DESARROLLO DE MTODOS

ANALTICOS POR HPLC.

 TEMARIO
Horario Tema

Introduccin
08:00 10:30 Antecedentes
Fundamentos de cromatografa de lquidos de alta resolucin.
Tipos de cromatografa

10:30 10:45 Receso

Detectores (Selectividad y sensibilidad)

Definicin del objetivo (valoracin, disolucin, impurezas, etc).
10:45 14:00
Plan de desarrollo de mtodos analticos.
Bsqueda bibliogrfica previa al proceso experimental.

14:00 15:00 Comida

Mtodos de preparacin de la muestra analtica

15:00 17:30
Seleccin de diluente.
 TEMARIO
Horario Tema

Tipos de columnas cromatogrficas.

08:00 10:30
Seleccin de la fase estacionaria (columna).
Seleccin de la fase mvil.

10:30 10:45 Receso

Gradientes y cambios a la fase mvil y a sus condiciones.

Evaluacin y optimizacin de variables crticas en un mtodo por
10:45 14:00
cromatografa de lquidos.
Adaptacin de sistema cromatogrfico HPLC !" U-HPLC

14:00 15:00 Comida

Especificidad (pureza de un pico).

15:00 17:30 Seleccin de filtros.
Factor de respuesta relativo.
INTRODUCCIN
Tabla comparativa de la evolucin del Desarrollo de Mtodos Analticos y
Especificaciones(1).

Innovador Primer Genrico Mltiples Genricos

Estndares
Informacin de
para API y Especificaciones del
agencias regulatorias Farmacopeas
Producto Innovador
(pblica) y literatura
Terminado

Mtodos establecidos y Mtodos derivados y Combinacin de

desarrollados en casa desarrollados en casa Verificacin de Mtodos
Mtodos
de Farmacopea y
Analticos Mtodos desarrollados
(por el innovador) (por el genrico) en casa

(1) Adaptacin de la presentacin de Birgit Schmauser / Junio 2010 / WHO.

 Lnea de Tiempo del Desarrollo de un Nuevo Medicamento.

Desarrollo de la Desarrollo del Lotes de

Formulacin Proceso Estabilidad Estudio
Prueba de
Concepto Clnico
(Escala (Escala Lote Clnico
Laboratorio) Piloto)
TTP

Dossier
Idea de
Registro
0 1 3 6 9 12 18 24
Meses
Soporte a la Frmula
(Tradicional o PAT)
TTA
Desarrollo de Validacin de
Mtodos Mtodos Estabilidad Estabilidad
Estabilidad
Analticos Analticos 6 meses 12 meses
3 meses
(Buenas Prcticas (Buenas Prcticas
Cientficas) de Fabricacin)

Regido por Buenas Prcticas Cientficas

Regido por Buenas Prcticas de Fabricacin

Haciendo una analoga en los propsitos del desarrollo farmacutico y
analtico:

Desarrollo Farmacutico Desarrollo Analtico

Seguridad y eficacia (dar en Exactitud (dar en el blanco
al blanco clnico). analtico).

Reducir la varianza. Reducir la varianza.

Calidad por Diseo como fundamentos para el Desarrollo
Analtico:
#La validacin es una demostracin de que funciona para el propsito.

#La validacin es un proceso continuo.

#La demostracin debe incluir consideraciones sobre el riesgo:

1. Riesgo de tomar decisiones con un procedimiento invlido.

2. Riesgo de invalidar un procedimiento que est bajo control.

#El riesgo est directamente relacionado con la falta de certidumbre.

#El procedimiento debe ser capaz de cuantificar el analito en

presencia de X, Y, Z, en el rango de A% a D% de la concentracin
nominal con una exactitud e incertidumbre tal que el resultado cae
dentro de B%.
Perfil Analtico Diseo de
Blanco Experimentos
Validacin
(ATP) (DoE)

Atributos
Crticos de Espacio de Control de
Calidad Diseo Calidad
(CQA) (ED)

Parmetros
Crticos de
Proceso
CpD
(CPP)
2015 Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. Analytical Quality by Design Approach in RP-
HPLC Method Development for the Assay of Etofenamate in Dosage Forms.
ANTECEDENTES
 Desarrollo de Mtodos Analticos
Es la aplicacin de conocimientos qumicos, fsicos, biolgicos y
matemticos en combinacin del uso de tcnicas instrumentales variadas
a fin de obtener un procedimiento/protocolo de anlisis para la sustancia
activa o el medicamento.
 Desarrollo de Mtodos Analticos

El desarrollo de mtodos analticos y la validacin juega

un rol crucial en el descubrimiento, desarrollo y
fabricacin de medicamentos.

Los mtodos oficiales que resultan de este proceso son

usados para el control de calidad a modo de asegurar la
identidad, pureza, potencia y desempeo de un
medicamento.
Porqu desarrollar un Mtodo Analtico?

$La sustancia/principio activo (API) o la combinacin de

APIs puede no estar oficialmente en las farmacopeas.

$Un procedimiento analtico adecuado para el anlisis del

API puede no estar disponible en la literatura debido a
que an posee patente.

$El mtodo analtico puede no estar disponible para el API

en la forma farmacutica deseada y/o presenta
interferencia por los excipientes de la frmula.
Porqu desarrollar un Mtodo Analtico?

$No hay mtodo analtico para la cuantificacin del API

en fluidos biolgicos.

$No hay mtodos analticos para el API en

combinacin con otros ingredientes activos.

$El procedimiento existente consume solventes y reactivos

costosos y utiliza vas de extraccin o separacin poco
confiables.
Clasificacin de Mtodos Analticos:

1. Pruebas de Identificacin.

2. Mtodos de Valoracin/Potencia.

3. Mtodos para Cuantificacin de Impurezas.

4. Pruebas Lmite de Impurezas.

5. Mtodos Especficos.
 CLINICO FARMACETICO MTODOS
En la fase Inicial del Desarrollo Farmacutico
Para determinar Para desarrollar Comprensin del perfil de
biodisponibilidad formulaciones estables impurezas / degradados y el
en voluntarios con los propsitos de: Estudio de Estabilidad.
sanos Bioequivalencia,
disolucin, estabilidad, Para medir el impacto del proceso
validacin escala piloto. de fabricacin y conocer las
variables crticas del proceso
que afectan la calidad del
producto.
En la fase Avanzadas del Desarrollo Farmacutico
Para demostrar Para optimizar, escalar y Debe ser robusto, facilmente
bioequivalencia. transferir un proceso transferible, exacto, preciso,
estable de fabricacin a indicativo de estabilidad y usado
la planta comercial. para control de calidad de lotes
pre-calificados / transferencia.
 Toxicidad
(Impurezas y
Prod. Degs)
Pre-formulacin Farmacocintica
(Permeabilidad,
(Solubilidad, Tamao
Absorcin, Cmax,
de Partcula, Estabilidad)
Cmin, AUC)

Desarrollo
de Mtodos
Analticos

Desarrollo
Farmacutico Distribucin
(Liberacin API, (Empaque,
funcionalidad Estabilidad)
de excipientes) Fabricacin
(Uniformidad,
Estabilidad,
Reproducibilidad)
 Guas /
PNO local de
Desarrollo
Analtico

Revistas
Procedimientos Cientficas y
Globales (HQ) o Disertasiones Conocimiento
Estndares
Corporativos Guas
de Expertos Pblico
Corporativas
Guas (Know-How)
Manual de
Calidad de la Bases de Datos
compaa ICH (SciFinder, PubMed)

FARMACOPEAS / Normas
FEUM / USP / WHO / TGA / Eur. Ph. /
Jap. Ph. / NOM / ISO
Lineamientos
Internacionales

Orange Calidad por

Book, PLM, Diseo
PDR, FDA, Anlisis en
AOAC, otros
% NOM-059-SSA1-1993. Buenas Prcticas de fabricacin para establecimiento de la
industria farmacutica dedicados a la fabricacin de medicamentos.
% NOM-073-SSA1-2005. Estabilidad de frmacos y medicamentos.
% NOM-177-SSA1-1998. Pruebas y procedimientos para demostrar que un
medicamento es intercambiable.
% Gua de Validacin de Mtodos Analticos CNQFB.
% CIPAM. Gua de validacin de mtodos analticos y otras Guas Selectas.
% ICH Q1A(R2). Stability Testing for New Drug Substances and Products.
% ICH Q1B. Stability Testing: Photostability of New Drug Substances and Products.
% ICH Q1C. Stability Test of New Dosage Forms
% ICH Q2(R1). Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology.
% ICH Q3B(R2). Impurities in New Drug Products.
% ICH Q3C Impurities: Residual Solvents.
% ICH Q4B. Evaluation and Recommendation of Pharmacopoeil Texts for Use in the ICH
Regions.
% ICH Q5A, Q5B, Q5C, Q5D, Q5E. Quality of Biotechnological Products.
% ICH Q6. Specifications.
% ICH Q8(R2). Pharmaceutical Development.
% ICH Q9. Quality Risk Management.
% ICH Q10. Pharmaceutical Quality System.
% ICH Q11. Development and Manufacture of Drug Substances.
% Guidance for Industry. Analytical Procedures and Methods Validation.
% Guidance for Industry. PAT-A framework for Innovative Pharmaceutical Development,
Manufacturing and Quality Assurance.
% Guidance for Industry. Extended Release Oral Dosage Forms: Development,
Evaluation, and Application of In Vitro / In Vivo correlations.
% Guidance for Industry. Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage
Forms
% ASTM Standard, E29-2008 Standard practice for using significant digits in test data to
determine conformance with specifications, ASTM International.
% United States Pharmacopei/National Formulary
% General Chapter <621> Chromatography
% General Chapter <1010> Analytical Data Interpretation and Treatment
% General Chapter <1224> Transfer of Analytical Procedures
% General Chapter <1225> Validation of Compendial Procedures
% General Chapter <1226> Verification of Compendial Procedures
 Incremento de
Cambios en el requerimientos
proceso de regulatorios en fases
manufactura posteriores

Cambio en la
formulacin

Cambio en la
ruta de
sntesis

MD = Desarrollo del mtodo

MV = Validacin del Mtodo
MT = Transferencia del Mtodo

Imagen adaptada de Particle Sciences. Technical Brief 2009 Vol. 5

Analytical Method Development and Validation .
Imagen sustraida de Particle Sciences. Technical Brief 2009 Vol. 5 Analytical
Method Development and Validation .
 FUNDAMENTOS DE
CROMATOGRAFA DE
LQUIDOS
 Cromatografa de Lquidos

Es la separacin de componentes de una mezcla, mediante el uso de un sistema

combinado de fase mvil y fase estacionaria donde se llevan a cabo interacciones
qumicas y fsicas temporales, que son detectadas finalmente por medio de un
detector especfico a las propiedades del(los) analito(s) de inters.

Carga de Adicin
la del
muestra solvente

Columna con
fase
estacionaria

Componentes
separados

Tiempo
 HISTORIA
El HPLC / CLAR tiene alrededor de 35 aos de existir:

# El botnico ruso Mikhail Tswett fue el primero en

usar el trmino cromatografa en 1906.
# La cromatografa de lquidos, empez en los aos
60s.
# Con el desarrollo de columnas e instrumentos
cambio de ser Alta presin a Alta Separacin.
# Su boom se dio en los aos 80s.
# A partir del 2006 aparecen variantes nuevas
basadas en soportar ms presin como son:
UPLC, RRLC, UFLC, RSLC etc.
DIAGRAMA GENERAL DE OPERACIN DE UN
CROMATGRAFO DE LQUIDOS.
 Fase estacionaria enlazada
Analito de inters qumicamente

Silica
empacada

Fase Mvil
Tiempo Cero
Fase Mvil

Bandas de Analitos

Tiempo + X minutos
Fase Mvil
Caractersticas de las molculas basadas en su estructura y
distribucin de carga de electrones.
 La desventaja de la slica es que
se disuelve a pH alto (por ello ha
sido necesario inventar partculas
hbridas que son ms estables a
pH alto.

Slica muy
polar
C18 (ODS)

Ligando C8 triclorosilano
 FORMULAS Y CONCEPTOS
Tiempo de retencin y tiempo de retencin de la fase mvil.
 FORMULAS Y CONCEPTOS

Factor de capacidad (retencin).

Describe la migracin de los analitos en la columna.

' t R to
k = k >> menor velocidad de migracin en la columna.
k << mayor velocidad de migracin en la columna.
to
 FORMULAS Y CONCEPTOS

Factor de selectividad.

Define la selectividad de una columna para

separar dos picos:
(t R )2 to
>> ms separacin. =
<< menos separacin (t R )1 to
FORMULAS Y CONCEPTOS
Nmero de platos
tericos:

L
N=
H
 FORMULAS Y CONCEPTOS
Resolucin
Representa pasos de equilibrio fase (2(t R )B (t R ) A )
estacionaria/fase mvil y en consecuencia RS =
una mejor separacin: WA + WB
Rs << picos ms estrechos = mejor
separacin.
Ecuacin fundamental de la Resolucin y su representacin grfica: A
valores muy pequeos el factor de retencin (k) tiene el impacto ms
grande en la resolucin, pero a valores modestos esto se vuelve
insignificante en comparacin con la eficiencia (N) y sucesivamente va
predominando la selectividad ().
 FORMULAS Y CONCEPTOS

La ecuacin de Van Deemter: H = A + B / u + Cu

A = Difusin axial (tamao y forma de partcula, distribucin,
uniformidad de la cama de fase estacionaria).

2
1

En columnas capilares
(CG) este trmino es
innecesario porque no
hay partculas como tal
que atravesar.
 FORMULAS Y CONCEPTOS

La ecuacin de Van Deemter: H = A + B / u + Cu

B/u = difusin longitudinal o ensanchamiento de banda (composicin y
flujo de la fase mvil).

Las molculas se difunden de reas de alta

concentracin a reas de baja concentracin.
A altas velocidades, el
Flujo efecto de esta variable para
la resolucin es mnimo
Con el tiempo. (cercano a 0).

Flujo
 FORMULAS Y CONCEPTOS

La ecuacin de Van Deemter: H = A + B / u + Cu

Cu = Resistencia a la transferencia de masa entre la fase mvil y la
estacionaria (tamao de partcula, porosidad, grosor de la fase
estacionaria).

Dependiendo de las
propiedades qumicas y fsicas
de las molculas algunas
tardarn ms o menos tiempo
en moverse de la fase mvil a
la fase estacionaria y
viceversa.
 FORMULAS Y CONCEPTOS

La ecuacin de Van Deemter:

H, Altura del plato H = A + B / u + Cu

Transferencia de masa, Cu

Difusin Axial , A

Difusin Longitudinal, B/u

Velocidad Lineal, u
 FORMULAS Y CONCEPTOS

La ecuacin de Van Deemter: H = A + B / u + Cu

Zona de U-HPLC

Figura tomada de Microparticle Packaging Material. Shimadzu.

 Fronteo y
Coleo

& Volumen muerto

& Efectos de adsorcin
& Empaque de la columna
& Efectos del solvente
Flujos mviles tpicos recomendados dependiendo de las
dimensiones de la columna cromatogrfica.

Dimetro Interno de la
Flujo (mL/min)
Columna (mm)

4.6 1.0
3.0 0.4
2.1 0.2
Combinacin de pendiente de dimensiones de la columna
y gradiente.

Dimetro Interno Tiempo del

de la Columna Flujo (mL/min) Gradiente
(mm) (minutos)

4.6 1.0 20
3.0 0.4 14
2.1 0.2 7
 TIPOS DE
CROMATOGRAFA
CROMATOGRAFA DE LQUIDOS:

'TLC (Cromatografa de Capa Fina).

'Cromatografa en Papel.
'SPE (Extraccin en Fase Slida).

'HPLC (Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin).

'U-HPLC (Cromatografa de Lquidos de Ultra Alta
Resolucin).
'Cromatografa de Iones.
TLC

Cromatografa
en Papel
Extraccin en
Fase Slida
 TIPOS DE CROMATOGRAFA DE LQUIDOS

Quiral
TIPOS DE CROMATOGRAFA DE LQUIDOS

Intercambio Inico
La elucin de las partculas cargadas (por ejemplo,
positivamente) se consiguen cambiando el pH del solvente
hasta igualarlo a su punto isoelctrico o hasta invertir su
carga neta.
 TIPOS DE CROMATOGRAFA DE LQUIDOS

Apareamiento Inico
 TIPOS DE CROMATOGRAFA DE LQUIDOS

Fase Normal

La fase estacionaria es convencionalmente

Slice o con algunos grupos Ciano y amino
funcional.
 TIPOS DE CROMATOGRAFA DE LQUIDOS

Fase Reversa (Inversa)

 TIPOS DE CROMATOGRAFA DE LQUIDOS

Exclusin Molecular
Carta de polaridad por composicin de la fase mvil.
 Carta de Selectividad para columnas de fase inversa
FAST LC.

Chromatographic Comparison of Column Selectivity in Reversed-phase Fast LC

L. Pereira, M. Dolci, W. Faulkner, S. Aspey, J. Ali, T. Edge.
Thermo Fisher Scientific
DETECCIN
 Detectores

Detector de ndice de Refraccin.

Detecta especies sin cromforos.

Respuesta universal
Dependiente de la temperatura.
Pobre sensibilidad (LD aprox 100 ng)
No gradientes.
 Detectores

Detector de Conductividad.

1. Casi universal (especies inicas)

2. Comnmente para CL intercambio inico.
3. Detecta especies no cromforas.
4. Sensible(LD aprox 1 ng)
5. Los gradientes son un reto.
6. No debe haber sales o buffers en fase mvil.
 La tecnologa del
supresor que manejan
los equipos Thermo
permiten que se
disminuya el ruido
generado por la alta
conductividad de los
eluentes.
 Detectores

Detector de Fluorescencia.

Mide una propiedad especfica

Altamente selectivo (debe haber fluorescencia).
Es el 2do detector ms comn
Muy Sensible (LD aprox 0.01 ng)
Tiene aplicaciones limitadas.
Caro
Detectores
Detector de Arreglo de Diodos.
Mide una propiedad especfica
C asi universal (debe tener un grupo
cromforo).
Es el ms comn de los detectores
Genera resultados 3D
Mnima interferencia
Se puede realizar pureza de pico
Se pueden revisar distintas longitudes de onda.
Sensible (LD aprox 1 ng)
Caro
 Detectores

Detector de longitud de onda fija y onda variable.

Mide una propiedad especfica

Casi universal (debe tener un grupo cromforo).
Es el ms comn de los detectores
Sensible (LD aprox 1 ng)
Caro
 Espectroscopia UV-Vis
La espectroscopia UV-Vis nos permite conocer las transiciones
electrnicas principales en los diferentes compuestos
qumicos.
Principalmente aquellos que en sus estructuras electrnicas
posean dobles o triples enlaces de tipo conjugado.

Tambin presentan absorcin al UV aquellas molculas que

posean grupos funcionales con electrones en un continuo
estado de transicin (aminas, amidas, esteres, halogenuros
conjugados, etc.)
 Celda
de Flujo

FD

Rejilla de difraccin /
Lmpara Lentes Foto Diodo
Seleccin de longitud de La variacin diferencial de la luz
onda
crea una seal elctrica que se
representa como un pico.
Flujo proveniente
de la columna
 Medicin de la absorbancia
En los anlisis espectrofotomtricos siempre intentamos trabajar a
longitudes de onda donde se encuentra la mxima absorbancia (max)
Este es el punto de mxima respuesta en donde se mejora la sensibilidad y
se tiene el lmite de deteccin ms bajo, y tambin donde se reduce el error
en la medicin.
Piridoxina 100% at 1.74 min
400
mAU
287.6
Error pequeo
300

200
Variaciones de idnticas
222.8
100
Error
grande

nm
-50
230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
 Desviaciones de la ley de Lambert-Beer

Muchas especies qumicas

2 absorben linealmente en un
estrecho intervalo de absorbancia

En la zona 1 la falta de respuesta

lineal puede ser debida a la
absorcin de fondo, interferencias
1 qumicas o a una falta de
sensibilidad.

En la zona 2 la falta de linealidad

puede deberse a un insuficiente
paso de luz a travs de la celda o
a una alta absorbancia.
 DETECTOR DE AEROSOL
CARGADO (Corona CAD)

( Usado para compuestos no

voltiles y semi-voltiles a
niveles de sub-nanogramos
(picogramo).

( N o s e r e q u i e r e q u e u n a
molcula contenga un cromforo
o que sea capaz de ionizarse.

( Principio es la conversin de un
efluente de la columna en un
aerosol seco al cual se le aplica
una carga elctrica, las
partculas se cargan en la
medida de la masa de cada
compuesto.

( Es compatible con gradientes.

 Detector Lmite de deteccin Permite gradiente

UV/Vis 0.1 1 ng SI

ndice de Refraccin 100 1000 ng NO

Dispersin de luz 0.1 1 ng SI

Fluorescencia 0.001 0.01 ng SI

Conductividad 0.5 1 ng NO
Espectrometra de
0.1 1 ng SI
masas
DEFINICIN DEL
OBJETIVO
Tomada de Development and Validation of HPLC Methods for Analytical
and preparative Purposes de Johan Linholm, 2004.
 VALORACIN
(API y DISOLUCIN).

#Usado tambin como tcnica para identificacin de analito(s),

cuando se tiene estndar contra cual comparar.

# Cuantificacin de analito(s) de inters (mtodo indicativo de

estabilidad) o para cuantificar liberacin o contenido de principio
activo.

#Anlisis en tiempos cortos.

#Alta flexibilidad en la selectividad.

#Sensibilidad no es necesariamente la prioridad.

#Linealidad del mtodo debe ser demostrada en rangos amplios.

# Posibilidad de modificar longitud de onda para disminuir

interferencias.
 CUANTIFICACIN DE
IMPUREZAS

#Requiere alta sensibilidad en el mtodo

#Identifica y cuantifica los productos de degradacin (impureza) que

ocurran durante la vida del producto.

#Anlisis generalmente de tiempos de corrida largos.

#Poca flexibilidad en la selectividad.

#La linealidad del mtodo debe ser demostrada a niveles de

concentracin bajos.
 PLAN DE
DESARROLLO
ANALTICO
 Estrategia General del Desarrollo de Mtodos
Investigacin Bibliogrfica Diseo de la Requerimientos del
Previa al Proceso Experimental Estrategia del Desarrollo Cliente / Usuario

Seleccin de las condiciones iniciales

del mtodo analtico

Scouting /
Caracterizacin

Optimizacin Preparacin de la Anlisis de Prototipos y

del Mtodo Muestra Analtica Medicamentos de Referencia

Documentacin
(Reporte y Libreta de Proyecto)

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

 Estrategia General del Desarrollo de Mtodos

Target Product Profile y el Plan Requerimientos del

de Desarrollo Farmacutico & Cliente / Usuario
Comercializacin.

Informacin de
Desarrollo Farmacutico
(que quieren hacer
nuestros colegas?).
En donde se pretende
vender el producto?
Qu tiempo tengo para
el Desarrollo del Mtodo
Analtico.
 Estrategia General del Desarrollo de Mtodos

Requerimientos del
Cliente / Usuario

Cuntos mtodos analticos vislumbro que se requerirn para este

proyecto?
Cules podran ser mis especificaciones tentativas para este
producto?
Con que equipos / instrumentos cuento en el corto, mediano y largo
plazo?
 Estrategia General del Desarrollo de Mtodos
Requerimientos del
Cliente / Usuario

Evidenciar la toma de decisiones crticas a las

que se enfrentar el Cientfico " Esto se
plasma en un Diagrama de Flujo del
Desarrollo Analtico.

Un planteamiento errneo puede llevar a la prdida de tiempo y

recursos para el desarrollo analtico y disminuir la calidad y
robustez de la metodologa final.
Look for chemical and
physical properties,
related/degradation Batch Record Stability Plan Test
products, impurities,
excipients, structures Raw Materials
and analytical Degradation
techniques. Formulation Prototypes and Products, Stress
Packing and/or accelerated
decomposition tests.

Previous Bibliographic
Research

Journals
International Guidelines 1. Identification Test
Pharmacopeia 2. Potency assays A n a l y t i c a l
Instruments, Non-
Supplier Technical 3. Impurity test: A n a l y t i c a l
Information Quantitative Instruments and/or
Apparatus Selection.
4. I m p u r i t y Te s t :
SPRI Information limit
Seminaries, Courses, 5. Specific Tests.
Trainings, Congresses.
Previous methodologies.

Acceptance Criteria and Analytical

Specifications Methodologies
Proposes
Estrategia General del Desarrollo de Mtodos
Diseo de la Estrategia Con que materiales cuento
del Desarrollo
AHORA o a CORTO PLAZO?
' Estndares de mis principios
activos.
' Materias Primas de mis principios
activos.
' Medicamentos de referencia o de la
competencia.
% C o l u m n a s c r o m a t o g r f i c a s
convencionales (fciles de conseguir
para empezar).
% Insumos bsicos (matraces, pipetas,
filtros, reactivos y solventes tpicos).
% Equipamiento bsico (HPLC).
Estrategia General del Desarrollo de Mtodos
Qu materiales Necesito tener
Diseo de la Estrategia
del Desarrollo
DESPUS o LARGO PLAZO?
' Sustancias de Referencia
' Materias Primas de Excipientes (todos
los potencialmente definidos por DF).
' Placebos (pueden ser no definitivos, sino
de prototipos)
' P r o t o t i p o s d e F o r m u l a c i n
(gradualmente perfeccionados y de un
proceso ms estandarizado).
% VARIAS columnas cromatogrficas de la
ya seleccionada (preferentemente
diferente lote)
% Insumos especficos del mtodo en
cantidad suficiente.
% Equipamiento especfico (p. Ej. un
detector especial)
Estrategia General del Desarrollo de Mtodos
 INVESTIGACIN
PREVIA A LA
EXPERIMENTACIN.
 Estrategia General del Desarrollo de Mtodos
Investigacin Bibliogrfica Diseo de la Requerimientos del
Previa al Proceso Experimental Estrategia del Desarrollo Cliente / Usuario

Propiedades Fsicas / Objetivo / Uso del mtodo a

Qumicas de los API y desarrollar.
Excipientes.
Regulacin / Normatividad a
Mtodos Farmacopicos Seleccin de las condiciones iniciales cumplir (validacin).
disponibles (FEUM, USP, Ph. del mtodo analtico
Tiempo asignado a la fase del
Eur.).
desarrollo analtico.
Productos de Referencia /
Recursos tecnolgicos, humanos
Innovadores.
y econmicos disponibles.
Patentes e informacin
pblica.
Scouting / Pases a los que ser transferido
Caracterizacin el mtodo analtico final.
PLM, Vademecum, Merck
Index.
Informacin preliminar de la
formulacin (prototipos).
Artculos / Revistas de Optimizacin Preparacin de la Anlisis de Prototipos y
Divulgacin Cientfica. del Mtodo Muestra Analtica Medicamentos de Referencia
Libros de Texto.

Documentacin
(Reporte y Libreta de Proyecto)

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

 Seleccin del Instrumento Farmacocintica
(condiciones de operacin, (Permeabilidad,
Calibracin). Absorcin, Cmax,
Cmin, AUC)

Caractersticas de los APIs Formulacin

(fsicas, qumicas, Mtodo Analtico (solubilidad, tamao de
biolgicas, BCS). Partcula, estabilidad).

Variables que afectan

Toxicidad Al mtodo (pH fase mvil,
(impurezas, productos de Temperatura,
Degradacin, Longitud de onda, etc.)
estrs forzado). Preparacin de la Muestra
 Analytical Method Development Documents

Pharmaceutical
Formula
Batch Record Data Base Search over the company
Analytical Methodologies previously
General Information generated and external.
Regulatory and Compendial
Information

Other
-Material Safety External Local
Data Bases Data Sheets -Journals -FEUM
Elsevier, PubMed, -Scientists -Data Bases - N O M
Magazines and International (COFEPRIS)
ScienceDirect, -Library
UNAM Library, articles. -USP -SEMARNAT
University
Nature Pharmaceuticals -EP -CFR
-IPA
Chemical Abstracts. Company -JP
-CIPAM
-Research Lab -ICH
-Intranet -International
Books -QC H e a l t h
-Handbook of excipients, -RMS Authorities
-Index Merck (FDA,EMEA,
-PLM, PDR TGA)
-Analytical Profiles and Drug
Substances. Florey Connors
-Martindale
 Raw Material Analysis Method Developments
Finished Product Methodology
First Analysis. Transferences

QC Technical Analytical Methodologies Pre-formulation

Support Protocol Study Analysis

Validation and
In process
Stability Area
Analysis
Pre-analytical Studies Support
Stability Study
Pilot Batches
Method (Most Important Variables)
analysis
Development

APIs and excipients data

Experimental Designes Proposes Re-definition behaviour.

Stability Plan
(25C/60%RH., 0C-5C, cycles, 40C, light, 75C, etc.).
Proposes Optimization
(Secondary variables
analysis). Sample Extraction
Robustness (Preliminary) Proccess and/or
Sample Preparation
(Operational Range Evaluation of the
critical variables of the method).
Method Linearity
Specificity (Preliminary)

QL, DL
Precision and (if apply)
Reproducibility
METHOD DEVELOPMENT
FINAL REPORT AND
ANALYTICAL
METHODOLOGY.
 Method Development Protocol.
1. Objective
2. Introduction
3. Background
3.1 API s Physical Chemical properties
3.2 Related/Degradation Products and
Impurities Physical Chemical
properties.
3.3 Excipients Physical Chemical
properties.
3.4 Formulation Prototype.
3.5 Previous Analytical Methodologies.
5. Scope
6. Justification
7. Analytical Method Proposes
7.1 Reactives and solutions
7.2 Standards and Sample Preparation
7.3 Special sample preparations
7.3 Test Process and/or Experimental Design.
8. Results and Analysis of Results (for each propose)
9. Conclusion (for each propose)
10. Perspectives and/or Next Step Re-definition of Final
chosen Method.
11. Optimization of Final chosen Method.
12. Method Validation Preliminary Tests.
'Esta etapa es fundamental y debe dedicarse el tiempo necesario
para investigar sobre informacin de muy diversas fuentes y tpicos.

'El resultado de esta etapa debe ser un acervo bibliogrfico que nos
haya permitido plantear la estrategia general para el Desarrollo del
Mtodo (plan).

'El plan debe ser visto desde el punto estratgico igualmente

(reactivos faltantes, tiempos de entrega, costo, etc.).

' Fundamental para la compaa es disear un sistema de

Preservacin del Conocimiento, know-how, independiente de la
experiencia que los analistas.
 TEMP' FLUJO'
ACTIVO' COLUMNA' VOL FASE'MVIL' GRADIENTE' [']' REFERENCIA'
(nm)' COL.' (mL/min)'
X.W. Teng et al. /
Ultrasphere
MeOH:Agua International Journal of
Octyl 150 mm x 248! 22 C! N/E! Isocratico! 0.28! N/E!
(59:41 % v/v)! Pharmaceutics 259
2 mm, 5m!
(2003) 129-141!
FUROATO DE MOMETASON'

Draft. Mometasone
Furoate Cream 3.2.P.
ACN:MeOH:Agu Gradiente 5.2.1 Analytical
C18, 150 x 4.6 a (10:9:90, v/v/v) 0.08 mg/
254! 40 C! 20 l! (Consultar 1.5! Procedures Assay,
mm, 3m! ACN:MeOH:Agu mL!
referencia)! Degradates and
a (90:9:10, v/v/v)!
Identity. Ver. 1.2 15-
ago-2012!
Silica Octadecil
ACN:Agua edQm. PhEur 7th
250mm x 4.6 254! N/E! 20 l! Isocratico! 1.0! 1 mg/mL!
(50:50 % v/v)! Edicin 2013 (7.6)!
mm, 5m!
0-44 min (70:30
% v/v)

L60 250 mm x ACN:Agua 45-46 min 0.1 mg/ Monografa USP35-

254! 25 C! 50 l! 2.0!
4.6 mm, 5m! (45:55 % v/v) mL! NF30 Pgina 3945!
46-50 min
(70:30 % v/v)!
Gemini RP-18 MeOH:Agua 1.0 20 Qum. Nova vol.35 no.
248! 25 C! 20 l! Isocratico! 1.0!
Column! (80:20 % v/v)! g/mL! 4 Sao Paulo 2012!
 Plan de
Desarrollo
Analtico
PREPARACIN DE LA
MUESTRA ANALTICA
 Preparacin de la
Muestra Analtica

El diseo de la preparacin de la muestra juega un papel crucial en el

Desarrollo del Mtodo Analtico. El 40% de las investigaciones de
Resultados Fuera de Especificaciones tienen su origen en una
inadecuada preparacin de muestra analtica.

'Seleccin adecuada del nmero de unidades representativas de

un lote.

'Seleccin correcta del mecanismo de extraccin de acuerdo a la

forma farmacutica (sonicacin, extraccin lquido-lquido, slido-
slido o lquido-slido, agitacin, centrifugacin, etc.).

'Uso de aforos y alcuotas estndares de fcil acceso para los

anlisis rutinarios.
Preparacin de la
Muestra Analtica

'Uso de material de vidrio clase A.

'Tiempos ptimos de extraccin.
'Uso de suministros reproducibles de lote a lote y que
no interfieran con el recobro (ej. Filtros, cartuchos de
extraccin).
'Si se involucran reacciones (ej. Complejamiento,
neutralizacin) calcular las cantidades de reactivo
necesarias para lograr el 100% de la reaccin.
'Seleccin de diluentes/solventes compatibles con los
analitos (evitar descomposicin de la muestra analtica
o generacin de artefactos).
 Algunas tcnicas comunes de preparacin
de muestras.
Especificidad Mtodo de
Tcnica Aplicacin Tpica
Relativa Separacin
Fsica (volatilidad) Anlisis de tabletas
Menos especfico Fsica (tamao) Bioanlisis de sangre.
Pre-concentracin de la
Fsica (masa) Bioanlisis de plasma
muestra.
Qumica Dioxinas
Filtrado
(desnaturalizacin) Pesticidad
Centrifugacin
Fsica (volatilidad)
Precipitacin de proteinas.
Qumica
Extraccin Soxhlet
(hidrofbicidad, Metabolitos de la orina
Extraccin Lquido Lquido.
polaridad,
Extraccin Lquido Lquido
ionizacin). Pesticidas en alimentos
asistida.
Pesticidad en anlisis de aguas
Micro-extraccin por gotas.
residuales
Micro-extraccin en fase slida
Saborizantes en bebidas.
Extraccin en fase slida
Sustancias en vino y cerveza
Mecanismo hidrofbico
Mecanismo electrosttico
Analitos hidrofbicos de ros y
Mecanismo mix-mode.
Mas especfico APIs ionizables en aguas
residuales.
 Extraccin de API en tabletas

Los principales mecanismos de extraccin (agitacin orbital, agitacin magntica y

sonicacin) fueron evaluados mediante diseos de experimentos, los resultados se
evaluaron estadsticamente afn de encontrar las variables que influyen en la correcta
extraccin Etoricoxib.
 REDUCCIN DE TAMAO DE PARTICULA

La reduccin de tamao de partcula es un proceso mecnico.

 EXTRACCIN FASE SOLIDA

& La Extraccin en Fase Slida (SPE)

& Es una tcnica de limpieza de muestras

rpida.

& Una columna SPE consiste en un lecho

de adsorbente de partculas gruesas

& SPE permite la preconcentracin de la

muestra con un riesgo mnimo de
prdida o contaminacin de la misma.

& El componente de inters es retenido

en una fase slida mientras que los
contaminantes de la matriz se eluyen.
Activacin de grupos
funcionales

Carga de la muestra

Lavado con solventes o

mezclas de solventes
 Secado Con aire

Elucin eliminacin de la
interaccin entre el analito y
solvente
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO

La extraccin lquido-lquido, tambin conocida extraccin de

disolvente, es un proceso qumico empleado para separar una
mezcla utilizando la diferencia de solubilidad de sus componentes
entre dos lquidos inmiscibles.

Ej: agua-cloroformo,
ter-agua,
n-heptano-agua
 DERIVATIZACIN
La derivatizacin es un proceso mediante el cual se transforma el analito
por una reaccin qumica en un derivado ms fcil de analizar.

Puede ser pre-columna (requiere de la

formacin de un producto estable y bien
definido).
 DERIVATIZACIN
Derivatizacin post-columna (se lleva a cabo en un reactor especial que
se coloca entre la columna y el detector. La reaccin se debe completar
rpidamente a temperatura moderada, la reaccin puede llevarse acabo en
otro medio que no sea fase mvil. Se puede optimizar la separacin y la
deteccin de manera separada.
Ejemplos:

Se obtienen
compuestos
fluorescentes
derivados de
proteinas, aminas y
compuestos
fenlicos, la
excitacin ocurre a
335 365 nm y la
Cloruro de
dansilo emisin a 520 nm.
Ejemplos:

Permite absorcin UV a los

570 nm
 MUESTRA DE DISOLUCIN

( La muestra analtica generalmente es

muestra directa de la prueba de
disolucin.

( No se sugiere diluirla.

( Siempre filtrar o clarificar la muestra

previa inyeccin en el cromatgrafo
de lquidos.

( Para los clculos, considerar la

cantidad retirada durante el
muestreo, en especial si se trata de
un perfil (no ms del 10%).
 Recobro de Ingrediente Activo
Lote
(SONICACIN POR 1 HORA)
25C/60%HR 30C/65%HR 40C/75%HR
Condicin de
28 das / sin 28 das / sin 28 das / sin
Estrs
proteccin proteccin proteccin
83524-090 96.7 95.3 93.5
83524-130 97.3 96.2 94.6
Preparacin de la 83524-131 96.2 96.5 93.7
Muestra Analtica
Recobro de Ingrediente Activo
Lote
(AGITACIN CON BARRA 3 HORAS)
25C/60%HR 30C/65%HR 40C/75%HR
Condicin de
28 das / sin 28 das / sin 28 das / sin
Estrs
proteccin proteccin proteccin
83524-090 99.8 98.7 97.5
83524-130 100.2 99.2 97.2
83524-131 99.9 99.3 96.9

Extraccin por Extraccin por agitacin

sonicacin 1 hora. con barra magntica.
 Definicin del Espacio de Diseo del Mtodo Analtico a travs del
Diseo de Experimentos / Anlisis Estadstico.

23 DoE. Organic solvent stirring extraction time

TIZANIDINE 10 bi-layer tabs / 0.5L 10 bi-layer tabs / 1L

stirring time with organic

3 hours 5 hours 3 hours 5 hours
component

97.2 95.8 99.7 98.1

50:50 100.2 97.3 99.8 97.9
Organic: 98.5 96.4 99.8 97.0
Aqueous diluent
ratio (MeOH: HCl
101.5 101.1 98.3 99.2
0.1N)
80:20 100.3 99.6 97.9 97.8
99.4 100.9 99.2 98.9
Definicin del Espacio de Diseo del Mtodo Analtico a travs del
Diseo de Experimentos / Anlisis Estadstico.
EJEMPLO 2
 Seleccin del diluente

El diluente es definido con el vehculo en el cual se disuelve el

analito que ser ensayado.

Los atributos que debe tener el diluente:

& Disolver preferencialmente al analito.

& Disolver impurezas y productos de degradacin.
& Permitir una simetra aceptable del pico cromatogrfico.
& No debe interferir en la respuesta del analito.
& Evitar interacciones entre el analito, el vial, otros
componentes de la matriz.
& No promover la degradacin del analito.
En el primer cromatograma
el diluente contine 10% de
ACN, posteriormente 50%
y finalmente 100% de ACN.
TIPOS DE COLUMNAS
CROMATOGRFICA Y
SELECCIN DE
COLUMNA
 Seleccin de Columna
$ El largo de la columna generalmente predice poder resolutivo (columnas ms largas =
mayor resolucin).
$ Tamao de partcula: Partculas pequeas dan mayor eficiencia, pero generar ms presin.
Silicas de 2.0 m o menores demandan sistemas U-HPLC.
$ Slicas menos cidas Tipo II(B) vs. Tipo I(A). Las primeras producen menos coleo en
analitos polares o ionizables.
$ Seleccin de la hidrofobicidad.

$ Fases estacionarias modificadas

con grupos funcionales embebidos.

$ Dimetro interno se define en base

a limitaciones del sistema y
requerimientos analticos.
& 4.6 mm D.I. con sistemas
HPLC convencionales.
& 2.1 mm D.I. con sistemas
HPLC de bajo volumen extra
columna y se desea mayor
sensibilidad.
El efecto Silanlico (Silanoles no protegido).
 EFECTOS DE LA PARTCULA DE SLICA.

(Entre ms grande sea el rea superficial, mayor ser la retencin,

factor de capacidad y resolucin para separar mezclas complejas.

(Entre menor sea el rea superficial, se equilibrar ms rpido, lo cual

puede ser bueno para anlisis de gradientes.
 EFECTOS DEL TAMAO DE PORO.

(Entre ms grandes los poros, las molculas de soluto ms grandes

pueden ser retenidas por ms tiempo.

(Se puede seleccionar un tamao de poro de 150A o menor para

muestras cuyo peso molecular es menor a 2000. Y de 300A para
muestras de peso molecular > 2000.
Fase estacionaria
La selectividad del medio en fase reversa es predominantemente
una funcin del tipo de ligando enlazado a la superficie del
medio.

-(CH2)3-CH3 C4 Butil Separacin de pptidos y protenas

-(CH2)7-CH3 C8 Octil Compuestos moderadamente a altamente

polares (esteroides, farmacuticos polares,
nucleosidos, pequeos pptidos, etc.)

-(CH2)17-CH3 C18 Octadecil Compuestos moderadamente

polares y no polares (cidos grasos, vitaminas
liposolubles, hidrocarburos poliaromticos, etc.)
Fase estacionaria
-(CH2)3- C6H5 Fenil Compuestos moderadamente polares
(Hidrocarburos policclicos aromticos, cidos
grasos, aromticos polares)

-(CH2)3-CN CN Nitrilo Compuestos polares en fase normal

Diferente selectividad que C18 y fenil en fase
reversa

-(CH2)3- -NO2 C6H5 Nitro Compuestos con dobles enlaces

(compuestos aromticos, hidrocarburos
policiclicos aromticos)
Fase estacionaria
-(CH2)3-NH2 NH2 Amino Compuestos polares (Carbohidratos)

-(CH2)3-O-CH2-CH-CH2 OH Diol Separacin de pptidos y protenas

OH OH
Fase estacionaria
> nmero
cidos Alcoholes Aminas, Aldehdos, No saturados Ramificados de carbonos
carboxlicos Fenoles Cetonas
O H
H NH2
C
C OH C OH H
H

Mayor retencin

Orden de elucin en una Columna C18

Fase estacionaria

C18
C2
C4 C8
NH2

Mayor retencin

Orden de elucin de un compuesto hidrofbico

en diferentes tipos de columnas
SELECCIN DE LA
FASE MVIL
Para la preparacin de la fase mvil
primeramente se debe determinar su
composicin por efecto de la polaridad
deseada. Esto se consigue revisando la
carta abajo mencionada y que se nombra,
fuerza eluotrpica.

'El Acetonitrilo forma mezclas binarias con

el agua.

'El Metanol es prtico lo que significa que

puede llevar a cabo interacciones polar-
polar y polar- inico con los solutos.
Usualmente resulta en mejor selectividad
para compuestos ms polares, sin
embargo, provoca tiempos de corrida ms
largas e incrementa la asimetra del pico.
Fase mvil
Disolventes tiles en HPLC de fase reversa

Agua/Buffer
Agua
Fuerza de Elucin

Metanol
Acetonitrilo

Etanol
Isopropanol
Tetrahidrofurano
Propiedades importantes de los solventes
' El Acetonitrilo tiene menor viscosidad reduce la contrapresin y
frecuentemente permite una mejor forma de pico.

' El Acetonitrilo posee un cutoff bajo, lo cual representa una ventaja en

la deteccin UV.

' El Metanol es menos caro, menos txico.

' El Metanol es ms polar reduce el riesgo de precipitacin de slidos

por el amortiguador.
Agua: todas las soluciones debern ser preparadas con
agua de ionizada 18M 1S tipo 1 (ASTM).

Para optimizar el desarrollo del sistema deber filtrarse con

membrana de poro de 0.22m.

Las soluciones stock debern prepararse concentradas ya

que esto les da mayor estabilidad.
Todas las soluciones deben preparase con un alto
grado de pureza 99.99% o mejor, si las soluciones
son stock es necesario cerciorase que no haya
crecimiento microbiano.
Fase mvil
Efecto de la concentracin de la fase mvil en la resolucin de
compuestos hidrofbicos

100% ACN

80% ACN

50% ACN

30% ACN
Fase mvil
Efecto del tipo de modificador orgnico de la fase mvil en la
resolucin de compuestos hidrofbicos

HPLC 50% THF:50% Agua

50% ISO:50% Agua

50% ACN:50% Agua

50% METOH:50% Agua

Elucin Isocrtica

Los compuestos son eluidos usando una composicin

constante de la fase mvil. La separacin puede ser
descrita usando las sig. ecuaciones.
 REPRESENTACIN GRFICA PARA LA ELUCIN
ISOCRTICA

X Y Z

DETECCIN
MIGRACIN

TIEMPO TIEMPO
 CONSEJO PARA DETERMINAR SI UN
MTODO PUEDE SER RESUELTO
ISOCRTICAMENTE.

Si entonces el anlisis por medio isocrtico es posible.

tg = (tf ti)
Tg = tiempo del gradiente.

tf = 21.2 min
ti = 12.8 min
tg = 20 min

tg = 21.2 12.8 = 8.4 min

0.25 x tg = 0.25 x 20 = 5 min

En este caso un anlisis

isocrtico NO es posible.
 GRADIENTES Y
CAMBIOS A LA FASE
MVIL Y SUS
CONDICIONES.
GRADIENTES

Los diferentes componentes son eluidos

incrementando la concentracin de solvente
orgnico, la muestra es inyectada a una
concentracin de fase mvil fija, en este momento
conforme transcurre el tiempo la concentracin de
solvente orgnico se incrementa para aumentar la
velocidad de elucin de los componentes.
Elucin con gradientes
Los componentes son eluidos usando una composicin
variable de la fase mvil.
MANEJANDO SEPARACIONES CROMATOGRAFICAS EN FASE
REVERSA UTILIZANDO pH

Rangos de pH de 1 a 12
) Utilizando mayores rangos de pH para resolver
problemas en desarrollo de mtodos de fase reversa

) Discusin sobre la relacin entre estructura del analito y

cambios dependientes en retencin y pH

) Seleccin de buffers

) Recomendaciones de bsqueda del mtodo

Utilizando rangos de pH podemos resolver

$Formas de picos
$Deteccin de anlitos problemas de sensibilidad.
$Selectividad.
Por que es importante el pH para obtener
resolucin ?

Es una de las ms poderosas formas de

incrementar (selectividad)
Soluciones amortiguadoras y su rango,
convencionalmente usadas para HPLC.
Relacin entre estructura del analito y pH

)pKa
)Cambios de selectividad
)Reglas tradicionales de fase mvil
)Tecnologa de partculas nuevas
)Influencia de concentracin organica
Como encontrar el pKa de tu compuesto?
)Tablas
)Textos
)Experimentales

'pKa = pH con un 50% analito ionizado y 50% no

ionizado
Comportamiento de retencin en fase reversa
(Supresin inica)
Neutro

Factor de capacidad (k)

cido Bsico

2 4 6 8 10 12 14
pH
Agentes de Apareamiento Inico
 Efecto de la temperatura
Como regla para fase reversa en separaciones
isocraticas, un incremento de 1C

Al disminuir la temperatura disminuye el valor de K

arpoximadamente un 2%

La temperatura afecta a:
& La selectividad
& Resolucin (Rs 2). Si la fase entrando a la
columna puede resultar en picos deformes.
& Para eliminar distorcin, la temperatura de la
fase movil entrando a la columna debe estar
dentro 6C de la temperatura de la columna.
 Perdida de Resolucin
Balance de T en la columna

Horno

60C
60C

Pre acondicionador

Gradiente de T

Horno

Sin pre acondicionador 60C 60C

40C

Centro de la columna:
*Viscosidad alta, menor velocidad linear, mayor retencin.
 Ensanchamiento de la banda extracolumnar
Tiene lugar cuando se transporta el soluto a travs de
tuberas como los utilizados en inyectores detector.

Se da por la diferencia entre la velocidad de flujo que hay

entre las paredes y el centro de las tuberas.
 EVALUACIN Y
OPTIMIZACIN DE
VARIABLES CRTICAS
POR HPLC
 Scouting /
Caracterizacin
El Scouting o Caracterizacin consiste en la evaluacin de las variables/
factores crticos (independientes) que afectan significativamente la respuesta del
mtodo.
& Evaluar 1 variable a la vez o Diseos Factoriales completos (ej. 23).

& Se pueden usar solamente materias primas de APIs y si se cuenta un prototipo

preliminar.
 Scouting /
Caracterizacin

Lo ms relevante de esta
etapa es comprender los
principios qumicos y
fsicos que rigen el
comportamiento del
mtodo en desarrollo y
medir su efecto sobre el
analito de inters.
Consiste en la evaluacin de las diferentes propuestas / alternativas para
fundamentar la metodologa analtica. Esta seleccin debe realizarse en
funcin de:
% Objetivo del mtodo analtico
% Disponibilidad de Tecnologa Instrumental.
% Facilidad de adquisicin de suministros para el anlisis.
% Factibilidad de implementacin / transferencia en los Laboratorios de Control
de Calidad para Anlisis Rutinario (cliente final).
% Tiempo asignado para el Desarrollo del Mtodo Analtico en cuestin.
% Respuesta inicial del mtodo y potencial de adaptacin para cumplir con el
objetivo.
En esta etapa para facilitar el escudriamiento de propuestas se puede recurrir a
software de Desarrollo de Mtodos Analticos
 Variable
Diseo de
Experimentos Proporcin de
[mM] Acetato de
23 pH Fase Orgnica
Amonio
(ACN:MeOH)
Con las variables crticas 1 5.6 17 7:3
identificadas, el cientfico puede 2 5.6 23 7:3
recurrir a Diseo de Experimentos 3 6.0 17 7:3
(factoriales completos 2n o 4 6.0 23 7:3
f r a c c i o n a d o s ( 2n-p) , P l a c k e t -
5 5.6 17 9:1
Burman, Simplex, Cuadrados
6 5.6 23 9:1
Latinos, etc.).
7 6.0 17 9:1
8 6.0 23 9:1

Tradicionalmente la evaluacin se hace un

factor a la vez. Bajo la nueva prctica de
Calidad por Diseo se buscan determinar
las interacciones por efecto combinado de
los diferentes factores y determinar el
Espacio de Diseo del Mtodo.
VARIABLES CRTICAS COMUNES EN MTODOS
HPLC:

Fortaleza (Inica) o Concentracin del Amortiguador.

Concentracin de agente de apareamiento inico (si
aplica).
pH de la fase mvil acuosa
Proporcin de la relacin acuoso: orgnico de la fase
mvil.
 Optimizando la separacin
Resolucin
La resolucin en trminos simples es la distancia que existe
entre dos picos vecinos, tomando como referencia la base de
estos.
Un aumento en la distancia de los picos es lo que cada
cromatografista se esfuerza por alcanzar.
 Optimizando la separacin
Nmero de platos
El nmero de platos es una medida del rendimiento o la
eficacia que presenta una columna, tambin nos permite
conocer el efecto del ensanchamiento de banda y los
fenmenos de difusin a los que se encuentran sometidos los
analitos
El nmero de platos depende de muchos factores como son:
el volumen de inyeccin, la temperatura, la composicin de la
fase mvil, el flujo y el tiempo de retencin del analito.
 Optimizando la separacin
Factor de separacin (selectividad)
es una medida de la capacidad de un sistema cromatogrfico
(fase estacionaria, fase mvil y temperatura) para separar dos
compuestos.
Es la relacin de los tiempos de retencin de dos componentes que
se encuentren dentro de la columna.
El factor de separacin solo depende de la qumica de la columna.

COOH
COOH

CH3
CH3
 Optimizando la separacin
Factor de retencin (factor de capacidad)
k es una medida de la fuerza de interaccin que tiene un
compuesto sobre el sistema cromatogrfico. Se expresa como el
tiempo de residencia de un compuesto en la fase estacionaria en
comparacin con la fase mvil.
El valor k, al igual que , es independiente de las condiciones
instrumentales (dimensiones de la columna, flujo, etc.) por lo que
se puede modificar solo con la qumica de la columna.
 Optimizando la separacin
Resolucin
La resolucin solo depende de tres factores:
La fuerza de interaccin entre los compuestos de inters y la
fase estacionaria (k)
La capacidad del sistema cromatogrfico para separar los
componentes de inters ()
El ancho de los picos de inters (N)
 Optimizando la separacin
Resolucin
En consecuencia para mejorar la resolucin hay 3
posibilidades:
Aumentando la interaccin (k)
Un cambio en la qumica de la columna()
Un aumento en la eficiencia de la separacin (N)
 Optimizando la separacin
Sistema Preliminar
240
mAU

200

150

100

50

min
-20
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
 Optimizando la separacin
Posibilidad 1. Disminuir el flujo
240
mAU

200

150

100

50

min
-20
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
 Optimizando la separacin
Posibilidad 2. Mejorar la forma del pico
240
mAU

200

150

100

50

min
-20
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
 Optimizando la separacin
Posibilidad 2. Mejorar la forma del pico

Reducir el volumen muerto (capilares mas delgados,

disminuir el tamao de celda)
Reducir el volumen de inyeccin
Disminuir la viscosidad de la fase mvil
Menor tamao de partcula
Cambiar por una columna nueva
 Optimizando la separacin
Posibilidad 3. Aumentar la interaccin
240
mAU

200

150

100

50

min
-20
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
 Optimizando la separacin
Posibilidad 3. Aumentar la interaccin

Cambio de la proporcion del componente acuso de fase

mvil
Cambio del eluente
Disminucin de la temperatura
Cambio de la fase estacionaria
 Optimizando la separacin
Posibilidad 4. Aumentar la interaccin con aditivos
240
mAU

200

150

100

50

min
-20
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
 Optimizando la separacin
Posibilidad 4. Aumentar la interaccin con aditivos

Cambio de pH
Uso de reactivos de apareamiento inico
Utilizar aminas para evitar el ensanchamiento de los picos
 Optimizando la separacin
En que secuencia se deben optimizar los parmetros
para la separacin?

Como se puede ver en la ecuacin , R responde ms

sensiblemente a un cambio de .
Por lo tanto, una variacin de la selectividad es la ms
efectiva.
 Optimizando la separacin
Estrategia para la optimizacin de la separacin

Informacin de la muestra

Optimizacin de k (2-8)
Baja resolucin

Cambiar
Baja resolucin

Optimizacin de N

Buena separacin
Reporte de
Desarrollo
Analtico
DE HPLC a U-HPLC
Los fundamentos
de U-HPLC
residen en la
curva de Van
Deemter.
 Al existir picos ms finos y delgados en UHPLC, se
pueden de conducir ms separacin y tener mezclas
de analitos con 10 a 30 picos.

Paso 1. Determina la qumica de la columna que

vas a usar (SELECTIVIDAD).
Paso 2. Ajusta las dimensiones de la
columna:

& Se prefiere de 2.1 mm de D.I.

& Si la meta principal es velocidad,
entonces usa columna de 50 mm
de longitud.
& Si la meta principal es resolucin,
usa columna de 100 mm de
longitud.
Ajusta largo de la columna
Paso 3. Ajusta el volumen de inyeccin:

& Convierte el volumen de inyeccin a volmenes de columna y

compralos para ajustar de manera geomtrica.

UHPLC
Ajusta el volumen de inyeccin:
Paso 4. Ajusta el flujo:

& Todo de manera proporcional .

& Toma en consideracin tamaos de partcula pequeos.

Paso 5. Expresa el gradiente adecuadamente:

& Expresa la duracin del gradiente en cambios porcentuales.

Calculadora de Transferencias de Mtodos
HPLC.

http://www.sigmaaldrich.com/analytical-
chromatography/hplc/method-transfer-
calculator.html#gradient
 Calculadora de Transferencias de Mtodos
HPLC.

http://www.hplctransfer.com/GradientMethod.aspx
Calculadora de Transferencias de Mtodos
HPLC.

http://www.hplctransfer.com/
GradientMethod.aspx
Calculadora de Transferencias de Mtodos
HPLC.

http://www.hplctransfer.com/
IsocraticMethod.aspx
ADECUABILIDAD DEL
SISTEMA Y PRE-
VALIDACIN
Conforme el mtodo analtico ha madurado, se deben evaluar ciertas caractersticas del
mismo a manera de Validacin temprana.

Especificidad/
Selectividad preliminar,
para asegurar que no hay
interferencias con los
analitos de inters.

En este punto es altamente recomendable usar suministros

nuevos (ej. Columna cromatogrfica) para probar la
reproducibilidad del mtodo.
Para la especificidad preliminar incluir
como soluciones muestra:

1.Diluente
2.Solucin estndar
3.S olucin muestra de producto
terminado recin fabricado.
4.S olucin muestra de producto
terminado estresada.
5.Solucin de sustancias relacionadas
disponibles.
6.Solucin de placebo (si se cuenta)

NO DEBE HABER INTERFERENCIA QUE

EXCEDA EL 2.0% Y EL COCIENTE DEL
TIEMPO DE RETENCIN DEL ANALITO DE
INTERES EN LA MUESTRA VS. ESTNDAR
DEBE ESTAR ENTRE 0.8 1.2.
Linealidad / Exactitud del Mtodo por ejemplo:

) Placebo Adicionado (estndar en forma

slida preferentemente).
) En ausencia de placebo, usar Producto
Terminado con Estndar Adicionado.

En avanzada obtener datos de Estabilidad de

la Muestra y de los Estndares por al menos
24 horas.

Repetibilidad segn el tipo

de mtodo.
NOTA: NO usar sobre-estresadas,
sino ms reales al
comportamiento de la estabilidad
 Se evalan las principales respuestas cromatogrficas para determinar los
niveles ptimos de las variables involucradas y fijar los criterios de aceptacin
para el mtodo.

Considerar la inclusin de una solucin de

resolucin en el caso de existir ms e un pico
de inters.

Definir con el histrico de las pruebas, el uso

de la columna seleccionada, en especial los
platos tericos.

Proponer en la tcnica analtica una

mecanismo de activacin, regeneracin,
limpieza y acondicionamiento de la columna
cromatogrfica.
 ADECUABILIDAD DEL SISTEMA.

CRITERIOS DE
ACEPTACIN

RESULTADOS
 ESPECIFICIDAD
(PUREZA DE UN PICO).
 Tipo de Mtodo
Cuantificacin de Lmite de Valoracin / Otros
Caracterstica Identificacin
Impureza Impurezas Potencia Especficos

Exactitud - + - + +
Repetibilidad - + - + +
Precisin - + (1) - + (1) +(1)
Intermedia

Especificidad (2) + + + + + (4)

Lmite de - - (3) + - -
Deteccin
Lmite de - + - - -
Cuantificacin

Linealidad - + - + +
Rango - + - + +
- Significa que la caracterstica normalmente NO se evala.
- Significa que la caracterstica es normalmente evaluada.
(1) Tambin puede ser considerada como la reproducibilidad.
(2) La falta de especificidad puede ser compensado al aplicar otro mtodo de soporte.
(3) Puede ser necesario en algunos casos.
(4) Puede no ser necesario dependiendo del objetivo del mtodo.
RAZONES POR LAS QUE SE HACE LA ESPECIFICIDAD.

% Identidad.
& Para asegurar la identidad del analito.

% Pureza y Valoracin.
& Para asegurar la declaracin de la cantidad exacta de un
analito (sustancias relacionadas, produ, metales pesados,
disolventes residuales), etc.

% Anlisis cualitativos.
& Debe tener la capacidad de distinguir compuestos
estructuralmente relacionados (productos de degradacin).
La especificidad: Sobrelapar el cromatograma de la
solucin de impurezas con la solucin muestra.

Analito

Impurezas

Muestra

Solucin de referencia
de impurezas
Las muestra para especificidad incluyen:

) Placebos (total y parciales).

) Materia prima (APIs y excipientes)

) Estndares de referencia (APIs e impurezas).

) Diluente (blanco)

) Producto terminado (con o sin entrs, de acuerdo al

propsito del mtodo).

) Soluciones de estrs forzado

Si se dispone de impurezas conocidas, la especificidad
puede establecerse por adicin:
o Se agregan cantidades conocidas (API o PT) con niveles
adecuados de impurezas.
MW368 Naphtyridina API
(impureza) (degradado)
N-Oxide
(degradado)

!
CRITERIOS DE ACEPTACIN:

'El tiempo de retencin del o los analito(s) de inters es unico con

respecto a todos los dems componentes que se presentan en el
anlisis (diluentes, impurezas, productos de degradacin, sustancias
relacionas, excipientes, agentes de limpieza, sanitizantes, etc.). Y estos
no interfieren en su cuantificacin.
CRITERIOS DE ACEPTACIN:

Se busca que la relacin TR de un pico de inters entre el

estndar y la muestra se encuentre entre 0.98 1.02
CRITERIOS DE ACEPTACIN:

'Para mtodos de impurezas y limpieza cualquier

interferencia con el activo o analito(s) deber ser 0.1% o
al lmite de reporte.

'Para mtodos de valoracin cualquier interferencia con el

analito(s) deber ser 2.0%
 0.230
0.220
Producto de Producto de Fenilefrina
0.210
0.200 Degradacin Degradacin
0.190 FEN (2) FEN (6)
0.180
0.170
0.160 Producto de Producto de Producto de Producto de
0.150 Degradacin Degradacin Degradacin Degradacin
0.140 FEN (4) FEN (7) FEN (8) FEN (9)
0.130
0.120
0.110
AU

0.100
0.090
0.080
D
0.070
0.060 C
0.050
0.040
0.030
B
0.020
0.010 A
0.000
-0.010
0.00 1.10 2.20 3.30 4.40 5.50 6.60 7.70 8.80 9.90 11.00 12.10 13.20 14.30 15.40 16.50 17.60 18.70 19.80 20.90 22.00 23.10 24.20 25.30
Minutes

A = Placebo Total
B = Placebo cargado Fenil
C = Placebo cargado Fenil + Dextro
D = Placebo cargado Fenil + CTM
 Fenilefrina - 19.052
0.0240
Producto de Producto de Fenilefrina
0.0228
Degradacin Degradacin
0.0216
FEN (1) Producto de FEN (8)
0.0204 Producto de Degradacin
0.0192 Degradacin
0.0180
FEN (6) Producto de
FEN (4) Degradacin
0.0168
Producto de Producto de FEN (9)
0.0156
Producto de Degradacin
0.0144 Degradacin Degradacin
0.0132 FEN (3) FEN (7)
0.0120 FEN (5) D
0.0108
C
AU

0.0096
0.0084
0.0072
0.0060
B
0.0048
0.0036 A
0.0024
0.0012
0.0000
-0.0012
-0.0024
-0.0036
0.97 1.94 2.91 3.88 4.85 5.82 6.79 7.76 8.73 9.70 10.67 11.64 12.61 13.58 14.55 15.52 16.49 17.46 18.43 19.40 20.37 21.34 22.31 23.28 24.25
Minutes

A = Hidrlisis cida
B = Hidrlisis bsica
C = Oxidacin
D = Degradacin Trmica
Los Estudios de Estabilidad de Prueba, tambin conocidos como
Estudios de Estrs Acelerado, NO son reconocidos como Estudios de
Estabilidad Formal para el integrar el Registro del Medicamento.
Su principal funcin es:

#Obtener informacin sobre el comportamiento de la frmula en

etapas previas del Desarrollo Farmacutico.

#Identificar el material de Empaque Primario adecuado para

asegurar la Estabilidad del Producto.
# Determinar que Pruebas son necesarias para el Control de
Calidad Rutinario.

# Obtener informacin sobre Especificaciones Tentativas de

Liberacin y Vida de Anaquel del medicamento en Desarrollo.
& Lmites de Productos de Degradacin.

# En cierto casos, proveer datos para proclamar una Fecha de

Re-anlisis en etapas tempranas del Desarrollo (ej. Liberacin
Material de Investigacin Clnica para Estudios de
Farmacocintica, PK).
FACTOR RESPUESTA
RELATIVO
Factor de Respuesta Relativo.

FRR = (Area Deg / [Degradado])/(Area API /[API]

o Usando estndar de impureza, realizar preparacin

de la impureza al 1.0% (w/w) en solucin que
contenga 100% del API padre.

o Realizar la medicin a la longitud de onda que indica

la metodologa analtica.

o Si el FRR esta fuera del 0.8 a 1.2, se deber incluir

un factor de correccin en los clculos finales.
Factor de Respuesta Relativo.

o Si no hay disponibilidad del estndar de la impureza

el FRR no se puede determinar, se asume un FRR
de 1.0

o Si se usa estndar de impureza en la aplicacin del

mtodo ms all de su simple identificacin, se
corrige la ecuacin anterior incluyendo la pureza.

o El FRR tambin puede calcularse por medio de la

relacin de pendientes entre la impureza y el API
padre obtenidos en la prueba de linealidad.
Factor de Respuesta Relativo.

Mtodo de estimacin por pendiente del mtodo.

& Preparar no menos de 7 preparaciones de impurezas individuales y

del API en concentraciones del 0.1 1.0% con respecto a la
concentracin de referencia (nivel del 100%) o bien alrededor del
nivel de especificacin (p. ej. LR). Siempre valores por encima del
LC. Inyectar en HPLC.

& Graficar concentracin vs. respuesta del estndar API y lo mismo

para la solucin de impurezas. Generar las rectas lineales de cada
grfica.

& Determinar la pendiente de cada grfica.

& El coeficiente de correlacin no debe ser menor de 0.995.

& Calcular FRR = (pendiente de curva de impurezas / pendiente de

curva de API). El factor de correccin es 1/FRR
Factor de Respuesta Relativo.

Mtodo de estimacin por pendiente del mtodo.

Factor de Respuesta Relativo.

Mtodo de estimacin por pendiente del mtodo.

Si el FRR esta
fuera del 0.8 a
1.2, se deber
incluir un
factor de
correccin en
los clculos
finales.
Factor de Respuesta Relativo.

Cuando no hay estndar de impureza presente: Se puede

hacer una aproximacin mediante la prueba de linealidad del
mtodo usando producto terminado estresado.

& A partir de una muestra altamente estresada, preparar por dilucin 5

niveles (concentraciones) de producto terminado estresado.
Asegurarse que en todos los casos la respuesta del API est dentro
del rango lineal.

& Inyectar individualmente de acuerdo a la metodologa analtica.

& Obtener el rea de cada inyeccin y calcular el % rea. Graficar la

concentracin vs. la respuesta (rea de impurezas y API).

& Calcular las pendientes y aplicar la frmula:

FRR = pendiente de la impureza / pendiente del API.

 % Vol Iny AAS AS
0.50 50 uL 40783 49902
0.25 25 uL 24543 26102
0.1 10 uL 5490 7112

Esta se prepar de STD

a cantidad conocida

Esta se prepar de un STD sometido

%AS = AAS/(AAAS + AAS) * 100 a estudio de estrs forzado y se
busco obtener un % de 0.5 de AS
60000" y"="85858x"'"721.03"
R"="0.96458"

50000"

40000"
y"="105773x"'"2263.8"
R"="0.99384"
30000"

20000"

AS"
10000" AAS"

Lineal"(AS)"
0" Lineal"(AAS)"
0" 0.1" 0.2" 0.3" 0.4" 0.5" 0.6"

FRR = 105773 / 85858 = 1.2319

RECUERDEN QUE
TODO MEDICAMENTO EN EL MUNDO DEBE
POSEER TRES CUALIDADES
FUNDAMENTALES:

EL DESARROLLO DE MTODOS
ANALTICOS CONTRIBUYE A LOGRAR
ESTE OBJETIVO.
GRACIAS
PREGUNTAS?