DETECCION MOLECULAR

DE MUTACIONES FLT3,
NPM1 Y CEBPA.

Presentado por: Dra. Silvia Mancilla Rivera

LMA
La leucemia mieloide aguda (LMA) es una enfermedad clonal
heterognea resultante de la transformacin maligna de
clulas madre hematopoyticas.
Se caracteriza por la presencia de diversas alteraciones
genticas adquiridas en clulas de estirpe mieloide que
alteran sus mecanismos normales de auto-renovacin,
proliferacin y diferenciacin celular.
Como consecuencia, en la mdula sea se acumulan
precursores mieloides inmaduros con capacidad de
replicacin, pero sin capacidad de diferenciacin hacia clulas
hematopoyticas maduras.
Grupos de riesgo citogentico segn el MRC 2010 (Grimwade
et al., 2010).
De todos ellos destacan los que afectan a los genes
FLT3, NPM1 y CEBPA, porque se han asociado con la
respuesta al tratamiento y el progreso de esta
enfermedad, principalmente de los pacientes con
cariotipo normal
El gen FLT3 (FMS-like tyrosine kinase ) codifica para un
receptor tipo tirosina cinasa (RTK) de clase III

Mutaciones enel genFLT3 relevantes enla leucemia mieloideaguda.A.El genFLT3 posee24 exones,
B. La protena FLT3 es un receptor tirosina cinasa de clase III. La mutacin FLT3-ITD ocurre en la
regin yuxtamembrana, eliminando el impedimento estrico que normalmente bloquea la
dimerizacin, mientras que FLT3-TKD estabiliza la forma activa de la protena
Deteccin de la mutacin del gen FLT3
(FMS-like tyrosine kinase )
Mutacin FLT3-ITD
Iniciadores:
11F 5 CAATTTAGGTATGAAAGCC 3
11R 5 CAAACTCTAAATTTTCTCT 3

Resuspensin:
11F resuspender con 487 uL para concentracin de 100 uM
11R resuspender con 702 uL para concentracin de 100 uM
 PROTOCOLO
REACTIVOS CONCENTRACIN CONCENTRACI VOLUMEN
INICIAL N DE
FINAL USO/TUBO

Tampn de PCR 10X 1X 5uL

MgCl2 50 mM 1,5 mM 1,5 uL

Ciclos Temperatura Tiempo

11F 10 uM 0.4 uM 2 uL

1 105 C 10 min
11R 10 uM 0,4 uM 2 uL
94 C 30 seg

35 52 C 55 seg
dNTPs 10 mM 0.8 mM 4 uL
72 C 30 seg

Go Taq 5 U/uL 1U 0,2 uL 1 72 C 7 min

Polimerasa

4 C 5 min
H2O ---------- ---------- 32,3 uL

Muestra de ADN ---------- ---------- 3 uL

Total 50 uL
 RESULTADOS
Presencia de Presencia de
Control banda wild- banda ITD
type (WT) de tamao
especfica variable
de 133 pb
C4
Control Si Si
positivo
FLT3-ITD
DNA

H2O
Control No No
negativo
Deteccin de la mutacin del gen FLT3
(FMS-like tyrosine kinase )
Mutacin FLT3-D835 o FLT3-TKD
Iniciadores:
17F 5 CCGCCAGGAACGTGCTTG 3
17R 5 GCAGCCTCACATTGCCCC 3

Resuspensin:
17F resuspender con 460 uL para concentracin de 100 uM
17R resuspender con 607 uL para concentracin de 100 uM
 PROTOCOLO
REACTIVOS CONCENTRACIN CONCENTRACI VOLUMEN
INICIAL N DE
FINAL USO/TUBO

Tampn de PCR 10X 1X 5uL

MgCl2 50 mM 1,5 mM 1,5 uL

Ciclos Temperatura Tiempo

17F 10 uM 0.4 uM 2 uL

1 105 C 10 min
17R 10 uM 0,4 uM 2 uL
94 C 30 seg

35 52 C 55 seg
dNTPs 10 mM 0.8 mM 4 uL
72 C 30 seg

Go Taq 5 U/uL 1U 0,2 uL 1 72 C 7 min

Polimerasa

4 C 5 min
H2O ---------- ---------- 32,3 uL

Muestra de ADN ---------- ---------- 3 uL

Total 50 uL
 RESULTADOS
Presencia de
Control banda
especfica
de 114 pb
C5
Control positivo FLT3-ITD Si
DNA

C3
Control negativo FLT3-ITD Si
DNA

H2O
Control negativo No
Determinacin de la mutacin puntual mediante
digestin enzimtica.

REACTIVOS CONCENTRACIN CONCENTRACIN VOLUMEN DE

INICIAL DE USO USO/TUBO

Tampn de PCR 10X 1X 2,5 uL

Incubacin a 37 C
por 30 min.
Enzima EcoRV 40 U/uL 20 U 0,5 uL
Inactivacin a 60
H2O ---------- ---------- 12 uL
C por 20 min.
Producto de PCR ---------- ---------- 10 uL

Total 25 uL
RESULTADOS
Deteccin de la mutacin del gen NPM1

Mutacin NPM1
Iniciadores:
NPM1-F 5 TTAACTCTCTGGTGGTAGAATGAA 3
NPM1-R 5 CAAGACTATTTGCCATTCCTAAC 3

Iniciadores:
NPM1-862 5 GAAAAAGGTGGTTCTCTTCCCA 3
NPM1-1216 GTCCTATCATAACATTCCATACATACTTAAAAC 3
 PROTOCOLO
REACTIVOS CONCENTRACIN CONCENTRACI VOLUMEN
INICIAL N DE
FINAL USO/TUBO

Tampn de PCR 10X 1X 5uL

MgCl2 50 mM 1,5 mM 1,5 uL

Ciclos Temperatura Tiempo

NPM1-F o 10 uM 0.4 uM 2 uL
NPM1-1216
1 105 C 10 min
NPM1-862F o 10 uM 0,4 uM 2 uL
NPM1-1216 95 C 30 seg

35 60 C 30 seg
dNTPs 10 mM 0.8 mM 4 uL
72 C 70 seg

Go Taq 5 U/uL 1U 0,2 uL 1 72 C 10 min

Polimerasa

4 C 5 min
H2O ---------- ---------- 32,3 uL

Muestra de ADN ---------- ---------- 3 uL

Total 50 uL
 RESULTADOS
Presencia de
Control banda
especfica
de 560 pb
C1
Control positivo NPM1 Si
DNA 0,93 ug/uL

C2
Control positivo NPM1 Si
DNA 0,72 ug/uL
 RESULTADOS
Presencia de
Control banda
especfica
de 355 pb
C1
Control positivo NPM1 Si
DNA 0,93 ug/uL

C2
Control positivo NPM1 Si
DNA 0,72 ug/uL
Deteccin de la mutacin del gen CEBP (CCAAT/enhancer-binding
protein)
Protenas potenciadoras de la unin a la secuencia CCAAT, que estn
Implicadas en el equilibrio entre proliferacin celular y diferenciacin
celular.
Iniciadores: 548 pb
CEBPA-AF 5 TCGCCATGCCGGAGAACTCTAAC 3
CEBPA-AR 5 AGCTGCTTGGCTTCATCCTCCT 3
Iniciadores: 390 pb
CEBPA-BF 5 CCGCTGGTGATCAAGCAGGA 3
CEBPA-BR 5 CCGGTACTCGTTGCTGCTTCT 3
Iniciadores: 356 pb
CEBPA-CF 5 CAAGGCCAAGAAGTCGGTGGACA 3
CEBPA-CR 5 CACGGTCTGGGCAAGCCTCGAGAT 3

 PROTOCOLO
REACTIVOS CONCENTRACIN CONCENTRACI VOLUMEN
INICIAL N DE
FINAL USO/TUBO

Tampn de PCR 10X 1X 5uL

MgCl2 50 mM 1,5 mM 1,5 uL

Ciclos Temperatura Tiempo

CEBPA AF 10 uM 0.4 uM 2 uL
CEBPA BF
CEBPA CF 1 105 C 10 min

CEBPA AF 10 uM 0,4 uM 2 uL 95 C 60 seg

CEBPA BF
35 62 C 40 seg
CEBPA CF
72 C 90 seg
dNTPs 10 mM 0.8 mM 4 uL
1 72 C 10 min

Go Taq 5 U/uL 1U 0,2 uL

4 C 5 min
Polimerasa

H2O ---------- ---------- 32,3 uL

Muestra de ADN ---------- ---------- 3 uL

Total 50 uL
RESULTADOS
 PROTOCOLO
REACTIVOS CONCENTRACIN CONCENTRACI VOLUMEN
INICIAL N DE
FINAL USO/TUBO

Tampn de PCR 10X 1X 5uL

MgCl2 50 mM 1,5 mM 1,5 uL

Ciclos Temperatura Tiempo

CEBPA AF 10 uM 0.4 uM 6 uL
CEBPA BF
CEBPA CF 1 105 C 10 min

CEBPA AF 10 uM 0,4 uM 6 uL 95 C 60 seg

CEBPA BF
35 62 C 40 seg
CEBPA CF
72 C 90 seg
dNTPs 10 mM 0.8 mM 4 uL
1 72 C 10 min

Go Taq 5 U/uL 1U 0,2 uL

4 C 5 min
Polimerasa

H2O ---------- ---------- 24,3 uL

Muestra de ADN ---------- ---------- 3 uL

Total 50 uL
RESULTADOS