PROGRESO EN LOS MTODOS MOLECULARES PARA LA DETECCIN Y CARACTERIZACIN GENTICA

DE CRYPTOSPORIDIUM EN MUESTRAS DE AGUA

Bogumila Skotarczak

Departamento de Gentica, Universidad de Szczecin, Polonia

Skotarczak B: Progreso en los mtodos moleculares para la deteccin y characteri-gentico zation

de Cryptosporidium en muestras de agua. Ana Agric Environ Med 2010, 17, 1-8.

Resumen: Cryptosporidium, el parsito protozoico, tiene varias rutas de transmisin, incluyendo

anthroponotic y la transmisin zoonotic, as como el camino foodborne, pero principalmente por
mar. El oocysts, la etapa resistente producida por Cryptosporidium, es re markably estable, y puede
sobrevivir durante semanas o an meses en el entorno(el medio ambiente). La piel - thermore, la
dosis de infective es baja, probablemente an oocyst solo puede causar la infeccin. El
Cryptosporidium

la causa la diarrea efmera, autoserena [49], mientras que en la gente con la inmunosupresin la
diarrea es insistente, a menudo causando la muerte como consecuencia de la deshidratacin, la
disminucin de peso considerable, y el sndrome malo de la absorcin [3, 9]. Tak-ing en
consideracin el factor socioeconomical (sobre todo en la poblacin con el VIH/SIDA), la Salud
Mundial Organi-sation clasifica Cryptosporidium como una referencia patgena en una valoracin
global de calidad de agua [37].

Cryptosporidium el gnero pertenece al tipo de Apicomplexa, que incluye al menos 16 especie: C.

andersoni, C. baileyi,

C. bovis, C. canis, C. felis, C. galli, C. hominis, C. melea-gridis, C. molnari, C. muris, C. parvum, C.

saurophilum,

C. scophthalmi, C. serpentis, C. suis y C. wrairi

C. hominis (antes sabido(conocido) como un C. parvum el tipo de geno-humano o genotype I)

excepcionalmente puede infectar a la gente, mientras

C. parvum (antes sabido(conocido) como un C. parvum el ganado geno-el tipo o genotype II)
infecta a la gente, ruminants y otros animales [41, 46]. Adems, la especie ha sido descubierta en
la gente como C. meleagridis, C. suis, C. felis y C. canis, que indica el riesgo de transmisin zoonotic
de estos pathogens [10, 33, 64, 65]. Como oocysts de toda la Cripta - osporidium spp. es
morfolgicamente similar y tiene el potencial para estar presente en el agua, detec-sensible y
especfico tion y la mecanografa de Cryptosporidium oocysts en el agua para determinar tanto la
especie como el genotype es esencial para la gestin del agua de la fuente y arriesga la evaluacin.

Los casos de cryptosporidiosis ocurren por todas partes el La identificacin exacta de un parsito
en la especie y/o el nivel de genotype tiene grandes consecuencias para varios aspectos de
parasitology humano y veterinario, incluyendo la taxonoma, el diagnstico, el tratamiento y el
control. El advenimiento de tcnicas moleculares, en particular aquellos basados en ampli-in vitro
fication de cidos nucleic, ha mejorado la capacidad de descubrir infecciones causadas por
parsitos. Sin embargo, la mayora de mtodos diagnsticos usados en la prctica clnica ha
limitado ap-plication en cuanto a a la deteccin de protozoans en muestras de agua. La restriccin
ms importante es concen-inferior tration de quistes u oocysts en el agua en comparacin con el
material tranquilo de pacientes. Por ejemplo, los niveles de oocyst de Cryptosporidium y quistes
Giardia en aguas superficiales son muy bajos, en los lmites de 0.5

LA REACCIN EN CADENA DE POLIMERASIS (PCR)

Hasta el momento, ninguna identificacin de especie de asla ha sido realizado sobre un estudio
rutinario de cryptosporidiosis; slo la identificacin para confirmar cul de la especie
Cryptosporidium tiene la importancia en la epidemiologa de esto mal el cabo en la gente. El uso
de mtodos moleculares hace tambin posible la valoracin del potencial zoonotic de
Cryptosporidium spp. y las fuentes de infeccin para el humano, que constituye una base para las
caractersticas de transaccin - la dinmica de misin sobre las reas endmicas y epidmicas. Dif-
ferent las variedades de PCR la amplificacin del ADN de oocysts purificado es la tcnica el ms
extensamente usada molecular para la deteccin y genotyping de Cryptosporidium. Esta tcnica
fue desarrollada a mediados de los aos 80 del 20o centro - tury y dentro de una docena de aos

el material, as como en muestras ambientales, es genes que codifican 18 pequea subunidad de

ARN ribosomal (18) [42, 48, 53, 63]; glycoprotein Cryptosporidium 60-kDa (gp60) [1]; el
Cryptosporidium oocyst la protena de la pared (COWP) [2, 52], el Cryptosporidium calienta la
protena de choque (HSP)-70 [40] y la beta-tubulin [58] y el lugar microsatlite 1 (ML1) y 2 (ML2)
[11, 23, 32].

La identificacin abajo a la especie, la reunin, geno-el tipo o el nivel de subgenotypes fue lograda
por apuntando genes sumamente variables o genes que eran nicos. Genes "variables", como el
gp60 y el lugar microsatlite 1 (ML1) y 2 (ML2), son usados para la identificacin y classifica-tion de
especie Cryptosporidium y variantes demogrficas (p. ej. genotypes o subgenotypes). El gene de la
pequea subunidad de ARN ribosomal (SSU) provee
REACCIN EN CADENA DE POLIMERASIS CON EL ANLISIS EN TIEMPO REAL (EN TIEMPO REAL PCR,
qPCR, " t de r " PCR)

" La t de r " PCR el mtodo puede ser usada para supervisar de estafas de ampli-en la reaccin PCR
y para la valoracin de la primera estafa - centration de plantilla de ADN en una muestra. Este
mtodo satisfactoriamente ha sido usado para la valoracin del nmero de genomas y para la
bsqueda diagnstica del ADN de para-

para-

sitic protozoans como Plasmodium o Toxoplasma gondii [8, 47]. La reaccin en cadena de
polimerasis clsica es un mtodo de calidad, que constituye una desventaja grande en el moni-
toring de infecciones. En esta tcnica, la intensidad del producto obtenido depende principalmente
del nmero de ciclos, y a un grado menor, sobre el nmero inicial de copias de plantilla.
Tericamente, la cantidad del producto despus del final de reaccin debera ser
exponencialmente proporcional al nmero de plantillas, cuyas secuencias son analizadas en la
muestra investigada (doblado en cada ciclo). Pero hay diferencias grandes en la prctica; por lo
tanto, una tcnica que permite al anlisis de cantidad exacto ha sido desarrollada. Estos mugidos
Al-la supervisin de la cantidad de producto de ADN en cada ciclo de la reaccin PCR

qPCR el protocolo ha sido desarrollado para la deteccin e identi fication de Cryptosporidium

oocysts la especie / genotypes para materiales diferentes y matrices. Usando 18 rRNA como un
objetivo, las sensibilidades de deteccin de PCR en tiempo real y anidaron-PCR los sistemas fueron
comparados por Sunnotel et al. [56]. Un anlisis de sensibilidad de este ensaye determin que era
rutinariamente capaz de descubrir tres oocysts. PCR mltiple en tiempo real (qPCR) el ensaye para
la deteccin simultnea de G. lamblia y C. parvum fue adaptado por el Tipo et al. [20], y para la
deteccin simultnea de E. histolytica, G. lamblia, y C. parvum en muestras de faecal por Verweij et
al. [61]. Sin embargo, qPCR ha revolucionado laboratorios de microbiologa clnicos diagnostican de
mucho hombre de hu-infecciones microbianas [13, 16].

Una variacin de este mtodo es una transcripcin inversa quantative PCR en tiempo real. Garces-
Sanchez et al. [18] us este mtodo de distinguir viable y herido

C. pavrum oocysts. Los mtodos que estiman oocysts viable incluyen in vitro excystation, el
manchar vital (la exclusin de tinte, el PESCADO), infectivity (in vitro o en vivo) e invierten tran-
scriptase (RT)-PCR. Cada uno de estos mtodos tiene limitaciones incluyendo en vivo infectivity
que requiere pruebas de animal, es que lleva mucho tiempo, y las ms costosas. Adems, ex -
cystation y el manchar vital sobrestiman la viabilidad oocysts y no responden bien con el animal
infectivity. Este incon-venience es solucionado por el RT-QPCR, sobre todo en el anlisis environ-
mental cuando respuestas rpidas son necesarias y cuando hay un riesgo de contaminacin del
agua, el alimento
HIBRIDACIN DE MANCHA DE LNEA INVERSA (RLB)

RLB al principio fue desarrollado como un ensaye de mancha inverso de punto para el diagnstico
de anemia de clula de hoz, pero la base de ambas tcnicas es la hibridacin de productos PCR a
sondas especficas inmovilizadas sobre una membrana para identificar diferencias de las
secuencias amplificadas [19]. Este instrumento al principio fue desarrollado para la identificacin
de Streptococcus serotypes [30], seguido por un RLB para la diferenciacin de tensin de
tuberculosis Mycobacterium [27]. RLB no es un nuevo mtodo en el diagnstico de protozoans
parsito, porque al final de los aos 90 del siglo pasado fue adaptado para la deteccin y la marca
de Babesia y la especie Theileria [19], pero su uso para el diagnstico Cryptosporidium es todava
en la etapa de desarrollo.

Membranas de niln negativamente cargadas los grupos que atan covalently con grupos positivos
amin se unieron con sondas de oligonucleotide. Los productos PCR creados como consecuencia de
la utilizacin de un arrancador marcado con biotin son colocados sobre la membrana, que antes
fue atada con sondas, y ellos son hybridized [19]. Despus, el complejo streptovidin-peroxidase se
une con los productos de hibridacin atados con biotin. La visualizacin de chemiluminescence
comienza af-ter la adicin del sustrato especfico para peroxidase (luminol), que permite la
reaccin de su oxidacin, el producto de lado de cual es ligera(de luz) certificada sobre la pelcula
fotogrfica [30], o analizada en el flujo compacto cytometer [6]

La hibridacin con la tcnica RLB permite simulta-neous la deteccin de mucha especie y tensiones
de organismos investigados sobre una membrana, que tiene el carcter de una macromatriz. La
membrana con el covalently uni oligonucleotides especfico de especie puede ser usado al menos
20 veces, as reduciendo gastos para proteger pathogens [19]. La encuadernacin del producto PCR
con la sonda ocurre slo cuando hay complementariedad del 100 % entre la sonda y el amplicon.
Por lo tanto, las sondas con exactitud diseadas permiten la diferenciacin de interespecie, y
adems proporcionan la posibilidad de descubrir diferencias microheterogenetic whitin la especie,
la variabilidad de especie interior supuesta de organismos investigados. Gracias a estos rasgos, la
tcnica RLB permite la identificacin de organismos del gen La ventaja de RLB es la posibilidad de
usarlo para sam-ples, donde hay una probabilidad de la presencia de un nmero ms grande de
organismos investigados; por ejemplo, en el caso de infecciones surtidas(mixtas) con especie
relacionada de parsitos, o en muestras ambientales.

muestras, o muestras artificialmente claveteadas con Cryptosporid-ium oocysts. En la opinin de

los autores, este ensaye es rpido (el procedimiento entero puede ser realizado dentro de 5 h) y es
menos caro que sequencing de PCR amplicons. El coste total de una prueba de RLB era menos de
0.16 dlares, comparados con el ADN tradicional sequencing el mtodo, que cuesta al menos 4.00
dlares por reaccin. Aunque esta tcnica fuera el 100 % especfico y ms sensible que la prueba
de anticuerpo de centavo directa fluores-, esto no puede diferenciar C. parvum
C. hominis. Para concluir este mtodo rpido, barato, y relativamente simple puede demostrar ser
un instrumento muy til diagnstico para la identificacin rpida de C. hominis y C. parvum.

LOS MTODOS DE AMPLIFICACIN EN CONDICIONES ISOTRMICAS

Amplificacin mediada por lazo isotrmica de ADN (LMPARA). LA LMPARA recientemente ha

sido como un mejor mtodo para la amplificacin de ADN que excede PCR clsico en su eficacia y
en su insensibilidad relativa a contamina-tion de ADN.

Notomi et al. [43] se desarroll un mtodo llam el lazo - la amplificacin mediada de ADN, que
amplifica el ADN con la alta especificidad, la eficacia y la velocidad en condiciones isotrmicas.
Segn Notomi et al. [43], una de las ventajas del mtodo de LMPARA es que el ADN ampli-fication
en condiciones isotrmicas procede sin alguno en - fluence del ADN que coexiste en una muestra.
Este mtodo requiere slo la polimerasis de ADN y un juego de cuatro spe-cially los arrancadores
diseados que reconocen seis se-diferentes quences en la plantilla de ADN. El arrancador interior,
incluyendo las secuencias del sentido y el hilo de antisentido de ADN de plantilla, comienza la
reaccin de LMPARA. Despus, hay una sntesis de hilos de ADN separados realizados por el
principio externo - ers, que libera el ADN de un hilo. Esto se hEl producto de la LMPARA es una
mezcla de fragmentos de ADN de longitud diferentes, teniendo la estructura parecida a una coliflor
con nu-merous lazos inducidos por anealing entre invertido re las turbas de secuencias de plantilla
sobre el mismo hilo; estos ms tarde simplemente y fcilmente son descubiertos, el mismo como
en el mecha-nism de cooperacin entre la antiinformacin multivalent y anti-ace la plantilla para

cuerpo. Otra ventaja del mtodo de LMPARA es su alta especificidad hacia las secuencias de
plantilla. Esto es causado por reconociendo las secuencias de plantilla por 6 secuencias
independientes en la etapa inicial, y por 4 se-independientes quences durante la etapa posterior
de reaccin de LMPARA - en parte re ducing el problema principal que acompaa todos los
mtodos de amplificacin [43]. Adems, la simplicidad de este mtodo viene de la
facilidad(instalacin) de preparar arrancadores, y del hecho que hay slo 4 arrancadores, la
polimerasis de ADN, y el bao mara de laboratorio o calentando el bloque (la amplificacin ocurre
en las condiciones isotrmicas). Uno ms ventaja es la posibilidad de usar este mtodo para la
amplificacin sumamente eficiente de ARN, si es unido con el revs transcrip-tion.

Un estudio de la literatura muestra que el mtodo de LMPARA ya ha sido desarrollado y solicitado

la deteccin de ms de 100 pathogens diferentes [28]. Este mtodo parece prometer para la
identificacin de especie y la especie differen-tiation. Sin embargo, el desarrollo de su uso depende
del attainability de especie secuencias de ADN especficas (p.ej. en el GeneBank). Corrientemente,
las secuencias de ADN que pueden ser la base para marcar la especie Cryptosporidium con el
mtodo de LMPARA estn disponibles slo en una gama limitada [5]. Karanis et al. [29] describi
el primer uso de la LMPARA para descubrir Cryptosporidium sobre la base de la amplificacin del
gene gp60 del C. parvum.
Bakheit et al. [5] el uso descrito de LMPARA para identificar la especie Cryptosporidium obtenida
de diferencia - ent animales criadores sobre la base del gene HSP-70, basado en el apuntamiento
del S-adenosyl-methionine synthetase (SAM) el gene y el gene gp60, y la validacin de la prueba de
LMPARA basada en amplicons ordenado de estos genes. La verificacin fue facilitada por una
modificacin innovadora de las cartillas de LMPARA para incorporar sitios de restriccin para
permitir a la supresin de producto objetivo. Los resultados de la deteccin fueron comparados
con aquellos obtenidos de anidado-PCR con arrancadores com-plementary a 18 rRNA el gene de
Cryptosporidium. Todas las muestras investigadas con el mtodo anidado-PCR eran negativas,
mientras en la LMPARA prueban un tercio de estos sam-ples eran positivo. Los autores acentan
que la prueba de LMPARA es simpleNucleic amplificacin cida a base de secuencia (NASBA). En
este mtodo, la plantilla inicial es el ARN y hay 3 enzimas y 2 arrancadores prometidos(ocupados).
Un arrancador y revs transcriptase amplifican un hilo de cDNA solo, el segundo en - zyme, la H de
ARN-ASE degrada el ARN del ARN creado - el hbrido de ADN, y finalmente, el segundo arrancador
(con la secuencia de promotor aadida T7) adjunta al cDNA y el transcrip-tion comienza con la
tercera enzima y la polimerasis de ARN.

Cada transcripcin es una plantilla para crear otro cDNA con el promotor T7, que es otra vez una
plantilla para el ARN tran-escrituras. Segn Mens et al. [38], este mtodo, basado en rRNA en la
deteccin de parsitos de sangre, predomina sobre " la t de r " PCR (la transcripcin inversa PCR),
porque est en - al dependiente de la presencia de ADN, que podra ocurrir en una muestra
inexactamente limpiada. El mtodo NASBA es muy sensible porque esto descubre rRNA, el nmero
de las copias de cual ocurriendo sobre el genoma de parsitos son considerablemente ms alto
que el rDNA, en el cual " la t de r " PCR est basado. Como NASBA es un mtodo basado en la
reaccin isotrmica oc-curring en una temperatura de 41C, y no requiere de naturation, esto
previene la amplificacin del ADN de genoma en el caso de contaminacin. Sin embargo, muchos
autores piensan

Connelly et al. [15] us el mtodo NASBA para spe-cific la deteccin de Cryptosporid-viable

humano patgeno ium la especie, C. parvum, C. hominis, y C. meleagridis. Oocysts fueron aislados
de muestras de agua. La secuencia amplificada objetivo empleada era hsp70 mRNA, la produccin
de cual fue estimulada va un breve choque de calor. El NAS-BA el producto fue descubierto en una
hibridacin nucleic cida el ensaye de emparedado de flujo lateral. Esto demostr sensitiv-extremo
ity de este ensaye que usa el flujo-cytometer las muestras contadas

C. parvum, y el ensaye puede descubrir toda la especie humana patgena Cryptosporidium. En la

opinin de los autores, an un oocyst puede ser descubierto entre num-grande bers de
microorganismos comunes martimos y el material de bola embalado filtrado de muestras
ambientales de agua con este mtodo.

CONCLUSIONES
El riesgo de transmisin martima de Cryptosporid-ium es un problema serio global en la seguridad
de agua potable. Oocysts de estos organismos son sumamente duradero enel entorno(el medio
ambiente)

el entorno(el medio ambiente). Entre la numerosa especie que pertenece a Cryptosporidium

oocysts, en principio, slo 3 son patho-genic para la gente. Como oocysts de todo el Cryptosporid-
ium spp. es morfolgicamente muy similar y potencialmente presenta en el agua, la deteccin
sensible y especfica y la mecanografa de Cryptosporidium oocysts en el agua para determinar la
especie y genotype son cruciales para el hombre de la fuente de agua - agement y arriesgan la
evaluacin. Esta revisin muestra que algn progreso ha sido hecho en el desarrollo de mtodos
moleculares para la identificacin, la caracterizacin gentica y la diferenciacin de especie
Cryptosporidium.

El ms ex - tensively us tcnicas moleculares para la deteccin y genotyping de Cryptosporidium

es diferente las variedades de PCR la amplificacin del ADN de oocysts purificado. Sin embargo, el
mtodo RT-QPCR proporciona la informacin sobre la viabilidad y puede ser usado diferenciar la
Cripta viable y herida - osporidium oocysts, que puede ser muy til para p.ej. hy-giene mandos
durante procesos de tratamiento de aguas residuales. La amplificacin mediada por lazo isotrmica
de ADN (la LMPARA) ensayes tiene ventajas para la deteccin de organismos en la concentracin
relativamente baja en muestras ambientales. Esto es un procedimiento sumamente especfico para
una plantilla de ADN imprecisamente aislada de una muestra que contiene el material de cal
extranjero biologi-. Esta prueba es insensible a la interferencia comnmente ocurrida que limita el
uso PCR.

El mtodo NASBA es capaz de discriminar entre la 3 especie humana patgena y varia especie no
patgena Cryptosporidium, y puede distinguirse entre oocysts vi-capaz y no viable. NASBA la
amplificacin y una hibridacin nucleic cida el ensaye de emparedado de flujo lateral,
expresamente descubre nicamente un oocyst de un hombre de hu-viable la especie patgena
Cryptosporidium. NASBA tiene de correo - tential para la adopcin como un instrumento
diagnstico para ambiental patgeno. La hibridacin de mancha de lnea inversa (RLB)
satisfactoriamente ha sido usada para la identificacin especfica y para se diferencian - entiation
de especie Cryptosporidium. Sin embargo, applica-bility de la mayor parte de estos mtodos de
descubrir la especie Cryptosporidium o genotypes de muestras ambientales tiene que ser evaluado
y estandarizado.

La opcin de mtodo molecular por laboratorios de es terminada principalmente por el alto coste
de equipo necesario para su realizacin. La utilizacin del ensaye molecular para caracterizar la
diversidad gentica no significa(piensa) que meth-ms tradicional ods de discriminacin sea ms
valioso. Tcnicas tradicionales phenetic han tenido imperfecciones principales para el diagnstico
especfico de cryptosporidiosis, pero el trabajo por horas molecular - acterization es no siempre
posible en algunas situaciones de campaa. Sin embargo, esto puede ser usado demostrar si
phenotyp-ic el rasgo, en particular morphologic, tener una base gentica.

La opcin de mtodo molecular por laboratorios de es terminada principalmente por el alto coste
de equipo necesario para su realizacin. La utilizacin del ensaye molecular para caracterizar la
diversidad gentica no significa(piensa) que meth-ms tradicional ods de discriminacin sea ms
valioso. Tcnicas tradicionales phenetic han tenido imperfecciones principales para el diagnstico
especfico de cryptosporidiosis, pero el trabajo por horas molecular - acterization es no siempre
posible en algunas situaciones de campaa. Sin embargo, esto puede ser usado demostrar si
phenotyp-ic el rasgo, en particular morphologic, tener una base gentica.