Que son las sondas de cidos nucleicos y cul es su importancia para la ecologa microbiana?
Sondas de cidos nucleicos:
Una sonda es un pequeo fragmento de DNA o RNA complementario, en secuencia de
bases, a la parte de un gen con el cual puede hibridarse. Algunas sondas emplean secuencias rRNA 16S como herramientas para diferenciar M.O. en ambientes naturales. Actualmente se cuenta con una gran cantidad de secuencias de rRNA 16S por lo que es posible construir sondas muy especficas, capaces de diferenciar organismos dentro de un mismo dominio y tambin diferenciar entre especies en una misma muestra.
Las sondas de cidos nucleicos son fragmentos de cido desoxirribonucleico (ADN) o de
cidoribonucleico (ARN) marcados con algn elemento que les permite revelar, mediante una seal, su presencia. Estos fragmentos pueden cumplir su tarea como sondas debido a que tienen la capacidad de unirse a fragmentos complementarios eventualmente presentes en la muestra que se desea analizar. La descripcin de la estructura de los cidos nucleicos nos llevar a comprender hasta qu punto es inherente a ellos el unirse a un complemento. En sondas filogenticas se utilizan dos formas de marcado: los istopos radiactivos y las tinciones fluorescentes. El mtodo de los istopos radiactivos emplea sondas marcadas con 35S o 32P, que se aaden a clulas fijadas, previamente permeabilizadas de modo que penetre a la clula y se fije a un ribosoma. El marcado de las clulas se verifica haciendo una autoradiografa (exposicin de una emulsin fotosensible a la radiactividad de los ribosomas. En las tinciones fluorescentes se emplean colorantes fluorescentes que se unen qumicamente a la sonda, lo que permite hacer visibles a las clulas cuando se observan mediante microscopio de fluorescencia. Utilizando sondas unidas a distintos colorantes es posible identificar y cuantificar distintos tipos de clulas en una determinada muestra. Sondas de cidos nucleicos para identificacin de m.o.: contraste de fase, teidas con sonda universal (rnar) y teidas con sonda eucaritica estudio de comunidades microbianas por medio de sondas Se puede estudiar la biodiversidad de las comunidades microbianas utilizando sondas de RNA ribosmico. Los mtodos se basan en la extraccin total del DNA o RNA de toda la comunidad microbiana y a continuacin utilizando sondas especficas de cidos nucleicos, se hace amplificacin de los genes RNA ribosmicos mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), lo que generar clones de RNA ribosmico, los que pueden secuenciarse y utilizarse para construir los rboles filogenticos que muestren la composicin en especies de la comunidad microbiana. Estudio de comunidades microbianas por medio de sondas Los anlisis filogenticos de las comunidades microbianas han demostrado en casi todos los casos la existencia de M.O. que no haban sido detectados previamente por mtodos de cultivos. Tambin se pueden utilizar sondas en tareas de seguimiento de M.O. en determinados hbitats. Es una excelente metodologa que slo permite la deteccin, enumeracin o localizacin filogentica de los M.O. en una muestra pero no da cuenta de su actividad.
2. Explica por qu la produccin de clulas en el ambiente natural es mucho menor
que en el laboratorio?
La produccin de clulas en el ambiente es mucho menor que en el laboratorio,
debido a algunas caractersticas del medio natural:
Disponibilidad de nutrientes, suele ser baja.
La distribucin de dichos nutrientes a lo largo del hbitat microbiano no suele ser
uniforme.
Salvo raras excepciones los microorganismos no se encuentran en cultivos axnicos
en los medios naturales, por lo que deben competir por los nutrientes.
3. Qu ventajas presentan los mtodos de cidos nucleicos (independientes de cultivo)
de los mtodos tradicionales de cultivo? Los tradicionales mtodos microbiolgicos no permiten una comprensin completa de la ecologa microbiana de estos sistemas complejos. Esto se debe principalmente a la capacidad de ciertos microorganismos de crecer en medios microbiolgicos preferentemente con respecto a otros. Adems, con estos mtodos, las clulas con estrs o daadas no pueden ser detectados en las placas. En los ltimos 10 aos se han desarrollado nuevos mtodos basados en el anlisis de los cidos nucleicos (DNA y RNA) que se extraen directamente de la muestra sin necesidad de cultivo microbiano. La dinmica microbiana de levaduras y bacterias se estudia desde los aos 1970 (Barnett et al., 1972). Mediante el uso de los mtodos clsicos, se realizan recuentos de microorganismos y se determina su diversidad en medios sintticos con agar, pero en algunos casos se requiere un perodo de incubacin en medio lquido, para promover el crecimiento de microorganismos especficos o seleccionarlos, ya que su aislamiento sera imposible sin este paso. El gran inconveniente de los mtodos microbiolgicos clsicos dependientes de cultivo es la imposibilidad de llegar a tener una visin precisa de la biodiversidad de estos ecosistemas complejos. Al utilizar los mtodos de enriquecimiento y crecimiento en medios microbiolgicos, la micro biota originalmente presente en la muestra es sometida a importantes cambios debido a la capacidad de ciertas especies para dominar el entorno y superar a los otros componentes microbianos. Por esta razn la poblacin numricamente menos importante, o en condiciones de estrs, apenas es recuperada e identificada. Con los mtodos dependientes de cultivo hay un alto riesgo de errores de identificacin de la ecologa de los complejos ecosistemas microbianos (Hugenholtz et al., 1998).