Journal of Orofacial Orthopedics
Fortschritte der Kieferorthopdie
IL-1 and compressive forces lead to a significant induction
of RANKL-expression in primary human cementoblasts
IL-1 und Kompression fhren zu einer signifikanten
Induktion der RANKL-Expression in primren humanen
Zementoblasten
Katja Diercke, Annette Kohl, Christopher J. Lux, Ralf Erber
Abstract
Aim. The aim of this study was to investigate the response of
primary human cementoblasts to conditions as they occur on the
pressure side during orthodontic tooth movement.
Methods. In our previous study, the cementoblasts were char-
acterized using markers for osteoblastogenic differentiation and
the cementoblast-specific marker CEMP-1. Initially, primary hu-
man cementoblasts were compressed for 1 h, 4 h, and 6 h (30 g/
cm2). In the second experiment, the cementoblasts were stimu-
lated with interleukin (IL)-1 for 24 h and for 96 h with 1 ng/ml and
10 ng/ml and subsequently compressed for 1 h and 6 h. Changes
in mRNA expression for receptor activator of NF-B (RANK), RANK
ligand (RANKL), osteoprotegerin (OPG), and cyclooxygenase-2
(COX-2) were measured by quantitative real-time polymerase
chain reaction (RT-PCR). RANK and RANKL were also examined by
immunocytochemical staining at the protein level.
Results. Compression (30 g/cm2) led to a significant increase in
RANKL expression after 6 h. OPG expression in compressed ce-
mentoblasts was significantly reduced after 1 h. RANK remained
unchanged during the course of the experiment. Stimulation with
IL-1 induced RANKL and OPG expression. However, IL-1-
dependent induction of RANKL was more prominent than the in-
duction of OPG, leading to a (significant) increase in the RANKL/
OPG ratios. The expression of RANK remained unchanged after 24
h of stimulation with IL-1 and decreased significantly after 96 h.
Compression of the prestimulated cells resulted in a further in-
crease in RANKL expression significant after 6 h. OPG and RANK
expression remained unchanged compared to the unstimulated
sample. COX-2 increased significantly after both compression and
stimulation with IL-1. Combined stimulation and compression
1
Poliklinik fr Kieferorthopdie, Universittsklinikum Heidelberg
Received: January 25, 2012; accepted: April 12, 2012;
published online: September 7, 2012
Original article
Zusammenfassung
Zielsetzung. Ziel war es, die Reaktion primrer humaner Ze-
mentoblasten auf verschiedene Konditionen zu untersuchen, die
auf der Druckseite whrend der kieferorthopdischen Zahnbewe-
gung vorherrschen.
Methode. Die verwendeten Zementoblastenpopulationen
wurden in einer vorangegangenen Arbeit mithilfe von Markern
der osteoblastogenen Differenzierung sowie dem zementoblas-
tenspezifischen Marker cementum protein 1 (CEMP-1) charakte-
risiert. Zunchst haben wir primre humane Zementoblasten fr
1, 4 und 6 h komprimiert. In einem zweiten Experiment wurden
die Zementoblasten zunchst mit 1 und 10 ng/ml Interleukin-1
(IL-1) fr 24 und 96 h stimuliert und anschlieend fr 1 und 6 h
mit 30 g/cm2 komprimiert. Nachfolgend wurden nderungen in
der mRNA-Expression fr receptor activator of NF-B (RANK),
RANK ligand (RANKL), Osteoprotegerin (OPG) und Zyklooxyge-
nase-2 (COX-2) mithilfe der quantitativen real-time polymerase
chain reaction (RT-PCR) gemessen. RANK und RANKL wurden zu-
stzlich mit immunzytochemischer Frbung auf Proteinebene
untersucht.
Ergebnisse. Die Kompression mit 30 g/cm2 fhrte zu einer sig-
nifikanten Steigerung von RANKL nach 6 h. Osteoprotegerin war
in komprimierten Zementoblasten bereits nach 1 h signifikant re-
duziert. Die Expression von RANK blieb ber den Beobachtungs-
zeitraum unverndert. Das Verhltnis von RANKL zu OPG stieg
ber den Verlauf des Experiments signifikant an, und die Stimula-
tion mit IL-1 induzierte die Expression von RANKL und OPG. Je-
doch war die Induktion von RANKL durch IL-1 strker als die von
OPG, sodass das Verhltnis von RANKL zu OPG (signifikant) zu-
nahm. Die Expression von RANK blieb nach 24-stndiger Stimula-
tion mit IL-1 unverndert und sank nach 96 h signifikant. Die zu-
stzliche Kompression der vorstimulierten Zellen resultierte in
einer weiteren signifikanten Steigerung der RANKL-Expression
nach 6 h.
J Orofac Orthop 2012; 73:397-412
DOI 10.1007/s00056-012-0095-y
J Orofac Orthop 2012 No. 5 Springer-Verlag 397
Diercke et al. RANKL, OPG-, und RANK-Expression in humanen Zementoblasten
resulted in a significant further increase after 6 h compared to IL-
1 stimulation alone.
Conclusion. Primary human cementoblasts in vitro express in-
creased levels of RANKL, in particular during the combination of
inflammation and compression. The increase in RANKL expression
is not compensated by an increase in OPG expression. The induc-
tion of RANKL expression was associated with a significant in-
crease in COX-2 expression. Since RANKL attracts osteoclasts, its
increase might be associated with the progression of root resorp-
tion. The in vitro alterations in cementoblasts we observed may be
indicators of cellular mechanisms that lead to the increased root
resorption during orthodontic treatment.
Keywords
Orthodontic tooth movement Human cementoblasts
Root resorption Compression side Inflammation
Introduction
There is general consensus that root damage occurs in over
90% of patients undergoing orthodontic tooth movement [26].
Cementoblastshighly specialized cells of ectomesenchymal
origincan repair this damage by replenishing such defects
with restorative cementum [5]. In 15% of patients, this repair
mechanism is ineffective, and particularly pronounced resorp-
tion of the dental root occurs involving a loss of more than 4
mm [24, 34]. Several patient- and treatment-related risk fac-
tors for the occurrence of root resorption have been studied
and described (see the systematic review of [34]).
Damage to the dental root is initiated by the application of a
force causing compression of the cell-rich and liquid-filled peri-
odontal ligament. This results in compression-induced degra-
dation of the blood supply in the periodontal ligament, with tis-
sue and cell necrosis in the periodontal ligament (PDL) as early
as within the first 24 h [31, 33]. The cell-free tissue appears his-
tologically as a glass-like layer, similar to the appearance of hya-
linized cartilage, and is characterized as a hyaline zone (from the
Greek hyalos = transparent, glassy, clear) [17, 30, 31].
The mechanical forces acting on the cells in the PDL cause
increased cytokine secretion by, for example, PDL fibroblasts.
Interleukins (e.g., IL-1 and IL-6) and tumor necrosis factor-
(TNF-) have been revealed in the compression side [1, 21, 32].
These cytokines also play an important role during the inflam-
matory reaction in the absence of a bacterial cause on the com-
pression side, a reaction described as an aseptic inflammatory
response during orthodontic tooth movement [3, 4]. The effect
of cytokines corresponds to that during inflammation: they at-
tract macrophages and support their differentiation into osteo-
clasts, which carry out bone resorption. At the same time, they
inhibit the activity of osteoblasts, thus, preventing bone forma-
tion [22]. This guarantees that the necrotic tissue is resorbed due
to the initial application of force and that tooth movement with
bone remodeling takes place.
398 J Orofac Orthop 2012 No. 5 Springer-Verlag
Die zustzliche Kompression hatte keinen signifikanten Effekt auf
die Expression von OPG und RANK im Vergleich zur ausschlielich
stimulierten Probe. Die Expression von COX-2 stieg signifikant so-
wohl durch Kompression als auch nach Stimulation mit IL-1.
Nach kombinierter Stimulation und Kompression kam es nach 6 h
zu einem signifikanten Anstieg im Vergleich zu den Zementoblas-
ten, die lediglich stimuliert wurden.
Schlussfolgerungen. Primre humane Zementoblasten expri-
mieren in vitro insbesondere whrend einer Kombination von In-
flammation und Kompression vermehrt RANKL. RANKL wird nicht
durch eine verstrkte Expression von OPG kompensiert. Die ver-
strkte Expression von RANKL war mit einer deutlichen Steige-
rung der Expression von COX-2 assoziiert. Da RANKL Osteoklasten
anzieht, knnte dies mit einer Progredienz von Wurzelresorptio-
nen einhergehen. Dies kann auch ein Hinweis fr zellulre Mecha-
nismen sein, die zur gesteigerten Entstehung von Wurzelresorp-
tionen im Verlauf einer kieferorthopdischen Behandlung fhren.
Schlsselwrter
Kieferorthopdische Zahnbewegung Humane Zement-
oblasten Wurzelresorptionen Druckseite Entzndung
Einleitung
Nach heutigem Kenntnisstand kann von einer Wurzelschdi-
gung bei ber 90% der Patienten whrend einer kieferorthop-
dischen Zahnbewegung ausgegangen werden [26]. Zement-
oblasten, hochspezialisierte Zellen ektomesenchymalen Ur-
sprungs, bernehmen die Reparatur dieser Schden, indem sie
die Defekte mit einem Reparaturzement wiederauffllen [5].
Bei 15% der Patienten bleibt der Reparaturmechanismus aus,
und es kommt zu besonders ausgeprgten Resorptionen der
Zahnwurzel mit einem Verlust > 4 mm [24, 34]. Verschiedene
patienten- und behandlungsabhngige Risikofaktoren fr das
Auftreten von Wurzelresorptionen sind untersucht und be-
schrieben worden (systematischer Review: [34]).
Die Entstehung von Schden an der Zahnwurzel wird durch
die Applikation einer Kraft eingeleitet, durch die es zu einer
Kompression des zellreichen und flssigkeitsgefllten Parodon-
talspalts kommt. Es resultiert eine kompressionsbedingte De-
gradierung der Blutversorgung im Parodontalspalt mit Nekroti-
sierung des Gewebes und der Zellen des Parodontalligaments
(PDL) bereits in den ersten 24 h [31, 33]. Histologisch imponiert
das zellfreie Gewebe als zellfreie glashnliche Schicht, vergleich-
bar mit dem Aussehen von hyalinisiertem Knorpel, und ist als
sog. hyaline Zone (grch: hyalos: durchsichtig, glasig, klar) be-
zeichnet worden [17, 30, 31].
Die mechanischen Krfte, die auf die Zellen im PDL einwir-
ken, bewirken eine erhhte Ausschttung von Zytokinen durch
beispielsweise Fibroblasten des PDL. Fr die Kompressionsseite
sind insbesondere Interleukine (z. B. IL-1 und IL-6) und Tu-
mor-Nekrose-Faktor(TNF)- nachgewiesen worden [1, 21, 32].
Da diese Zytokine ebenfalls eine bedeutende Rolle whrend der
 Diercke et al. RANKL, OPG-, and RANK-Expression in human cementoblasts

alveolar bone PDL cement dentin

direction of force

compression

RANK receptor

RANKL

OPG
b osteoblast, osteocyte, cementoblast osteoclast activated osteoclast

Figure 1. a Schematic representation of processes on the compression side during orthodontic tooth movement that lead to root re-
sorption. Activated osteoclasts attach themselves to the dental root and resorb the cementum here. The results are resorption lacunae in
the root cementum. b Schematic representation of how the RANKL-RANK-OPG system functions. The application of pressure on osteo-
cytes, osteoblasts, and cementoblasts causes them to increase the secretion of RANKL. The RANK ligand (RANKL) binds to its RANK recep-
tor on osteoclasts and causes activation of the osteoclasts. These resorb bone or cementum. Free OPG occupies the RANK receptors on
the osteoclasts, preventing RANKL from binding there. This leads to the inactivation of the osteoclasts
Abbildung 1. a Schematische Darstellung der Vorgnge auf der Druckseite whrend einer kieferorthopdischen Zahnbewegung, die zu
Wurzelresorptionen fhren. Aktivierte Osteoklasten lagern sich der Zahnwurzel an und resorbieren hier das Zement. Es entstehen Re-
sorptionslakunen im Wurzelzement. b Schematische Darstellung der Funktion des RANKL-RANK-OPG-Systems. Die Applikation von
Druck auf Osteozyten, Osteoblasten und Zementoblasten fhrt zu einer gesteigerten Sekretion von RANKL durch diese Zellen. Der
RANK-Ligand (RANKL) bindet an seinen RANK-Rezeptor auf Osteoklasten und bewirkt eine Aktivierung der Osteoklasten. Diese resorbie-
ren Knochen bzw. Zement. Freies OPG kann die RANK-Rezeptoren auf den Osteoklasten besetzen, sodass dort RANKL nicht mehr binden
kann. Dies fhrt zu einer Inaktivierung der Osteoklasten

In the case of root resorption, histological studies suggest ex-
cessive resorption due to macrophages and odontoclasts/osteo-
clasts that absorb not only the necrotic tissue, but also root ce-
mentum and, in some cases, dentin. As a result, dental root re-
sorption always takes place in close proximity to the hyalinized
areas [6, 13].
Slight resorption of cementum induced by orthodontic tooth
movement, thus, seems inevitable. Even orthodontically un-
treated teeth demonstrate slight resorption defects. Resorption
Entzndungsreaktion spielen, jedoch auf der Druckseite eine
bakterielle Ursache fehlt, wird von einer aseptischen Entzn-
dungsreaktion whrend der kieferorthopdischen Zahnbewe-
gung gesprochen [3, 4]. Die Wirkung der Zytokine entspricht
der whrend einer Entzndung: Sie ziehen Makrophagen an
und untersttzen deren Differenzierung zu Osteoklasten, die
die Resorption von Knochen bernehmen. Gleichzeitig hem-
men sie die Aktivitt von Osteoblasten und dadurch die Kno-
chenformation [22]. So kann gewhrleistet werden, dass das

J Orofac Orthop 2012 No. 5 Springer-Verlag 399

Diercke et al. RANKL, OPG-, und RANK-Expression in humanen Zementoblasten
is clinically irrelevant because the cementoblasts repair the de-
fects by secreting cellular afibrillar cementum [26]. The defects
where the repair mechanism has failed are visible in radio-
graphs. It remains unclear under what conditions the cemento-
blasts refill the cementum lacunae with cementum and under
what conditions the repair of the defects fails.
We can assume thatsimilar to the regulation of continuous
bone remodelinga variety of molecules regulate the activity of
root-resorbing osteoclasts/macrophages and cementum-form-
ing cementoblasts. In particular, osteoclasts and cementoblasts
may become interconnectedsimilar to bone remodelingin
a way that alternatingly directs these activities. With respect to
bone remodeling, it is well known that the receptor activator of
NF-B/receptor activator of NF-B ligand/
osteoprotegerin(RANK/RANKL/OPG) signal pathway is cru-
cial for bone homeostasis and bone remodeling [23, 35]. The
RANKL secreted by osteoblasts and osteocytes [22, 23], medi-
ated by the transcription factors NF-B (nuclear factor -c of bei denen der Reparaturmechanismus ausbleibt. Unklar ist
activated B-cells), c-fos and NFATc1 (nuclear factor of activated
T-cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 1), induces the dif-
ferentiation of macrophages to osteoclasts. This leads to osteo-
clastogenesis and osteolysis of the bone. OPG, which osteoblasts
also secrete, acts as a quasi-ligand for RANK, thus, antagonizing
the RANKL effect, which results in the inhibition of osteoclas-
togenesis (Figure 1).
In association with root resorption, there is evidence that PDL
cells of strongly resorbed teeth express significantly more RAN-
KL than do PDL cells from intact teeth [36]. Here, RANKL is
induced in correlation with prostaglandin E2 (PGE2) and cy-
clooxygenase-2 (COX-2) in the PDL cells and murine cemento-
blasts (OCCM-30) [15, 18, 20, 29].
However, non-human cementoblasts are only comparable
with their human equivalents to a limited extent because they
form a different repair cementum (acellular cementum) than
human cementoblasts (cellular cementum) [2]. Acellular ce-
mentum is formed much more quickly. Since the roots of ro-
dents are exposed to extremely high loads, damage to dental
roots is, thus, repaired more effectively. In a previous study,
three primary human cementoblast populations were exten-
sively characterized using markers for osteoblastogenic differ-
entiation (osteocalcin, alkaline phosphatase, bone sialoprotein
and the runt-related transcription factor 2 (RUNX2), as well as
CEMP-1. The expression pattern of those cementoblasts resem-
bled that of osteoblasts in the early phase of osteoblastogenic
differentiation. Those investigators also demonstrated via ali-
zarin staining that these cementoblasts were capable of produc-
ing a mineralized matrix [9].
Until now, there has been no investigation of the response of
primary human cementoblasts in terms of their RANKL and
OPG expression on the compression side during orthodontic
tooth movement. We assume thatunder the conditions pre-
vailing on the compression side of orthodontic tooth move-
mentcementoblast activity is altered in terms of the RANKL-
dependent signal pathway. This may favor the development of
root resorption. Our study focused on this mechanism.
400 J Orofac Orthop 2012 No. 5 Springer-Verlag
nekrotische Gewebe infolge der initialen Kraftapplikation re-
sorbiert wird und eine Zahnbewegung mit Knochenremodellie-
rung stattfindet.
Im Fall der Wurzelresorptionen wurde aufgrund von histo-
logischen Studien eine berschieende Resorption durch Mak-
rophagen und Odontoklasten bzw. Osteoklasten vermutet, die
nicht nur das nekrotisierte Gewebe, sondern ebenfalls den Wur-
zelzement und teilweise das Dentin resorbieren. So finden Re-
sorptionen der Zahnwurzel immer in rumlicher Nhe zu den
hyalinisierten Arealen statt [6, 13].
Eine geringgradige Resorption von Wurzelzement, induziert
durch eine kieferorthopdische Zahnbewegung, scheint somit
unvermeidlich. Selbst kieferorthopdisch unbehandelte Zhne
weisen kleinere Resorptionsdefekte auf. Klinisch sind die Re-
sorptionen nicht relevant, da die Zementoblasten die Defekte
durch die Sekretion von zellulrem afibrillrem Zement repa-
rieren [26]. Rntgenologisch sichtbar sind diejenigen Defekte,
nach wie vor, unter welchen Konditionen die Zementoblasten
die Zementlakunen mit Zement wiederauffllen und unter wel-
chen Konditionen die Reparatur der Defekte ausbleibt.
Es ist davon auszugehen, dass, hnlich der Steuerung der kon-
tinuierlichen Knochenremodellierung, eine Vielzahl von Mole-
klen die Aktivitt von wurzelresorbierenden Osteoklasten/
Makrophagen und zementbildenden Zementoblasten steuert.
Insbesondere knnte es, hnlich der Knochenremodellierung,
eine Kopplung zwischen Osteoklasten und Zementoblasten ge-
ben, die wechselseitig die Aktivitten steuert. In Hinsicht auf die
Knochenremodellierung ist bekannt, dass der receptor activa-
tor of NF-B/receptor activator of NF-B ligand/Osteoprote-
gerin-(RANK/RANKL/OPG-)Signaltransduktionsweg von
entscheidender Bedeutung fr die Knochenhomostase bzw.
die Knochenremodellierung ist [23, 35]. Dabei induziert von
Osteoblasten und Osteozyten sezerniertes RANKL [22, 23], ver-
mittelt ber die Transkriptionsfaktoren nuclear factor '-light-
chain-enhancer' of activated B-cells (NF-B), c-fos und nucle-
ar factor of activated T-cells, cytoplasmic, calcineurin-depen-
dent 1 (NFATc1) die Differenzierung von Makrophagen zu
Osteoklasten. In der Folge kommt es zur Osteoklastogenese und
Osteolyse des Knochens. Osteoprotegerin, ebenfalls von Osteo-
blasten sezerniert, fungiert als Scheinligand fr RANK und an-
tagonisiert damit die Wirkung von RANKL, was eine Hem-
mung der Osteoklastogenese herbeifhrt (Abbildung 1).
Im Zusammenhang mit Wurzelresorptionen konnte bereits
gezeigt werden, dass PDL-Zellen von stark resorbierten Zhnen
signifikant mehr RANKL exprimieren als PDL-Zellen aus un-
beschdigten Zhnen [36]. Dabei erfolgte die Induktion von
RANKL Prostaglandin-E2(PGE2)- und COX-2-abhngig in
PDL-Zellen und in Zementoblasten von Musen (OCCM-30)
[15, 18, 20, 29].
Nichthumane Zementoblasten lassen sich jedoch nur bedingt
mit ihren humanen quivalenten vergleichen, da sie einen an-
deren Reparaturzement (azellulrer Zement) bilden als mensch-
liche Zementoblasten (zellulrer Zement) [2]. Azellulrer Ze-
ment wird wesentlich schneller produziert. Da die Wurzeln von
 Diercke et al. RANKL, OPG-, and RANK-Expression in human cementoblasts
Materials and methods
Isolation and culturing of primary human cementoblasts
The cells originated in tissues of patients aged 1220 years.
The teeth were extracted for orthodontic reasons. The extrac-
tion and cultivation of cementoblasts from extracted teeth was
approved by the local ethics committee. The cementoblasts
were isolated according to techniques published previously [7,
12, 14, 16]. Specifically, the PDL cells were fractionated by
means of sequential (20140 min) enzymatic digestion with
collagenase 2 (2 mg/ml [0.1 units/mg], 0.25% trypsin, PAA
Laboratories, Clbe, Germany) [14, 16]. The fraction after 140
min of enzymatic digestion contained mainly cementoblasts,
while PDL fibroblasts predominate in the early phases [14, 16].
The cementoblasts investigated in this study were isolated after
140 min of digestion and then cultured in Dulbecco's Modi-
fied Eagle Medium (DMEM, Invitrogen, Karlsruhe, Germany)
with 10% fetal calf serum (Biochrom, Berlin, Germany), 2 mM
of L-glutamine, antibiotics, and antifungals (PAA Laboratories,
Clbe). The medium was replaced every 3 days. Primary
human cementoblasts in the 4th8th passage were used for the
experiments.
Application of pressure
The cementoblasts were compressed at 127 g in cell culture
dishes (d = 60 mm) using centrifugation. The centrifugal force
was 30.3 g/cm2 [8] calculated using the following formula:
P = (mrrpm22)/A9.8900), where P = pressure (kg/cm2), Zementoblasten
m = mass (of the medium; in kg), r = radius (m), A = surface
area of the cell culture dishes (cm2 [28]). Pressure was applied
constantly for various durations (1 h, 4 h, 6 h; [25]).
Stimulation with IL-1 and pressure application
To stimulate the cells, they were cultured for 24 h with reduced
serum (DMEM with 2% FCS). Subsequently, IL-1 (Promok-
ine, Heidelberg, Germany), dissolved in DMEM/1% albumin
from bovine serum (BSA, SigmaAldrich, Steinheim, Ger-
many) was added to the cultured cementoblasts. The condi-
tions 1 ng/ml and 10 ng/ml, each for 24 h and 96 h, were
thereby examined. Both periods were incubated continuously
in DMEM/1% BSA without subsequent media replacement.
The controls were cultured in DMEM/1% BSA only.
Immunocytochemical staining
To illustrate the localization of RANKL and RANK, cementob-
lasts were cultured on slides with wettable reaction wells and
then fixed with methanol/acetone (1:1) at 20C for 10 min.
The cells were blocked with 0.25% casein/0.1% bovine serum
albumin for 30 min at room temperature. The antibodies
against RANKL (1:50) or RANK (1:50; Santa Cruz Biotech,
Heidelberg, Germany) were incubated overnight at 4C. Stain-
ing was visualized by using a serum against rabbit IgG conju-
gated with Alexa 594 (1:50; Lifetechnologies, Darmstadt, Ger-
many). Counterstaining (nuclear staining) was performed
with DAPI (4',6-diamidine-2-phenylindole). Photomicro-
Nagetieren einer besonders hohen Belastung ausgesetzt sind,
knnen Schden an den Zahnwurzeln somit effektiver repariert
werden. In einer vorangegangenen Arbeit wurden 3 primre
humane Zementoblastenpopulationen umfangreich mithilfe
von Markern der osteoblastogenen Differenzierung [Osteokal-
zin, alkalische Phosphatase, bone sialoprotein und dem runt-
related transcription factor 2 (RUNX2) sowie cementum pro-
tein 1 (CEMP-1)] charakterisiert. Dabei glich das Expressions-
muster der untersuchten Zementoblasten dem Expressions-
muster von Osteoblasten in der frhen Phase der osteoblastoge-
nen Differenzierung. Ebenso wurde mithilfe der Alizarinfr-
bung gezeigt, dass die untersuchten Zementoblasten fhig wa-
ren, eine mineralisierte Matrix zu produzieren [9].
Bislang fehlen Untersuchungen zur Reaktion primrer huma-
ner Zementoblasten hinsichtlich ihrer RANKL- und OPG-Ex-
pression auf der Druckseite whrend der kieferorthopdischen
Zahnbewegung. Wir gehen davon aus, dass unter den Bedin-
gungen, die auf der Kompressionsseite kieferorthopdischer
Zahnbewegungen vorherrschen, die Aktivitt von Zement-
oblasten in Hinsicht auf den RANKL-abhngigen Signaltrans-
duktionsweg verndert wird. Dies kann die Entstehung von
Wurzelresorptionen begnstigen. Die vorliegende Arbeit fokus-
siert darauf.
Material und Methoden
Isolierung und Kultivierung von primren humanen
Die Zellen stammen aus Geweben von Patienten im Alter von
12 bis 20 Jahren. Die Extraktion von Zhnen erfolgte aus kie-
ferorthopdischen Grnden. Entnahme und Kultivierung der
Zementoblasten aus den extrahierten Zhnen wurden durch
die lokale Ethikkommission genehmigt. Die Isolierung von
Zementoblasten wurde in Anlehnung an bereits publizierte
Techniken durchgefhrt [7, 12, 14, 16]. Dabei wurden die Zel-
len des PDL mithilfe des sequenziellen (20140 min) enzyma-
tischen Verdaus mit Kollagenase 2 [2 mg/ml (0,1 U/mg),
0,25%iges Trypsin, PAA Laboratories, Clbe] fraktioniert [14,
16]. Die Fraktion nach 140-mintigem enzymatischem Verdau
enthlt hauptschlich Zementoblasten, whrend in den frhen
Phasen die PDL-Fibroblasten berwiegen [14, 16]. Die hier
untersuchten Zementoblasten wurden nach 140-mintigem
Verdau isoliert und anschlieend in Dulbecco's Modified
Eagle Medium (DMEM, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland)
in 10%igem fetalem Klberserum (FCS; Biochrom, Berlin), 2
mmol L-Glutamin, Antibiotika und Antimykotika (PAA Labo-
ratories, Clbe) kultiviert. Das Medium wurde im Abstand
von 3 Tagen gewechselt. Fr die Experimente wurden primre
humane Zementoblasten in der 4.8. Passage verwendet.
Applikation von Druck
Die Zementoblasten wurden in den Zellkulturschalen
(d = 60 mm) durch Zentrifugation bei 127 g komprimiert. Die
Zentrifugationskraft betrug 30,3 g/cm2 [8]. Sie wurde mit der
folgenden Formel berechnet: P=(m r rpm2 x 2)/A9,8900),
J Orofac Orthop 2012 No. 5 Springer-Verlag 401
Diercke et al. RANKL, OPG-, und RANK-Expression in humanen Zementoblasten

7 4
RANKL expression (fold of control)

OPG expression (fold of control)

6 *
3
5

4
2
3

2 1
1
* * *
0 0
0h 1h 4h 6h 0h 1h 4h 6h
a compression b compression
Figure 2. ad RANKL, OPG,
RANKL/OPG expression (fold of control)

140 4
* and RANK expression of prim-

RANK expression (fold of control)

120 mary human cementoblasts
3 after pressure application.
100 See text for further details.
80 * Results are expressed as mul-
2 tiples of the control (0 h;
60 *p < 0.05)

40
Abbildung 2. ad RANKL-,
1 OPG- und RANK-Expression
20 primrer humaner Zement-
oblasten nach Applikation
0 0 von Druck. Weitere Details s.
0h 1h 4h 6h 0h 1h 4h 6h Text. Die Ergebnisse sind als
c compression d compression Vielfaches der Kontrolle dar-
gestellt (0 h; *p < 0,05)

graphs of immunofluorescent staining were made using a P =Druck [kg/cm2], m =Masse (des Mediums) [kg], r =Radius
Leica DMRE microscope together with a Leica DFC 400 dig- [m], A =Oberflche der Zellkulturschalen [cm2] [28]. Die Ap-
ital camera. The images were documented and processed plikation des Drucks erfolgte konstant ber die einzelnen Zeit-
using proprietary software from the microscope manufacturer rume (1 h, 4 h, 6 h) [25].
(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)
Stimulation mit IL-1 und Applikation von Druck
Quantitative RT-PCR Zur Stimulation der Zellen wurden diese fr 24 h serumredu-
To quantify the gene expression of cementoblasts, total RNA ziert kultiviert (DMEM mit 2%igem FCS). Anschlieend
was determined using the RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Ger- wurde IL-1 (Promokine, Heidelberg), gelst in DMEM/
many). RNA integrity was analyzed using capillary electro- 1%igem Rinderserumalbumin (BSA, SIGMA-Aldrich, Stein-
phoresis according to the manufacturer's instructions (Expe- heim), auf die kultivierten Zementoblasten gegeben. Folgende
rion System, Bio-Rad, Munich, Germany). C-DNA was gener- Bedingungen wurden untersucht: 1 und 10 ng/ml sowie je-
ated by standard methods using poly-dT primers. Quantitative weils 24 und 96 h. Dabei erfolgten die Inkubationen fr beide
polymerase chain reaction (qPCR) was performed using SYBR Zeitrume kontinuierlich in DMEM/1%igem BSA ohne weite-
Green and TaqMan-based assays in the iCycler Instrument res Wechseln der Medien. Die Kontrollen wurden ausschlie-
(Bio-Rad, Munich). To ensure the efficiency and reproducibil- lich in DMEM/1%igem BSA kultiviert.
ity of the amplifications, commercial qPCR Primer Assay
RANKL (Hs TNFSF11_1_SG QuantiTect Primer Assay, Immunzytochemische Frbung
#QT00215614), OPG (Hs TNFRSF11B_1_SG QuantiTect Zur Darstellung der Lokalisation von RANKL und RANK
Primer Assay, #QT00014294), RANK (Hs TNFRSF11A_1_SG wurden Zementoblasten auf Objekttrgern mit benetzbaren
QuantiTect Primer Assay, #QT00035434; Quantitect, Qiagen; Reaktionsfeldern kultiviert und anschlieend mit Methanol/
Hilden, Germany) and COX-2 (Assay ID: Hs01573472_g1; Aceton (1:1) bei 20C fr 10 min fixiert. Die Zellen wurden
Life Technologies, Darmstadt) were used. For the quantitative mit 0,25%igem Casein/0,1%igem BSA fr 30 min bei Raum-
analyses, at least three independent experiments were per- temperatur (RT) blockiert. Die Inkubation mit den Antikr-
formed in each case. Each qPCR assay was done in triplicate or pern gegen RANKL (1:50) oder RANK (1:50; Santa Cruz Bio-
when necessary double triplicates. tech, Heidelberg) erfolgte ber Nacht bei 4C. Die Frbung
wurde durch die Verwendung eines Serums gegen Kaninchen-

402 J Orofac Orthop 2012 No. 5 Springer-Verlag

 Diercke et al. RANKL, OPG-, and RANK-Expression in human cementoblasts
The amplification efficiency was evaluated and judged to be
comparable and reproducible. Relative gene expression was,
thus, determined using the CT method.
Statistical analyses
Our results are represented as the mean the standard devia-
tion. Differences between groups were calculated using one-
way ANOVA. All statistical calculations were performed with
the SigmaStat software (IBM-SPSS, Ehningen, Germany). Re-
sults were considered significant with a probability value of
< 0.05.
Results
RANKL, OPG, and RANK expression of primary human ce-
mentoblasts after pressure application
Pressure application of 30 g/cm2 on human primary cemento-
blasts already led to the induction of RANKL mRNA expres-
sion after 4 h. Later during the experiment, the compression-
dependent induction of RANKL mRNA expression became
Figure 3. af The location and expression of RANKL
and its RANK receptor on the protein level were dem-
onstrated using immunofluorescence. Nuclei were
counterstained using DAPI. See text for further details
Abbildung 3. af Lokalisation sowie Expression von
RANKL und seines Rezeptors RANK auf Proteinebene
wurden mithilfe der Immunfluoreszenz dargestellt. Die
Gegenfrbung der Kerne erfolgte mit DAPI. Weitere
Details s. Text
IgG, konjugiert mit Alexa 594 (1:50; Lifetechnologies, Darm-
stadt), visualisiert. Die Gegenfrbung (Kernfrbung) erfolgte
mit 4',6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI). Mikrofotografien
der Immunfluoreszenzfrbungen wurden mit einem Leica-
DMRE-Mikroskop, verbunden mit einer Leica-DFC-400-Di-
gitalkamera, hergestellt. Aufnahme und Bildbearbeitung wur-
den mit der proprietren Software des Mikroskopherstellers
(Leica Microsystems, Wetzlar) vorgenommen.
Quantitative RT-PCR
Um die Genexpression der Zementoblasten quantifizieren zu
knnen, wurde die Gesamt-RNA mit dem RNeasy-Kit (Qia-
gen, Hilden, Deutschland) bestimmt. Die Unversehrtheit der
RNA wurde anhand einer Kapillarelektrophorese entspre-
chend den Herstellerangaben untersucht (Experion System,
Bio-Rad, Mnchen). cDNA wurde nach Standardmethoden
unter Verwendung von Poly-dT-Primern generiert. Die quan-
titative RT-PCR wurde mit SYBR-Green- und TaqMan-basier-
ten Nachweisverfahren im iCycler Instrument (Bio-Rad, Mn-
chen) durchgefhrt. Um die Effizienz und Vergleichbarkeit
J Orofac Orthop 2012 No. 5 Springer-Verlag 403
Diercke et al. RANKL, OPG-, und RANK-Expression in humanen Zementoblasten

a b
16 30
RANKL expression (fold of control)

RANKL expression (fold of control)

24h IL-1 24h IL-1
14 96h IL-1 * o
96h IL-1
25 *o
12 *o
10
*o 20

*
8 15

6 *
10
* *o
4
* *
5
2

0 0
Stimulation 00 1ng/ml 1ng/ml 1ng/ml Stimulation 00 10ng/ml 10ng/ml 10ng/ml
Compression 00 0h 1h 6h Compression 00 0h 1h 6h

c d
4 4
24h IL-1 24h IL-1
OPG expression (fold of control)

96h IL-1 OPG expression (fold of control) 96h IL-1

3 3

2 * 2 * *
* * * *
*
1 1

0 0
Stimulation 00 1ng/ml 1ng/ml 1ng/ml Stimulation 00 10ng/ml 10ng/ml 10ng/ml
Compression 00 0h 1h 6h Compression 00 0h 1h 6h

e f
RANKL/OPG expression (fold of control)

RANKL/OPG expression (fold of control)

20 20
24h IL-1 24h IL-1
96h IL-1 96h IL-1 *o
15 15 * o Figure 4. ah RANKL, OPG,
and RANK expression of pri-
mary human cementoblasts
*o *
o
10 10 upon stimulation with IL-1
and subsequent pressure ap-
* o
plication. See text for further
5 5 *o details. The results are ex-
* o
* * pressed as multiples of the
control (0 h). Black bar 24 h,
grey bar 96 h, *p < 0.05. Sig-
0 0
Stimulation 00 1ng/ml 1ng/ml 1ng/ml Stimulation 00 10ng/ml 10ng/ml 10ng/ml
nificant changes compared
Compression 00 0h 1h 6h Compression 00 0h 1h 6h with IL-1-stimulated sam-
ples are also marked
g 4 h 4
(p < 0.05)
24h IL-1 24h IL-1
RANK expression (fold of control)

RANK expression (fold of control)

Abbildung 4. ah RANKL-,
96h IL-1 96h IL-1
OPG- und RANK-Expression
3 3 primrer humaner Zement-
oblasten nach Stimulation
mit IL-1 und anschlieender
2 2 Applikation von Druck. Weite-
re Details s. Text. Die Ergebnis-
se sind als Vielfaches der Kon-
1 1 trolle dargestellt (0 h).
* *
* * Schwarze Balken 24 h, graue
* * Balken 96 h. Signifikante n-
0 0 derungen im Vergleich zur
Stimulation 00 1ng/ml 1ng/ml 1ng/ml Stimulation 00 10ng/ml 10ng/ml 10ng/ml nur mit IL-1 stimulierten
Compression 00 0h 1h 6h Compression 00 0h 1h 6h Probe sind ebenfalls gekenn-
zeichnet (p < 0,05)

404 J Orofac Orthop 2012 No. 5 Springer-Verlag

 Diercke et al. RANKL, OPG-, and RANK-Expression in human cementoblasts
significant (a 5-fold increase in expression after 6 h (Figure
2a). At the same time, compression already significantly in-
duced the reduction in mRNA expression of OPG in cemento-
blasts after 1 h, which competitively inhibits RANKL, remain-
ing at this level after 4 h and 6 h. OPG mRNA expression re-
mained significantly reduced during the experiment (Figure
2b). The longer the compression lasted during the experiment,
the more the ratio of RANKL to OPG shifted in favor of
RANKL (Figure 2c). RANK expression was unchanged in the
compressed cementoblasts during the 6-h observation period.
(Figure 2d).
On the protein level, RANKL was initially undetectable under
control conditions (Figure 3a). A small amount of RANKL was
detectable in the cytoplasm of cementoblasts just 1 h after pres-
sure application (30 g/cm2; Figure 3b) during the experiment.
However, during pressure application (6 h), increasing levels of
RANKL were detected in the cytoplasm (Figure 3c). Subcellular
RANKL was present in clusters. RANK, as a RANKL receptor,
was also detected on the protein level in primary human cemen-
toblasts (Figure 3c). This was identified as a granular intracel-
lular immune response, indicating localization in the cell's se-
cretory vesicles (the golgi). RANKas a RANKL receptorwas
also detected at the protein level in cementoblasts (Figure 3d, e,
f). No significant changes in either the subcellular location or
expression levels of RANK receptor were observed during the
experiment. The presence of the RANKL-receptor RANK on
cementoblasts may be evidence of a feedback loop for regulating
RANKL expression in cementoblasts.
RANKL, OPG, and RANK expression of primary human
cementoblasts upon stimulation with IL-1 and subse-
quent pressure application
Stimulation with the proinflammatory cytokine IL-1 alone
for 24 h and 96 h with 1 ng/ml (Figure 4a) and 10 ng/ml (Fig-
ure 4b), RANKL expression increased in primary human ce-
mentoblasts. Additional compression (30 g/cm2) led to a fur-
ther significant increase in RANKL mRNA expression in the
prestimulated cementoblasts. After 6 h, this was already signif-
icantly higher in all four states of IL-1 stimulation (24 h, 96 h,
1 ng/ml, 10 ng/ml) in both comparison to the unstimulated
controls and to the prestimulated samples.
At first, the OPG expression increased significantly after stim-
ulation with 1 ng/ml of IL-1 for 24 h and 96 h. The subsequent
application of pressure for 1 h and 6 h resulted in a return of
OPG expression to the level of the control in the cementoblasts
(Figure 4c) Stimulation with 10 ng/ml of IL-1 also significant-
ly induced OPG expression after 24 h and 96 h. Subsequent
compression of the cementoblasts revealed no other significant
effect on OPG expression (Figure 4d). The ratio of the mean
expression of RANKL to the mean expression of OPG increased
after the cell stimulation with IL-1 alone and continued to rise,
depending on time and concentration, after additional com-
pression. (Figure 4e, f).
On the mRNA level, RANK expression underwent no signifi-
cant changes after IL-1 stimulation for 24 h at 1 ng/ml and 10 ng/
der Amplifikationen sicherzustellen, wurden die kommerziel-
len qPCR-Primer-Assays RANKL (Hs TNFSF11_1_SG Quan-
tiTect Primer Assay, # QT00215614), OPG (Hs
TNFRSF11B_1_SG QuantiTect Primer Assay, #QT00014294),
RANK (Hs TNFRSF11A_1_SG QuantiTect Primer Assay,
#QT00035434; Quantitect, Qiagen; Hilden, Deutschland) bzw.
COX-2 (Assay Id: Hs01573472_g1; Life Technologies, Darm-
stadt) genutzt. Fr die quantitativen Analysen wurden jeweils
mindestens 3 unabhngige Experimente durchgefhrt. Die
qPCR-Anstze dazu erfolgten jeweils in Triplikaten oder, so-
fern notwendig, in doppelten Triplikaten.
Die Amplifikationseffizienz wurde evaluiert und als ver-
gleichbar sowie reproduzierbar beurteilt. Deshalb wurde die
relative Genexpression mithilfe der -CT-Methode bestimmt.
Statistische Analyse
Die Ergebnisse wurden als Mittelwert Standardabweichung
dargestellt. Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen
wurden mit der one-way ANOVA berechnet. Alle statisti-
schen Berechnungen erfolgten mit SigmaStat-Software (IBM-
SPSS, Ehningen). Die Ergebnisse galten als signifikant bei
einer Irrtumswahrscheinlichkeit von < 0,05.
Ergebnisse
RANKL-, OPG- und RANK-Expression primrer humaner
Zementoblasten nach Applikation von Druck
Die alleinige Applikation eines Drucks von 30 g/cm2 auf humane
primre Zementoblasten fhrte zu einer Induktion der Expres-
sion von RANKL-mRNA bereits nach 4 h. Im weiteren Verlauf
des Experiments erreichte die kompressionsabhngige Induktion
der RANKL-mRNA-Expression Signifikanz (5-fach erhhte Ex-
pression nach 6 h; Abbildung 2a). Gleichzeitig induzierte die
Kompression in Zementoblasten bereits nach 1 h signifikant die
Reduktion der mRNA-Expression von OPG, das RANKL kom-
petitiv hemmt, und OPG blieb nach 4 und 6 h auf diesem
Niveau. Im Verlauf des Experiments blieb die OPG-mRNA-Ex-
pression signifikant reduziert (Abbildung 2b). Das Verhltnis
von RANKL zu OPG verschob sich im Verlauf des Experiments
mit zunehmender Dauer der Kompression zugunsten von
RANKL (Abbildung 2c). Die Expression von RANK blieb in den
komprimierten Zementoblasten whrend des Beobachtungszeit-
raums von 6 h unverndert (Abbildung 2d).
Auf Proteinebene war RANKL unter Kontrollbedingungen
zunchst nicht nachweisbar (Abbildung 3a). Im Verlauf des Ex-
periments fand sich nach der Applikation von Druck (30 g/cm2)
bereits nach 1 h in geringem Umfang RANKL im Zytoplasma
der Zementoblasten (Abbildung 3b). Im Zeitverlauf der Druck-
applikation (6 h) war RANKL verstrkt im Zytoplasma nach-
weisbar (Abbildung 3c). RANKL war hierbei subzellulr in
Clustern lokalisiert. Der Ligand war im Sinne einer granulren
intrazellulren Immunreaktion, die auf eine Lokalisation im se-
kretorischen Apparat der Zellen (Golgi-Apparat, sekretorische
Vesikel) hindeutet, nachweisbar. RANK, als Rezeptor von
RANKL, war auf Proteinebene ebenfalls auf Zementoblasten
J Orofac Orthop 2012 No. 5 Springer-Verlag 405
Diercke et al. RANKL, OPG-, und RANK-Expression in humanen Zementoblasten

a
8
Cox2 expression (fold of control)

6 *
Figure 5. ac COX-2 expres-
sion of human primary ce-
4 mentoblasts upon stimula-
tion with IL-1 and subse-
quent application of pressure.
2 * See text for further details.
These results are expressed as
multiples of the control (0 h).
0 Black bar 24 h, grey bar 96 h,
0h 1h 4h 6h *p < 0.05. Significant changes
compression compared with IL-1-
b c stimulated samples are also
1000 1000 marked (p < 0.05)
24h IL-1 *o 24h IL-1 *o
Cox2 expression (fold of control)

800 96h IL-1 *o Cox2 expression (fold of control) 800 96h IL-1 Abbildung 5. ac COX-2-Ex-
* *o
600 600 pression humaner primrer
* Zementoblasten nach Stimu-
* * *
400 * * * 400 lation mit IL-1 und anschlie-
ender Applikation von
5 5 Druck. Weitere Details s. Text.
4 4 Die Ergebnisse sind als Vielfa-
3 3 ches der Kontrolle dargestellt
2 2 (0 h). Schwarze Balken 24 h,
1 1 graue Balken 96 h, *p < 0,05.
0 0 Signifikante nderungen im
Stimulation 00 1ng/ml 1ng/ml 1ng/ml Stimulation 00 10ng/ml 10ng/ml 10ng/ml Vergleich zur allein mit IL-1
Compression 00 0h 1h 6h Compression 00 0h 1h 6h stimulierten Probe ebenfalls
gekennzeichnet (p < 0,05)

ml. Further compression caused no further changes in RANK ex- nachweisbar (Abbildung 3d, e, f). Im Verlauf des Experiments
pression either. Stimulation with IL-1 alone for still longer (96 h) konnten keine eindeutigen Vernderungen der subzellulren
led to significantly reduced RANK expression in human cemen- Lokalisation sowie des Expressionsniveaus des RANK-Rezep-
toblasts. However, subsequent compression led to no further sig- tors gezeigt werden. Der Nachweis des RANKL-Rezeptors
nificant changes in RANK expression (Figure 4g, h). RANK auf Zementoblasten knnte auf einen feedback loop
zur Regulation der RANKL-Expression in Zementoblasten hin-
COX-2 expression of human primary cementoblasts upon weisen.
stimulation with IL-1 and subsequent application of pres-
sure RANKL-, OPG- und RANK-Expression primrer humaner Ze-
It is well-known that the expression of RANKL in osteoblasts mentoblasten nach Stimulation mit IL-1 und anschlieen-
depends on cyclooxygenase 2 (COX-2) activity, on which its der Applikation von Druck
enzymatic end product, the proinflammatory mediator pros- Die alleinige Stimulation mit dem proinflammatorischen Zy-
taglandin E2 (PGE2), thus also depends. The analysis of tokin IL-1 fr 24 und 96 h mit 1 ng/ml (Abbildung 4a) und
COX-2 expression on the mRNA level was performed using 10 ng/ml (Abbildung 4b) induzierte die Expression von
qPCR. We did not perform immunohistochemistry because RANKL in den humanen Zementoblasten bereits nach 24 h
the regulation of expression had been clearly demonstrated on bei 1 und 10 ng/ml. Die zustzliche Kompression (30 g/cm2)
the mRNA level. Detection of secreted COX-2 in the culture's fhrte zu einem weiteren signifikanten Anstieg der RANKL-
supernatant of the stimulated cementoblasts also appeared un- mRNA-Expression in den vorstimulierten Zementoblasten.
necessary due to obvious mRNA regulation. Diese war nach 6 h bereits signifikant hher fr alle 4 Bedin-
We were also able to demonstrate a correlation between in- gungen der IL-1-Stimulation (24 und 96 h sowie 1 und 10
creased RANKL and COX-2 expression in human cementoblasts ng/ml) sowohl im Vergleich zu den nichtstimulierten Kontrol-
(Figure 5). There was a significant increase in COX-2 expression len als auch im Vergleich zu den vorstimulierten Proben.
after 4 h of pressure application on primary human cementob- Die Expression von OPG stieg nach Stimulation mit 1 ng/ml
lasts, which continued to rise to 6 times the control after 6 h (Fig- IL-1 fr 24 und 96 h zunchst signifikant an. Die nachfolgende
ure 5a). The stimulation of the cementoblasts with IL-1 for 24 h Druckapplikation fr 1 und 6 h bewirkte eine Rckkehr der
(black bar) and 96 h (grey bar) with 1 ng/ml (Figure 5b) and 10 OPG-Expression auf das Niveau der Kontrolle in den Zement-
ng/ml (Figure 5c) resulted in COX-2 expression increasing dra- oblasten (Abbildung 4c). Die Stimulation mit 10 ng/ml IL-1

406 J Orofac Orthop 2012 No. 5 Springer-Verlag

 Diercke et al. RANKL, OPG-, and RANK-Expression in human cementoblasts
matically up to 400 times the control. The additional application
of pressure caused the COX-2 expression to rise to a level after 6
h significantly higher than that of the stimulated-only control. As
a result, the temporal course of COX-2 resembled that of RAN-
KL expression (Figure 4a, b, Figure 5b, c).
Discussion
These results enable us to demonstrate for the first time that
RANKL expression in primary human cementoblasts is signif-
icantly induced both after the application of compressive
forces and after stimulation with the proinflammatory cy-
tokine IL-1. The combination of a pro-inflammatory stimu-
lus with compression forces led to a further significant in-
crease in RANKL expression in primary human cementob-
lasts. OPG, as a quasi-receptor of RANKL and an antagonist
for its activity, was much less regulated under all experimental
conditions [21]. Therefore, the ratio of RANKL to OPGcru-
cial for the regulation of bone remodelingmoved in favor of
RANKL compared to control conditions under all experimen-
tal conditions. RANKL is the main inducer of osteoclastogenic
differentiation; therefore it may contribute to root resorption
in vivo [10] when secreted by cementoblasts during orthodon-
tic tooth movement characterized by marked inflammation
and compression [1, 21]. Our results indicate that cellular
mechanisms may lead to the increased root resorption during
orthodontic treatment.
As a result, this study differs from others in that (1) we did not
examine all PDL cells (PDL fibroblasts and cementoblasts), just
a putative cementoblast population, (2) we assessed the reaction
of human primary cementoblasts under compression condi-
tions in particular, and (3) we did not neglect the inflammatory
environment typical of the compression side of orthodontic
tooth movements.
Experimental setup
This method of sequential digestion for isolating cementob-
lasts from the PDL has been in use since the 1990s [7, 12, 14,
16]. Nevertheless, until now there were no markers capable of
identifying cementoblasts alone. Several efforts have been
made to characterize a specific marker for cementoblasts.
CEMP-1 has recently been proposed as a promising candidate.
We already described extensively the cementoblast population
used in this study using markers of osteoblastogenic differenti-
ation (osteocalcin, alkaline phosphatase, bone sialoprotein,
and the runt-related transcription factor 2 (RUNX2), as well as
CEMP-1 [9]. The expression pattern of these cementoblasts re-
sembled that of osteoblasts at the early stage of osteoblast-
ogenic differentiation.
Previous in vitro experiments of cellular mechanisms on the
compression side of orthodontic tooth movement were limited
to the sole application of pressure on PDL cells. However, an es-
sential component beyond in vivo PDL compression is aseptic
inflammation of the PDL due to force application. As both his-
tological and clinical studies have revealed, inflammatory me-
induzierte ebenfalls signifikant die Expression von OPG nach
24 und 96 h. Die darauffolgende Kompression der Zement-
oblasten hatte auf die OPG-Expression keinen weiteren signifi-
kanten Einfluss (Abbildung 4d). Das Verhltnis von mittlerer
RANKL-Expression zu mittlerer OPG-Expression nahm nach
alleiniger Stimulation der Zellen mit IL-1 zu und erhhte sich
zeit- und konzentrationsabhngig nach zustzlicher Kompres-
sion weiter (Abbildung 4e, f).
Die Expression von RANK blieb auf mRNA-Ebene ohne sig-
nifikante nderungen nach IL-1-Stimulation fr 24 h mit 1
und 10 ng/ml. Die zustzliche Kompression bewirkte keine wei-
tere Vernderung der RANK-Expression. Die alleinige Stimula-
tion mit IL-1 ber einen lngeren Zeitraum (96 h) fhrte zu
einer signifikanten Reduktion der RANK-Expression in den
humanen Zementoblasten. Die nachfolgende Kompression be-
wirkte jedoch zu keine weiteren signifikanten nderungen hin-
sichtlich der Expression von RANK (Abbildung 4g, h).
COX-2-Expression humaner primrer Zementoblasten nach
Stimulation mit IL-1 und anschlieender Applikation von
Druck
Es ist bekannt, dass die Expression von RANKL in Osteoblas-
ten von der Aktivitt der Zyklooxygenase-2 (COX-2) und
damit auch ihrem enzymatischen Endprodukt, dem proin-
flammatorischen Mediator Prostaglandin E2 (PGE2) abhngig
ist. Die Analyse der COX-2-Expression erfolgte auf mRNA-
Ebene mithilfe der qPCR. Auf einen immunhistochemischen
Nachweis wurde verzichtet, da die Expressionsregulation auf
mRNA-Ebene eindeutig nachgewiesen werden konnte. Ein
Nachweis von sezerniertem COX-2 im Kulturberstand der
stimulierten Zementoblasten erschien aufgrund der deutlichen
mRNA-Regulation ebenfalls nicht notwendig.
Wir konnten auch eine Koinzidenz einer gesteigerten
RANKL- und COX-2-Expression in humanen Zementoblasten
zeigen (Abbildung 5). Infolge der Applikation von Druck auf die
primren humanen Zementoblasten kam es zu einem signifi-
kanten Anstieg der COX-2-Expression nach 4 h. Diese stieg
nach 6 h weiter auf ein 6-Faches der Kontrolle an (Abbildung
5a). Die Stimulation der Zementoblasten mit IL-1 fr 24 und
96 h mit 1 ng/ml (Abbildung 5b) sowie 10 ng/ml (Abbildung 5c)
lie die COX-2-Expression bis auf ein 400-Faches der Kontrolle
stark ansteigen. Die zustzliche Applikation von Druck erhhte
die COX-2-Expression nach 6 h auf ein Niveau, das im Ver-
gleich zur nur stimulierten Kontrolle signifikant gesteigert war.
Damit glich der zeitliche Verlauf von COX-2 dem der RANKL-
Expression (Abbildung 4a, b sowie Abbildung 5b, c).
Diskussion
Mit diesen Ergebnissen konnten wir erstmals zeigen, dass die
Expression von RANKL in primren humanen Zementoblas-
ten signifikant sowohl nach der Applikation von kompressiven
Krften als auch nach der Stimulation mit dem proinflamma-
torischen Zytokin IL-1 induziert wird. Die Kombination von
proinflammatorischem Stimulus mit Kompressionskrften
J Orofac Orthop 2012 No. 5 Springer-Verlag 407
Diercke et al. RANKL, OPG-, und RANK-Expression in humanen Zementoblasten
diators such as IL-1, TNF- and IL-6 play a key role here [1, 21,
32]. To simulate these conditions in vitro in this study, both
compression and the reactions of cementoblasts to a combina-
tion of stimulation and compression were examined. We suc-
cessfully demonstrate that the combination of both parameters
(IL-1 and 6 h compression) leads to significantly increased ex-
pression of RANKL compared with both the untreated control
and with the control stimulated with IL-1 alone. Thus, in vitro
studies assessing only compression may yield a diminished re-
sult. Taking this into account, it is interesting that OPG expres-
sion decreased significantly under compression alone while,
with pre-stimulation using IL-1, this effect was absent or OPG
expression was only slightly induced. At the same time, RANKL
expression increased 5-fold after pressure application and, de-
pending on the conditions, 1023-fold after stimulation and
compression. Thus, the ratio of RANKL to OPG under all of
these experimental conditions favored RANKL compared to
control conditions. This experimental approach represents a
first attempt to recreate significant events on the compression
side of orthodontic tooth movement in vitro. Nevertheless, this
experimental approach and, thus, its results cannot reveal the
entirety of the complex events that take place on the compres-
sion side.
The combination of inflammation and compression causes
the greatest increase in RANKL expression of human ce-
mentoblasts
Numerous studies have shown a compression-dependent in-
crease in RANKL, i.e., in osteoblasts and fibroblasts. This was
accomplished using a method that depended on COX-2 and
PGE2. The subsequent binding of RANK ligands to the RANK
receptor leads to osteoclastogenesis induction [15, 18]. In two
studies recently published, osteocytes were identified both as
the main reservoir for RANKL and as the most potent cells
promoting osteoclastogenesis [23, 35]. Similarly, cementocytes
and osteoblasts can increasingly express RANKL due to their
close proximity to the cementoblasts.
Studies of the behavior of cementoblasts under compression
have so far described just one cell line of cementoblasts in mice
(OCCM 30). Murine cementoblasts increase RANKL expres-
sion under the pressure application on a COX-2 and PGE2-de-
pendent pathway, whereas OPG remained unchanged at 12 h
and 24 h. These authors also reported an increase in COX-2 ex-
pression in conjunction with a maximum 6 h of compression
[29]. The induction of RANKL expression in murine cemento-
blasts was also dependent on PGE2 by binding PGE2 to EP4, the
PGE2 receptor [20]. RANKL expression is also induced by the
application of compressive forces in PDL cells [15, 18, 27]. Gen-
erally speaking, the significant drawback associated with PDL
cell assessment is that the responses of fibroblasts and cemento-
blasts cannot be differentiated.
The human cementoblasts investigated in this study showed a
significant increase in RANKL expression after just 6 h of pres-
sure application and after stimulation with IL-1. We demon-
strated the greatest increase in RANKL expression after com-
408 J Orofac Orthop 2012 No. 5 Springer-Verlag
fhrte zu einer weiteren signifikanten Steigerung der RANKL-
Expression in primren humanen Zementoblasten. Osteopro-
tegerin, als Scheinrezeptor von RANKL und Antagonist fr
dessen Aktivitt, war unter allen verwendeten experimentellen
Bedingungen wesentlich geringer reguliert [21]. Daher war
das fr die Steuerung der Knochenremodellierung ausschlag-
gebende Verhltnis von RANKL zu OPG unter allen experi-
mentellen Konditionen im Vergleich zu den Kontrollbedin-
gungen in Richtung RANKL verschoben. RANKL ist der we-
sentliche Induktor der osteoklastogenen Differenzierung und
knnte daher, sezerniert von Zementoblasten, whrend der or-
thodontischen Zahnbewegung, die durch eine ausgeprgte In-
flammation und Kompression geprgt ist [1, 21], in vivo zur
Wurzelresorption beitragen [10]. Unsere Ergebnisse deuten
auf zellulre Mechanismen hin, die zu einer gesteigerten Ent-
stehung von Wurzelresorptionen im Verlauf einer kieferortho-
pdischen Behandlung fhren knnten.
Somit unterscheidet sich die vorliegende Arbeit von anderen
Studien insofern, dass 1) nicht alle Zellen des PDL (Fibroblasten
und Zementoblasten), sondern lediglich eine putative Zement-
oblastenpopulation untersucht wurde, dass 2) speziell die Re-
aktion primrer humaner Zementoblasten unter Kompres-
sionsbedingungen evaluiert wurde und dass 3) das fr die
Druckseite kieferorthopdischer Zahnbewegungen typische in-
flammatorische Umfeld nicht vernachlssigt wurde.
Experimentelles Set-up
Die Methode der sequenziellen Verdauung zur Isolierung von
Zementoblasten aus dem PDL ist seit den 1990er Jahren etab-
liert [7, 12, 14, 16]. Trotzdem fehlen bislang Marker, um Ze-
mentoblasten eindeutig identifizieren zu knnen. In der ver-
gangenen Zeit wurden vielerlei Anstrengungen unternommen,
um einen spezifischen Marker fr Zementoblasten zu charak-
terisieren. In jngster Zeit gilt CEMP-1 als ein aussichtsreicher
Kandidat. Die in dieser Studie verwendete Zementoblasten-
population wurde von uns bereits umfangreich mithilfe von
Markern der osteoblastogenen Differenzierung (Osteokalzin,
alkalische Phosphatase, bone sialoprotein und RUNX2 sowie
CEMP-1) charakterisiert [9]. Dabei glich das Expressionsmus-
ter der untersuchten Zementoblasten dem Expressionsmuster
von Osteoblasten in der frhen Phase der osteoblastogenen
Differenzierung.
Bislang beschrnkten sich In-vitro-Experimente zu zellulren
Mechanismen auf der Druckseite kieferorthopdischer Zahn-
bewegungen auf die alleinige Druckapplikation auf Zellen des
PDL. Ein wesentlicher Bestandteil neben der Kompression des
PDL ist jedoch in vivo eine aseptische Inflammation des PDL
infolge der Kraftapplikation. Dabei spielen v. a. Entzndungs-
mediatoren wie IL-1, TNF- und IL-6 eine Rolle, wie sowohl
histologische als auch klinische Studien belegen konnten [1, 21,
32]. Um diese Voraussetzungen in vitro zu simulieren, wurde in
dieser Studie zustzlich zur Kompression auch die Reaktion der
Zementoblasten auf eine Kombination aus Stimulation und
Kompression untersucht. Wir konnten zeigen, dass die Kombi-
nation beider Parameter (IL-1 und 6-h-Kompression) zu einer
 Diercke et al. RANKL, OPG-, and RANK-Expression in human cementoblasts
bining stimulation with IL-1 and 6 h of compression.
Yamaguchi et al. [36] showed that PDL cells in teeth with strong
root resorption express more RANKL than PDL cells in teeth
with low resorption [10]. An experimental study using rats also
demonstrated the crucial involvement of RANKL and OPG in
root resorption [19]. With our experimental design, we assume
that a combination of inflammatory environment and compres-
sive forces promotes the progression of root resorption. This
was confirmed in an in vivo study showing that teeth with peri-
odontitis developed significantly more root resorption as a re-
sult of orthodontic tooth movement [11].
OPG is modulated to a low degree under pressure applica-
tion, stimulation with IL-1, and a combination of the two
RANKL expression alone is not critical to the resorptive proc-
esses in the bone or cementum. It is rather the ratio of RANKL
to OPG that plays a decisive role. As a quasi-receptor for
RANK, OPG occupies the receptor, thereby preventing the
binding of RANKL and, thus, arresting osteolytic and cemen-
tolytic processes.
The murine cementoblasts examined by Rego et al. [29] dem-
onstrated an unchanged expression of OPG after 12 h compared
to the control. We showed a preliminary reduction in OPG mR-
NA up to 6 h. Thus, it can be assumed that OPG expression will
also increase again in human cementoblasts during compres-
sion in order to inhibit RANKL effects. One reason for the early
increase in OPG expression in murine cementoblasts after 12 h
may be that these form a different repair cementum (acellular
cementum) than do human cementoblasts (cellular cementum)
[2]. Due to the high levels of pressure to which they are exposed,
we assume that rodent roots must respond significantly faster to
resorption with repair of the lacunae in order to prevent damage
to the teeth.
In examining the RANKL/OPG ratio, it is clear that the small
changes in OPG expression are significantly less pronounced
than the changes in RANKL expression. Thus, the ratio of RAN-
KL to OPG favors RANKL and, therefore, also favors resorption
processes [27]. This supports our hypothesis that a combination
of inflamed peridontium and orthodontic tooth movement re-
inforces root resorption via a RANKL-dependent signal path-
way (Figure 1a).
RANK
This is the first report showning the expression of RANK in
cementoblasts on both mRNA and protein levels. Under these
experimental conditions, it was possible to demonstrate signif-
icant changes in the expression of RANK in primary human
cementoblasts aftercombined inflammatory stimulation and
compression only. The reduction in RANK expression ob-
served under these conditions is associated with elevated
RANKL expression. RANK/RANKL-dependent involvement
in root resorption has been demonstrated in PDL fibroblasts
[10, 19]. The simultaneous expression of RANK and RANKL
in cementoblasts may also indicate RANK/RANKL-dependent
involvement of this cell type in root resorption. Likewise,
signifikant erhhten Expression von RANKL im Vergleich zur
unbehandelten Kontrolle und zur nur IL-1-stimulierten Kont-
rolle fhrt. Insofern geben die In-vitro-Untersuchungen allein
unter Kompression mglicherweise ein nur abgemildertes Er-
gebnis. Interessant ist unter diesem Gesichtspunkt, dass unter
alleiniger Kompression die Expression von OPG deutlich sank,
whrend dieser Effekt bei einer Vorstimulation mit IL-1 aus-
blieb bzw. es zu einer geringen Induktion der OPG-Expression
kam. Gleichzeitig war die RANKL-Expression nach der Druck-
applikation um das 5-Fache sowie nach Stimulation und Kom-
pression je nach Kondition um das 10- bis 23-Fache erhht.
Damit war das Verhltnis von RANKL zu OPG unter allen ex-
perimentellen Konditionen im Vergleich zu Kontrollbedingun-
gen in Richtung RANKL verschoben. Dieser experimentelle
Ansatz stellt einen ersten Versuch dar, wesentliche Ereignisse
auf der Druckseite einer orthodontischen Zahnbewegung in vi-
tro nachzustellen. Nichtsdestotrotz spiegeln dieser experimen-
telle Ansatz und damit seine Ergebnisse nicht die Gesamtheit
der komplexen Ereignisse wider, die auf der Druckseite statt-
finden.
Kombination aus Inflammation und Kompression bewirkt
den grten Anstieg in der RANKL-Expression von huma-
nen Zementoblasten
Zahlreiche Untersuchungen haben u. a. in Osteoblasten und
Fibroblasten bereits einen kompressionsabhngigen Anstieg
von RANKL nachgewiesen. Dieser erfolgte auf einem COX-2-
und PGE2-abhngigen Weg. Durch die anschlieende Bin-
dung des RANK-Liganden an den RANK-Rezeptor kommt es
zu einer Induktion der Osteoklastogenese [15, 18]. In 2 erst
krzlich verffentlichten Publikationen wurden die Osteozy-
ten als Hauptreservoir fr RANKL identifiziert. Gleichzeitig
wurden sie als die potentesten Zellen beschrieben, die die Os-
teoklastogenese frdern [23, 35]. Ebenso knnen Zementozy-
ten und Osteoblasten aufgrund ihrer engen rumlichen Bezie-
hung zu den Zementoblasten vermehrt RANKL exprimieren.
Bislang sind Untersuchungen zum Verhalten von Zement-
oblasten unter Kompression lediglich an einer Zelllinie von
Musezementoblasten (OCCM-30) beschrieben. Die Zement-
oblasten der Muse exprimierten unter Druckapplikation ver-
mehrt RANKL auf einem COX-2- und PGE2-abhngigen Weg,
wohingegen OPG zu den untersuchten Zeiten (12 und 24 h) un-
verndert blieb. Die Autoren wiesen ebenfalls eine Steigerung
der COX-2-Expression mit einem Maximum nach 6-stndiger
Kompression nach [29]. Die Induktion der RANKL-Expression
in Zementoblasten der Maus erfolgte ebenfalls PGE2-abhngig
ber die Bindung von PGE2 an den PGE2-Rezeptor EP4 [20].
Auch in PDL-Zellen kommt es zu einer Induktion der RANKL-
Expression durch die Applikation von kompressiven Krften
[15, 18, 27]. Die Zellen des PDL in ihrer Gesamtheit zu unter-
suchen, hat den wesentlichen Nachteil, dass die Reaktionen von
Fibroblasten und Zementoblasten nicht differenziert werden
knnen.
Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten menschlichen
Zementoblasten zeigten bereits nach 6-stndiger Druckappli-
J Orofac Orthop 2012 No. 5 Springer-Verlag 409
Diercke et al. RANKL, OPG-, und RANK-Expression in humanen Zementoblasten
RANK and RANKL expression may indicate a possible feed-
back regulation of RANKL and RANK in cementoblasts. This
is, however, dysregulated under combined stimulation and
compression conditions, as indicated by simultaneous RANKL
induction with RANK reduction. This would suggest further
enhancement of the stimulation- and compression-dependent
effect on RANKL expression. We will gather data for this pur-
pose in future experiments.
COX-2 expression resembled RANKL expression during ex-
periments
The expression of COX-2 due to the human cementoblasts
was analogous to RANKL expression; thus, a COX-2-depend-
ent activation of RANKL in the cementoblasts can be as-
sumed. The COX-2- and PGE2-dependent activation of
RANKL due to mechanical stimulation of murine cementob-
lasts was already demonstrated by Rego et al. [29]. Our COX-2
expression results are in line with theirs.
Conclusion
It is the particular combination of an inflammatory environ-
ment and in vitro pressure application that results in increased
expression of RANKL, which promotes osteoclastogenesis. A
possible reason for the increased incidence of root resorption
in teeth with changes to the periodontium caused by inflam-
mation may be the increased COX-2-dependent expression of
RANKL under these conditions, while OPG expression re-
mains relatively low.
Acknowledgment
This study received financial support from the Deutschen
Gesellschaft fr Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde
(DGZMK; German Society for Dental, Oral and Maxillofacial
Surgery) and the Medical Faculty of the University of Heidel-
berg.
Conflict of interest
On behalf of all authors, the corresponding author states that
there are no conflicts of interest.
410 J Orofac Orthop 2012 No. 5 Springer-Verlag
kation sowie nach Stimulation mit IL-1 einen signifikanten
Anstieg in der RANKL-Expression. Nach der Kombination aus
Stimulation mit IL-1 und einer Kompression von 6 h konnten
wir den grten Anstieg der RANKL-Expression demonstrie-
ren. Yamaguchi et al. [36] zeigten, dass PDL-Zellen von Zhnen
mit starken Wurzelresorptionen mehr RANKL exprimieren als
PDL-Zellen von Zhnen mit geringen Resorptionen [10]. Eine
experimentelle Studie an Ratten konnte ebenfalls eine entschei-
dende Beteiligung von RANKL und OPG an der Wurzelresorp-
tion belegen [19]. Mit unserem experimentellen Design gehen
wir davon aus, dass eine Kombination von inflammatorischem
Milieu und kompressiven Krften die Progression von Wurzel-
resorptionen frdert. Dies besttigt eine In-vivo-Studie, in der
Parodontitis geschdigte Zhne durch eine kieferorthopdische
Zahnbewegung deutlich mehr Wurzelresorptionen entwickel-
ten [11].
OPG wird durch die Applikation von Druck, die Stimulation
mit IL-1 und deren Kombination nur in geringem Umfang
moduliert
Die Expression von RANKL allein ist nicht entscheidend fr
die resorptiven Vorgnge an Knochen oder Zement. Vielmehr
spielt das Verhltnis von RANKL und OPG eine entschei-
dende Rolle. OPG als Scheinrezeptor fr RANK besetzt den
Rezeptor und verhindert somit eine Bindung von RANKL.
Dies hat die Konsequenz, dass osteolytische und zementolyti-
sche Prozesse aufgehalten werden.
Die von Rego et al. [29] untersuchten Musezementoblasten
wiesen nach 12 h eine im Vergleich zur Kontrolle unvernderte
Expression von OPG auf. Wir konnten fr die Zeit bis 6 h zu-
nchst eine Reduktion an OPG-mRNA zeigen. Es ist anzuneh-
men, dass die OPG-Expression im weiteren Verlauf einer Kom-
pression auch in humanen Zementoblasten wieder angehoben
wird, um die Effekte von RANKL zu hemmen. Ein Grund fr die
frhe Anhebung der OPG-Expression in Musezementoblasten
nach 12 h kann sein, dass diese einen anderen Reparaturzement
(azellulrer Zement) als menschliche Zementoblasten (zellulrer
Zement) bilden [2]. Es wird vermutet, dass Nagetierwurzeln auf-
grund ihrer starken Beanspruchung deutlich schneller auf Re-
sorptionen mit einer Reparatur der Lakunen reagieren mssen,
um einen Schdigung der Zhne zu verhindern.
Bei Betrachtung des RANKL/OPG-Verhltnis wird nun klar,
dass die nur geringen nderungen der OPG-Expression deut-
lich unter den nderungen der RANKL-Expression liegen. So-
mit liegt das Verhltnis von RANKL zu OPG aufseiten von
RANKL und auch aufseiten der Resorptionsvorgnge [27]. Dies
spricht fr unsere Hypothese, dass eine Kombination aus ent-
zndetem Parodont und kieferorthopdischer Zahnbewegung
Wurzelresorptionen ber einen RANKL-abhngigen Signal-
transduktionsweg untersttzt (Abbildung 1a).
RANK
Wir konnten erstmals die Expression von RANK in Zement-
oblasten auf mRNA-Ebene und auch auf Proteinebene zeigen.
Unter den gewhlten experimentellen Konditionen konnten
 Diercke et al. RANKL, OPG-, and RANK-Expression in human cementoblasts
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wir signifikante nderungen der Expression von RANK in
primren humanen Zementoblasten nur nach kombinierter
inflammatorischer Stimulation und Kompression nachweisen.
Die unter diesen Bedingungen beobachtete Reduktion der
RANK-Expression geht mit einer verstrkten Expression von
RANKL einher. Fr PDL-Fibroblasten konnte eine RANK-/
RANKL-abhngige Beteiligung an der Wurzelresorption be-
reits gezeigt werden [10, 19]. Die gleichzeitige Expression von
RANK und RANKL auf Zementoblasten knnte ebenfalls auf
eine RANK/RANKL-abhngige Beteiligung dieses Zelltyps an
der Wurzelresorption hindeuten. Gleichzeitig knnte die Ex-
pression von RANK und RANKL auf eine mgliche Feedback-
Regulation von RANKL und RANK in Zementoblasten hin-
weisen. Dieser ist jedoch unter Bedingungen einer kombinier-
ten Stimulation und Kompression dysreguliert, wie die gleich-
zeitige Induktion von RANKL bei Reduktion von RANK an-
deutet. Dies wrde fr eine weitere Verstrkung des Stimulati-
ons- und kompressionsabhngigen Effekts auf die RANKL-
Expression sprechen. Daten hierzu werden wir in zuknftigen
Experimenten erheben.
COX-2-Expression hnelt der RANKL-Expression im Verlauf
der Experimente
Die Expression von COX-2 durch die humanen Zementoblas-
ten verlief analog zur RANKL-Expression, was eine COX-2
abhngige Aktivierung von RANKL in den Zementoblasten
vermuten lsst. Eine COX-2- und PGE2-abhngige Aktivie-
rung von RANKL durch mechanische Stimulation von Muse-
zementoblasten wurde bereits gezeigt [29]. Unsere Ergebnisse
stimmen mit dieser Arbeit hinsichtlich der COX-2-Expression
berein.
Fazit
Insbesondere die Kombination aus inflammatorischem Milieu
und einer Druckapplikation resultiert in vitro in einer gestei-
gerten Expression von RANKL, das die Osteoklastogenese fr-
dert. Eine mgliche Ursache fr das vermehrte Auftreten von
Wurzelresorptionen an Zhnen mit entzndlich verndertem
Parodont kann die unter diesen Bedingungen vermehrte
COX-2-abhngige Expression von RANKL bei vergleichsweise
geringer OPG-Expression sein.
Danksagung
Diese Studie wurde mit den Mitteln der Deutschen Gesell-
schaft fr Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde (DGZMK) und
der Medizinischen Fakultt der Universitt Heidelberg durch-
gefhrt.
Interessenkonflikt
Die korrespondierende Autorin gibt fr sich und ihre Koauto-
ren an, dass kein Interessenkonflikt besteht.
J Orofac Orthop 2012 No. 5 Springer-Verlag 411
Diercke et al. RANKL, OPG-, und RANK-Expression in humanen Zementoblasten

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