[REV. MED. CLIN.
CONDES - 2013; 24(4) 563-570]
BIOLOGA MOLECULAR EN ONCOLOGA:
LO QUE UN CLNICO DEBIERA SABER
MOLECULAR BIOLOGY IN ONCOLOGY: WHAT A PHISICIAN SHOULD KNOW
DR. GONZALO ENCINA S. (1)
1. Bioqumico, PhD. Laboratorio de Oncologa y Gentica Molecular. Clnica Las Condes.
Email: gencina@clc.cl
RESUMEN
El cncer es una patologa con prevalencia en alza y cuyo
origen se encuentra en el DNA, ms especcamente en las
alteraciones que lo afectan, y que nalmente se traducen en
la desregulacin del ciclo celular y de los mecanismos celula-
res reparadores del DNA. La desregulacin del ciclo celular se
traduce nalmente en la formacin de tumores, que pueden
invadir tejidos u rganos distantes, provocando la muerte del
paciente. Conocer y entender las alteraciones y/o daos que
puede sufrir el DNA permite comprender el proceso de carci-
nognesis a escala molecular, pero tambin a escala humana.
Esta revisin pretende actualizar y/o claricar algunos con-
ceptos moleculares bsicos del cncer, cmo stos pueden
estudiarse en un laboratorio de biologa molecular y cmo
pueden ayudar a mejorar la prctica clnica con un paciente
oncolgico.
Palabras clave: Cncer, DNA, gen, mutacin, polimorsmo,
PCR, anlisis gentico.
SUMMARY
Cancer prevalence is rising worldwide. The main pathogenic
events of this devastating disease are alterations in the
DNA, which eventually result in the dysregulation of
both the cell cycle and DNA repair mechanisms. This
dysregulation of the cell cycle results in the formation of
a tumor, from which cancer cells disseminate to distant
organs, nally bringing about patient death. Knowledge
and understanding of the nature of the DNA alterations is
essential to the comprehension of the carcinogenic process
at both a molecular and human scale. This review aims to
update and clarify some basic molecular concepts in cancer,
Artculo recibido: 29-04-2013
Artculo aprobado para publicacin: 30-05-2013
focusing principally on how alterations can be studied
within the molecular biology lab, and how this discipline
can improve clinical cancer practice.
Key words: Cancer, DNA, gene, mutation, polimorsm,
PCR, genetic analyses.
INTRODUCCIN
La alta prevalencia del cncer a nivel mundial y la gravedad de sus im-
plicancias lo han convierten la ms icnica de las patologas humanas.
Es as como prcticamente cualquier persona tiene una nocin ms o
menos acertada de qu es el cncer. La Organizacin Mundial de la
Salud dene al cncer como un proceso de crecimiento y diseminacin
incontrolado de clulas que puede aparecer prcticamente en cualquier
lugar del cuerpo. El tumor suele invadir el tejido circundante y puede
provocar metstasis en puntos distantes del organismo. Sin embargo,
lo que mayoritariamente no se sabe es que el cncer podra tambin
denirse como una enfermedad del DNA, y que como consecuencia del
dao en el DNA se afecta la proliferacin celular con todas las conse-
cuencias frecuentemente conocidas.
El DNA es otro cono de las ciencias biolgicas, con una estructura tridi-
mensional de doble hlice fcilmente reconocible e instalada en el sub-
consciente colectivo. Destaca adems por ser la molcula codicadora
de las instrucciones genticas usadas en el desarrollo y funcionamiento
de todos los organismos vivos conocidos y algunos virus. Adems, es la
molcula responsable de la transmisin hereditaria. Sin embargo, poco
se sabe sobre las alteraciones que puede sufrir el DNA, de sus repercu-
siones, o de los mecanismos que utiliza el organismo para defenderse
o reparar los daos a los que estamos habitualmente expuestos. Enten-
diendo los tipos de alteraciones y/o daos que puede sufrir el DNA es
posible comprender el proceso de carcinognesis desde un punto de
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vista molecular, pero a la vez amplio, y aplicable en el entorno clnico La regin codicante a su vez esta dividida funcionalmente en 2 ti-
diario. Esta revisin pretende, en trminos muy simples, actualizar y/o pos de segmentos; (i) los exones y (ii) los intrones. Los exones e intrones
claricar algunos conceptos moleculares bsicos del cncer y cmo s- se intercalan ordenadamente como vagones de un ferrocarril. Los exo-
tos pueden estudiarse en un laboratorio de biologa molecular. nes contienen la informacin gentica cifrada mientras que los intrones
no. Los intrones deben ser removidos, dejando nicamente a los exones
alineados y ordenados. Este proceso se conoce como corte y empalme
NUEVO DOGMA DE LA BIOLOGA MOLECULAR o splicing y genera una secuencia de RNA especca, ms corta que
El dogma central de la biologa molecular es un concepto que ilustra el su contraparte de DNA.
mecanismo de transmisin de la herencia gentica y de su expresin,
formulado por Francis Crick en 1970 (1). Inicialmente se propona un
sentido unidireccional en el ujo de la informacin gentica, comen-
zando por el DNA, seguido por el proceso de transcripcin1 a RNA y FIGURA 1. DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGA
nalmente por la traduccin2 a una protena. Actualmente se sabe que MOLECULAR
el proceso de ujo de la informacin gentica es bidireccional, con pro-
cesos como la transcripcin inversa o paso de RNA a DNA, fenmeno
utilizado por retrovirus para multiplicarse en las clulas infectadas. El Propuesta inicial de Crick (1970)
DNA puede tambin duplicarse, generando una nueva copia de DNA.
Adems, algunas protenas son capaces de duplicarse y proliferar en Replicacin
ausencia de DNA, como en el caso de los priones (Figura 1). Transcripcin Traduccin
DNA RNA Protena
ESTRUCTURA Y FUNCIN DE UN GEN.
Actualmente se dene como gen a un segmento de DNA que codica
para cualquier molcula con actividad biolgica3, no slo protenas. Modicaciones posteriores
As, encontramos genes que codican para ribozimas (fragmentos
de RNA que cortan y destruyen a otro RNA), RNA de transferencia Replicacin Replicacin Replicacin
(tRNA) necesarios para la sntesis de protenas, micro-RNA (miRNA)
o RNA con actividad reguladora de la expresin gnica, entre otras, Transcripcin Traduccin
siendo las protenas el producto principal (en adelante generalizare- DNA RNA Protena
mos como protenas al producto de la expresin gnica). Funcional-
Transcripcin
mente, los genes estn divididos en 2 regiones: (i) la regin codi-
inversa
cante y (ii) la regin promotora. Se llama regin codicante al
segmento de DNA que contiene la informacin que dar origen a una
protena. Por otro lado, la regin promotora (o promotor) es un Concepto propuesto inicialmente en 1958 por Francis Crick, postulndose
nuevamente en un artculo de la revista Nature publicado en 1970, que ilustra un
segmento de DNA localizado inmediatamente adelante o rio arriba mecanismo unidireccional de transmisin y expresin de la herencia, desde el DNA
de la regin codicante, y que posee una funcin reguladora de la hasta las protenas, pasando por el RNA. El dogma inicial postulaba que slo el ADN
expresin gnica. El promotor es el responsable de que no todos los puede duplicarse y, por tanto, reproducirse y transmitir la informacin gentica a la
descendencia. Actualmente se ha ampliado el dogma debido al descubrimiento
genes se expresen en todas las clulas del cuerpo. As, la insulina se de la transcriptasa inversa, enzima capaz de transformar el RNA a DNA, presente
expresa slo en las clulas beta del pncreas y no en neuronas o car- en retrovirus, o los priones, protenas capaces de replicarse en ausencia de DNA,
diomiocitos. En otras palabras, puede visualizarse al promotor como o de las ribozimas, RNAs con propiedades autocatalticas capaces de modicarse
y duplicarse a s mismos en ausencia de protena y ADN. Otra situacin que rompe
un interruptor gentico que determina la expresin especca de una
con la secuencia denida por el dogma es la posibilidad de obtener protena in vitro,
protena en un tejido particular, o en un ciclo circadiano da/noche, o en un sistema libre de clulas y en ausencia de ARN, por lectura directa del ADN
en respuesta a un estmulo especco. mediante ribosomas, en presencia de neomicina.

1
Se llama transcripcin al proceso de paso de DNA a RNA. Tanto el DNA como el RNA estn compuestos por las mismas unidades bsicas, los nucletidos adenina (A), timina (T),
guanina (G) y citosina (C). Haciendo una analoga literaria es posible imaginar que el DNA y RNA hablan un mismo idioma, el idioma de los nucletidos. Cobra sentido entonces
el hecho que el nombre del proceso de paso de DNA a RNA se llame transcripcin, ya que solo se esta transcribiendo o copiando un mensaje en el mismo idioma.
2
Se llama traduccin al proceso de paso de RNA mensajero (o mRNA) a una protena. A diferencia del DNA y RNA, las protenas estn compuestas por unidades bsicas distintas
a los nucletidos, los aminocidos. Continuando con la analoga anterior, en el paso del RNA a protenas existe un cambio de idioma, traduciendo el idioma de los nucletidos
al idioma de los aminocidos.
3
Inicialmente se aceptaba el axioma de Un gen, una protena haciendo referencia a que cada protena de nuestro cuerpo estaba codicada por su nico y exclusivo gen. El
genoma humano esta compuesto por aprox. 27000 genes. Sin embargo, poseemos mucho ms de 27000 protenas distintas. En la actualidad se sabe que un gen puede dar origen
a ms de una protena mediante un proceso llamado corte y empalme alternativo o splicing alternativo.

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El cdigo gentico y los tipos de alteraciones genticas
El DNA est compuesto por los nucletidos A, T, C y G. La combi-
nacin de estas cuatro letras en triadas llamadas codones, dan
origen a una biblioteca gentica con aproximadamente 27000 li-
bros o genes, todo esto dentro de cada una de nuestras clulas
nucleadas. Las distintas combinaciones de nucletidos en diferentes
codones dan nalmente origen a 23 aminocidos. Algunas combina-
ciones tales como T-A-G no codican para un aminocido sino que
son seales de trmino de la traduccin, es decir, donde se detiene
la sntesis de la cadena proteica. Una caracterstica importante del
cdigo gentico es que ms de un codn puede codicar para un
mismo aminocido. Por ejemplo, las combinaciones G-G-G y G-G-A
codican para el aminocido glicina. Se agrega as un sistema de
seguridad frente a alteraciones en el DNA para que, aunque cambie
G por A, no se produzca un cambio en la protena ya que ambas
combinaciones dan origen al mismo aminocido, glicina. El orden
de importancia de cada letra de un codn aumenta de derecha a
izquierda, siendo el primer nucletido fundamental en la codicacin
de cada aminocido. Un cambio en la primera letra del codn siem-
pre cambiar el aminocido codicado.
TIPOS DE ALTERACIONES GENTICAS
Nuestro organismo y nuestro DNA est sometido constantemente a la
accin de agentes nocivos con capacidad de introducir alteraciones en la
secuencia de nucletidos; radiacin UV, tabaco, polucin ambiental, etc.
Una secuencia de DNA puede sufrir tres tipos de alteraciones principales:
1. Sustituciones nucleotdicas.
2. Inserciones nucleotdicas.
3. Deleciones nucleotdicas.
Las sustituciones son remplazos de un nuclotido por otro. El ejem-
plo anterior graca una sustitucin de G por A en el codn que co-
dica para glicina. Algunas sustituciones pueden (o no) cambiar el
aminocido. Aquellas sustituciones que no cambian el aminocido se
denominan sustituciones sinnimas. Por otro lado, las inserciones y
deleciones, como sus nombres indican, agregan o eliminan letras del
cdigo, generando un corrimiento en el marco de lectura gentica. En
otras palabras, desde el lugar de insercin (o delecin) nucleotdica en
adelante se cambia el sentido del cdigo, generndose una cadena
peptdica completamente diferente a la originalmente codicada y/o
generando una protena ms corta o truncada debido a la aparicin
aleatoria de un codn de trmino temprano.
no contienen secuencias codicantes). La regin intrnica inmediata-
mente colindante al exn contiene seales para el correcto splicing del
mRNA. Alteraciones en esta regin, aunque no alteran directamente la
codicacin de aminocidos, pueden producir la retencin total o par-
cial de un intrn, o la prdida total o parcial de un exn, cambiando la
naturaleza de la protena sintetizada.
MUTACIONES VERSUS POLIMORFISMOS
Cuando se piensa en alteraciones en el DNA es casi inevitable asociar
el trmino mutacin. El trmino mutacin describe aquellas alte-
raciones nucleotdicas que producen un cambio drstico en la funcin
de la protena. Este cambio puede incluir prdida total o parcial de la
funcin de la protena. Podemos poner como ejemplo una mutacin
que altere la estructura de una enzima, hacindola permanentemen-
te inactiva. Por otro lado, una mutacin puede ser responsable de la
activacin permanente de un receptor de membrana, gatillando una
respuesta an en ausencia de la unin del ligando especco. Las mu-
taciones pueden entonces producir alteraciones tanto por prdida
como por ganancia de funcin. Una mutacin puede ser la respon-
sable de la generacin de una protena truncada sin funcin, o alte-
rar levemente la estructura tridimensional de la protena, pudiendo
afectar fuertemente la interaccin con otras protenas de un complejo
proteico mayor. Es decir, es muy difcil predecir el efecto de una altera-
cin gentica por el solo hecho de saber su ubicacin en el genoma, y
conrmar el efecto de una mutacin requiere de estudios funcionales
de la protena en estudios in vitro.
No todos los cambios nucleotdicos producen alteraciones drsticas en la
funcin de la protena. Algunas alteraciones nucleotdicas estn presentes
en ms del 1% de la poblacin sin afectar la salud del individuo que la
porta. Incluso, es posible que dichas alteraciones coneran una ventaja
adaptativa frente al individuo que no la porta. Estas alteraciones se deno-
minan polimorsmos y son responsables de la diversidad gentica entre
distintos individuos y/o tnicas entre distintas poblaciones. Un ejemplo
clsico es un polimorsmo muy frecuente en la poblacin japonesa que
afecta la actividad de la enzima metabolizadora de alcohol Acetaldehdo
deshidrogenasa tipo 2 (ALDH2). Los portadores de este polimorsmo no
son capaces de metabolizar el acetaldehdo producido por la degradacin
del etanol. Aunque son perfectamente sanos, los portadores acumulan
acetaldehdo en la circulacin con efectos disfricos como nuseas y enro-
jecimiento facial, protegindolos contra el alcoholismo, problema de salud
publica muy importante en Chile y Latinoamrica.

Existen otros tipos de alteraciones que implican grandes reordenamien-
tos o rearreglos gentico o genmicos, los que pueden incluir prdida
(o duplicaciones) de fragmentos de genes, genes completos, fragmentos
de cromosomas e incluso cromosomas completos, con un muy amplio
espectro de repercusiones.
Alteraciones nucleotdicas en regiones intrnicas tambin pueden afec-
tar la naturaleza o actividad de la protena (recordemos que los intrones
Finalmente, se denominan variantes allicas a aquellas alteraciones
nucleotdicas con un efecto incierto o desconocido. Las variantes allicas
pueden explicarse por cambios nucleotdicos sinnimos donde el cambio
de nucletido no cambia el aminocido (como el mencionado anterior-
mente), cambios nucleotdicos silentes o aquellos que caen en intrones o
regiones no codicantes ni regulatorias. Finalmente puede ocurrir que el
cambio nucleotdico efectivamente cambie el aminocido, pero que este
cambio no afecte de forma conocida la funcin de la protena.

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MUTACIONES SOMTICAS Y MUTACIONES DE LNEA
GERMINAL
Aquellas mutaciones que se localizan slo en el DNA de las clulas
tumorales se denominan mutaciones somticas. Por otro lado, una mu-
tacin puede originarse (aleatoriamente) en clulas de la lnea germinal
de un individuo y ser por lo tanto heredada a su descendencia en una
proporcin mendeliana. As, esta mutacin heredada estar presente
en todas las clulas del cuerpo del individuo. Este tipo de mutaciones
se denominan mutaciones de lnea germinal. Las mutaciones somticas
pueden asociarse con la agresividad tumoral o con respuesta a terapias
con anticuerpos monoclonales. La deteccin de mutaciones somticas
puede ofrecer una alternativa teraputica a pacientes que sern buenos
respondedores de acuerdo a perl mutacional tumoral que posea. De
lo contrario, la deteccin de un paciente portador de una mutacin so-
mtica que lo haga mal respondedor a una terapia dada podra evitar
efectos adversos severos sin un benecio teraputico. Este es el caso de
la deteccin de mutaciones en el gen KRAS para pacientes con cncer
colorectal. La deteccin mutaciones en el gen KRAS que activan perma-
nentemente a la protena KRAS permite distinguir aquellos pacientes
que no respondern a terapias con anticuerpos monoclonales dirigidos
al receptor de EGFR.
Las mutaciones de lnea germinal pueden predisponer a un individuo
portador al desarrollo de cncer. En otros casos, la presencia (o ausen-
cia) de una determinada mutacin puede conrmar (o descartar) un
diagnstico basado solamente en los hallazgos clnicos. Podemos men-
cionar mutaciones en genes como RET, PTEN, APC, BRCA1 y BRCA2,
entre muchos otros. Las mutaciones en estos genes pueden activar o
inhibir constitutivamente a la protena, con efectos diversos segn cada
caso. As, un nio que haya heredado una mutacin activante en el co-
dn 918 del gen RET tiene un 99% de probabilidades de desarrollar
cncer medular de tiroides antes del 1er ao de vida. Una mujer por-
tadora de una mutacin inactivante en el gen BRCA1 tiene un riesgo
aumentado de desarrollar cncer de mama y/o ovario a edad temprana.
En cada caso, el conocimiento de la presencia de una mutacin en la
lnea germinal entrega informacin valiosa que permitir ofrecer una
tiroidectoma prolctica en el caso del gen RET, o una vigilancia activa
en el caso de una mujer portadora de una mutacin en BRCA1.
LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR EN ONCOLOGA:
CMO SE DETECTAN LAS MUTACIONES?
La solicitud de bsqueda de mutaciones de lnea germinal se realiza
previa sospecha clnica y de acuerdo a criterios de inclusin bien deni-
dos. La entrevista previa con el paciente en la que se indaga por ante-
cedentes familiares relevantes, construyndose una genealoga lo ms
completa posible cobra una gran relevancia. De esta forma es posible
descartar la realizacin de un estudio gentico en casos en que no hay
reales antecedentes de predisposicin familiar al desarrollo de cncer.
En el caso de haber antecedentes fundados que avalen la realizacin de
un estudio gentico, ste debe realizarse en el paciente afectado con
cncer. Basta con la toma de una muestra de sangre (en tubo con anti-
coagulante) para extraer el DNA de leucocitos. En el caso de las muta-
ciones somticas, se requiere una muestra tumoral para extraer el DNA
de las clulas cancerosas. Normalmente se utilizan los tacos de tejido
tumoral jado en formalina y embebido en parana. Un patlogo debe
seleccionar la zona del tejido con la mayor proporcin de clulas tu-
morales. Cabe recordar que una muestra de tejido tumoral es un tejido
heterogneo, compuesto tanto por clulas tumorales como por clulas
normales. Debido a que la mutacin est presente slo en ciertas clulas
tumorales, es fundamental el trabajo del patlogo en la identicacin
de las clulas tumorales para la extraccin del DNA. De lo contrario, las
clulas tumorales podran estar sub-representadas en un contexto de
clulas normales, arrojando un posible resultado falso negativo.
PCR: reaccin en cadena de la polimerasa
La tarea de encontrar una mutacin en un gen del genoma humano
equivale a hallar una falta ortogrca en una pgina de un libro de
una biblioteca con 27000 ejemplares. Esa biblioteca es el genoma hu-
mano con aproximadamente 27000 genes, cuyas secuencias se
conocen completamente gracias a los dos proyectos simultneos de se-
cuenciacin del genoma humano, uno nanciado con fondos pblicos y
dirigido por el Instituto Nacional de Salud Norteamericano NIH (2) y otro
nanciado con fondos privados y llevado a cabo por la compaa Celera
Genomics dirigida por Craig Venter (3). Con esto en mente, la estrategia
de bsqueda de una mutacin puede realizarse de forma dirigida a un
nucletido especco, en un exn especco de un gen de inters, en
caso de tratarse de una mutacin conocida (por ejemplo, se sabe que la
mutacin V600E que cambia el aminocido 600 de la protena de valina
a cido glutmico, se ubica en el nucletido 1799 del gen BRAF, en el
que se sustituy T por A). En otras palabras, es equivalente a ir directa-
mente a la pgina 1000 de El Quijote de la Mancha porque sabemos
que en esa particular edicin del libro existe una falta ortogrca. Por
otro lado, si no se conoce la mutacin especca, se debe examinar la
secuencia completa del gen, letra por letra, en busca de alguna diferen-
cia con respecto a la secuencia de referencia conocida. En otras pala-
bras, se debe leer completamente el libro en busca de una eventual falta
ortogrca. Estas tareas se han facilitado gracias a la tcnica de PCR,
acrnimo del ingls Polymerase Chain Reaction o reaccin en cadena
de la polimerasa. La tcnica de PCR fue desarrollada por Kary Mullis (4)
en 1983 y su propsito es amplicar un fragmento de ADN particular,
partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de

4
La va de sealizacin de EGFR esta comnmente activada en varios tipos de cncer por la sobreexpresin del receptor de EGF. Normalmente la va se activa por unin de un
ligando al receptor de EGF, el cual se dimeriza y activa, transmitiendo y amplicando la seal hacia el interior de la clula hasta el ncleo donde se iniciar la expresin de un
sinnmero de genes que orquestarn una respuesta celular coordinada y regulada. Esta seal se transmite al ncleo celular a travs de una serie de protenas intermediarias que
traspasan una seal qumica (ej. fosforilacin) de una a otra, como una posta de relevos en atletismo o un efecto domin. Cuando una de las protenas intermediarias (como KRAS)
esta mutada y constantemente activada, la seal de activacin se enva al ncleo celular pese a no haber estimulo alguno en el receptor de EGF. Pacientes con mutaciones en KRAS
no sern buenos respondedores a terapias que busque bloquear el receptor de EGF ya que la va seguir activa por accin de la protena KRAS mutada.

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ese fragmento original, o molde. Volviendo a la analoga literaria inicial,
la tcnica de PCR puede imaginarse como una fotocopiadora gnica
que permite sacar mltiples copias de la pgina 1000 de El Quijote de
la Mancha o de cualquier otro de los 27000 libros o genes. Tras la
amplicacin se obtiene una gran cantidad de DNA fotocopiado lo
que facilita mucho la identicacin de cualquier mutacin, por baja que
sea la abundancia relativa del DNA mutado respecto al DNA normal.
Esta tcnica tiene un sinnmero de otras aplicaciones como deteccin
de virus o bacterias, identicacin de personas (cadveres) o hacer in-
vestigacin cientca sobre el ADN amplicado. Con el tiempo, la tcni-
ca de PCR ha derivado en una serie de otras tcnicas ms especcas,
sosticadas y sensibles, pero que comparten un principio fundamental
muy simple; las dos hebras que componen la doble hlice del DNA pue-
den separarse o volver a unirse especcamente, como una cremallera,
con el solo hecho de aumentar o bajar la temperatura.
La tcnica de PCR descansa en la propiedad natural de la enzima DNA
polimerasa para replicar hebras de DNA. Para ello se emplean ciclos
alternados de altas y bajas temperaturas, elevando la temperatura de
reaccin para separar las dobles hebras de DNA, permitir la replicacin
de cada una de las hebras simples, dejando que posteriormente vuelvan
a unirse al bajar la temperatura, formando ms y nuevas dobles hebras
tras cada ciclo de replicacin. De esta forma se logra una amplicacin
exponencial de cada hebra de DNA molde original. Debido a que la
temperatura necesaria para la separacin de las hebras de DNA (fase de
desnaturalizacin del DNA) alcanza los 95C se emplean ADN polimera-
sas termoestables, extradas de microrganismos, generalmente arqueas,
como Thermus aquaticus o Pyrococcus furiosus, adaptados a vivir a altas
temperaturas (ej. giseres).
Tcnicamente, el proceso de PCR consiste simplemente en una serie de
20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos. Cada ciclo
suele consistir a su vez en 3 etapas a diferentes temperaturas (Figura 2).
Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen
de gran variedad de parmetros tales como la enzima usada para la
sntesis de DNA, la concentracin de iones y de los nucletidos libres
necesarios para la sntesis de la nueva hebra de DNA, y la temperatura
de unin de los partidores5, as como la longitud o tamao del DNA
que se desea amplicar. Hoy, el proceso es parcialmente automatiza-
do mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar
y enfriar rpidamente los tubos de reaccin, controlando namente la
temperatura necesaria en cada etapa de la reaccin6. En la prctica,
los ingredientes de una PCR son (i) una mnima cantidad del DNA
molde que se desea amplicar (como el DNA extrado de un tumor),
(ii) los partidores especcos para el fragmento de DNA que deseamos
amplicar, (iii) la enzima DNA polimerasa termoestable, (iv) un exceso
de nucletidos libres A, T, C y G que formarn parte de las nuevas hebras
5
Los partidores son fragmentos cortos de DNA de hebra simple de aproximadamente 15 a 25 nucletidos de longitud, diseados especcamente para ser complementarios a la
secuencia gnica de inters segn las reglas de Watson y Crick donde A se une a T y C se une a G.
6
El sistema original usaba grandes fuentes con agua a distintas temperaturas en las cuales se sumergan manualmente los tubos de ensayo con la mezcla de reaccin, durante
varios ciclos.
de DNA que se sintetizarn en cada ciclo y nalmente (v) agua, sales
y iones necesarios para ofrecer condiciones de pH ptimas, todo en un
tubo de ensayo de un volumen menor a 1 mL. El tubo se somete a
tres distintas temperaturas en forma cclica, obtenindose nalmente un
tubo con gran cantidad de copias del DNA molde original.
Partidores y su rol en la especicidad de la amplicacin
Cmo puedo amplicar especcamente una regin de un gen en la
que sospecho puede existir una mutacin? La especicidad de la re-
accin de PCR est dada por los partidores o primers. Como se
mencion, se conoce completamente la secuencia del genoma humano.
Esto es equivalente a decir que sabemos exactamente lo que dice cada
uno de los 27000 libros de nuestra biblioteca gnica. La probabilidad
de que ms de un gen o libro contenga una pgina que comience y -
nalice con exactamente la misma combinacin de palabras es muy baja.
Entonces, conociendo las secuencias nucloeotdicas o palabras con
que comienza y termina nuestra pgina de inters, podemos especicar
nuestro fotocopiado gnico exactamente a nuestra pgina deseada.
En otras palabras, es como utilizar en nuestro computador un procesa-
dor de texto para que busque una pgina que comience y termine con
una combinacin especca de palabras. Las palabras iniciales y nales
corresponden a las secuencias hacia las cuales se dirigen los partidores
para alinearse y unirse por complementariedad de bases, dando as ini-
cio al proceso de amplicacin. La enzima DNA polimerasa lee una
secuencia de DNA de hebra simple y sintetiza la hebra complementaria
inmediatamente a medida que avanza en la lectura, como un escner
gentico; si lee una A, introduce una T, si lee una G, introduce una C a la
nueva cadena de DNA en formacin. Sin embargo, para poder comenzar
a sintetizar las copias de DNA, la DNA polimerasa necesita instalarse
sobre una pequea regin de DNA de doble hebra. Esta regin esta
dada por la unin del partidor diseado in vitro a la secuencia blanco
en el genoma. As se da inicio especcamente al copiado del DNA en la
regin escogida previamente.
SECUENCIACIN GNICA Y OTRAS TCNICAS DE DIAGNSTICO
MOLECULAR
Una vez amplicado un gen mediante PCR, el fragmento de DNA am-
plicado o amplicn puede secuenciarse y leerse completamente, letra
por letra, nucletido por nucletido. La secuencia resultante se entre-
ga como un grco llamado electroforetograma (Figura 3) con cientos
de peaks de cuatro colores que representan los cuatro nucletidos. La
ausencia de un peak, o un peak extra, o un doble peak, son seales
que pueden dar cuenta de la presencia de una mutacin. El anlisis
profesional y acucioso de las secuencias permite discriminar entre una
mutacin real y posible falsos positivos producto de artefactos propios
de la tcnica de secuenciacin.
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FIGURA 2. REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA O PCR

Esquema del proceso cclico de amplicacin de un fragmento de DNA especco, por accin de la DNA polimerasa. Al subirse la temperatura de la reaccin se logra separar
las 2 hebras del DNA. Bajando la temperatura se logra la unin especca al DNA blanco de unos pequeos fragmentos de DNA, llamados partidores o primers, diseados in
vitro para ser compatibles con regiones conocidas del gen que se desea estudiar. Esta unin permite el posicionamiento correcto de la polimerasa, la que comienza a replicar
la hebra molde usando nucletidos libres agregados a la mezcla de reaccin. Al cabo de 30 ciclos se habr logrado la generacin de ms de 2 mil millones de copias del
fragmento original, permitiendo tener una gran cantidad de DNA de inters replicado para la realizacin de diversos estudios, como la secuenciacin en busca de mutaciones.
Esquema adaptado de New England Biolabs.

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FIGURA 3. ESQUEMA GENERAL DE LAS ESTRATEGIAS PARA ESTUDIO DE MUTACIONES

(A) El estudio de mutaciones somticas se realiza a partir del DNA extrado de una pieza tumoral. Es amplicado mediante PCR y estudiado por secuenciacin o PCR en tiempo
real, tcnica que incorpora partidores uorescentes que permiten aumentar enormemente la sensibilidad y disminuir los tiempos de trabajo. (B) El estudio de mutaciones
de lnea germinal se realiza a partir del DNA extrado de una muestra de sangre del paciente. Se amplica mediante PCR y se secuencia en busca de mutaciones, las que se
visualizan en un electroforetograma como el doble peak correspondiente al nucletido 73 de la secuencia mostrada.

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 [REV. MED. CLIN. CONDES - 2013; 24(4) 563-570]
Existen otras tcnicas moleculares utilizadas en el diagnstico molecular
de una mutacin o alteracin gentica. Podemos destacar algunas como
(i) hibridacin in situ de DNA uorescente o FISH (del ingls
Fluorescence in situ hybridization), que permite realizar estudios
de citogentica molecular, detectando anomalas cromosmicas grandes
como aneuploidias o reordenamientos cromosmicos, lo que puede
implicar la prdida o sobre-representacin de aquellos genes que se
encuentren en fragmento cromosmico estudiado. En la tcnica de FISH
se utiliza un fragmento de DNA de hebra simple llamado sonda que es
complementario a la regin cromosmica de inters, y que esta marcado
con una molcula uorescente. La sonda uorescente permite la
visualizacin microscpica de los fragmentos cromosmicos duplicados
y su cuanticacin. (ii) La tcnica de MLPA o Multiplex ligation-
dependent probe amplication permite detectar rearreglos genticos
grandes, como prdidas o duplicaciones de exones de un gen, lo que
puede implicar la obtencin de una protena truncada y sin funcin o una
enzima inactiva. Esta tcnica tambin se basa en la unin de una sonda
uorescente especca para distintas regiones de un gen especco. A
diferencia de la tcnica de FISH que permite visualizar rearreglos en un
cromosoma, la tcnica de MLPA permite visualizar rearreglos en un gen.
Los resultados se visualizan en un equipo de PCR adaptado para detectar
la seal uorescente de la sonda y cuanticarla. (iii) Los microarreglos
de DNA o DNA microarray permiten ver el patrn de expresin de
miles de genes a la vez. Utilizando el mismo principio que las tcnicas
de FISH y MLPA donde sondas marcas uorescentemente, permiten
visualizar la presencia, ausencia y/o cantidad relativa de miles de genes
(o de mRNA) a la vez. Sistemas robotizados logran ordenar sobre una
pequea supercie como un portaobjeto de vidrio miles de pequesimas
gotas, cada una conteniendo sondas o fragmentos de distintos genes
conocidos. El portaobjeto con las sondas adheridas se incuba con una
muestra de DNA (ej. DNA total extrado de un tumor), su resultado se
compara con el resultado obtenido de una muestra control (ej. tejido
sano). As es posible visualizar el patrn de expresin gnica, de forma
amplia, pero especca, y con mucha sensibilidad. Cabe mencionar
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Crick, F., Central dogma of molecular biology. Nature, 1970. 227(5258): p.
561-3.
2. Lander, E.S., et al., Initial sequencing and analysis of the human genome.
Nature, 2001. 409(6822): p. 860-921.
3. Venter, J.C., et al., The sequence of the human genome. Science, 2001.
291(5507): p. 1304-51.
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que gran parte de las patologas con un componente gentico tienen
ms de un gen alterado, por lo que la visualizacin a travs de DNA
microarray de la expresin gnica permite detectar conjuntos de genes
potencialmente alterados e involucrados en algun cncer. Deteccin
de DNA libre circulante de clulas tumorales circulantes se presentan
como alternativas diagnsticas y pronsticas a corto plazo. En Clnica Las
Condes ya se trabaja en un banco de suero y plasma de pacientes con
cncer para la deteccin de DNA tumor libre en la circulacin que permita
a futuro la implementacin de una tcnica de pronstico o seguimiento
que slo requiera de una muestra de sangre por parte del paciente.
CONSEJERA GENTICA
Los avances cientcos y tecnolgicos han permitido el advenimiento
de sistemas de deteccin de diversos tipos de aberraciones genticas
y genmicas que permiten obtener resultados con una sensibilidad ex-
traordinaria, a una velocidad inimaginada slo algunos aos atrs (ej.
sistemas de secuenciacin masiva, PCR en tiempo real, etc). Sin embar-
go, la cantidad y complejidad de los resultados obtenidos puede ser
abrumadora e incomprensible incluso para el cuerpo mdico y, ms im-
portante an, para el paciente con cncer. Entender que una mutacin
puede predisponer al desarrollo de cncer, que pudo ser heredada (o no)
de uno de sus padres y que por lo tanto puede ser transmitida a su des-
cendencia, es fundamental para desarrollar estrategias de prevencin
y/o de vigilancia activa, y de apoyo emocional. La consejera gentica
cobra un rol fundamental en el acercamiento de la brecha que existe
entre el mundo de la ciencia bsica y el paciente. Profesionales capa-
citados en consejera gentica son fundamentales para aclarar dudas y
conceptos en un paciente que ya debe lidiar con una carga emocional
fuerte relacionada a su enfermedad o a la de un familiar. Entender con-
ceptos bsicos de biologa molecular del cncer ayuda a aclarar estos
conceptos que parecen oscuros y complejos, pero que en el fondo son
simples y disponer de ellos puede hacer una diferencia en el tratamiento
integral de un paciente oncolgico.
4. Saiki, R.K., et al., Primer-directed enzymatic amplication of DNA with a
thermostable DNA polymerase. Science, 1988. 239(4839): p. 487-91.
El autor declara no tener conictos de inters, con relacin
a este artculo.