ESTUDIO DE MICROORGANISMOS ENDFITOS EN PLANTAS DE

Rhizophora mangle EN DOS ECOSISTEMAS DE MANGLAR DEL CARIBE

COLOMBIANO

ELIZABETH PAOLA JIMNEZ BASTIDAS

SHAYRA PATRICIA VLEZ CARVAJAL

UNIVERSIDAD LIBRE DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE MICROBIOLOGA
BARRANQUILLA
2008

1
 ESTUDIO DE MICROORGANISMOS ENDFITOS EN PLANTAS DE
Rhizophora mangle EN DOS ECOSISTEMAS DE MANGLAR DEL CARIBE
COLOMBIANO

ELIZABETH PAOLA JIMNEZ BASTIDAS

SHAYRA PATRICIA VLEZ CARVAJAL

Asesores
M.Sc. ANA MEDINA BUELVAS
M.Sc. NELSON VALERO VALERO
Esp. ARACELY GARCIA DE BALLN

UNIVERSIDAD LIBRE DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE MICROBIOLOGA
BARRANQUILLA
2008

2
 CONTENIDO

Pg.

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 6

2. JUSTIFICACIN 9
3. OBJETIVOS 12
3.1 OBJETIVO GENERAL 12
3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS 12
4. MARCO TERICO 13
4.1. ECOSISTEMA DE MANGLAR 13
4.1.1. Generalidades 13
4.1.2. Importancia y Funcin Ecolgica 13
4.1.3. Importancia Econmica 14
ANLISIS DE LOS ECOSISTEMAS DE MANGLAR EN
4.2. 15
COLOMBIA
4.3. CARACTERSTICAS DE LAS PLANTAS DE MANGLE 18
4.4. Rhizophora mangle (Mangle Rojo) 19
4.4.1. Caractersticas Morfolgicas 19
4.4.2 Estrategias de Adaptacin 21
4.5. MICROBIOLOGA DEL MANGLAR 24
4.6. MICROORGANISMOS ENDFITOS 28
4.6.1. Generalidades 28
4.6.2. Relaciones Simbiticas de los Hongos Endfitos. 31
4.6.3. Mecanismo De Transmisin de Los Hongos Endfitos. 32
4.6.4. Efectos Fisiolgicos de los Hongos en el Hospedero. 32
5. MARCO ESPACIAL 34
6. MARCO TEMPORAL 35

3
7. DISEO METODOLGICO 36
7.1. TIPO DE INVESTIGACIN 36
8. METODOLOGA 37
8.1 REA O ZONA DE ESTUDIO 37
8.1.1. Baha de Chengue 37
8.1.2. Cuenca Hidrogrfica de la Cinaga de Mallorqun 37
8.2. METODOLOGA DEL MUESTREO 38
8.3. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 39
8.3.1. Prelavado (Bacon, 2002). 39
Proceso de Esterilizacin Superficial para Muestras destinadas
8.3.2. 39
para el Aislamiento de Hongos Endfitos (Bacon, 2002)
Proceso de Esterilizacin Superficial para Muestras destinadas
8.3.3. 40
para el Aislamiento de Bacterias Endfitas (Bacon, 2002)
8.4. PROTOCOLO DE AISLAMIENTO 41
8.4.1. Aislamiento e Identificacin De Hongos Endfitos. 41
Aislamiento e Identificacin De Bacterias Endfitas Aerobias y
8.4.2. 42
Anaerobias.
8.4.3. Aislamiento e Identificacin Bacterias Endfitas Diaztrofas. 43
9. PRESUPUESTO 46
10. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES 47
11. BIBLIOGRAFA 48
ANEXOS

4
 LISTA DE IMGENES

Pg.

Imagen 1. Corteza de Rhizophora mangle 20

Imagen 2. Flores de Rhizophora mangle 20

Imagen 3. Hojas de Rhizophora mangle 20

Imagen 4. Races de Rhizophora mangle 22

Imagen 5. Propgulos de Rhizophora mangle 23

5
 1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Los manglares cubren el 60-75% de las costas tropicales y subtropicales del

mundo, de las cuales han desaparecido un 25% (FAO 2003), causando graves
impactos ambientales, sociales y en las economas de las comunidades locales
usuarias de estos ecosistemas. En Amrica Latina ocupan aproximadamente
4.000.000 de ha, en las costas del Pacfico y del Atlntico; en Colombia cubren
aproximadamente 379.954 ha entre ambas costas, de las cuales 292.726 se
encuentran en el litoral Pacfico y 87.908 en el Caribe.

En los dos litorales se han realizado actividades que han ocasionado impactos
negativos sobre estos ecosistemas tales como: construccin de obras civiles
-carreteras, muelles y algunas obras inadecuadas en la produccin de camarones,
expansin de las fronteras urbanas, agrcolas e industriales, contaminacin por
hidrocarburos y plsticos, tala indiscriminada del bosque de mangle y
construcciones tursticas. Lo anterior, ha generado efectos o consecuencias
negativas como la alteracin y deterioro de las funciones ecolgicas del manglar -
refugio, alimentacin y anidacin de diversas especies amenazadas de
mamferos, reptiles, anfibios y aves; estabilizacin de playas, control de la
erosin, evotranspiracin, detoxificadores, amortiguadores de inundaciones y
atenuadores del calentamiento global- (Snchez-Pez, et.al.,2000b).

Por tal motivo hoy en da la situacin de los ecosistemas de manglar en Colombia

y en especial en el Caribe colombiano es crtica. Se calcula que unas 40.000
hectreas han sido alteradas y deterioradas, de las cuales se han perdido por
completo aproximadamente 1.220 km2 en treinta aos, equivalentes a 40,8 km 2
por ao, de los cuales la mayor prdida se ha registrado en la regin Caribe, 1.898

6
km2 estimados en 1984, en consecuente en la regin actualmente solamente
permanecen 863 km2, por efecto de diversos impactos como explotacin forestal
intensiva, conversin a otros usos y contaminacin entre otros (Ocampo-Aguirre,
1997).

En el Departamento del Atlntico, los manglares estn sometidos a altos niveles

de contaminacin y eutrofizacin; ejemplo de ello es La Cinaga de Mallorqun
afectada por descargas de desechos qumicos e industriales de Barranquilla y de
la acumulacin de productos contaminantes y alta carga de sedimentos
provenientes del ro Magdalena. Igualmente pueden mencionarse como tensores
de los manglares en el rea, los procesos de aterramiento derivadas de las
actividades operativas de Cementos del Caribe, del Barrio las Flores y la
desviacin de los cauces de varios caos. En las Cinagas de Balboa y del Rincn
se presentan tambin vertimientos de aguas residuales y de productos qumicos
que afectan el recurso pesca y a los ecosistemas de manglares en general
(IDEAM).

Ante esta problemtica se han venido desarrollando programas de reforestacin,

sin embargo la sobrevivencia de plntulas de mangle durante los procesos
naturales es baja (Holgun et al., 1999), En los ltimos aos se ha documentado el
importante papel de las comunidades microbianas asociadas a los ecosistemas de
Manglar. Estudios previos relacionados con el efecto promotor del crecimiento
vegetal por especies microbianas asociadas a la rizsfera revelan su potencial
como coadyuvantes en programas de reforestacin, la aplicacin de
biofertilizantes en estas plntulas podra contribuir a promover su crecimiento,
supliendo las deficiencias nutricionales y liberando fitohormonas que pueden ser
de gran utilidad para promover el desarrollo temprano y establecimiento de estas
plantas (Bashan, 2002).

7
En diferentes especies se ha visto el importante papel de microorganismos
endfitos para la nutricin y el desarrollo de plantas como caa de azcar, caf,
mango, entre otras. Hasta el momento no se han adelantado estudios sobre
microorganismos endfitos en plantas de mangle, por cual se propone aislar y
caracterizar dichos microorganismos en plantas de Rhizophora mangle, situadas
en ecosistemas de manglar con diferentes condiciones medioambientales
-Cinaga de Mallorqun y en la Baha de Chengue-, teniendo en cuenta que estos
microorganismos podran estimular el crecimiento vegetal de dichas plantas,
contribuyendo de este modo en los programas de reforestacin, garantizando un
crecimiento mucho ms efectivo.

Por consiguiente surge la siguiente inquietud: Existen Microorganismos Endfitos

en plntulas de la especie Rhizophora mangle?

8
 2. JUSTIFICACIN

Con este trabajo se iniciarn en la Universidad Libre Seccional Barranquilla

proyectos de investigacin relacionados con microbiologa marina, siendo esta la
nica universidad colombiana con un programa de microbiologa que tiene
directamente un rea de influencia sobre el patrimonio martimo nacional,
pudiendo desarrollar bioprospeccin de recursos del litoral en Colombia como
estrategia de apropiacin de la diversidad microbiana.

La innovacin de esta investigacin esta planteada teniendo en cuenta que a

nivel mundial no se han identificado microorganismos endfitos promotores de
crecimiento en plntulas de mangle, referencindose hasta el momento endfitos
en caf, caa de azcar (Valero, 2000), arroz (Verma, 2001) y otros pastos,
donde estos microorganismos han resultado ser bastante promisorios como
estrategia de biofertilizacin, esto se debe a que se encuentran mejor protegidos
a las condiciones adversas del medio en relacin a los rizosfricos y tienen un
contacto directo con la planta brindando beneficios a su hospedero excrecin de
fitohormonas y proteccin contra patgenos-, por este motivo es muy probable que
este fenmeno tambin se presente en plntulas de mangle (Muoz-Rojas, 2000).

Teniendo en cuenta que en los ecosistemas de manglar las relaciones ecolgicas

entre plantas y microorganismos son muy importantes, el hecho de contar con un
microorganismo endfito que promueva el crecimiento vegetal sera una ventaja
para el establecimiento de estas plntulas y muy conveniente para la produccin
de biofertilizantes, que puedan suplir la deficiencia de nitrgeno que se presenta
en dichos ecosistemas (Holgun et al., 1992), y protegerlas de la tensin
ambiental; adems los endfitos podran ser utilizados en otros cultivos de inters

9
comercial (Galindo, 2006) o ser aplicados en suelos y ambientes donde otros
microorganismos no se adaptaran fcilmente.

En diferentes estudios realizados en pases como Mxico, USA, Brasil, entre otros,
se ha demostrado que el uso e introduccin de bacterias promotoras de
crecimiento vegetal (BPCV) puede aumentar el desarrollo de plntulas de mangle
e incluso crear manglares artificiales en tierras hmedas. Se han realizado
inculos para manglar con cianobacterias como M. chthonoplastes y BPCV como
Azospirillum sp. (Bashan y Holgun, 2002). Adems, otros estudios revelan una
densa poblacin de Azospirillum brasilense y A. halopraeferans colonizando las
races de A. germinans a cuatro das de la inoculacin (Puente et al., 1999).

La aplicacin de biofertilizantes puede contribuir a promover el crecimiento de

plntulas de mangle ya que en condiciones naturales su sobrevivencia es baja;
esto ha dado lugar a desarrollar programas de reforestacin de ecosistemas de
manglar (Holgun et al., 1999). Para dichos programas en Colombia se han
utilizado principalmente plntulas de Rhizophora mangle, teniendo en cuenta que
esta especie tiene las tasas ms altas de supervivencia y crecimiento frente a
otros gneros como Avicennia germinans y Laguncularia racemosa (Elster, 2000).
El aislamiento de microorganismos endfitos a partir de plantas de Rhizophora
mangle provenientes de ecosistemas con diferentes condiciones medio
ambientales -salinidad- nos permitiran proponer nuevos productos con
microorganismos capaces de adaptarse a manglares con parmetros medio
ambientales diversos; con el fin de comprobar lo anterior se seleccionaron para
este estudio la Cinaga de Mallorqun que es un sistema estuarino y la Baha de
Chengue la cual solo se ve influenciada por corrientes de agua marina.

La finalidad de esta investigacin es proyectar la importancia de estos

microorganismos en el estimulo del crecimiento vegetal y su aporte nutricional,
promoviendo de este modo prcticas de bioprospeccin, encaminadas al estudio

10
de nuestra promisoria diversidad en un ecosistema como el manglar, donde los
estudios de ecologa microbiana son escasos pero con alta potencialidad,
siguiendo lineamientos propuestos por el Plan Nacional de Bioprospeccin
Continental y Marina del Ministerio del Medio Ambiente (Melgarejo et al, 2003), ya
que si no se desarrollan nuevas tecnologa de usos sostenibles que se puedan
utilizarse para la renovacin de dichos ecosistemas pueden desaparecer,
afectando el equilibrio ecolgico y la economa de las regiones aledaas.

11
 3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GENERAL

Estudiar microorganismos endfitos en plantas de Rhizophora mangle en dos

ecosistemas de manglar del Caribe Colombiano.

3.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

Desarrollar una metodologa para el aislamiento de microorganismos endfitos

cultivables a partir de plantas de mangle.

Identificar microorganismos endfitos presentes en diferentes rganos de

plantas de Rhizophora mangle.

Comparar la diversidad de los grupos microbianos aislados de los dos

ecosistemas.

12
 4. MARCO TERICO

4.1. ECOSISTEMA DE MANGLAR

4.1.1. Generalidades. Su nombre deriva de los rboles que los forman, los
mangles, el vocablo mangle de donde se deriva mangrove (en alemn, francs e
ingls) es originalmente guaran y significa rbol retorcido. El manglar es un tipo
de ecosistema, formado por rboles que ocupan la zona intermareal de las costas
de latitudes tropicales, son biotopos tropicales y subtropicales anfibios, localizados
en la zona intermareal, de costas protegidas o poco expuestas, que reciben
peridicamente agua dulce por escorrenta y que resiste salinidades hasta de 40
mil 50 mil ppm (Prahl, 1990).

4.1.2. Importancia Y Funcin Ecolgica. Los ecosistemas de manglar se

caracterizan por su alta produccin y actividad en el lavado del suelo, generando
materia vegetal compuesta principalmente de hojas y madera en descomposicin,
transformndose luego en detrito que puede ser transportado hacia el mar segn
el flujo hdrico de la zona y posteriormente los organismos detritvoros lo
aprovechan y transfieren energa a los sistemas marinos a travs de la cadena
trfica por esta razn se consideran eslabones de gran importancia en la cadena.
Entre otras funciones ecolgicas tenemos que: son excelentes detoxificadores y
amortiguadores de inundaciones. (Snchez-Pez, et.al.,2000b), desarrollan un
papel como evotranspiradores, actan como sumideros naturales de CO 2, fuente
de materia orgnica e inorgnica, sirven de refugio, as como de sitios de
alimentacin y anidacin de diversas especies de mamferos, aves, reptiles,
invertebrados y anfibios, muchos de estos son de gran importancia comercial.

13
Los manglares constituyen uno de los ecosistemas ms frgiles, y por este motivo
su proteccin es prioritaria, garantizando, mediante su gestin integral, la
continuidad de la utilizacin de los recursos forestales, biolgicos e
hidrobiolgicos. Adicionalmente, son formadores de suelos, protegen los litorales
de la erosin costera, dan sombro en las playas y le ganan terreno al mar y
fijacin de contaminantes en los sedimentos, el efecto de filtro de los bosques de
mangles protegen tambin los vitales arrecifes de coral y pastizales marinos del
dao por erosin, estrellas de mar y caracoles

4.1.3. Importancia Econmica. En muchas partes del mundo, los mangles son
usados directamente en actividades comerciales de gran impacto, como la
produccin de madera para construccin, lea, carbn, tanino, y muchos otros. En
algunos sitios, las frutas de los mangles son consumidas por humanos, y las hojas
son utilizadas en gran variedad de cocimientos, pociones, y como alimentacin
para el ganado (Morton 1965). Debido a su ubicacin, los manglares son
frecuentemente utilizados como sitios para establecer operaciones comerciales de
acuacultura y en Mxico el 100% de la produccin de camarones depende de la
existencia del manglar. Adems el fruto de una de las especies de mangle
(Rhizophora mangle) se extrae jugo fermentado para producir una bebida
embriagante.

Cabe mencionar que el valor esttico, de esparcimiento y turstico de los

manglares no se debe subestimar, ya que cerca de ellos es que ocurre el
fenmeno de las bahas o lagunas bioluminicentes. Estos sitios son muy
importantes para la navegacin recreativa, la observacin de vida silvestre, y el
simple esparcimiento.

14
4.2. ANLISIS DE LOS ECOSISTEMAS DE MANGLAR EN COLOMBIA

En Colombia los manglares ocupan una superficie aproximada de 380.634 ha de

las cuales 292.726 se encuentran en el litoral Pacfico y 87.908 en el Caribe. Los
aspectos relativos a la definicin de estos ecosistemas, su importancia, as como
su estado y los principales tensores e impactos que los afectan, fueron
presentados en Informes del Estado de los Ambientes Marinos y Costeros en
Colombia correspondientes a los aos 2001, 2002 y 2003. Debido a la ausencia
de cambios significativos en los temas citados, stos se omiten en el informe
llevado a cabo en el ao 2004 y solamente se incluyeron los avances realizados
por las CAR e Institutos de Investigacin en los ecosistemas de manglares y de
guandales durante el 2004 (INVEMAR, 2004).

En el Caribe y Pacfico colombiano han incidido numerosas acciones antrpicas

que han generado deterioro y destruccin de los manglares entre las que se
encuentran la expansin turstica, construcciones civiles y asentamientos urbanos,
drenajes y canalizaciones, construccin y operacin de fincas camaroneras,
extraccin intensiva de recursos maderables, expansin de reas agrcolas y
ganaderas, y la disposicin inadecuada de residuos industriales y domsticos.
Estos factores han generado la degradacin de miles de hectreas de manglar
con la consecuente disminucin en la biodiversidad y recursos pesqueros,
formacin de playones salinos y la sedimentacin de los cuerpos de agua
(Snchez-Pez et al., 1997; Snchez-Pez et al., 2000).

Pese al creciente deterioro que presentan los ecosistemas de manglar, en la

actualidad continan los esfuerzos por parte del Ministerio de Ambiente (MAVDT),
las CAR costeras, Universidades, Institutos de Investigacin, empresas privadas,
las ONG y la participacin de las comunidades locales e indgenas, para obtener
mayor conocimiento sobre estos ecosistemas costeros. Se han realizado estudios
sobre coberturas, atributos estructurales y funcionales, seguimiento para evaluar

15
posibles impactos por obras civiles, as como tambin acciones
interinstitucionales para su conservacin, recuperacin y uso racional a travs de
la formulacin y ejecucin de los planes de manejo.

Desde enero de 2002 y hasta junio de 2004 se ejecut el proyecto Manejo

Sostenible y Restauracin de los Manglares por Comunidades Locales del Caribe
de Colombia que cont con el apoyo del Ministerio de Ambiente Vivienda y
Desarrollo Territorial, la Corporacin Nacional de Investigacin y Fomento Forestal
(CONIF), la Organizacin Internacional de Maderas Tropicales (OIMT), las
Corporaciones Autnomas Regionales convocadas (CORPOURAB, CVS,
CARSUCRE, CARDIQUE, INVEMAR y CORPAMAG) y la participacin activa de
las comunidades locales. El Proyecto permiti dar respuesta a los planteamientos
de las comunidades locales (que dependen de estos ecosistemas), de las
entidades ambientales y del pas, para desarrollar las acciones encaminadas al
manejo sostenible de los ecosistemas de manglar y a la restauracin de las reas
degradadas, y de esta forma contribuir al desarrollo de un sistema productivo y
sostenible desde los puntos de vista social, ecolgico y econmico (Snchez-
Pez et al., 2004). Como actividades relevantes se destacan la restauracin de
450 ha de manglares deteriorados, para lo cual se restablecieron las condiciones
de flujos hdricos, se produjeron las plantas en viveros comunitarios y se
efectuaron las siembras. Adems, se continu con el estudio de la dinmica de
crecimiento de los mangles en las parcelas permanentes de crecimiento, se
capacit a las comunidades locales en prcticas adecuadas de manejo de estos
bosque, se elabor un plan de manejo integral de los manglares de la zona de uso
sostenible de la Baha de Cispat en colaboracin con la CVS y las comunidades
locales, el cual comenz a ejecutarse. Finalmente, se elabor un plan de manejo
para los manglares de la Cinaga de la Caimanera en Sucre con el apoyo de
CARSUCRE.

16
En el marco del Programa CARICOMP (Caribbean Coastal Marine Productivity
Program), el INVEMAR realiza anualmente el monitoreo de arrecifes coralinos,
pastos marinos y manglares en la Baha de Chengue (Caribe colombiano). La
informacin obtenida durante el 2004 en las parcelas permanentes del bosque de
manglar indica que los atributos estructurales presentaron cambios poco
significativos. Se detect un descenso en el promedio de la densidad de rboles,
debido a la muerte de algunos individuos en las parcelas evaluadas. Este hecho
ya se haba registrado anteriormente y se atribuy al impacto causado por las
termitas (Rodrguez-Ramrez y Garzn-Ferreira, 2003). En consecuencia, la
prdida de estos rboles redujo el valor de otros atributos estructurales como el
rea basal y la biomasa, sin embargo aparentemente no tuvo incidencia en la
productividad parcial del bosque, evaluada a travs de la medicin de la cada de
hojarasca, pues los valores obtenidos en octubre y noviembre de 2004 (3.2 y 4.6 2
g/m /da respectivamente), se hallan dentro del intervalo de variacin registrado
entre 1995 y 2003. La continuidad del monitoreo permitir evaluar si los cambios
observados indican algn proceso de deterioro en el manglar de Chengue
(INVEMAR, 2004).

Por otra parte en la Cinaga de Mallorqun las plantas de mangle han sido
sometidas a una fuerte presin antrpica como la tala, debido a asentamientos
humanos subnormales especialmente en el margen oriental de la laguna y en la
desembocadura del arroyo Len hacia la zona noroccidental de la cinaga, a la
inadecuada disposicin de aguas residuales, al aporte de sedimentos
provenientes del ro Magdalena y en menor proporcin de la cuenca del arroyo
Grande, debido a estos factores el ecosistema se encuentra en un alto grado de
deterioro ambiental. Como resultado en la zona, donde se concentra la mayor
extensin de manglares en el departamento, se han generado condiciones
extremas, como son largos periodos de sequa, alta evaporacin, escaso
intercambio de agua dulce y marina, y altas concentraciones de salinidad, hasta el
punto que R. mangle, ha desaparecido casi en su totalidad, siendo reemplazado

17
por el mangle salado -A. germinans y L. racemosa- en la mayora del rea de la
cinaga. En muchos sectores ya se evidencia la presencia de especies
colonizadoras como el trupillo, el aromo y algunas bromeleceas, propias de
ambientes desrticos (Hidroestudios S.A.-ConCEP Ltda., 2003).

4.3. CARACTERSTICAS DE LAS PLANTAS DE MANGLE

Los Mangles son rboles o arbustos leosos, que viven entre la zona de nivel de
mar media y la lnea de las mareas altas de primavera en costas ms o menos
estables donde forman comunidades conocidas como manglares (Hogarth, 1999).

Los mangles verdaderos tienen varias adaptaciones que los ayuda a prosperar en
esta zona que delimita la tierra y el mar incluyendo adaptaciones para anclaje en
sedimentos suaves, races respiratorias, mecanismos especializados para la
dispersin, y mecanismos especializados para lidiar con concentraciones
excesivas de sal. Los mangles son las nicas plantas verdaderamente vivparas,
en las cuales las semillas se mantienen fijadas a la planta madre y germinan
formando un embrin ("propgulo") antes de caer del rbol.

Por lo general, los mangles se pueden caracterizar por los siguientes rasgos:

Adaptaciones morfolgicas, como races especializadas, que los adaptan a

su ambiente.
Habilidad de excluir o filtrar sales.
Las semillas germinan estando an conectadas a la planta madre.
Restringidos en distribucin al ambiente de los manglares.
Aislamiento taxonmico (no tienen parientes cercanos por lo menos al nivel
genrico).

18
Los mangles prosperan en costas protegidas con sedimentos finos donde la
temperatura promedio del mes ms fro es mayor que 20C. Muchos factores
influyen en el desarrollo de los manglares incluyendo componentes edficos (de
los suelos), hidrogrficos, qumicos, geolgicos, estocsticos (del azar), y
biolgicos (Tomlinson 1986).

Se encuentra una amplia variedad de plantas de mangle, aproximadamente unas

54 especies pertenecientes a 20 gneros, encuadrados en 16 familias.

4.4. Rhizophora mangle (Mangle Rojo)

Pertenece a la familia Rhizophoraceae, la cual cuenta con alrededor de 120

especies distribuidas en 16 gneros, siendo el gnero Rhizophora el mejor
conocido, dominando las partes ms anegadas de los ecosistemas manglar.

4.4.1 Caractersticas Morfolgicas. Los rboles de Rhizophora mangle son de 4

a 10 metros de alto, su forma es de rbol o arbusto perennifolio, halfilo, en el
tronco se encuentran apoyadas numerosas races areas simples o
dicotmicamente ramificadas con numerosas lenticelas, la corteza es de color
olivo plido con manchas grises, sin embargo en el interior es de color rojizo, su
textura es de lisa a levemente rugosa con apariencia fibrosa. Las hojas son
simples, opuestas, pecioladas, de hoja redondeada, elpticas a oblongas, estas se
aglomeran en las puntas de las ramas, su color es verde oscuro en el haz y
amarillentas en el envs. Las flores son pequeas, de 2.5 cm de dimetro con
cuatro spalos lanceados, gruesos y coriceos. La flor tiene cuatro ptalos
blancos amarillentos. Tiene de dos a cuatro flores por tallo o pednculo. Los frutos
se presentan en forma de baya de color pardo, coricea, dura, piriforme, farinosa.
El desarrollo de las semillas se lleva a cabo en el interior del fruto por viviparidad,

19
los propgulos son frecuentemente curvos, de color verde a pardo en la parte
inferior y presentan numerosas lenticelas y por ultimo sus races son flcreas,
ramificadas, curvas y arqueadas.

Imagen 1. Corteza de Rhizophora

mangle

Imagen 2. Flores de Rhizophora mangle Imagen 3. Hojas de Rhizophora mangle

20
4.4.2. Estrategias De Adaptacin. Las zonas costeras en las cuales se localizan
los ecosistemas de manglar son consideradas sistemas muy dinmicos, motivo
por el cual las plantas all situadas estn sometidas a una serie de variables que
se encuentran en interaccin constante, entre estas se pueden mencionar las
corrientes marinas, las mareas, los vientos, la precipitacin, el caudal y la
sedimentacin de los ros, entre otros. Con el fin de tolerar todas estas
condiciones a las cuales se encuentran expuestas, las plantas han desarrollado
ciertas estrategias de adaptacin fisiolgicas y anatmicas como una marcada
tolerancia a las altas concentraciones de sal, adaptaciones para ocupar suelos
inestables, adaptaciones para intercambiar gases en sustratos anaerbicos y
embriones capaces de flotar que se dispersan transportados por el agua (Prahl,
1990).

Tolerancia al agua salada

Todos los mangles excluyen alguna porcin de sal cuando se absorbe el agua a
travs de las races, otra parte se concentra al interior en el tejido de la planta,
variando las cantidades acumuladas de acuerdo a cada especie. El mangle rojo
(Rhizophora mangle) deja entrar el agua con cantidades bajas de sal a travs de
membranas situadas en las races, realizando filtraciones, ello se logra
manteniendo diferencias de presin negativas en el interior del tejido a travs de
un proceso fsico (Prahl, 1989).

Desarrollo en suelos inestables

Rhizophora mangle es la especie que mejor est adaptada a esta situacin por
poseer races en forma de zancos, lo que le permite estabilizarse sobre planos
lodosos, es comn verlo a orillas de cinagas, esteros o caos siempre
procurando aumentar su rea radicular para poder desarrollarse y colonizar
nuevos espacios; es el sistema radicular ms conocido, ya que se distingue por
una maraa de races difcil de sobrepasar.

21
 Imagen 4. Races de Rhizophora mangle

Intercambio de gases en sustratos anaerbicos

Para superar la falta de oxgeno (anoxia) en el suelo las especies de rboles han
tomado distintos caminos evolutivos, en el caso de Rhizophora mangle posee en
sus races orificios llamados lenticelas, aberturas hidrfobas permeables al aire y
no al agua, los cuales se abren y se cierran de acuerdo al nivel de inundacin
presente (Prahl, 1990).

Embriones Capaces de flotar

Cuando se trata el tema de la reproduccin es importante destacar que a
diferencia de las plantas terrestres tpicas, Rhizophora mangle ha logrado que las
semillas antes de abandonar al rbol que la produjo, realicen sobre ste el
proceso de germinacin (vivparismo), es decir, cuando las semillas son
despedidas inmediatamente despus de encontrar condiciones de lechos
adecuados, las plntulas inician su crecimiento sin incurrir en azarosos procesos
germinativos, como si lo hacen las plantas de tierra firme, esta semilla es llamada
hipoctilo. La dificultad surge cuando en el medio existen sustancias nocivas, ya

22
que pueden ser destruidas fcilmente por no poseer estructuras externas que las
protejan como si ocurre con las plantas terrestres.

La capacidad de flotar es otro aspecto a destacar en los embriones ya que pueden

viajar por varios meses hasta colonizar nuevos lechos, esta condicin les permite
dispersarse a grandes distancias sobre flujos de agua por accin del oleaje, las
mareas, inundacin por desborde de los ros y la precipitacin.

Por otra parte estudios realizados demuestran que al momento de reforestar con
propgulos de esta especie de mangle, dichos embriones tienen las tasas mas
bajas de mortalidad en relacin a los provenientes de las especies de Avicennia
germinans y Laguncularia racemosa (Elster, 2000), por este motivo Rhizophora
mangle es la especie de mangle ms usada en la actualidad en programas de
reforestacin.

Imagen 5. Propgulos de
Rhizophora mangle

23
4.5. MICROBIOLOGA DEL MANGLAR

En la actualidad es bien conocido que aunque los ecosistemas de manglar son

ricos en materia orgnica, en general, son deficientes en nutrientes, especialmente
nitrgeno y fsforo (Sengupta y Chaudhuri, 1991; Holgun et al., 1992). No
obstante los manglares son altamente productivos, lo cual puede ser explicado por
un sistema de reciclaje de nutrientes en el que aquellos que son escasos son
retenidos y los nuevos son regenerados por descomposicin de las hojas del
bosque (Alongi et al., 1993; Holgun et al., 1999).

En la transformacin de nutrientes dentro del manglar se propone una relacin

cclica entre microorganismos nutrientes plantas como el principal mecanismo
de reciclaje y conservacin de nutrientes. La alta productividad y diversidad de la
comunidad de microorganismos en los ecosistemas de manglar transforman
continuamente la necromasa en fuentes de nitrgeno, fsforo y otros elementos
que pueden ser utilizados por las plantas. Los exudados rizosfricos del manglar
son fuente de alimentacin para los microorganismos en el ecosistema y generan
una gran red alimentaria (Holgun et al., 2001).

Los exudados rizosfricos del manglar promueven la actividad microbiana en

sedimentos, que sostienen los ecosistemas (Holgun et al., 1999). Mecanismos de
promocin del crecimiento estn dados por la fijacin biolgica de nitrgeno y la
solubilizacin de fosfato, entre otros. La fijacin biolgica de N en el manglar es
considerable, con tasas que en algunos casos pueden proveer hasta un 40-60%
de los requerimientos de los mangles (Zuberer y Silver, 1978). Se han detectado
los procesos asociados a las hojas y races en descomposicin, a la corteza de
rboles, a la rizsfera, sedimentos y races areas (Zuberer y Silver 1978). La
fijacin de nitrgeno mediada por bacterias asociadas al sustrato, as como por
cianobacterias colonizadoras de races areas, cubre los requerimientos de los

24
manglares y desempean un importante papel en el mantenimiento y desarrollo
del ecosistema (Holgun, 1999).

Algunas de las ms importantes bacterias fijadoras de nitrgeno (BFN),

identificadas hasta ahora en ecosistemas terrestres, pertenecen a los gneros
Azospirillum, Azotobacter, Acetobacter, Rhizobium, Clostridium y Klebsiella. De
sedimentos y rizsfera de Rhizophora mangle, Avicennia germinans y
Laguncularia racemosa han sido aisladas varias cepas de diaztrofos asociativos
como Vibrio campbelli, Listonella anguillarum, V. aestuarianus y Phyllobacterium
sp. (Holgun et al., 1992).

En la superficie de los neumatforos de A. germinans se ha encontrado una gran

variedad de cianobacterias cuya distribucin de colonizacin est dada por
diferentes afinidades de oxgeno. Las cianobacterias filamentosas como Lyngbya
sp y Oscillatoria sp colonizan la parte inferior de los neumatforos. La porcin
central es colonizada por Microcoleus sp y la parte superior por Aphanothece sp
(Toledo et al., 1995).

Se ha encontrado que la fijacin biolgica de N2 disminuye significativamente

durante el proceso de purificacin de la cepa, debido a una necesaria interaccin
de diferentes grupos bacterianos para mediar el proceso. La asociacin con
Staphylococus sp (bacteria no fijadora de N) con la bacteria diazotrfica L.
anguillarum increment su tasa de fijacin (Holgun et al., 1992).

La inoculacin de A. germinans con la cianobacteria diaztrofa Microcoleus

chthonoplaste ha incrementado la actividad de fijacin de N y su concentracin
total. Esta asociacin soporta el uso de M. chthonoplaste como inoculante para la
reforestacin y rehabilitacin de manglares parcial o totalmente destruidos
(Holgun et al., 2001).

25
En cuanto al proceso de solubilizacin de fosfatos, las fuentes de fsforo
provienen de la descomposicin de residuos de plantas y animales que llegan al
mar, fosfatos de roca y otros insolubles de la roca nativa del subsuelo del mar e
inorgnicos insolubles de Na, K, Ca y Mg. La abundancia de cationes en aguas
marinas provoca la precipitacin del fsforo del agua intersticial del manglar, que
se deposita en sedimentos e imposibilita su absorcin por parte de las plantas. Los
fosfatos insolubles estn sujetos a la accin de los microorganismos de una
manera directa. Los cidos orgnicos e inorgnicos que producen los
microorganismos interactan con los fosfatos insolubles, dando lugar a
compuestos solubles y asimilables por las plantas.

En la rizsfera existe una gran proporcin de microorganismos solubilizadores de

fosfatos; los exudados radicales y detritos vegetales proveen el sustrato
energtico para soportar la intensa actividad microbiolgica caracterstica de este
microhbitat y la energa necesaria para llevar a cabo la solubilizacin de fosfatos.

Holgun (1999) reporta el aislamiento de diferentes bacterias solubilizadoras de

fsforo a partir de A. germinans como Bacillus amyloliquefaciens, B. licheniformis,
Enterobacter aerogenes, E. taylorae, E. asbururiae y Kluyvera cryocrescens y dos
especies de bacterias solubilizadoras de fosfatos (BSP) en races de mangle
blanco Chryseomonas luteola y Pseudomonas stutzeri.

El inculo con la mezcla de Phyllobacterium sp (diaztrofo) y Bacillus licheniformis

aislados de la rizsfera de mangle aument la fijacin de N por parte de
Phyllobacterium sp de 160 mmol/colonia a 470mmol/colonia. La coinoculacin de
plntulas de mangle con estas dos bacterias increment la incorporacin de N en
las hojas, de 1,700 a 3,200 N15 (Holgun et al., 2001).

La inoculacin con varias bacterias de la rizsfera de manglar a semillas de

Salicornia bigelovii (planta halfita de pantanos salados del norte de Amrica)

26
aument su crecimiento de un 44-102 % en peso seco, en un 500% sus
contenidos de N y protenas, y en un 94 % el contenido de cidos grasos. Estas
bacterias incluyen a Vibrio aestuarianus (diaztrofo) con la bacteria solubilizadora
de fosfato (BSF) V. proteolycus y a Phylobacterium myrsinacearum (diaztrofo)
con BSF B. licheniformis (Bashan et al., 2000).

Dentro de las estrategias estudiadas para mejorar la propagacin y crecimiento del

mangle, Kathiresan y Ravikumar (1995) concluyeron que el acodo areo y los
tratamientos hormonales con cido indol actico y cido indolbutrico pueden ser
aplicados en la propagacin vegetativa del mangle. Sin embargo, la aplicacin de
estas fitohormonas es costosa y en vez de la apicacin directa, podra suplirse
indirectamente por la aplicacin de microorganismos que las pueden producir por
metabolismo secundario.

En Colombia, una de las estrategias que se han estudiado para la reforestacin de

manglares ha sido la aplicacin exgena de poliaminas estimulando el crecimiento
vegetal y disminuyendo la fase de crecimiento lento en plntulas de R. mangle. La
aplicacin de putrescina y espermina activ el crecimiento de las plntulas de
mangle e indujo cambios favorables en diferentes parmetros de desarrollo
(Mendoza, 2000), sin embargo los resultados no son contundentes y esta
estrategia tambin resulta costosa.

Gonzlez et al. (1995) utilizaron el acodo areo como tcnica para la repoblacin
con mangle rojo logrando supervivencias del 64.4% y enraizamiento 80.2% de los
casos. No obstante la supervivencia de las plntulas fue nula al cabo de 40 das
de efectuado el transplante.

Otros estudios llevados a cabo en el pas se han basado en la aplicacin de

microorganismos aislados de rizsfera de manglar, con actividad fijadora de
nitrgeno (Aquaspirillum vinelandii) y solubilizadora de fosfatos (Penicillium sp.)

27
comprobada previamente in Vitro (Vanegas et al), sobre el crecimiento de
plntulas de mangle (A. germinans y R. mangle) y patilla (Citrullus vulgaris), en
dicho estudio se observ que la utilizacin de estas cepas causan un efecto
positivo de estimulacin de crecimiento en las plantas tratadas con dichos
inoculantes, motivo por el cual los autores relacionan los resultados obtenidos con
el potencial biotecnolgico de los inoculantes en procesos de restauracin,
reforestacin y uso como biofertilizantes (Vanegas y Galindo, 2006)

Por otra parte el proyecto manglares del Ministerio del Medio Ambiente de
Colombia obtuvo resultados satisfactorios con una tasa de supervivencia de
plntulas mayor del 70%, pero con un crecimiento lento (Ulloa et al.,1998) que, en
condiciones poco favorables (sedimentos inestables, la salinidad y las corrientes
marinas), contribuyen a una baja tasa de recuperacin de manglares (McKee,
1993).

A pesar de todo lo anterior la diversidad y gran actividad microbiana y faunstica,

an inexploradas, que transforman y reciclan los nutrientes en el manglar se
conocen muy poco (Holgun et al., 2001).

4.6. MICROORGANISMOS ENDFITOS

4.6.1. Generalidades. La palabra endfito se deriva del griego endon, que

significa dentro y phyte que significa planta (Chanway, 1996). De Barry fue el
primero en utilizar este trmino, en el ao 1866, al referirse a hongos viviendo
dentro de los tejidos de una planta (Petrini, 1986). A travs de los aos, diferentes
autores han propuesto definiciones ms complejas, coincidiendo en que la
naturaleza endfita permite colonizar tejidos internos de plantas sin producir
signos visibles de enfermedad, aunque algunas veces pueden presentar un grado
de patogenicidad leve.

28
En cuanto a los hongos endfitos, en 1986, Carroll los describi como
endosimbiontes y excluy los hongos patgenos y asociaciones micorrizas. Petrini
(1991) expandi esta definicin e incluy a los organismos con fases epifitas y
patgenos latentes que viven asintomticamente, por algn tiempo, dentro de los
tejidos internos de la planta.

A pesar de lo anterior en la actualidad el trmino endfito se refiere a los hongos y

bacterias que durante todo o parte de su ciclo de vida viven sin causar dao en el
interior de clulas o tejidos de plantas superiores (Wilson, 1995); esto excluye las
asociaciones micorrcicas e incluye hongos con fases latentes antes del periodo
de infeccin y hongos que son patgenos conocidos pero que no expresan
sntomas en el tejido.

Los microorganismos endfitos suelen vivir en los espacios intercelulares y,

algunas veces, intracelularmente en hojas, tallos y flores, absorbiendo nutrientes
de la planta. En algunos casos, estos confieren beneficios a la planta que pueden
resultar mutuos: utilizan los nutrientes que sintetiza la planta y sta se beneficia de
los metabolitos bioactivos que ellos producen, actividad que promete adelantos en
el rea biotecnolgica y en sistemas agrcolas. En gramneas se ha demostrado
que brindan resistencia a herbvoros mediante la produccin de metabolitos
secundarios que resultan txicos o reducen la palatabilidad para los organismos
que las consumen (insectos, mamferos).

La diversidad y nmero de microorganismos en la rizsfera es muy grande, lo cual

ocasiona que en este ambiente exista una fuerte competencia por los nutrientes y
en consecuencia que su disponibilidad sea limitada. Sobre esta base se ha
considerado que los microorganismos endfitos podran tener algunas ventajas
competitivas sobre los rizosfricos, ya que la disponibilidad de nutrientes es mayor
en el interior de las plantas y el nmero de microorganismos endfitos es menor
que el de los rizosfricos (James, 2000). Por otro lado, los microorganismos

29
endfitos se encuentran mejor protegidas que los rizosfricos de las condiciones
adversas que se presentan en el medio ambiente (Reinhold, 1998). Considerando
que los microorganismos endfitos se ubican en contacto ntimo con las plantas,
ellas podran brindar beneficios ms directos a su hospedero en comparacin con
los rizosfricos. Por ejemplo, podran excretar fitohormonas en el interior de las
plantas y/o protegerlas contra la accin de los fitopatgenos. La proteccin podra
ser a travs de efectos antagnicos, debido a la produccin de substancias que
inhiben el crecimiento de los patgenos (Muthukumarasamy, 2000) o bien, por el
desencadenamiento de una respuesta de defensa de la planta en contra de
patgenos inducida por el endfito, en forma similar a la que se observa con
algunas rizobacterias (Pieterse, 1999). Por otro lado, se ha sugerido que el interior
de las plantas es un ambiente propicio para que se lleve a cabo la fijacin
biolgica de nitrgeno (FBN), ya que este ambiente es bajo en oxgeno y
relativamente alto en fuentes de carbono, por lo que las bacterias diaztrofas
endfitas podran fijar el nitrgeno y liberarlo directamente en el interior de las
plantas contribuyendo con una parte de los requerimientos nitrogenados de la
planta hospedera (Boddey, 1995).

Para el caso particular de los hongos endfitos, se dice que algunos de estos
tambin producen sustancias con propiedades insecticidas, antibacteriales,
antifngicas y txicas a mamferos (Siegel y Schardl, 1991). Estos compuestos se
pueden desarrollar como modelos investigativos, fuentes de nuevos metabolitos
para medicamentos y usos industriales, agentes de control biolgico y
manipulacin gentica con fines biotecnolgicos (Clay, 1989; Siegel y Schardl,
1991; Stone et al., 2000).

En plantas no gramneas, aunque los hongos endfitos no se han relacionado con

un incremento en la resistencia a la herbivora, en ocasiones pueden reducir la
incidencia y proteger a las plantas de infecciones causadas por microorganismos
patgenos; aunque muchos de ellos producen diversos metabolitos secundarios

30
bioactivos, sin embargo an no se ha esclarecido su funcin exacta dentro de las
plantas.

Sridhar y Raviraja (1995) indican que el endofitismo podra ser una adaptacin en
respuesta a la competencia por sustrato. Por otro lado, se sugiere que los hongos,
luego de vivir como endfitos, pueden actuar como saprfitos al iniciar los
procesos de senescencia en una planta (Petrini, 1991). Estudios como el de
Rodrigues (1996) confirman esta hiptesis debido a que la mayora de los hongos
aislados como endfitos ya han sido reportados como saprfitos o patgenos de
otras especies de plantas. De igual manera, Schulz et al. (1998) corroboraron la
capacidad patognica de hongos aislados inicialmente como endfitos.

Segn investigaciones llevadas a cabo, todas las plantas de la tierra pueden ser
hospederos de al menos un hongo endfito (Petrini, 1986; Rodrigues, 1996) e
inclusive los endfitos han sido aislados de plantas acuticas (Stone et al., 2000).
El mayor nfasis se le ha dado a plantas de las familias Coniferaceae, Ericaceae y
Gramineae en zonas templadas; pero tambin se han aislado endfitos de plantas
no vasculares y helechos (Dreyfuss y Petrini, 1984; Petrini, 1986). Sin embargo en
los ltimos aos se ha comenzado a estudiar la diversidad de hongos endfitos en
un amplio grupo de plantas en zonas tropicales.

4.6.2. Relaciones Simbiticas de los Hongos Endfitos. Los hongos endfitos

forman con sus hospederos relaciones simbiticas complejas, y en la actualidad
existe un gran nmero de interrogantes acerca del funcionamiento de esta
simbiosis. En primera instancia se desea saber qu beneficio recibe cada uno de
los participantes por estar involucrado en esta relacin simbitica.

En los trpicos no hay ningn ejemplo comprobado de mutualismo entre endfitos

y sus hospederos, pero se cree que s hay casos. Existe un grupo de hongos

31
endfitos en pastos de las zonas templadas que les proveen proteccin contra
herbivora y depredacin de semillas mediante produccin de toxinas. A cambio
reciben alimento, un lugar donde vivir y, en algunos casos, dispersin a travs de
la semilla de su hospedero (Johnson et al., 1985; Clay, 1988; Knoch et al., 1993).

4.6.3. Mecanismo De Transmisin de los Hongos Endfitos. Petrini (1991)

propuso tres mecanismos que explican la llegada de hongos endfitos al tejido
vegetal:

Llegada e incorporacin de esporas aerotransportadas.

Transmisin por semillas.
Esporas inoculadas por insectos directamente en las plantas.

El primer mecanismo, tambin conocido como transmisin horizontal, ocurre en la

mayora de los casos, predominando en plantas leosas donde el hongo
usualmente se dispersa mediante esporas (Carroll, 1990). La transmisin por
semillas ha sido ampliamente estudiada en gramneas, donde los hongos se
transmiten entre generaciones a travs de las semillas de la planta hospedera
(Carroll, 1986).

4.6.4. Efectos Fisiolgicos de los Hongos en el Hospedero. Los hongos son

microorganismos con gran capacidad de influir el destino y la disponibilidad de los
nutrientes en un ecosistema (Lodge y Cantrell, 1995), por lo que es viable pensar
que su presencia tenga repercusiones fisiolgicas en el hospedero. Por ejemplo,
las especies de endfitos pueden afectar diferencialmente la tasa de uso de
fotosintatos, ya que las especies varan en sus requerimientos y preferencias
nutritivas. Esto podra afectar al hospedero, al inducir agotamiento de ciertos

32
productos y/o acumulacin de otros, de acuerdo con la presencia y/o dominancia
de ciertos endfitos.

Estudios indican que los hongos endfitos no afectan la tasa fotosinttica de sus
hospederos naturales en el estado de plntula (Gamboa-Gaitn et al., 2005b),
aunque recientemente se reporta el efecto negativo de los endfitos en plantas
tropicales de inters comercial (Rodrigues-Costa et al., 2000). Una publicacin en
cebada, reporta el aumento de la tolerancia al estrs salino y de la resistencia a
enfermedades por parte de la planta gracias a la presencia de un endfito de raz
(Waller et al., 2005). De otra parte, los hongos endfitos tambin producen
metabolitos secundarios que pueden proteger la planta contra herbvoros (Clay et
al., 1985; Clay, 1988). Si el recambio espaciotemporal de especies endfitas
modifica la calidad y/o cantidad de tales metabolitos, entonces es posible que el
hospedero tenga fluctuaciones temporales en la sensibilidad a herbvoros. La
importancia de este aspecto es innegable, al menos para la planta.

Desafortunadamente, no se sabe si la produccin de toxinas in vivo alcanza

cantidades fisiolgicamente activas (Lodge et al., 1996), por lo que en este campo
hay ms especulaciones que datos reales, especialmente para especies
tropicales. Un aspecto interesante pero poco explorado, es el de la interaccin
fisiolgica de los miembros de esta simbiosis, la cual debe ser muy intensa dada la
asociacin celular cercana. El tema es de tan crucial importancia para la existencia
de esta simbiosis, que se ha postulado recientemente que el estado fisiolgico de
la planta determina si la relacin ser de carcter mutualista o parastico (Redman
et al., 2001).

33
 5. MARCO ESPACIAL

Las reas de estudio tomadas para la investigacin se encuentran localizadas

en La Baha de Chengue ubicada dentro del Parque Nacional Natural Tayrona,
a unos 14 km al nororiente de la ciudad de Santa Marta (Depto. Magdalena) y la
Cinaga de Mallorqun situada en las reas de jurisdiccin de los municipios de
Barranquilla y Puerto Colombia en el Departamento del Atlntico.

34
 6. MARCO TEMPORAL

La presente investigacin se llevar a cabo a partir del mes de Agosto de 2008 y

se espera culminar en Mayo de 2009.

35
 7. DISEO METODOLGICO

7.1. TIPO DE INVESTIGACIN

Emprica: ya que el mtodo utilizado incluye operaciones prcticas y

experimentales.

Aplicada: debido a que el fin que persigue es prctico y los conocimientos

obtenidos sern aplicados para la toma de decisiones.

No experimental: ya que no se controlan variables, solo sern estudiadas o

analizadas en su situacin normal.

De Laboratorio: teniendo en cuenta que ser llevada a cabo en un ambiente

cerrado y controlado.

Exploratoria: ya que ya que se busca dar una visin aproximada de un tema.

Descriptiva: debido a que estudia sucesos del presente.

36
 8. METODOLOGA

8.1. REA O ZONA DE ESTUDIO

8.1.1. Baha de Chengue. La Baha de Chengue hace parte del Parque Natural
Tayrona, situado 14 km al noreste de la ciudad de Santa Marta en la Costa Caribe
de Colombia; esta baha se encuentra localizada en las siguientes coordenadas
1120'N y 7408'W y cuenta con una extensin de 3,3 km2.

Presenta el bosque manglar en mejor estado y con mayor cobertura de todo el

parque Tayrona, principalmente alrededor de la laguna sur, domina al borde una
franja R. mangle y al interior o en zonas mas estables se presenta A. germinans.
Tiene una marcada influencia marina, la salinidad promedio es de 37.5
(mximo=43.0; mnimo=29.0) (Rodrguez-Ramrez y Garzn-Ferreira, 2003) y
vara segn las pocas climticas y la ubicacin en el sistema. En la laguna
durante la poca seca se ha registrado una estratificacin salina, segn la cual la
salinidad tiende a ser menor hacia la boca que en las zonas interiores (Boca=38;
interior=42), y en los meses lluviosos se invierte el gradiente, pero las diferencias
son menores entre la boca y el interior (Boca=33-34, interior=32-33) (lvarez-Len
et al., 1995).

8.1.2. Cuenca Hidrogrfica de la Cinaga de Mallorqun. La cuenca de la

Cinaga de Mallorqun se localiza en las siguientes coordenadas 7452 longitud
Oeste y 1105 latitud Norte, presenta una superficie aproximada de 296.2 Km 2,
cuya rea de influencia esta definida a partir del nacimiento del arroyo Grande a la
altura de Pital de Megua del municipio de Baranoa, extendindose hacia el norte
hasta desembocar en el margen sur occidental de la cinaga de Mallorqun.

37
En el costado noroccidental se encuentra un bosque maduro dominado por la
especie A. germinans entre la cual se mezclan algunos rboles de C. erectus y L.
racemosa. La regeneracin natural de L. racemosa es abundante y hay algunas
plntulas de R. mangle y A. germinans.

En el costado sur existe un bosque monoespecfico de A. germinans poco

desarrollado, en los claros formados por tala o por la cada de los rboles viejos,
se encuentran plntulas de R. mangle, sobre todo en las zonas anegadas por las
aguas negras que ingresan al bosque desde los caseros y barrios vecinos.

En el costado oriental se observa un playn bordeado por un cinturn de manglar,

compuesto exclusivamente por A. germinans. En la orilla de la cinaga se
encuentra un borde de R. mangle de aproximadamente 10 metros de ancho.
Despus de la franja de R. mangle, se observa un cinturn de rboles jvenes de
L. racemosa; seguido a esta franja el bosque esta compuesto por A. germinans,
L. racemosa y C. erectus; y hacia el final del bosque crece un cinturn de R.
mangle. La salinidad promedio del ecosistema es de 20,6 ppm.

8.2. METODOLOGA DE MUESTREO

Se seleccionarn rganos vegetativos a partir de plantas de Rhizophora mangle;

solo se tendrn en cuenta aquellas plantas que no presenten sintomatologa de
enfermedades -sin manchas foliares, clorosis, zonas necrticas, marchitez o
heridas-.

Entre las muestras de los rganos vegetativos a tomar se encuentran:

- Hojas.
- Tallos jvenes

38
 - Races
- Frutos (propgulos)

Se realizar un muestreo aleatorio, en el cual se tomarn las muestras a partir de

10 plantas diferentes, de las cuales a cada una se le tomar dos submuestras de
cada rgano -hojas, tallos, races, propgulos- para obtener un total de 20
muestras por rgano, las cuales sern agrupadas por subgrupo, y al azar se
seleccionarn 10, cuatro de estas destinadas para el aislamiento de hongos y las
seis restantes para el aislamiento de bacterias.

Luego de haber recolectado todas las muestras se procede a sellarlas en bolsas

de plstico estriles para evitar la contaminacin con el ambiente y se llevan al
laboratorio para ser procesadas en un periodo no mayor a 24-48 horas despus
del muestreo.

8. 3. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

8.3.1. Prelavado (Bacon, 2002). Todas las muestras sern lavadas con buffer
salino, en el caso de las bacterias este ser ajustado a pH de 7.2 y para el caso de
los hongos a un pH de 5.6.

8.3.2. Proceso de Esterilizacin Superficial para Muestras destinadas para el

Aislamiento de Hongos Endfitos (Bacon, 2002).

Esterilizacin Superficial para Races, Propgulos y Tallos

Todo el material ser sometido a una solucin de Hipoclorito de Sodio al 5.25%
suplementada con 0,01% de Tween 20 por un periodo de 15 minutos, en un
shaker orbital con agitacin constante. Luego del tiempo transcurrido durante la

39
esterilizacin, el material es sometido a lavados sucesivos con agua destilada
estril.

Esterilizacin Superficial para Hojas

Para esterilizar la superficie de estos rganos, se llevar a cabo el procedimiento
descrito anteriormente variando el tiempo de exposicin a la solucin a tan solo 3-
5 minutos, despus de los cuales las muestras sern sometidas a lavados
sucesivos con agua destilada estril.

8.3.3. Proceso de Esterilizacin Superficial para Muestras destinadas para el

Aislamiento de Bacterias Endfitas (Bacon, 2002).

Inicialmente se lleva a cabo un lavado de todo el material con agua destilada

estril y luego se sumerge en un buffer salino (pH 7) por 10 minutos para equilibrar
la presin osmtica y prevenir la difusin pasiva de los agentes esterilizantes al
interior de los tejidos.

Esterilizacin Superficial para Races, Propgulos y Tallos

El material es inmerso en una solucin de cloramina-t por un periodo de 1 hora,
luego se sumerge en un buffer fosfato 0.05M (pH 7) durante 30 minutos,
finalmente se llevan a cabo lavados sucesivos con agua destilada estril.

Esterilizacin Superficial para Hojas

Para esterilizar este material, se emplea una solucin de cloramina-t al 1% en la
cual este es sumergido por un periodo de 30 minutos o bien se emplea una
solucin de hipoclorito de sodio al 5.25% por 5 minutos. Luego se lava el material
con agua destilada estril dejndolo en contacto con esta por 3 minutos.

40
Para el secado de todo el material se deja pasar unos minutos bajo la cabina de
flujo laminar o se seca sobre papel estril.

Con el fin de comprobar la efectividad de cada uno de los procesos de

esterilizacin, se tomarn algunas partes despus de realizado este proceso (sin
tener ningn tipo de corte) y se imprimir el tejido sobre los diferentes medios de
cultivo con los cuales se va a trabajar.

8.4. PROTOCOLO DE AISLAMIENTO

8.4.1. Aislamiento de Hongos Endfitos por El Mtodo Directo.

Siembra de Muestras
Ya habiendo esterilizado cada una de las partes, se procede a realizar cortes en
ellas, con el fin de que al momento de sembrar en cada uno de los medios, los
hongos que se encuentren en el interior de la estructura vegetal migren hacia el
exterior de esta y se evidencie su crecimiento en medio de cultivo. Ese
procedimiento se llevar a cabo de manera distinta para cada uno de los rganos:

o Hojas
Se dividen en distintas partes y mediante tcnicas aspticas se cortan en
secciones pequeas (1-2 cm) entre la nervadura central y el borde de la hoja,
con el uso de un bistur estril (Ganley, 2006).

o Ramas
Inicialmente se realizar un corte longitudinal y luego uno transversal, con el
fin de obtener fragmentos de no ms de 1cm de longitud.

41
 o Races y Propgulos
Son cortados en pequeas rodajas de no ms de 5mm de grueso.

Luego de haber practicado los cortes, las muestras se sembrarn en Agar

Sabouraud suplementado con antibiticos -Cloranfenicol 0,05 mg/ml y
Estreptomicina 0,05 mg/ml- para evitar el crecimiento bacteriano, y se incuba a
temperatura ambiente por un periodo de 2-8 semanas.

Purificacin de las Colonias e Identificacin

A partir de los crecimientos obtenidos en las cajas se procede a aislar cada uno de
los morfotipos, realizando una resiembra en Agar PDA, para su posterior
identificacin mediante claves taxonmicas y el empleo de pruebas
convencionales.

Los aislamientos obtenidos se conservarn en condiciones apropiadas con el fin

de mantenerlas como cepas de referencia.

8.4.2. Aislamiento De Bacterias Endfitas Aerobias y Anaerobias.

Mtodo Directo
Se realizarn cortes en el material vegetal de la misma manera que para el
aislamiento de hongos y las muestras sern sembradas en cajas con Agar
Nutritivo suplementado con 0.20% de cicloheximida y se incuba a 37C por un
periodo de 7 das. Para el caso de las bacterias anaerobias al agar se le
adicionar 0.01% de clorhidrato de cistena y se incubar en condiciones de
anaerobiosis.

42
 Mtodo de Diluciones
Solo se realizar una dilucin, para ello se tomar 1gr de cada una de las
submuestras y por separado se homogenizarn en licuadora con 9ml de agua
peptonada 0.01% suplementada con 0.20% de cicloheximida. Para el caso de
aquellas muestras que sern destinadas para el asilamiento de bacterias endfitas
anaerobias, al diluyente se le adicionar 0.01% de clorhidrato de cistena.

Se sembrarn alcuotas de 0.1ml de cada muestra en cajas con agar nutritivo

suplementado con 0.20% de cicloheximida y se incubar a 37C por un periodo
de 7 das. Para el caso de las bacterias anaerobias al agar se le adicionar 0.01%
de clorhidrato de cistena y se incuba en condiciones de anaerobiosis.

Purificacin de las Colonias e Identificacin

Despus de haber observado crecimiento de las colonias durante las primeras
semanas, se proceder a realizar un recuento de las colonias obtenidas para cada
tipo de muestra, luego se procede a aislarlas a cajas de Petri con Agar Nutritivo,
para su posterior identificacin mediante el empleo de pruebas bioqumicas
indicadas en Koneman (1987) para observar utilizacin de sustratos y con paneles
de deteccin rpida de microorganismos (API 20E, BBL Crystal). Los aislamientos
obtenidos se conservarn en condiciones apropiadas con el fin de mantenerlas
como cepas de referencia.

8.4.3. Aislamiento e Identificacin de Bacterias Diaztrofas Endfitas.

Siembra de Muestras
Se sembrarn alcuotas de 0.1ml de las diluciones realizadas para el aislamiento
de bacterias endfitas aerobias y anaerobias, en tubos con medio NFB semislido
y se incuba en aerobiosis a una temperatura de 37C por un periodo de 7 das o

43
hasta observar en el medio de cultivo una pelcula superficial o subsuperficial de
color amarillo a blanco (Dbereiner, 1994).

Repique en el Mismo Medio.

Para el caso de aquellos tubos que hayan presentado formacin de la pelcula
caracterstica, sern repicados en el mismo medio con la finalidad de agotar en lo
posible el nitrgeno que se pudiera agregar con la muestra al ser sembrada.

Prueba de Reduccin del Acetileno

Con el fin de confirmar la presencia de organismos diaztrofos con actividad
fijadora de nitrgeno se lleva a cabo el mtodo indicado por Lozano (1998) para la
comprobacin de la actividad nitrogenasa de forma indirecta a travs de la
reduccin del acetileno a etileno, utilizando cromatografa de gas en medios
sembrados con aquellas bacterias que presentaron crecimiento con formacin de
pelcula caracterstica. El ensayo ser realizado en un Cromatgrafo Gases
SHIMADZU GC-2014 con una columna Porapak N 80/100 (Porapak T.).

Aislamiento de Colonias
A partir de rplicas de los tubos con actividad nitrogenasa positiva se hace una
siembra en estriado en el mismo medio de cultivo selectivo pero slido el cual es
suplementado con extracto de levadura que promueve el crecimiento; segn
Dobereiner (1980) en este paso debido a las condiciones de incubacin aerbica
los microorganismos microaeroflicos no pueden fijar su propio nitrgeno por lo
tanto una fuente de nitrgeno combinado (extracto de levadura) asegura la
supervivencia de microorganismos que en condiciones de aerobiosis no tienen
mecanismos adecuados de proteccin de la nitrogenasa.

44
Se identifican los diferentes tipos de colonias y se pasan nuevamente al medio de
cultivo semislido con el fin de conocer cuales son los responsables de la
formacin de la pelcula caracterstica, las cuales se seleccionarn para su
purificacin.

Purificacin de Colonias e Identificacin

Se lleva a cabo un aislamiento de cada una de las colonias obtenidas en Agar
papa (AP), para su posterior identificacin mediante el empleo de pruebas
bioqumicas indicadas en Koneman (1987) para observar utilizacin de sustratos y
con paneles de deteccin rpida de microorganismos (API 20E, BBL Crystal). Los
aislamientos obtenidos se conservarn en condiciones apropiadas con el fin de
mantenerlas como cepas de referencia.

45
 9. PRESUPUESTO

Descripcin Valor en Pesos

Personal 5.760.000
Equipos de Uso propio (cuantificacin-10%) 10.000.000
Salidas de Campo 2.000.000
Materiales y Suministros 6.710.000
Servicios Tcnicos y Mantenimiento 1.000.000
Bibliografa 500.000
TOTAL 25.970.000

46
 10. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Meses
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Actividades
Muestreo en campo

Aislamiento de Hongos Endfitos

Identificacin de Hongos Endfitos

Aislamiento de Bacterias Endfitas

Identificacin de Bacterias Endfitas

Aislamiento de Bacterias Endfitas

Diaztrofas

Identificacin de Bacterias Endfitas

Diaztrofas

Estandarizacin de la actividad de la
nitrogenasa (Cromatografa de gases).

Evaluacin de la actividad nitrogenasa

Anlisis de datos

Conservacin y mantenimiento de cepas

Entrega de informes

47
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58
 ANEXOS

ANEXO 1

Localizacin y distribucin de las formaciones de manglar de la Baha de Chengue.

59
 ANEXO 2

Localizacin de la cuenca Hidrolgica de Mallorqun con la red

hdrica. Fuente: CI (2005).

60