TECNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR

Laboratorio
Introduccin
La biologa molecular es una extensin de la bioqumica que enfoca su rea de estudio en las molculas de
importancia biolgica como son protenas y cidos nucleicos (DNA y RNA).Es por eso que es importante
conocer algunas de las herramientas que con los aos se ha desarrollado para la investigacin de esta rea de
la biologa.
Como se mencion, el DNA forma una parte importante de la biologa molecular y su obtencin es
fundamental para su anlisis. A pesar de que se han desarrollado nuevos mtodos de obtencin que resultan
en DNA un poco ms libre de impurezas, las propiedades qumicas tanto de las membranas celulares y del
mismo DNA permiten mtodos de extraccin poco costosos y caseros.
Sin embargo, verificar la pureza del DNA obtenido es importante y algunas formas de checar eso es mediante
la espectrofotometra para a partir de esta obtener relaciones de absorbancia cuyos valores nos dirn en que
estado de pureza se encuentra nuestro DNA. Estos valore, as como las longitudes de onda a las culaes se debe
analizar el DNA se encuentran estandarizados.
Desde que se estableci que el DNA contiene la informacin necesarias para el desarrollo y funcionamiento
de los organismos y que se transmite ya sea por desendencia o por algn otro mecanismo, la manipulacin
del material gentico se ha vuelto una prioridad y motivo de desarrollo de varias tecnologas que permitan
esto.
Las bacterias resultaron ser un organismos muy tili ya que de manera natural asimilan con facilidad DNA
extrao proveniente de plsmidos de otras bacterias. La modificacin de estos plsmidos permite que se
pueda controlar el fenotipo expresado por una bacteria para que atienda a las necesidades cientficas. A este
proceso de permitir que una bacteria asimile un plsmido modificado con un determinado gen y hacer que
exprese un fenotipo deseado se le conoce como transformacin bacteriana y uno de sus usos es la obtencin
de una determinada protena en grandes cantidades al modificar colonias enteras de bacterias. Sin embargo,
en esta tcnica de transformacin bacteriana se corre el riesgo de que las bacterias no internen los plsmidos
y para verificar una transformacin exitosa se utilizan fenotipos caractersticos y fcilmente identificables
como la resistencia a antibiticos; esta resistencia se expresa si las clulas adquieren el plsmido.

Metodologa
Para la extraccin del DNA se sigui un mtodo casero y fcil de realizar. Para la ruptura de membranas
celulares se coloc la muestra biolgica, en este caso pulpa de guayaba, en un matraz y se le aadi
detergente lquido para trastes. Posteriormente se agreg jugo de pia y un poco de sal. Se revolvi con
cuidado esta mezcla y lentamente se aadi alcohol fro. En este punto se pudo observar como el DNA se
precipitaba y fue posible extraerlo y almacenarlo para la siguiente sesin.
Para verificar la pureza del DNA obtenido se realiz el lavado y centrifugado del DNA. Primero se centrifug
durante tres minutos a 14000 rpm y el botn se resuspendi con etanol 70% fro. Se repiti este proceso hasta
que el botn casi no fuera visible y con un color blanco. Se dej secar y posteriormente se le 300 aadi m de
solucin salina y se mezcl perfectamente.
Se procedi a leer las absorbencias a 260 nm y 280 nm de la muestra ms 950 m de solucin salina una celda
de cuarzo. Para aumentar la pureza de la muestra se re-precipit el DNA en 4 volmenes de etanol absoluto,
se centrifug, sec y redisolvi en solucin salina y se volvi a cuantificar a las dos longitudes de onda.
Para la transformacin bacteriana se nos proporcion un plsmido que contiene resistencia a ampicilina y
clulas bacteriana competentes. A los tubos con clulas se les aadi 1 l de DNA en concentracin 10 m y se
dejaron en hielo por 30 minutos al cabo de los cuales se les coloc a bao mara con agua a 42C por 90
segundos (choque trmico) y se esper a que las clulas se recuperaran al colocarlas en hielo por 5 minutos.
A los tubos con clulas se le aadieron 900 l de medio LB y se mantuvieron a 36 por 30 minutos. En un placa
de agar LB se sembr 1 l de clulas y en otra placa pero esta LB + ampicilina se sembr 10 l de clulas
potencialmente transformadas. Ambas placas se dejaron incubar a 37C y se verific el desarrollo de colonias.

Resultados
De la extraccin de DNA conseguimos muestra suficiente para realizar la cuantificacin (fig. 1). Los resultados
de las absorbancias se muestran en la tabla 1 y la relacin OD final qued con un valor de 0.8
, lo cual nos indica que existe cierto grado de contaminacin en la muestra puesto que la relacin ideal es de1.6.

Fig. 1

Lectura 260 nm 280 nm OD

1 0.106 0.152 0.697
Tabla. 1
2 0.208 0.245 0.8

La transformacin bacteriana (realizada la segunda vez) nuestro cultivo en LB se dio en forma de tapete,
haciendo imposible el conteo de colonia (Fig. 2). Esto puedo ocurrir debido a una equivocacin en la cantidad
sembrada. Por otro lado el cultivo en LB + Amp mostr un crecimiento de algn tipo de colonia cuya
morfologa no corresponde a E. coli. Sin embargo, una revisin ms detallada muestra una pequea colonia
que s se asemeja a la buscada (Fig. 3).
 Fig. 2. Siembra de bacterias
en medio LB.
Fig. 3. Se seala con un
crculo la colonia que
posiblemente corresponda
a bacterias transformantes.

Discusin
El mtodo utilizado para la extraccin de DNA involucra a varios posibles contaminantes de la muestra
adems de que esta no se trat con las medidas adecuadas para evitar la contaminacin. Esto qued
demostrado en la prctica nmero dos puesto que nuestra relacin OD es menor a la que se espera en una
muestra de DNA puro. 0.8 es un valor que nos dice que la muestra est contaminada con otras protenas. Otra
de las posibles causas de estas impurezas es que, en el afn de conseguir ms DNA, el matraz con el DNA ya
precipitado se puso a enfriar, causando posiblemente la precipitacin de protenas que no son de nuestro
inters.
La transformacin bacteriana se intent realizar dos veces. En la primera los cultivos en placas de LB se
realizaron con diluciones de las clulas, lo que disminuy el nmero de bacterias a crecer en medio LB + AMP
y por esta razn, la segunda vez se decidi no realizar las diluciones. Posiblemente este cambio fue lo que
propici el crecimiento de la colonia no identificada (y posiblemente transformante) que se menciona en los
resultados. ). Es imposible determinar con precisin si esta colonia corresponde a bacterias transformadas y
para determinarlo sera necesario anlisis adicionales y un cultivo de esta colonia.