utilizada en los equipos de bio-

balstica. Detiene a la membrana portadora de las par-
tculas, sin afectar el paso de las partculas propiamen-
te tal.

Membrana portadora. Membrana del equipo de biobalstica

que permite ubicar las partculas recubiertas con el
DNA a ser proyectado en su superficie.

Microarreglos de DNA o chips de genes. Ordenamientos

de secuencias definidas de genes u ligos en soportes
slidos de vidrio o nylon, en microespacios y debido a
la accin de robots especialmente diseados. Estos mi-
croordenamientos son utilizados en distintos experimen-
tos de hibridain masiva con cDNAs de forma de eva-
luar simultneamente el nivel de expresin de varios
genes.

Mixotrfico. Poblaciones de clulas con diferente autono-

ma y capacidad de sntesis de compuestos orgnicos

Moratoria. Esquema administrativo que han implementado

ciertas naciones frente a la internacin para comercia-
lizacin o evaluacin de ciertos eventos transgnicos,
en espera de ms antecedentes tcnicos y/o polticos.

Morfognesis. Los cambios en el desarrollo que dan forma a

un individuo adulto a partir de un cigoto.

Morfolgico. Relativo a las caractersticas fsicas de un ser

(fenotipo).

mRNA y DNA colineales. Se refiere a que la secuencia de

DNA que origina el mRNA son correspondientes, salvo
en los loops o zonas que corresponden a los intrones.

Mutagnesis. Mtodos para introducir variaciones en la se-

cuencia original del DNA. Estos pueden ser fsicos, qu-
micos o biolgicos.

202
GLOSARIO

Ncleos generativos. En angiospermas, corresponden a los

dos gametos masculinos que se forman por divisin
de la clula generativa. Ambos migran por el tubo pol-
nico participando en el proceso de fertilizacin. Uno
se fusiona con la clula huevo para formar el cigoto;
el otro, normalmente se fusiona con los ncleos pola-
res para formar el ncleo primario del endosperma.

Ncleo vegetativo. En el polen de angiospermas; correspon-

de a un ncleo de mayor tamao que los ncleos gene-
rativos. Su funcin, durante la germinacin del polen,
es controlar el desarrollo del tubo polnico, desinte-
grndose cuando ste penetra al nucelo.

Nuclesido. Molcula que posee un anillo heterocclico con

tomo de carbono y nitrgeno (bases nitrogenadas) y
un grupo azcar con cinco carbonos dispuestos en
forma de anillo pentosa. Las bases nitrogenadas pue-
den ser purinas (adenina y guanina) y pirimidinas (cito-
sina, timina y uracilo).

Nucletido. Unidad qumica que compone el DNA. En esen-

cia, corresponden a nuclesidos que han sido incorpo-
rados a un cido nucleico a travs de uniones fosfo-
dister (utilizando un grupo fosfato).

Ontogenia. Todos los cambios que ocurren en la historia de

vida de un organismo.

Opern. Unidad de expresin y de regulacin gnica en

bacterias, en que un conjunto de genes es transcrito
bajo el control de un promotor nico, originando un
mRNA policistrnico.

Opinas. Compuestos aminoacdicos derivados de arginina

que permiten a Agrobacterium, una mejor interaccin
con la planta.

Organognesis. Los cambios en el desarrollo que ocurren

durante la formacin de un rgano determinado.

Organelo. Parte especializada de una clula eucaritica de-

limitada por una membrana, con funciones especficas.
Cloroplastos y mitocondrias son ejemplos de organelos.

203
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Origen de replicacin autnomo. Secuencia de nucletidos

en la que se inicia la duplicacin (replicacin) del
DNA, de una forma autnoma de otras secuencias si-
milares o con la misma funcin en una clula.

Partenognesis. Produccin de un embrin del gameto fe-

menino sin la participacin del gameto masculino.

Patrones de difraccin. Conjunto de desviaciones en un haz

de rayos X al atravesar el DNA en estructura semicris-
talina. Estas se registran en pelculas fotogrficas.

pH. Abreviatura que expresa el logaritmo negativo de la con-

centracin de iones de hidrgeno de una solucin
acuosa.

Pili bacteriano. Filamento proteico que se forma en la su-

perficie de algunas clulas bacterianas que permite su
ligacin a otras clulas bacterianas. Por ejemplo, el
pili F (canal sexual) est involucrado en la conjuga-
cin bacteriana.

Planta transgnica. Planta modificada genticamente a tra-

vs de tcnicas biolgicas especficas que involucran
la insercin en su genoma, de un segmento de DNA
distinto al de su genoma original.

Planta transplastmica. Planta transgnica, modificada

especficamente en el genoma de sus organelos y no
en el nuclear.

Plasmidio. DNA circular extracromosomal con origen de re-

plicacin autnomo, presente en el citoplasma bac-
teriano.

Plasmidio binario. Plasmidio que se utiliza para transforma-

cin de plantas y cuyas funciones son cooperativas
con otro, para generar un complejo T funcional y trans-
ferible.

Plasmidio integrativo. Plasmidio con secuencias homlogas

al plasmidio residente de las cepas comerciales de
Agrobacterium. Al incorporarse a la bacteria, estas

204
GLOSARIO

zonas permiten la recombinacin homloga entre el

plasmidio residente y el integrativo, formado un
plasmidio Ti (o Ri) ntegro, formando as el comple-
jo T y transformando las clulas blanco.

Plasmidio lanzadera. Plasmidio que funciona tanto en A.

tumefaciens como en E. coli y que posee los brazos
izquierdo y derecho de Agrobacterium. Esta caracte-
rstica, permite que todas las operaciones de clo-
namiento de un gen de inters (en su sitio mltiple de
clonamiento) y su manipulacin para que se exprese
correctamente en la planta, son posibles de realizar
en este plasmidio utilizando bacterias tipo E. coli, tal
como si fuera un plasmidio pequeo y con todas las
herramientas que se pueden aplicar con la tecnologa
del DNA recombinante.

Plasmidio recombinante. Plasmidio que posee en su sitio

mltiple de clonamiento, un fragmento de DNA exter-
no de inters e insertado mediante tcnicas de DNA
recombinante.

Plasmidio Ti. Plasmidio encontrado en cepas patognicas

de Agrobacterium tumefaciens. La bacteria transfiere
parte de su DNA (T-DNA) a la clula vegetal, generan-
do la enfermedad de la agalla de la corona.

Plasmidio Ti residente. Plasmidio Ti desarmado, habitante

de A. tumefaciens y que slo posee las funciones vir.

Poliembriognesis. Produccin de ms de un embrin de

clulas gametofticas o esporofticas.

Poliembriognesis esporoftica. Cuando un embrin se ge-

nera por yemacin esporoftica del nucelo o del
integumento en plantas con flores. Los embriones son
normalmente idnticos entre s y la planta madre.

Poliembriognesis simple. Cuando varias clulas huevo se

desarrollan de una megaspora, siendo cada una ferti-
lizada por esperma o una espora distinta, o su desa-
rrollo puede ocurrir en forma partenognica.

205
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Poliploida: 1) Clula u organismo con un nmero mltiplo

de cromosomas mayor que el normal (diploide). 2) C-
lula u organismo con un nmero mltiplo de cromoso-
mas de un conjunto haploide, causado por la replica-
cin cromosomal sin divisin celular.

Presin osmtica. Presin inducida por el flujo osmtico

(energa libre) del agua a travs de una membrana para
una solucin en la cual el soluto est en mayor con-
centracin. (Sinnimo = Potencial Osmtico).

Polimorfismo gentico. Ms de una forma gentica.

Primordio. Cualquier parte inmadura de una planta destinada

a diferenciar en una cierta clula, tejido u rgano; ejem-
plo, un primordio foliar se diferenciar luego en una hoja.

Producto biofarmacutico. Producto de utilidad farmacu-

tica, producido por herramientas biotecnolgicas en
organismos (plantas, clulas, animales) modificados
genticamente con el gen que fomenta (o produce di-
rectamente) una alta cantidad de l (ejemplo, insulina
o interfern producido en bacterias).

Promotor. Secuencia nucleotdica o regin de un gen, en

que una RNA polimerasa se une para dar inicio a la
transcripcin de dicho gen. Adems de la RNA poli-
merasa, son requeridas una serie de protenas que se
unen a DNA, a otras protenas, o a ambos.

Promotor 35S 35S-CaMV. Una de las secuencias promotoras

de la transcripcin en plantas ms fuerte conocidas has-
ta el momento. Se aisl del virus del mosaico de la coli-
flor (CaMV), en donde activa la transcripcin del RNA35S
del virus.

Protenas multimricas. Protenas que presentan ms de una

cadena de polipptidos en mltiples combinaciones.

Protocolo de Cartagena. Acuerdo legalmente vinculante para

proteger el ambiente de los eventuales riesgos que po-
dra ocasional el movimiento transfronterizo de orga-
nismos vivos modificados (OVMs). El objetivo es que

206
GLOSARIO

los pases tengan la oportunidad de realizar el anlisis

de riesgo que involucra la internacin de los produc-
tos obtenidos mediante la biotecnologa moderna. De
esta forma, se persigue que cada pas pueda tomar de-
cisiones de una forma lo ms informada posible con
respecto a estos organismos y sus contenedores (ali-
mentos, granos, materias primas, etc.).

Puentes de hidrgeno. Atraccin electrosttica dbil entre

un tomo electronegativo (Oxgeno, Nitrgeno, etc.)
y un tomo de hidrgeno. Enlace que permite el apa-
reamiento complementario de bases segn el modelo
de Watson y Crick.

Quelato (de chelos= tenazas). Compuesto qumico capaz

de capturar temporalmente un in en una solucin,
evitando su precipitacin y hacindolo de esta mane-
ra, soluble y disponible para su absorcin por las plan-
tas.

Radiacin ionizante. Radiacin beta y o gamma, incluyen-

do rayos X, que provocan la ruptura de la hebra cro-
mosomal y con ello, graves mutaciones en la clula y
organismo.

Razn estequiomtrica. Proporcin de masas entre distintos

tomos. A nivel de DNA, se refiere a que la constitu-
cin de una clula entre adeninas y timidinas es 1:1,
de forma similar a lo que acontece con la proporcin
entre guaninas y citocinas.

Reaccin de ligacin. Reaccin in vitro en la que se intenta

ligar dos fragmentos de DNA de inters, mediante la
enzima DNA ligasa.

Recombinacin del DNA. Evento molecular en el que he-

bras de DNA son intercambiadas.

Recombinacin homloga. Proceso en el que se intercam-

bian dobles hebras de DNA en zonas donde existe una
similitud substancial de las secuencias (es decir,
homologa).

207
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Recombinacin ilegtima. Recombinacin de DNA en el que

se incluyen todos los eventos de recombinacin que
no caen en recombinacin homloga o sitio especfi-
ca. En esencia, este tipo de recambio o integracin
entre hebras de DNA no requiere homologa de se-
cuencias, o si lo hace, estas son zonas de unos pocos
nucletidos de largo.

Recombinacin sitio especfica. Recombinacin del DNA

que involucra el reconocimiento entre secuencias que
son homlogas e involucran la participacin de pro-
tenas de recombinacin. Este mecanismo se ha identi-
ficado especialmente en E. coli, que posee secuencias
que son homlogas al bacterifago y que requieren
la participacin de una protena llamada integrasa.

Regeneracin. Estadio clave en el cultivo in vitro y transfor-

macin de plantas, en donde, las clulas de un ex-
plante eventualmente sometido a transformacin
gentica, son inducidas a re-diferenciar hasta una plan-
ta nueva. Esto se procura mediante la manipulacin
hormonal especfica.

Replicacin semiconservativa. Modelo propuesto por Watson

y Crick para la replicacin (duplicacin) del DNA, en
donde cada una de las hebras molde se separan, para
dar origen a su complementaria respectiva.

Ribosoma. Complejo ribonucleoproteico encontrado en el

citoplasma de las clulas, en forma libre o unido a
membranas del retculo endoplasmtico. Poseen dos
subunidades, mayor y menor, siendo la menor la en-
cargada de unirse al RNA y la mayor, de aportar a la
maquinaria necesaria para ingresar los aminoacil-
tRNAs, descargarlos y cargar otros nuevos.

RNA de transferencia (tRNA). RNA que media la traduccin

de cidos nucleicos en secuencias de aminocidos.
Sirven de molculas adaptadoras, uniendo cada amino-
cido especficamente (por lo que existen por lo me-
nos 20 tRNAs distintos) y lo ubican segn la lectura
del codn respectivo, el que tambin es ledo por
otro segmento del tRNA (el anticodn).

208
GLOSARIO

RNA mensajero (mRNA). RNA que lleva la informacin que

va a ser traducida a protenas. Representa una peque-
a fraccin del RNA total.

Secuencias flanqueadoras (en el DNA). Secuencias de DNA

encontradas junto a la de inters.

Secuencia palindrmica. Secuencia del DNA que es reco-

nocida por las enzimas de restriccin y que varan en
su largo (4, 6 ms nucletidos) segn dicha enzima.
Estas secuencias son repetidas invertidas, vale decir,
que son idnticas cuando ambas hebras son ledas en
la direccin opuesta (desde una hebra y su comple-
mentaria).

Seleccin. Estadio en la transformacin de plantas, en don-

de, las clulas regeneradas son sometidas a una com-
probacin masiva de su estado efectivo de transfor-
macin, a travs del uso de marcadores de resistencia
a antibitico, morfolgico u otro.

Semillas recalcitrantes. Son semillas que pierden rpidamen-

te su poder germinativo durante el almacenamiento y
son posteriormente difciles de germinar. En semillas
de frutos tropicales esta caracterstica es comn. Ejem-
plo: caf, cacao, caucho, etc.

Simplstico (relativo a simplasto). Todo lo que implica

transporte de agua y iones por estructuras celulares
tales como membranas, citosol, plasmodesmos, exclu-
yendo transporte por la pared celular y espacios inter-
celulares.

Sitio mltiple de clonamiento. Sitio especfico de un plasmi-

dio, en donde se han posicionado sucesivamente, dis-
tintos sitios de restriccin para poder insertar all, en
varias posibilidades, un segmento externo de DNA de
inters.

Solucin hidropnica. Solucin nutritiva con aireacin para

hacer crecer plantas con inters cientfico o econmico.

209
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

Solucin hipotnica. Es una solucin en que el soluto est

en baja concentracin molar. Ejemplo: 0,01 molar de
NaCl. Contrariamente en la solucin hipertnica el
soluto est en mayor concentracin. Ejemplo: 2 molar
NaCl.

Suspensin celular. Conjunto de clulas aisladas creciendo

en un medio de cultivo bajo condiciones in vitro.

T-DNA o DNA de transferencia. Fragmento del plasmidio Ti

que va a ser transferido a una planta. En forma origi-
nal, el T-DNA est constituido por los genes que per-
miten la sntesis de opinas y fitohormonas, flanqueados
por los brazos izquierdo y derecho. En los plasmidios
lanzadera o de tipo binario, estos genes se han remo-
vido y reemplazado por sitios mltiples de clonamiento
y "cassettes" de expresin para genes reportero.

Tcnica del DNA recombinante. Conjunto de tcnicas que

permiti la manipulacin y el clonamiento de fragmen-
tos de DNA de inters.

Terminador. Secuencia de DNA localizada en el extremo 3

de la regin codificante de un gen y que obliga a la
RNA polimerasa a interrumpir la transcripcin y diso-
ciarse del DNA.

Tonoplasto. Membrana unitaria de la vacuola de una clula

vegetal.

Totipotencia celular. Capacidad que pueden expresar algu-

nas clulas diferenciadas para regenerar plantas ente-
ras clulas vegetales y clulas tronco-embrionarias en
animales.

Transformacin bacteriana. Evento de captacin de DNA

desde el medio externo por parte de una bacteria. En
el laboratorio, es la transferencia controlada de una
secuencia o porcin de DNA hacia una bacteria, ge-
neralmente utilizando plasmidios.

210
GLOSARIO

Transformacin estable. Transferencia controlada de una

secuencia o zona de DNA hacia un genoma receptor,
generalmente aportando nuevas caractersticas a este
genoma, que son establemente adquiridas.

Transposasa. Enzima clave involucrada en las actividades

de salto de elementos de DNA especficos llamados
transposones, hacia un nuevo sitio del genoma.

Transposn. Elemento gentico capaz de translocarse (escin-

dirse e insertarse) a una nueva posicin.

Tubo polnico. Estructura originaria de la intina del grano

de polen que, durante su germinacin, emerge a tra-
vs de una apertura existente en la exina, creciendo
hacia la clula huevo y portando el ncleo vegetativo
y ncleos generativos.

Vacuola. En la clula vegetal, cavidad celular llena de flui-

do, separada del citosol, provista de una membrana
unitaria (tonoplasto). Clulas jvenes pueden tener
varias vacuolas pequeas respecto de clulas adultas
que generalmente poseen una sola. Su tamao puede
implicar el 90% del volumen celular.

Zigoto (cigoto). Producto de la fusin de dos gametos antes

que se inicie la mitosis o meiosis.

211
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

212
AUTORES

HUMBERTO PRIETO E.
Chileno, Bioqumico, Doctor en Bioqumica e
investigador jornada completa en INIA La Platina
desde 1998. Su principal rea de trabajo ha sido
participar e impulsar diversos proyectos de
transformacin gentica de plantas dentro del
grupo de investigacin del Laboratorio de
Biotecnologa de INIA-La Platina. Uno de los
primeros trabajos en este tema en INIA LaPlatina,
fue la generacin de melones resistentes a aislados
chilenos del Watermelon Mosaic Virus Type II,
trabajo iniciado en 1994 y culminado en 1999,
siendo a la vez su tesis doctoral. Luego, se
ha vinculado activamente al desarrollo de la
plataforma de transformacin gentica de cultivos
econmicamente importantes, como vides y
ltimamente, frutales de carozo (iniciativas
FONDEF, FDI; en conjunto con Fundacin Chile,
Agrcola Brown y ANA). En forma adicional,
desde el ao 2000, el Dr. Prieto tambin se ha
relacionado con las iniciativas de genmica
funcional de vides (en el sub-proyecto del estudio
de la respuesta vegetal frente al hongo Botrytis
cinerea) y en el desarrollo de un proyecto FIA,
que evala el flujo gnico entre cultivos
genticamente modificados y sus parientes
silvestres.

213
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

AUTORES

MIGUEL JORDAN
Nacido en Alemania y nacionalizado chileno.
Desde 1967, es profesor e investigador a tiempo
completo en la Pontificia Universidad Catlica de
Chile. Doctorado en 1975, Justus Liebig- Universitt,
Giessen, Alemania. Profesor Encargado del curso
de Fisiologa Vegetal. Su investigacin est referida
a aspectos de Morfognesis y Regeneracin de
Plantas, en particular al potencial de manipulacin
y regeneracin de plantas a partir de sistemas
celulares (protoplastos y suspensiones), tejidos y
rganos bajo condiciones in vitro, como igualmente
aspectos de transformacin en plantas referidos a
papa, pepino dulce y tomate de rbol (tamarillo)
(Proyectos PNUD, CONICYT, AID).
Otras actividades de investigacin corresponden a
estudios sobre germinacin, viabilidad, multiplicacin
y conservacin in vivo e in vitro a bajas temperaturas
de clones lite de diferentes especies forestales
introducidas y nativas (pino, eucalipto, raul)
(Proyectos con BIOFOREST); produccin in vitro
de diversos compuestos metablicos y regeneracin
de plantas medicinales (BMBF). Estos aspectos estn
igualmente vinculados con otras temticas, en especial
aspectos de Fitorremediacin de diversos residuos,
acumulacin de metales pesados con uso de plantas
tolerantes y sobre colonizacin de especies vegetales
en depsitos de acopio de residuos (FONDEF/DIPUC).

214
AUTORES

L. PEDRO BARRUETO CID

Nacido en Chile, investigador en el rea de cultivo
de tejidos de plantas en el Centro Nacional de
Recursos Genticos y Biotecnologa (CENARGEN)
ubicado en Brasilia-DF y dependiente de la
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria
(EMBRAPA), empresa dependiente del Ministerio
de Agricultura del Gobierno Brasileo. Profesor
de Biologa y Ciencias de la Universidad de Chile.
Magister Scientiae en Fisiologa Vegetal,
Universidad Federal de Viscosa, MG Brasil;
Doctor Scientiae en Fisiologa Vegetal, Universidad
de Campinas, Sao Paulo, Brasil. Post-doctorado en
el tema de Hiperhidricidad en UC-Davis (USA).
Como investigador, es coordinador en la actualidad
de dos proyectos de investigacin en el rea del
cultivo de tejidos. Uno sobre micropropagacin
de caf (Coffea arabica) y otro sobre pia (Ananas
comosus), a travs del uso de biorreactores de
inmersin permanente. Adems, como investigador,
es consultor de varios proyectos de investigacin
de otras unidades de EMBRAPA, entre ellos
mandioca, mango y eucalypto. En CENARGEN,
es responsable del curso sobre Introduccin al
Mtodo Cientfico, para alumnos de pre y
post-grado del rea de biologa de plantas.

215
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

M. CRISTINA R. CORDEIRO
Brasilea nacida en Rio de Janeiro,
Biomdica, M.Sc. en Biofsica y Ph.D.
en Biologa Molecular. Ex profesora de
la Universidad Gama Filho en Rio de Janeiro.
Actualmente se desempea como investigadora
en el rea de biotecnologa (biologa molecular)
en el Centro de Pesquisa de Cerrados de EMBRAPA,
en Braslia-DF, dependiente del Ministerio de
Agricultura del Brasil. Investigadora especializada
en biologa molecular del Centro de Pesquisa
Agropecuria do Cerrado (CPAC), Brasilia, Brasil.
Sus lneas actuales de investigacin son:
Mejoramiento Gentico de Frutas con nfasis en
mango, especficamente en EMBRAPA Cerrados
(Subproyecto Uso de Marcadores Moleculares no
Melhoramento Gentico da Mangueira (Mangifera
indica, L.)) y mejoramiento en leguminosas
(Subproyecto Banco de Germoplasma de
Leguminosas com Potencial Forrageiro
para a Regio dos Cerrados).

216
AUTORES

DON DURZAN
Nacido en EE.UU., profesor del Environmental
Horticulture de la University of California en Davis.
Entre 1981 a 1986 fue Chairman del Department
of Pomology. En conjunto con Calgene, logr la
primera evidencia de introduccin de genes estables
en conferas. Gest ocho patentes en USA vinculadas
con poliembriognesis somtica, partenognesis,
drogas anticncer, mtodos de deteccin, y usos de
ciclodextrinas en formulaciones nutritivas. Junto
con NASA microgravity support ha inducido la
sobreproduccin de TaxolTM, droga anti-cancergena
generada en clulas rediseadas. Ha sido consultor
de US Agency for International Development, the
Center for Application of Biotechnology in
Agriculture, the United Nations Development
Program para Indonesia, y para gobiernos e
industrias de biotecnologa y de azcar de diferentes
pases. Cuenta con artculos en variados temas tales
como Bioqumica Analtica, Bioqumica, Botnica,
Fisiologa Vegetal, Fisiologa de Insectos y Forestal.
Co-editor de cinco volmenes de libro referidos a
cultivo de clulas y tejidos de especies forestales y
causas de envejecimiento a nivel molecular.
Editor asociado y referee en varias revistas cientficas.

217
 BIOTECNOLOGA VEGETAL

218

View publication stats