Metabolitos secundarios de importancia farmacutica producidos por actinomicetos

Palabras clave: Actinomicetos, metabolitos secundarios, productos bacterianos naturales.

RESUMEN

El advenimiento de la moderna biotecnologa abri por completo nuevas perspectivas para el

uso de microorganismos como generadores de productos farmacuticos. A la vista de la inmensa
variedad de grupos de genes biosintticos de productos naturales que ahora son accesibles a
travs de la secuenciacin de alto rendimiento, es deseable establecer tecnologas eficientes de
modificacin, transferencia y expresin. Los mtodos que la ingeniera gentica provee pueden
ser utilizados para la produccin de productos naturales derivados de microorganismos de lento
crecimiento o incluso de aquellos que no se pueden cultivar. Estos mtodos pueden modificar
genes biosintticos o insertar genes especficos dentro del ADN de una cepa productora de
antibiticos para obtener metabolitos secundarios modificados. Aunado a lo anterior, nuevos
metabolitos se pueden obtener por combinar al azar los genes de dos o ms grupos de genes
que tienen influencia en rutas biosintticas similares. El presente artculo describe brevemente
diferentes clases de sustancias mdicamente tiles producidas por actinomicetos con
aplicaciones farmacolgicas. Adems, se mencionan los efectos de algunos compuestos sobre
diferentes organismos y la bacteria que lo produce.

INTRODUCCION

Los microorganismos viven en ambientes naturales, donde su crecimiento es afectado tanto por
interacciones con otras poblaciones (sinrgicas, antagnicas, etc.) como por las caractersticas
fsicas y qumicas de su entorno. Como consecuencia de esas interacciones, se producen
metabolitos secundarios con actividades biolgicasvariadas, que juegan un papel importante en
su sobrevivencia. En contraste a los metabolitos secundarios producidos por las plantas, cuyo
uso contra enfermedades tiene sus races en la medicina tradicional, los compuestos de
importancia farmacutica obtenidos de microorganismos son el resultado de intensas
investigaciones de la naturaleza como fuente de compuestos bioactivos llevados a cabo por un
gran nmero de laboratorios en todo el mundo. La identificacin y caracterizacin biolgica y
molecular de microorganismos tiles como agentes de biocontrol, productores de compuestos
bioactivos o sustitutos de antibiticos, ha sido de gran inters para la medicina y la agricultura
moderna. En este contexto se han evaluado microorganismos, se han aislado y caracterizado
qumica y biolgicamente sus metabolitos secundarios, y se ha estudiado el papel que estos
juegan en el control de enfermedades y en las respuestas de defensa (Martn, 2003; National
Research Council (NRC), 2003 www.item.ba.crr.it/biopesti.htm.) Originalmente la bsqueda de
compuestos tiles se realizaba siguiendo varios pasos, entre los cuales se pueden mencionar los
siguientes: 1) colectar sistemticamente microorganismos del suelo, 2) crecerlos en cultivos
axnicos, 3) probar la capacidad de los medios donde crecan los microorganismos para inhibir
el crecimiento de organismos patgenos, y 4) recuperar las sustancias activas producidas por los
microorganismos. De est bsqueda se obtuvo que los actinomicetos eran los organismos que
con mayor frecuencia producan compuestos inhibidores del crecimiento de bacterias
patgenas, en particular cerca del 50% de las cepas aisladas de Streptomyces presentan algn
compuesto activo principalmente contra bacterias Gram-positivas. De tal manera que al inicio
de los aos sesenta se descubrieron miembros de las principales familias de antibiticos
clnicamente tiles. Con excepcin de las penicilinas, cefalosporinas y algunos productos
menores, todos eran producidos por los actinomicetos. De manera colectiva su espectro de
accin cubra prcticamente todos los patgenos bacterianos importantes (www.bib.gbf.de/
ergebnisbenisberech/1997/english/section-c/c3/ c3english.htm). Sin embargo, a pesar de la
gran cantidad de compuestos aislados, surgi la necesidad de una revisin a fondo de los
objetivos y los mtodos para buscar compuestos tiles. Esto se dio por el hecho de que el
nmero de antibiticos aislados fue tal que la competencia por descubrir nuevos compuestos
se volvi cada vez ms frecuente. Sin embargo, considerando la dificultad y costos elevados de
aislar nuevas estructuras y agentes antimicrobianos con formas novedosas de actuar, el
descubrimiento de nuevos compuestos entr en una fase de decaimiento acelerado (DiMasi et
al., 1994), sobretodo si se toma en cuenta que la probabilidad de encontrar en los
microorganismos compuestos bioactivos tiles es de 1 por cada 10,000 cultivos examinados por
los mtodos microbiolgicos tradicionales (Clark, 1996). En este sentido, la bsqueda de
compuestos activos comenz a dar un giro importante, principalmente teniendo como objetivo
la bsqueda de compuestos contra hongos, virus o cepas bacterianas resistentes a antibiticos.
Por lo tanto, la estrategia de bsqueda de metabolitos novedosos se cambi lentamente en
muchos laboratorios, tomando en cuenta que menos del 1% de las especies bacterianas y menos
del 5% de las especies de hongos son conocidas, y que millones de especies microbianas
permanecen desconocidas, por lo que es grande el potencial de los microorganismos como
proveedores de compuestos bioactivos tiles (Yung, 1997), algunos de ellos han optado por
mtodos de bsqueda masiva de microorganismos inusuales o raros (como algunos
actinomicetos) u organismos que viven en ambientes marinos peculiares, principalmente en
ambientes de temperaturaextrema o de elevadas presiones
(www.febras.ru/vpiboc/english/newpsoe1.htm; Carte, 1996). Otros grupos han enfocado su
investigacin a la bsqueda de nuevos sitios blanco de los compuestos ya conocidos, en vez de
aislar nuevos organismos productores. El resultado de todo ello ha sido el descubrimiento de
agentes antimicrobianos nuevos e importantes, sustancias con actividad antitumoral e
inhibidores de enzimas de mamferos de potencial inters farmacutico, entre otros
compuestos. Sin embargo, a pesar de contar con un nmero importante de metabolitos, se
requiere de nuevos productos que cubran diferentes necesidades en las reas mdica, agrcola
y alimenticia. Por ejemplo, en la medicina se requiere de nuevos productos debido a: 1) el
desarrollo de resistencia de microorganismos patgenos, 2) la aparicin de nuevas
enfermedades (SIDA, virus Hanta, virus del bola, enfermedad de Lyme, Escherichia coli
0157:H7, entre otras), 3) la existencia de bacterias resistentes naturalmente y 4) la toxicidad de
algunos compuestos actualmente en uso (Demain, 1999); en la agricultura se requiere de
compuestos tiles para combatir bacterias, virus, insectos y nematodos fitopatgenos; para la
nutricin animal se requiere de compuestos que puedan utilizarse para la preservacin de
alimentos. Los progresos de la biotecnologa moderna han abierto nuevas perspectivas para el
uso de microorganismos como productores de metabolitos con aplicaciones farmacuticas,
auxilindose de la ingeniera gentica como herramienta que provee de nuevos mtodos para
la obtencin de metabolitos secundarios modificados que cubran las necesidades actuales.

METABOLITOS SECUNDARIOS PRODUCIDOS POR ANTINOMICETOS

Los metabolitos secundarios producidos por bacterias son molculas relativamente pequeas
producidas por un nmero limitado de cepas, que al parecer no tienen una funcin determinada
en el crecimiento celular. De hecho, las cepas productoras de stos, que por alguna mutacin
han perdido su capacidad de producirla, presentan crecimiento y caractersticas normales. Estos
metabolitos incluyen diferentes tipos de compuestos de importancia econmica, dentro de los
cuales se encuentran los antibiticos, pigmentos, toxinas, feromonas, inhibidores enzimticos,
agentes inmunomoduladores, antagonistas y agonistas de receptores, pesticidas, agentes
antitumorales y promotores del crecimiento en animales y plantas. Esta gran variedad de
compuestos producidos en la naturaleza se ve reflejada en cerca de los ms de 23,000
metabolitos microbianos conocidos, de los cuales el 42% los producen hongos, 32%
actinomicetos y el resto producidos por otros grupos de bacterias (Lazzarini et al., 2000). En el
caso de los actinomicetos, es ampliamente reconocida la capacidad que tienen de producir una
gama muy variada de metabolitos secundarios (Baltz & Hosted, 1996), algunos de los cuales se
describen a continuacin y que son relevantes por su uso como frmacos. I. Antibiticos Los
metabolitos microbianos ms importantes son los antibiticos, sustancias que a bajas
concentraciones inhiben el crecimiento de diferentes especies de microorganismos y que
ejercen su mayor efecto sobre la salud, nutricin y economa de la sociedad. Un aspecto
importante es el gran nmero de antibiticos existentes, de los aproximadamente 8,000
reportados hasta 1999, 45.6% eran producidos por estreptomicetos, 16% por otros
actinomicetos, 16.9% por otras bacterias y 21.5% por hongos (Lazzarini et al, 2000). Otro aspecto
importante de los antibiticos se refiere a la variedad de estructuras qumicas que presentan,
en donde todas las clases de molculas de la qumica orgnica estn representadas: cadenas
alifticas, anillos aromticos aislados o condensados, anillos heterocclicos, oligopptidos y
oligosacridos entre otros muchos ms. La propiedad que hace que los antibiticos sean
considerados como frmacos maravillosos, es la selectividad de su mecanismo de accin, que
los distingue de germicidas y desinfectantes sintticos. Su toxicidad selectiva contra algunas
clases de organismos, con pocas excepciones, los ha convertido en los compuestos ms
utilizados para la terapia contra microorganismos patgenos. Esto ha significado que las ventas
de algunos de estos compuestos superen los 23 billones de dlares, ventas relacionadas a no
ms de 300 productos naturales, semisintticos o sintticos, que incluyen cefalosporinas,
penicilinas, quinolonas, tetraciclinas y macrlidos (Strohl et al., 1991). Los antibiticos se
agrupan en familias, caracterizadas porque agrupan compuestos que tienen una estructura
qumica similar y comparten el mismo mecanismo de accin antimicrobiano (Lancini et al.,
1995). De manera breve se describen algunos de los antibiticos producidos por actinomicetos.
La tabla 1 muestra los principales antibiticos, su estructura qumica y el sitio donde actan.
 Seleccin de cepas de Trichoderma spp. generadoras de metabolitos
secundarios de inters para su uso como promotor de crecimiento en
plantas cultivadas

Selecting strains of Trichoderma spp. generating secondary metabolites of

interest for use as a growth promoter in plants grown

Resumen

La interaccin Trichoderma-Trichoderma de 35 cepas, fue estudiada debido al

potencial del hongo para sintetizar Metabolitos Secundarios (MS), como el cido-3-
indolactico (AIA), mediante enfrentamientos duales en medio de cultivo slido
potato-dextrose-agar (PDA) como mtodo de seleccin para cepas formadoras de
barrera de defensa entre 0.5-0.7cm con ancho ptimo de seleccin. Se
identificaron 20 enfrentamientos duales, estos fueron replicados en medio de
cultivo lquido potato-dextrose-agar (PDA) en agitacin constante, al cabo de 9 das
de crecimiento se realiz el filtrado del caldo para separar los metabolitos
sintetizados por el hongo del micelio formado. Esta sustancia de inters, que
contiene a los MS, fue inoculada en dos cultivos: Lactuca sativa y Raphanus
sativus. Se encontr que, los mejores tratamientos para el ensayo de Lactuca
sativa son los enfrentamientos 3(BP-T0001-BPT0029), 4(BP-T0006-BPT0028),
7(BP-T0007-BPT0024) y el cultivo individual I (BP-T0028) como las mejores cepas
inductoras de crecimiento e involucra el peso, largo, volumen de raz y el peso de
hoja. Para el ensayo de Raphanus sativus los mejores tratamientos son el
enfrentamiento 10 (BP-T0015-BPT0025) y el cultivo individual K (BP-T0031) como
inductores del largo de raz, dimetro y peso de bulbo. El cultivo individual G (BP-
T0024) y fertilizante qumico QUI inductores del peso de hoja y el enfrentamiento 3
(BP-T0001-BPT0029) como inductor del peso de raz. Por lo tanto los MS
sintetizados por Trichoderma spp. durante los enfrentamientos duales actan como
Promotores del Crecimiento en Plantas (PGP).

Palabras clave: Trichoderma spp, metabolitos secundarios, hongo promotor de

crecimiento en plantas, enfrentamientos duales, Lactuca sativa, Raphanus sativus.

Introduccin

Trichoderma es un gnero de hongos que tiene bastante importancia para la vida

humana y la funcionalidad de un ecosistema, descomponedor de la materia orgnica,
esencial en la recirculacin de nutrientes en el medio ambiente. Algunos miembros de
este gnero tienen asociaciones simbiticas con plantas, leguminosas, gramneas,
compuestas, solanaceas y otras, mientras otras son utilizados como biocontroladores
contra organismos patgenos como Fusariumy Rizoctonia, adems la produccin de
enzimas industriales como los pigmentos de antraquinona y otros (Druzhinina & Kubicek
2005) y metabolitos secundarios (MS) como antibiticos y promotores del crecimiento
de plantas (PGP: Plant Growth Promoting), ideales para la agricultura (Harman et al.
2004, Vinale et al. 2006, Vinale et al. 2008, Vinale et al. 2009, Druzhinina et al.
2011). Trichoderma spp. uno de los hongos que est presente en todo tipo de suelos
agrcolas y ecosistemas, su versatilidad, adaptacin y fcil manipulacin (Fernndez-
Larrea 2001) ha permitido su uso por ms de 70 aos como antagonista para el control
de enfermedades en plantas producidas por hongos en el mundo (Kubicek & Harman
2002).

Entre los MS de Trichoderma spp. se encuentra el cido-3-indolactico (AIA)

una hormona inductora del crecimiento (Gravel et al. 2007), as Trichoder ma spp.
como hongo promotor del crecimiento (PGPF: Plant Growth Promoting Fungi) (Yedidia
1999, Harman 2000, Gravel et al. 2007, Vinale et al. 2008, Ach 2008), accin que fue
estudiada mediante la induccin de la produccin de metabolitos con (i) aminocidos
inductores especficos de hormonas (AIA) como el L-triptfano (L-Trp) (Gravel et al.
2007), (ii) patgenos (Vinale et al. 2006, Vinale et al. 2008) y (iii) el inculo directo
de Trichoderma spp. identificado como PGP. Se ha logrado incrementar la velocidad y
porcentaje de germinacin, reducir los efectos causados por condiciones de estrs
ambiental (Bjorkman et al. 1998), y frente a patgenos como Rhizoctonia
solani y Fusarium sp. comunes en cultivos agrcolas (Ach 2008), como tambin el
aumento de la altura de las plantas, peso seco y tamao de las races (Kleifeld & Chet
1992).

As, la creciente demanda de alternativas ecolgicas para el uso de agroqumicos y

fertilizantes sintticos en la produccin agrcola, su estudio de propiedades benficas de
los microorganismos en el suelo (Har man et al. 2004, Vinale et al. 2008, Vinale et al.
2009, Ryder et al. 2012). Actualmente se desarrollan productos con organismos vivos,
conocidos como agentes de control biolgico: hongos, bacterias, virus e insectos
(PROINPA 2012) a travs del aislamiento y caracterizacin de microorganismos nativos
bolivianos mediante pruebas en laboratorio (Ortuo et al. 2004) y en campo mediante
ensayos realizados con Trichoderma spp. en plntulas de cebolla y tomate en el Valle
Alto de Cochabamba-Bolivia donde se destaca la particularidad de este hongo co mo
PGPF (Medrano & Ortuo 2007, Ach 2008).

Por esta razn, las cepas de Trichoderma spp. han adquirido un alto valor comercial,
abarcando nuevas tecnologas para la produccin masiva de productos de este hongo
(Cruz 2007). Aunque su uso travs de productos donde se tiene como componente
activo esporas de Trichoderma spp. en diferentes medios de crecimiento, ya sea de
forma slida o lquida (PROINPA 2012), se tiene como dependencia la capacidad de
crecimiento y supervivencia del hongo en el sustrato inoculado y la competencia con
otros micro organismos de suelo.

Esta interaccin provocada lleva a una mayor produccin de componentes de defensa,

sintetizados a travs del metabolismo secundario del hongo donde se ha encontrado al
AIA entre otros (Bentez et al. 2004). Segn Kilian et al. (2006), el desarrollo de
productos biolgicos basados en microorganismos benficos puede ampliar las opciones
del mantenimiento y rendimiento de cultivos en campo, dentro de la agricultura
boliviana andina, la baja fertilidad, deficiente conservacin de suelos se refleja en bajos
rendimientos de los cultivos, que sera superable con el empleo de biofertilizantes de
preparacin local (Franco et al. 2005).

Por consiguiente se ha visto necesario la bsqueda de formas alternativas de obtener

dichos beneficios: mediante tcnicas de estrs biolgico en laboratorio, como los
enfrentamientos duales de Trichoderma spp. donde se aprovecha doblemente el
potencial del hongo, identificndose las cepas productoras de MS-PGP dejando de lado
los mtodos tradicionales de enfrentamientos de Trichoderma spp. con patgenos de la
planta.

Materiales y mtodos

El ensayo se realiz en el laboratorio de microbiologa de la Fundacin para la

Promocin e Investigacin de Productos Andinos (Fundacin PRO INPA), ubicada en
la provincia Quillacollo del departamento de Cochabamba, que se encuentra a 15
Km de la ciudad, a una altitud de 2613 msnm y cuyas coordenadas geogrficas son
1721 00.7 latitud sur y 6615 40.6 longitud oeste.

Cepas microbianas, 35 cepas nativas bolivianas de Trichoderma spp disponibles en

la coleccin de la Fundacin PROINPA, fueron activadas en (PDA: potato-dextrosa-
agar, DifcoTM Laboratories, Becton Dickinson, Sparks, MD, USA). Estas fueron
incuba das en tubos de ensayo de 6 mL a 202 oC durante 8 das.

Prueba preliminar de deteccin del cido indol actico (AIA), la capacidad de

sntesis del cido indol actico (AIA) de las 35 cepas de Trichoderma spp. de forma
individual, Rico (2009). Inicialmente, se prepar el medio de cultivo caldo de papa
(PDB: potato-dextrose-broth), segn el protocolo establecido por el laboratorio de
microbiologa de la Fundacin PROINPA. El medio fue llevado a la autoclave durante
15 min a 121 C, se agreg la mezcla previamente filtrada de 0.153 g de L-Trp
disuelto en 15 mL de agua. A continuacin se realiz la inoculacin de las 35 cepas
de Trichoderma spp en erlenmeyer de 50 mL con el medio de cultivo PDB
enriquecido con L-Trp (aminocido precursor para la sntesis del AIA durante el
desarrollo de Trichoderma spp.). El medio de crecimiento del hongo se mantuvo en
agitacin constante a 100 rpm a 232 oC durante 7 das, se centrifug a 5000 rpm
durante 10 min, en una centrfuga marca Vortex 21K, el sobrenadante se dispenso
en placas de plstico tipo ELISA, con 96 hoyos de 250 L, marca MicroWell. Para su
revelado se adicion solucin de Salkowski (ClFe3=2% al 0.05M, H2SO4=35%
H2O=63%), que detecta derivados del Indol (Gordon & Weber 1951). Como testigo
negativo o cero se us un pocillo control con PDB ms la solucin de Salkowski.
Para el control positivo se usaron dos bacterias identificadas (Bacillus
subtilis y Bacillus amiloliquefasciens) como positivas a la prueba. La placa de ELISA
se llev a oscuridad por 15 min, para su posterior revelado, se observ viraje de
color de amarillo a diversas tonalidades entre el rango de rosado a fucsia
encendido, coloracin que indica la presencia de AIA (Gordon & Weber 1951).

Enfrentamientos duales-PDA, para seleccionar las mejores cepas

de Trichoderma spp. productoras de MS de inters, se produjo el estrs biolgico
del hongo mediante enfrentamientos duales en placas petri de 90 mm de dimetro
con PDA, las 35 cepas de Trichoderma spp. tuvieron en 7 das de crecimiento (placa
matriz), de esta se tom una muestra general de inculo un disco de 5 mm de
dimetro (PDA ms hongo en crecimiento), que fueron sembrados en puntos
equidistantes en placa petri de 50 mm, se incubo a 202 oC por 8 das. Durante
este tiempo, se realizaron controles de velocidad de crecimiento, compatibilidad o
incompatibilidad. Hecho que se verifica con la presencia o no de la barrera de
defensa . Para este ensayo se trabaj con 315 enfrentamientos: combinaciones
duales de las 35 cepas de Trichoderma spp. cada enfrentamiento cont con tres
repeticiones.

Anlisis estadstico, se consideraron los siguientes parmetros como variables de

respuesta: Para el con trol de velocidad de crecimiento de los enfrentamientos
duales, se tom como variables (i) crecimiento horizontal del hongo en la placa
petri (cm) y (ii) crecimiento vertical del hongo en la placa petri (cm), datos que
fueron evaluados mediante un anlisis de cluster con el programa estadstico PAST.
Se observaron tres caractersticas de forma general al final de los 8 das de
crecimiento: (i) compatibilidad de ciertas cepas durante su crecimiento en la placa
petri, (ii) crecimiento en la placa petri de forma proporcional, y (iii) crecimiento
agresivo de una de las dos cepas enfrentadas, limitando el avance de su
antagonista en la placa petri. Al terminar el periodo de crecimiento del hongo, se
tom como parmetro de seleccin el ancho de barrera presentado en la placa petri
(Tabla 1).
Produccin de Metabolitos Secundarios (MS), la replicacin en medio de cultivo PDB
los 20 enfrentamientos duales que presentaron formacin de la barrera de
defensa gruesa (0.5-0.7 cm) en el medio de cultivo PDA y as facilitar la
separacin de la sustancia de inters producida durante la interaccin de ambas
cepas del micelio formado, realizndose nuevos cultivos duales con los
enfrentamientos seleccionados segn la metodologa Rea ves & Crawford (1994),
tambin descrita en Vinale et al. (2009), en matraces erlenmeyer de 50 mL con
PDB autoclavado a 121 C durante 15 min, tambin se realiz el cultivo individual
(discos de 5 mm de dimetro tomados de la plaza matriz) en PDB de las 12 cepas
de Trichoderma spp. que forman parte de los enfrentamientos duales. Los matraces
fueron llevados a agitacin constante, 100 rpm durante 9 das a temperatura
ambiente (252 C). Cada enfrentamiento cont con cinco repeticiones, de ellas se
tom un matraz al azar para la medicin del pHinicial (da uno), pHintermedio (a cuatro
das), pHfinal (a nueve das. Los cultivos individuales, con una repeticin, se tom el
pH final de cada uno (datos no presentados).

Filtrado del medio de cultivo PDB, despus de 9 das de crecimiento, los

enfrentamientos y cultivos individuales de Trichoderma spp. en PDB, se separaron
de la sustancia de inters del micelio del hongo formado mediante el siguiente
protocolo: (i) se separ el micelio formado por Trichoderma spp. del caldo, (ii) se
realiz choque trmico a 50 C por 15 min del lquido obtenido, luego se filtr y
separo cualquier resto de estructura fngica de la sustancia de inters que contiene
a los MS: (i) papel filtro No1, (ii) papel de filtro cualitativo 415VWR equivalente a
papel filtro WHATMAN No6 de 3 m y (iii) Sterile Syringe Filter de 0.2 m Cellulose
Acetato VWR mas una jeringa estril de 5 mL.

Bioensayos en invernadero, se utiliz el diseo alea torio por bloques, con 6

bloques para cada ensayo (Lactuca sativa y Raphanus sativus) cada bloque con 35
tratamientos: 20 enfrentamientos duales, 12 cepas individuales, 1 testigo (T) caldo
de cultivo PDB, 1 tratamiento biolgico (BIO): TRICOBAL, y 1 tratamiento qumico
(QUI): INKAFERT AZUL. Los fertilizantes qumico (QUI) y biolgico (BIO) fueron
instalados como tratamientos positivos, las semillas de Lactuca sativa y Raphanus
sativus sem bradas en macetas de 2 kg con tierra estril (Arena-Cascarilla de
Arroz-Tierra vegetal en proporcin 1:1:1), esterilizada a 150 C por 120 min con
vapor de agua. A partir de la germinacin de las se millas se control el tiempo en
el cual estas llegaron al estadio de plantines (punto de partida del ensayo). De esta
forma se procedi a inocular 500 L de cal do filtrado de los enfrentamientos duales
de Trichoderma spp. 500 L de caldo filtrado de las cepas individuales
de Trichoderma spp. 0.5 g de TRICOBAL y 0.44 g de INKAFERT AZUL. El inculo del
caldo filtrado de 500 m por tratamiento se hizo en la zona de la meso-rizsfera.
En el caso del inculo slido como es TRICOBAL e INKAFERT AZUL se realiz
alrededor de la rizsfera entre 6-8 cm de profundidad.

Variables de respuesta, se realizaron evaluaciones semanales de desarrollo de

plantines en cuanto a altura del rea foliar, nmero de hojas, el regado de las
plantas en desarrollo se realiz cada 48 h, por la maana. Al cabo de un mes y
medio de crecimiento controlado, se realiz la cosecha de Lactuca
sativa y Raphanus sativus, se consider las variables de respuesta: (i) cultivo
de Lactuca sativa: peso de hoja (g), peso de raz (g), largo de raz (cm), volumen
de raz (mL) y (ii) cultivo de Raphanus sativus: peso de hoja (g), dimetro del
bulbo (cm), peso del bulbo (g), largo del bulbo (cm), volumen del bulbo (mL), largo
de raz (cm), peso de raz (g).

Anlisis estadstico, el anlisis de cluster mediante el programa estadstico PAST

para la evaluaciones de invernadero: cosecha de los cultivos de Lactuca
sativa y Raphanus sativus. Tambin se realizaron para los datos de las variables de
respuesta obtenidos de la cosecha de los ensayos evaluaciones mediante el anlisis
de varianza (ANOVA) bajo la distribucin normal con un nivel de confianza del 99%
con el software estadstico SAS-9.2.

Resultados

Prueba preliminar de deteccin de AIA, las 35 cepas de Trichoderma spp.

analizadas de forma individual en la prueba de AIA, las cepas 1, 6, 7, 8, 10, 15, 18,
23, 24, 25, 28, 29, 31, 32 marcaron positivo a la presencia de AIA.

Enfrentamientos duales-PDA, los controles de crecimiento de

cepas Trichoderma spp. se observ un efecto antagnico en PDA, la formacin de
barrera de defensa entre cepas incompatibles en rea de terminada de crecimiento.
En su inicio una cepa enfrentada es capaz de inhibir a su antagonista a distancia,
luego la detencin, se realiza por secrecin de sustancias antifngicas, parmetro
de seleccin, formacin y dimensin de la barrera (Figura 1).
Considerando la clasificacin de los 105 enfrentamientos, realizados en PDA, se
tiene como resultado: 20 enfrentamientos con barrera gruesa (Tabla 2)
seleccionados para la produccin de MS en PDB, adems de ser este el grupo que
mostr la menor velocidad de crecimiento al momento de competir frente a otro
hongo del mismo gnero en un rea determinada, segn el anlisis de Cluster.

Dentro de los 20 enfrentamientos duales de Trichoderma spp. las cepas individuales

1, 6, 7, 15, 18, 23, 24, 25, 28, 29, 31, 32 identificadas como productoras de AIA
mediante la induccin del L-Trp, formaron la barrera de defensa gruesa al ser
enfrentadas entre las cepas del mismo grupo en PDA, las cepas individuales 8 y 10
no presentaron el mismo resultado, ya que al ser enfrentadas con otra cepa
de Trichoderma spp. del mismo grupo, la barrera de defensa formada en la placa
petri con el medio de cultivo PDA fue delgada en un 56% de los enfrentamientos y
fina en un 36%.

Produccin de MS, la evaluacin del pH final de los enfrentamientos duales y las

cepas individuales de Trichodermaspp. en PDB, el anlisis ANOVA indica que no
existen diferencias estadsticas notables (P<0.01) entre ambos tratamientos. En
general, el pH final de los cultivos de cepas individuales de Trichoderma spp. al final
del ensayo present variaciones entre 4.28 y 8.38, y solamente una cepa present
pH neutro. Asimismo el pH final de los enfrentamientos duales no sobrepasa el
valor de 7.17.

Bioensayos en invernadero

Anlisis estadstico para el ensayo de Lactuca sativa, se muestra que los

enfrentamientos duales y los cultivos individuales, pueden ser agrupados en 8
(Tabla 3) segn la eficiencia de accin como PGPF.

Por lo tanto, de acuerdo al anlisis de las medias generales para las variables de
respuesta evaluadas al final de la cosecha, los mejores tratamientos pertenecen
al Grupo 5 con los tratamientos: 3, 4, 7 (enfrentamientos) e I (cultivo
individual). Por lo que estos tratamientos podran utilizarse como promotores de
crecimiento en el cultivo de Lactuca sativa (Figura 2).
Por otra parte en anlisis de varianza muestra que se encontraron diferencias
estadsticas significa tivas (Pr<0.01) para las variables de respuesta peso de hoja,
peso de raz, largo de raz y volumen de raz para el cultivo de Lactuca sativa. Por
lo que el efecto de los cultivos individuales y enfrentamientos duales entre los
tratamientos vari segn los caracteres de la planta.

Anlisis estadstico para el ensayo de Raphanus sativus, se muestra que los

enfrentamientos duales y los cultivos individuales, pueden ser agrupados en 9
(Tabla 4).
De los cuales el mejor grupo como PGPF, de acuerdo al anlisis de medias
generales para las variables de respuesta evaluadas al final de la cosecha, es
el Grupo 6 (Figura 3) con los tratamientos 10 (enfrentamiento) y K (cultivo
individual).

El anlisis de varianza muestra diferencias significativas (Pr<0.01) para las

variables de respuesta peso de hoja, dimetro de bulbo, peso de bulbo, largo de
bulbo, volumen de bulbo y largo de raz para el cultivo de Raphanus sativus, y no
as para la variable peso de raz.