Tema 4 - Replicacin en eucariotas

La replicacin eucariota est catalizada principalmente por las polimerasas (primasa), y .

Las dos ltimas tienen actividad exonucleasa 3-5 para reducir la tasa de error, mientras que a
la primera no le hace falta por sintetizar menos cantidad de DNA (cebadores y poco ms). Estas
dos son adems muy parecidas estructuralmente, aunque la polimerasa tiene un dominio P
que ayuda a fijar la doble hebra, aumentando su procesividad, ausente en la polimerasa .

*La polimerasa , por ser de estructura diferente a las otras dos, puede inhibirse
especficamente por afidilcolina.

Origen de replicacin eucariota

El origen de replicacin eucariota es anlogo al procariota, con la

diferencia de durante la fase G1 del ciclo celular, antes de empezar
a replicar, se ensambla sobre l un pre-complejo de replicacin
proteico formado por tres componentes: el complejo de varias
protenas ORC (anlogo a la DnaA), las protenas accesorias
Cdc6/Cdc18 y Cdt1 (anlogas a DnaC) y el complejo helicasa
MCM2-7, que se fija sobre las protenas accesorias.

Los cromosomas lineales eucariotas se dividen en varias regiones

llamadas timing domains que tienen un tiempo de replicacin
similar. En cada uno de esto dominios hay mltiples orgenes de replicacin, de los cules slo
algunos son orgenes activos mientras que los dems quedan como orgenes dormidos.

Estructura y dinmica de la horquilla de replicacin eucariota

Cada hebra en una horquilla de replicacin eucariota es

sintetizada por una polimerasa distinta. As, la polimerasa va
avanzando y sintetizando la hebra continua mientras, mientras
que, por otro lado, la hebra retrasada empieza a sintetizarse por la
polimerasa (que tiene un dominio primasa y puede sintetizar el
cebador y los primeros deoxinucletidos) y luego sta es
reemplazada por la polimerasa . Es decir: la cadena continua es
sintetizada por la polimerasa y la retrasada, por la .

Apuntes descargados de wuolah.com

Tanto la polimerasa como la van unidas a una abrazadera PCNA (proliferating-cell nuclear
antigen) que les permite avanzar por la doble hlice a medida que la van sintetizando. La PCNA
(trmero de subunidades de dos dominios) es estructuralmente muy similar a la 2 bacteriana
(dmero de subunidades de tres dominios) en tanto que ambas forman un anillo de seis dominio.
Adems, tambin se une al DNA gracias a un cargador de abrazadera, el complejo RFC
(replication factor C) que la pasa de conformacin abierta a cerrada en torno al DNA con gasto
de ATP.

El DNA monocatenario que queda antes de la accin de las polimerasas se estabiliza mediante
protenas RPA (similares a las SSB bacterianas).

Biosntesis de los fragmentos de Okazaki

La sntesis de los fragmentos de Okazaki comienza por la polimerasa , que sintetiza el

segmento : un hbrido de RNA por un lado y DNA por otro. A continuacin, la polimerasa
es sustituida por la (en vez de por la como en la adelantada), que sigue sintetizando la
cadena hasta llegar al llegar al fragmento de Okazaki anterior.

Tras la sntesis del fragmento de Okazaki, queda un segmento de RNA en el segmento .

Adems, como la polimerasa no tiene correccin de errores, stos son ms abundantes en el
dicho segmento que en el resto del fragmento, por lo que conviene sustituirlo. Se plantean tres
posibles mecanismos para ello:

- La RNasa H, una endonucleasa especfica para el RNA de segmentos hbridos, hidroliza

todos los enlaces fosfodister de los ribonucletidos menos el ltimo (que est unido a un
deoxinucletido). Luego acta la endonucleasa FEN1 (Flap EndoNuclease), que hidroliza
enlaces fosfodister que hacen esquina con segmentos desapareados de DNA (flap).
*Los segmentos diana de la FEN1 se desaparean por la propia vibracin de la molcula y
son inmediatamente cortados. En ausencia de la endonucleasa, vuelven a unirse sin mayor
consecuencia.
- Ahora bien, un mutante carente de RNasa H sobrevive, por lo que se piensa que ste no es
el mecanismo ms relevante. Se plantea como alternativa el desplazamiento de hebra: la
polimerasa va avanzando y sustituyendo el cebador. ste queda suelto y forma un flap
que es sustrato de FEN1.
- Otra opcin es que tras un desplazamiento de hebra acte la endonucleasa DNA2 sobre la
zona de cadena sencilla que une el cebador de RNA con el DNA, y luego FEN1 para
eliminar del todo el segmento .

Estos mecanismos estn coordinados por la PCNA, que adems de servir de abrazadera tiene
gran capacidad de interaccin con otras protenas de la replicacin. As, la PCNA va avanzando
por la secuencia unida a la polimerasa hasta llegar al cebador, momento en que FEN1 metilada
interacciona con ella y desplaza la polimerasa . FEN1-me corta entonces el segmento y se
fosforila, perdiendo afinidad con abrazadera y separndose. A continuacin se une a la ligasa a
la PCNA y empalma ambas hebras.
Nucleosomas

Los nucleosomas consisten en un ncleo de histonas, compuesto por dos histonas H2A, dos
H2B, dos H3 y dos H4, en torno al cual la doble hlice da dos vueltas a izquierdas. El
nucleosoma est reforzado adems por histonas H1.

Las hebras recin sintetizadas tambin necesitan nucleosomas, por lo que para la replicacin
deben sintetizarse nuevas histonas. Los nuevos nucleosomas son una mezcla de histonas
antiguas y otras recin sintetizadas

*La sntesis de histonas se activa poco antes de que empiece la fase S.

Las dos H3 y las dos H4 forman un tetrmero H32-H42 fuertemente unido, mientras que las
otras forman dos dmeros H2A-H2B tambin fuertemente unido. El tetrmero y los dmeros se
unen dbilmente entre s. Por este motivo, tetrmeros y dmeros se mantienen unidos entre s
mismos (no hay tetrmeros ni dmeros de histonas nuevas y viejas mezcladas), pero entre
ambos, no necesariamente (puede haber, p. ej., nucleosomas con tetrmero viejo y dmeros
nuevos).

Cuando la horquilla de replicacin avanza, disgrega la estructura octamrica en tetrmero y

dmeros. La quinasa CDK2, asociada a PCNA, fosforila la histona H1 haciendo que pierda
afinidad por el nucleosoma y, por tanto, facilitando el proceso. Los componentes interaccionan
de nuevo muy rpidamente, entre s o con histonas nuevas, y se incorporan al DNA replicado
como nucleosomas inmediatamente detrs de la horquilla de replicacin.

*Este proceso afecta a los fragmentos de Okazaki, de tal manera que el segmento queda
parcialmente protegido por las histonas. As pues, cuando la polimerasa llega a uno de ellos,
se frena, pero sigue avanzando y desenrollando hasta que se atasca del todo. En este punto se
disocia de la abrazadera, pero para entonces ya queda un trozo de cadena simple suelto y la
FEN1 puede degradarlo.
Es posible reconstruir cromatina in vitro a partir de histonas y DNA, pero in vivo el ensamblaje
de los nucleosomas no es espontneo, sino que hace falta una serie de protenas chaperonas que
se asocien a las histonas y faciliten su unin al DNA por detrs de la horquilla de replicacin.

Las histonas presentan modificaciones postraduccionales variables que dependen del estado
funcional de la cromatina. stas deben conservarse tras la replicacin para que las clulas hijas
tengan el mismo patrn de expresin que la madre, lo que significa que las histonas nuevas
deben ser modificadas del mismo modo que las viejas (ej.: clulas que se diferencian tienen
unas modificaciones concretas que deben transmitirse para que sus descendientes tambin
estn diferenciadas).

Se hipotetiza que existen complejos proteicos que reconocen las modificaciones de las histonas
parentales y atraen al enzima que las cataliza (ej.: reconocen metilaciones y atraen metilasas),
de tal manera que ste pueda modificar igualmente las histonas recin sintetizadas de los
nucleosomas vecinos. Otra posibilidad es que todo lo haga un mismo complejo enzimtico
capaz de asociarse a un nucleosoma modificado y modificar a sus vecinos (ej.: complejo histona
metiltransferasa MTC).
Terminacin de la replicacin en eucariotas

La replicacin se detiene al llegar al final del cromosoma lineal

debido a la ausencia de molde. En el caso de la hebra retardada, al
final queda un fragmento de Okazaki que, al ser retirado, deja un
extremo 3 colgante formado por varios nucletidos sin aparear. Esos
nucletidos no podrn recuperarse en posteriores replicaciones por
falta de molde, de modo que el cromosoma se har ms corto y se
perder informacin.

Para evitar este tipo de daos existen los telmeros: secuencias

repetidas cortas que no contienen informacin y que, por tanto,
pueden degradarse sin riesgo (actan como tampones de acortamiento que evitan la prdida
de informacin til). Sin embargo, los telmeros se acaban gastando, por lo que su presencia
slo retrasa la prdida de informacin. Para evitarla por completo se emplea la enzima
telomerasa, que sintetiza los telmeros.

La telomerasa es un tipo peculiar de polimerasa capaz de aadir secuencias de seis nucletidos

mltiples veces a un extremo 3 colgante utilizando como molde un cido ribonucleico que
forma parte de su propia estructura (es una transcriptasa reversa). La enzima tiene
procesividad: si se observa su actividad por electroforesis, se ve que el ADN va incrementando
de 6 en 6 nucletidos, y que difcilmente se ven tamaos intermedios.

La telomerasa slo aade nuevos nucletidos a extremos 3 colgantes. As, si el cromosoma

tiene extremos romos es necesario degradar el extremo 5 mediante exonucleasas 5-3 (Apolo).

En general, las secuencias telomricas aadidas son ricas en G y pobres en C, pero la secuencia
repetida concreta de los telmeros (as como la del RNA molde de la telomerasa) es
caracterstica de cada especie. A estas secuencias se unen muchas protenas que sirven por un
lado para proteger los telmeros y por otro para regular la telomerasa (la reclutan, marcan su
terminacin, etc.).
El extremo 3 colgante genera una estructura caracterstica de los telmeros: el bucle-T. Como
la secuencia telomrica est repetida, la hebra complementaria puede hibridar con cualquier
segmento, de modo que el extremo colgante desplaza a otro fragmento y da lugar al lazo en T.
El objetivo es tener el telmero protegido. Queda una zona de triple cadena llamada bucle-D.

Otra estructura peculiar son los cuartetos de G: interacciones entre grupos de cuatro G
mediadas por puentes de hidrgeno. Como el extremo sobresaliente es rico en G, puede plegarse
sobre s mismo y dar lugar a G-cudruplex.

Una clula sin telomerasa tiene un nmero finito de divisiones, tras el cual sus cromosomas ya
son inestables y entre en senescencia, mientras que otra con telomerasa es virtualmente
inmortal. As, hay correlacin entre el nmero de veces que debe dividirse una clula y su
actividad telomerasa. Tambin est relacionada con el envejecimiento.

*Las clulas de la lnea germinal tienen actividad telomerasa. Cuando una clula tumoral
reactiva la telomerasa se vuelve maligna.

*Existen tambin otros mecanismos de inmortalizacin que son independientes de telomerasas,

como los basados en religacin entre cromosomas con telmeros de distinta longitud.

Replicaciones extraas

Replicacin mitocondrial

Las mitocondrias tienen un nico cromosoma circular que en el caso de

humanos tiene 16000 pares de bases. Su replicacin no es simtrica, sino
asimtrica: la sntesis de cada hebra empieza en un sitio diferente. La hebra
continua empieza a sintetizarse, originando lazos D, hasta llegar al punto en
que empieza a sintetizarse la retrasada.
Crculo rodante

Se da en molculas circulares de doble cadena. A medida que se va sintetizando nuevo ADN, va

saliendo del cromosoma. La polimerasa puede seguir sintetizando sucesivamente conforme la
nueva hebra va saliendo.

Ej.1: fago M13: virus cuyo genomio es un cromosoma circular de cadena

sencilla. Cuando infecta una bacteria, lo primero que hace es sintetizar una
hebra de dos cadenas. Como el cromosoma es de cadena sencilla, es
cubierto por protenas SSB excepto por una zona autocomplementaria que
forma hlices consigo misma. Sobre ese extremo de doble cadena puede
sintetizarse un cebador que facilita la replicacin. El cebador es
directamente sintetizado por la RNA polimerasa de la bacteria debido a que
hay un inicio de replicacin en el cromosoma. La replicacin de este
cromosoma origina la forma replicativa, que se superenrolla.

Ej.2: X174: similar, pero con distinto mecanismo. El virus tiene un

genomio de una cadena, por lo que el primer paso es duplicarlo para
conseguir una molcula de doble cadena. Despus, mecanismo de crculo
rodante. Desplazamiento de hebra lo lleva a cabo helicasa dimrica Rep,
que va desenrollando y avanzando. Primasa se une a helicasa y va
avanzando por el genomio. De vez en cuando se para y sintetiza un
cebador. A partir de esos cebadores, la polimerasa va sintetizando
discontinuamente el resto del cromosoma. Cuando se da la vuelta del todo
al cromosoma, se tiene una hebra circular de ssDNA y el cromosoma de
nuevo, que vuelve a cerrarse. El nmero de enlaces y la energa se
conservan. Al final se origina la forma replicativa de doble cadena y
superenrollada RF1.

Cebador proteico

Una protena se une al extremo 5 y funciona

como cebador. Tiene serina, a cuyo grupo OH
se une una base formando un enlace ster. No
se une exactamente en el extremo, sino algunos
nucletidos ms adelante. Los nucletidos de
los extremos estn repetidos, por lo que el
cebador puede saltar hacia atrs y colocarse en
el principio. A continuacin sigue elongacin
normal. Polimerasa va avanzando y provocando
desplazamiento de hebra. La molcula de
ssADN que es desplazada adquiere una forma similar a una horquilla debido a que sus extremos
son complementarios entre s. Despus se replica, volviendo a ser doble cadena.

*La actividad exonucleasa de la polimerasa no puede actuar en el mismo extremo, sino que
requiere algunos nucletidos. El salto hacia atrs hace que esto sea irrelevante, ya que si hay
algn fallo no se dar la replicacin,, por lo que no se asumir el error.
Replicacin de los poxvirus

Su cromosoma tiene una forma especial:

Replicacin de virus de RNA

En general, sus mecanismos se basan en la RNA-polimerasa dependiente de RNA. Sin embargo,

en el caso de los retrovirus depende de DNA-polimerasa dependiente de RNA (transcriptasa
reversa). En estos ltimos, a partir de su genomio de RNA se obtiene una copia de DNA, se le
elimina la hebra de RNA con RNasa H (destruye RNA de hebras hbridas) y se duplica la hebra
de DNA, obtenindose una doble hlice que puede insertarse en el genomio de un husped. Ah
queda latente hasta que el husped lo transcriba, momento en que servir de molde para copiar
muchos genomios RNA vricos. Como es RNA, sirve tambin de mensajero, siendo transcrito
de inmediato por los ribosomas y pudiendo as crear muchos virus nuevos rpidamente.

*El cebador de la transcriptasa reversa es t-RNA complementario que se une al genomio.

*El mecanismo de replicacin se basa en secuencias repetidas a ambos extremos.

*Polimerasa reversa tiene actividad exonucleasa H, por lo que va sintetizando DNA y

destruyendo RNA. Sin embargo, ni tiene actividad exonucleasas 3-5, por lo que tiene alta tasa
error. Esto provoca que el virus cambie muy rpido. Tambin lo vuelve susceptible al uso de
anlogos de nucletidos, ya que la polimerasa reversa los reconoce y une, pero tambin hace
que gane resistencia rpidamente.