AO DEL BUEN SERVICIO AL CUIDADANO

UNIVERSIDAD
NORBETH WIENER
CONTROL MICROBIOLGICO DE LOS MEDICAMENTOS
INFORME N9
TEMA:
PRUEBAS DE PROMOCIN DE CRECIMIENTO Y APTITUD DEL MTODO
PREVIO AL ANLISIS DE UN PRODUCTO FARMACUTICO NO ESTRIL:
LISTA DE CHEQUEO Y EJECUCIN. USP 38; CAP 61; 62.

ALUMNOS:
CHEPE CUEVA, JESS
HUERTO MACHADO, MARY CARMEN
GALLARDO, SHIRLEY
LEON OSORIO, SHERLEY
SANTIAGO VALVERDE MEDALIT ELISABETH

DOCENTE:
BLGA. MNICA MARGARITA VELARDE VLCHEZ.
SECCIN:
FB6M1 / PRCTICA C

LIMA PER
2017
CUESTIONARIO

1.- Cul es la finalidad para la aplicacin de los diferentes mtodos de

recuperacin de microorganismos?

Identificacin de las especies bacterianas dentro de las ciencias bsicas aplicadas a las
ciencias de la salud, se realiza convencionalmente a travs de cultivos, pruebas
bioqumicas y tinciones para la adecuada identificacin y caracterizacin del
microorganismo y su morfologa.
La finalidad de determinar si una sustancia o preparacin cumple con especificaciones
establecidas de calidad microbiolgica mediante la determinacin de la ausencia de la
aparicin limitada de microorganismos especficos.

2.- De no contar con suficiente material de vidrio para la ejecucin de las pruebas
de promocin de crecimiento a qu microorganismos se restringira esta prueba
preliminar?

A la cepa Aspergillus barsiliesis ATCC 16404 ya que es un hongo y solo podramos

realizar promocin de crecimiento para hongos con solo candida albicans.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Disponible: [Internet] 02 de Noviembre 2017.

http://recuperacionmicroorganismos.blogspot.pe/
2. Disponible: [Internet] 02 de Noviembre 2017.
https://www.researchgate.net/publication/262724715_Metodos_generales_de_co
nservacion_de_microorganismos.
3. Disponible: [Internet] 02 de Noviembre 2017.
file:///C:/Users/Terminal1/Downloads/Dialnet-
MetodosDeIdentificacionBacterianaYSusAplicacionesE-4788193.pdf
 AO DEL BUEN SERVICIO AL CUIDADANO

UNIVERSIDAD
NORBETH WIENER
CONTROL MICROBIOLGICO DE LOS MEDICAMENTOS
INFORME N10
TEMA:
ANLISIS MICROBIOLGICO DE FORMAS FARMACEUTICAS NO
ESTERILES: SLIDAS Y LIQUIDAS. VALIDACIN DEL MTODO. USP 38
CAP 61; CAP 62.

ALUMNOS:
CHEPE CUEVA, JESS
HUERTO MACHADO, MARY CARMEN
GALLARDO, SHIRLEY
LEON OSORIO, SHERLEY
SANTIAGO VALVERDE MEDALIT ELISABETH

DOCENTE:
BLGA. MNICA MARGARITA VELARDE VLCHEZ.
SECCIN:
FB6M1 / PRCTICA C

LIMA PER
2017
INTRODUCCIN

Las pruebas que se describen en lo sucesivo de permitir de determinacin de la

ausencia, de la aparicin limitada de microorganismo especficos que se pueden detector
en las condiciones descritas.
Las pruebas estn diseadas principalmente para determinar si una sustancia o
preparacin cumple con una especificacin establecida para la calidad microbiolgica.
Cuando se utiliza para tales fines, siga las Instrucciones que se indican a continuacin.

Procedimientos microbiolgicos alternativos, incluyendo mtodos automatizados, se

pueden utilizar, siempre que su equivalencia con el mtodos de la Farmacopea se ha
demostrado.

OBJETIVOS

Reconocer la importancia de comprobar la aptitud de los mtodos de anlisis:

recuento y pruebas de microorganismos especficos.
Aplicar y experimentar la metodologa para las pruebas de microorganismos
especficos de una forma farmacutica slida oral y liquida.

MATERIALES Y EQUIPOS

Materiales

24 Tubos x 9 mL de Buffer pH 7,2

12 Tubos con 9 mL de Caldo Mossel
12 Frascos de 250 mL, con 90 mL de Buffer pH 7,2
8 Frascos de 250 mL, con 100 mL de Buffer pH 7,2
4 Frascos con 200 mL de Agar Digerido de Casena y Soja
4 Frascos con 200 mL de Agar Sabouraud Dextrosa.
4 Frascos con 90 mL de Caldo Mossel.
16 Frascos con 90 mL de Caldo Digerido de Casena y Soja
4 Frascos con 100 mL de Caldo Mac Conckey
4 Frascos con 100 mL de Caldo Rappaport Vassiliadis.
 12 Placas con Agar Manitol Salado
4 Placas con Agar Cetrimide
16 Placas con Agar Violeta Rojo Bilis.
32 Pipetas de 1 mL, 2mL
12 Pipetas de 10 mL.
1 Bao Mara a 22,5 C
20 Pipetas de 5 mL.
4 Asas de siembra

Medios de Cultivo y Reactivos

Buffer pH 7,2
Caldo Mossel
Agar Digerido de Casena y Soja
Agar Sabouraud Glucosado
Caldo Mossel
Agar Digerido de Casena y Soja
Caldo Mac Conckey
Caldo Rappaport Vassiliadis.
Agar Manitol Salado
Agar Cetrimide
Agar Violeta Rojo Bilis

Cepas de estudio:

Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, cultivo de 24 horas en Agar

Digerido de Casena y Soja en solucin amortiguada de fosfato monobsico de
potasio de pH 7,2 que permitan obtener inculos de 100 ufc.
Aspergillus niger, cultivo en solucin amortiguada de fosfato monobsico de
potasio ms
0,05 % de polisorbato 80, de pH 7,2 de 5 das que permita obtener inculos de
100 ufc.
PROCEDIMIENTO
 Agar Cetrimide y
Materiales A. manitol salado

Realizamos la siembra de 10-

Aadimos el 1
,10-2,10-3 se aadir a cada
buffer al tubo 1 ml
Agar M.S

De igual manera
Agar nutritivo 30-37C realizamos la siembra 10-
1
por 24-72 horas ,10-2,10-3
Preparamos 8 placas Petri
para la siembra Rotulamos las
placas

Sembramos el Llenamos hasta una

agar TSA cierta cantidad la
placa

Placas en proceso de
incubacin
RESULTADOS

Mtodo de extensin con agar saboraud

En el agar nutritivo con polisorbato se observa el

crecimiento de bacterias pseudomonas.
En el Agar saboraud observamos el Aspergillus
crecimiento de hongos de Niger.
CONCLUSIN

o Las pruebas de promocin de crecimiento nos aseguran que los medios de

cultivo son los indicados para el crecimiento de microorganismos que
empleamos en la prueba.
o Los recuentos realizados para la prueba de esterilidad le va otorgar solidez a la
validacin que realizamos.
o Se puede establecer mediante los resultados obtenidos que las pruebas realizadas
para la promocin de crecimiento cumple con los parmetros como son la
especificidad, precisin, reproducibilidad, lmite de deteccin y solidez.

CUESTIONARIO

1. Si se trata de realizar el examen microbiolgico de un antibitico, explique

los mtodos de estdio de la sensibilidad antibitica.

Estandarizacin
Todos los mtodos de estudio por nosotros utilizados, estn
estandarizados por el National Commitee for Clinical Laboratory
Standars (NCCLS), de manera que los resultados sean reproducibles y
comparables. La realizacin de estos procedimientos requiere la
utilizacin de cepas de control de calidad con resultados conocidos, de
manera de saber si nuestra metodologa se realiz en forma correcta.
Dentro de los parmetros a estandarizar se encuentran los siguientes:
a) El tipo de bacterias a estudiar, ya que no es lo mismo un
microorganismo de crecimiento rpido que lento, exigente o no exigente,
aerobio o anaerobio. Describiremos aqu los mtodos para el estudio de
microorganismos no exigentes, de crecimiento rpido, capaces de crecer
en aerobiosis.
b) Los medios de cultivo para realizar las pruebas. De los medios
disponibles se considera que tanto el agar como el caldo Mueller Hinton
(MH) son los ms apropiados para las pruebas de sensibilidad de rutina
dado que muestran buena reproducibilidad entre los diferentes lotes
comerciales, son baratos, contienen bajo nivel de inhibidores de
sulfonamidas, trimetoprim y tetraciclinas, son adecuados para la mayora
de las bacterias patgenas en lo que a requerimientos nutricionales se
refiere y existen suficientes datos recopilados que avalan su uso en las
pruebas de sensibilidad.
A pesar de estas cualidades, algunos parmetros del medio se deben
controlar en cada lote de uso, como ser:
PH: para cada lote debe ser controlado cuando se prepara el medio. El
agar debe tener un pH 7,2-7,4 a temperatura ambiente. Si el pH es
demasiado bajo ciertas drogas como amino glucsidos, quinolonas y
macrlidos parecern menos activas, mientras otras como las
tetraciclinas parecern tener mayor actividad. Si el pH es ms alto se
podrn esperar los resultados opuestos.
Humedad: si existe un exceso de humedad en la superficie del agar las
placas deben ser incubadas a 35C durante 10 a 30 minutos antes de
utilizarse. Las placas debern estar hmedas pero no mostrar gotas de
agua en la superficie.
Efecto de la timina o timidina: los medios que contienen un exceso de
timina o timidina pueden revertir los efectos inhibitorios de las
sulfonamidas y triometoprim, produciendo alteraciones en las zonas de
inhibicin del crecimiento bacteriano en la placa.
Cantidad de cationes divalentes: la variacin de los cationes divalentes
principalmente de Ca++ y Mg++, tambin afecta los resultados de
antibiticos como tetraciclinas, amino glucsidos, etc.
El medio debe ser preparado segn las indicaciones del fabricante. Luego
de preparado debe esterilizarse y cuando llega a una temperatura
aproximada de 50 C debe ser repartido en las placas de Petri. El espesor
del mismo debe oscilar entre 3 y 5 mm. Para esto se considera que
aquellas placas de 150 mm de dimetro deben llevar 60 a 70 ml del
medio, y las que tienen 100 mm de dimetro deben llevar 25 a 30 ml.
Las placas que no se usan en el da pueden mantenerse en el refrigerador;
aquellas con ms de siete das de preparacin no son adecuadas, salvo
 que sean envueltas en bolsas de plstico para evitar la desecacin, de lo
contrario deben controlarse con los organismos de referencia. Debemos
controlar la esterilidad de cada lote incubando al menos una de sus
placas 24 hr o ms a 35C, verificando si hay o no crecimiento de algn
microorganismo contaminante.
c) El tiempo de incubacin: la mayora de los resultados deben leerse
entre 18 y 20 horas, aunque para la lectura de la meticilinorresistencia en
S. Aureus debe incubarse 24 horas completas.
d) La temperatura de incubacin, lo cual altera la velocidad de
crecimiento bacteriano y su viabilidad.
e) El estado de los antibiticos, su fecha de vencimiento si se trata de
discos, o su potencia si se trata de antibitico como droga. Si bien estos
parmetros pueden ser controlados fsicamente, es decir el operario
puede controlar temperaturas, tiempos, estados de los medios, etc., los
controles de calidad se realizan utilizando cepas conocidas. A
continuacin destacaremos algunos de los mtodos antes mencionados.

Mtodo de disco diffusion.

Este es un mtodo cualitativo, que se caracteriza por ser fcilmente
estandarizable y que est indicado para microorganismos no exigentes de
crecimiento rpido. Partiendo de una muestra clnica siempre se debe
realizar un cultivo puro para poder comenzar el estudio de la sensibilidad
antibitica. Para esto se utiliza la tcnica de aislamiento en placas que
contengan un medio adecuado para la cepa en estudio (al cual adems se
le deben otorgar las condiciones atmosfricas especficas de esa cepa). El
antibiograma por disco difusin basado en el trabajo de Bauer, Kirby y
colaboradores, es uno de los mtodos que el NCCLS recomienda para la
determinacin de la sensibilidad bacteriana a los antibiticos.
Indicaciones: el antibiograma est indicado en las siguientes situaciones:
Se asla una bacteria responsable de un proceso infeccioso y no puede
predecirse su sensibilidad, especialmente si se sabe que este tipo de
bacteria puede presentar resistencia a los antimicrobianos ms
habituales.
En estudios epidemiolgicos, aunque hasta el momento no se halla
descrito mecanismos de resistencia para dicho organismo.
Cuando a pesar de conocerse la sensibilidad del germen a drogas
altamente efectivas, el paciente no puede recibir dicha medicacin
(Sensibilidad de S. pyogenes a eritromicina en pacientes alrgicos a la
penicilina).
En el estudio de nuevos antibiticos.
Fundamento: el mtodo de disco difusin consiste en depositar en la
superficie de una placa de agar MH previamente inoculada con el
microorganismo, discos de papel de filtro impregnados con los diferentes
antibiticos. Tan pronto el disco impregnado en antibitico se pone en
contacto con la superficie hmeda del agar, el filtro absorbe agua y el
antibitico difunde por el agar, formndose un gradiente de
concentracin. Transcurridas 18 a 24 horas de incubacin, los discos
pueden o no aparecer rodeados por una zona de inhibicin de
crecimiento bacteriano.
Materiales: Suero fisiolgico estril o caldo de cultivo estril, hisopos
estriles, pinzas estriles o dispensador, gradillas, descartador, ansa
bacteriolgica, estufa de 35C.
Discos de antibiticos: los discos deben mantenerse en el freezer o en el
refrigerador para mantener la actividad del antibitico. Deben ser
sacados una o dos horas antes de su uso.
Debemos fijarnos siempre en la fecha de vencimiento antes de usarlos.
Patrn de turbidez: para estandarizar la densidad del inculo se usa una
suspensin de sulfato de bario como estndar de turbidez que
corresponde a un 0,5 del nefelmetro de Mc Farland. La densidad se
corrobora con un espectrofotmetro. Luego de preparado el patrn de
turbidez se distribuye en tubos de ensayo (4 a 6 ml por cada tubo). Estos
deben ser guardados a temperatura ambiente y protegidos de la luz. Esta
turbidez corresponde a 1.5 x 108 UFC/ml.
Medio: placas de agar MH.
Procedimiento (como preparar el inculo): existen dos formas
bsicamente de cmo preparar el inculo.
1. Mtodo del medio de cultivo lquido o de Kirby-Bauer: con un asa
bacteriolgica se tocan cuatro o cinco colonias bien aisladas del mismo
tipo morfolgico y se inocula en 4 a 5 ml de caldo apropiado, como
caldo MH. Los cultivos de caldo se dejan incubar a 35C hasta que
aparece una turbidez ligeramente visible (generalmente 2 a 5 hr). La
turbidez se ajusta con suero fisiolgico estril o caldo para obtener una
turbidez visualmente comparable a la de un estndar preparado
previamente (llamado 0.5 de Mc Farland). Este estndar debe agitarse
antes de usar y ser comparado en forma visual con el inculo preparado.
Para ello se miran ambos tubos al mismo tiempo contra un fondo blanco
con una lnea negra como contraste Este mtodo es recomendado cuando
el cultivo tiene ms de 24 hr de incubacin.
2. Mtodo de suspensin directa de colonias o Kirby-Bauer modificado:
se colocan entre 4 y 5 ml de suero fisiolgico estril en un tubo de
ensayo. Se toma con un asa bacteriolgica tres o cuatro colonias
morfolgicamente similares y se suspenden en el tubo hasta alcanzar una
turbidez comparable a la solucin de Mc Farland 0.5. Luego de
preparado el inculo bacteriano con la cepa en estudio se deben seguir
los siguientes pasos:
Introducir el hisopo estril en el inculo bacteriano preparado, de
manera de embeberlo completamente. Antes de retirarlo se debe escurrir
sobre las paredes del tubo para retirar el exceso de lquido del mismo.
Sembrar la placa de MH de manera de obtener un crecimiento
confluente, para lo cual se estra con el hisopo en forma paralela y bien
compacta abarcando toda la superficie de la misma. Luego se repite el
procedimiento rotando la placa 60 en dos oportunidades ms. Deben
extremarse los cuidados en sembrar las placas de borde a borde, porque
de lo contrario puede haber problemas en la realizacin de las lecturas.
Dejar secar 3 a 5 minutos antes de colocar los discos.
 Colocar los discos. Estos deben ser colocados con dispensador o pinza
estril. Luego de estar sobre el agar se debe presionar los discos
levemente para que queden adheridos al mismo. Deben estar a ms de 15
mm del borde de la placa y deben distribuirse de manera de que no haya
superposicin de los halos de inhibicin. En las placas de 150mm no se
colocarn ms de 12 discos, y en las placas de 100 mm no es aconsejable
colocar ms de 6.
Luego de colocados los discos las placas deben incubarse a 35C a
37C en grupos no mayores a cinco placas durante 18 hr. Para detectar la
meticilinorresistencia las placas deben incubarse 24 hr. completas. Las
placas deben colocarse en forma invertida para que el agua condensada
no caiga sobre el agar, lo que cambiara las condiciones del medio y por
lo tanto no servira para la lectura de los halos.
Ventajas: Es un mtodo sencillo, barato y de fcil control y
estandarizacin. Una ventaja adicional del mtodo y especficamente del
medio, es que se le pueden realizar algunas modificaciones en cuanto a
los requerimientos nutricionales para poder llevar a cabo el antibiograma
con microorganismos exigentes o muy exigentes que necesitan ms
nutrientes que los que este medio les puede ofrecer. Un ejemplo claro es
S. Pneumoniae, microorganismo exigente para el cual se puede hacer un
agregado de sangre de oveja desfibrinada en una concentracin al 5%.
Muchas veces estos agregados generan cambios conocidos en los halos
de inhibicin del crecimiento bacteriano.

Control de calidad.
Para proceder a la lectura de los antibiogramas debemos previamente
asegurarnos que se cumpla un estricto control de calidad para supervisar
la exactitud y fiabilidad de la metodologa.
Esto se realiza debido a que existe un gran nmero de variables que
pueden afectar los resultados dentro de las que se destacan:
a) Actividad de los discos (cuidar que no estn vencidos o que pierdan su
carga por almacenamiento incorrecto).
b) Inadecuada composicin y espesor del medio.
c) Alteraciones en ms o en menos en el inculo (patrn de turbidez 0.5
de la escala de Mc Farland).
d) Problemas con el tiempo o temperatura de incubacin, etc.
Para llevar a cabo eficientemente este control de calidad al mismo
tiempo que se realiza el procedimiento para la cepa en estudio, se realiza
para una cepa control. Las cepas control utilizadas sern las
recomendadas por la NCCLS. Estas cepas son denominadas ATCC, una
marca registrada (American Type Culture Collection). Estas son cepas
conocidas, de las cuales se sabe su patrn de resistencia o sensibilidad.
Se conocen y se han establecido los rangos de dimetros en el que debe
estar la zona de inhibicin de crecimiento bacteriano si las condiciones
del procedimiento son las adecuadas. Estos datos se encuentran en tablas
de la NCCLS. Se debe verificar que los dimetros de inhibicin del
crecimiento bacteriano de los discos de antibiticos entren dentro de los
establecidos en las tablas, de lo contrario podremos concluir que existe
alguna variable que est cambiando las condiciones en que debe ser
realizado el procedimiento.

Medicin de los halos e interpretacin de los mismos.

Luego de corroborar que las cepas ATCC se encuentran en rango
procedemos a realizar la lectura de los antibiogramas. La lectura se
realiza a travs de la medicin de los halos de inhibicin. Al igual que
para las ATCC, existen tablas proporcionadas por la NCCLS que segn
el dimetro del halo de inhibicin de crecimiento bacteriano, definen
categoras de resistencia, sensibilidad y sensibilidad intermedia.

Mtodo de gradiente antibitico (E-TEST).

Este es un mtodo cuantitativo. El principio de este mtodo es una
expansin de la tcnica de difusin en disco. En el mtodo E-test
podemos, mediante lectura directa, determinar la CIM.
Consiste en una tira de plstico no poroso de 6 cm de largo por 5 mm de
ancho que incorpora un gradiente predefinido de antimicrobiano
equivalente a 15 diluciones. El protocolo para preparar el inculo es el
 mismo que para la difusin en disco. Siguiendo el mtodo de difusin,
una vez inoculado la placa de agar con el microorganismo, se coloca la
tira de E-test sobre su superficie, producindose de forma inmediata una
difusin del antibitico desde el soporte hasta el agar, crendose de este
modo a lo largo de la tira un gradiente exponencial de las
concentraciones del antimicrobiano. Tras la incubacin de las placas, se
puede observar una zona de inhibicin elipsoidal y simtrica. Despus de
la incubacin la CIM ser el valor donde la elipse corta la tira. Las tiras
deben conservarse a menos de 20C y deben estar protegidas de la
humedad. Antes de usarse se deben atemperar a temperatura ambiente
durante por lo menos 30 minutos. Las placas de Petri con el medio de
MH y la forma de sembrado es la misma que en el mtodo de disco
difusin. Luego se colocan las tiras sobre la superficie del agar. Se debe
dejar absorber el inculo de 10 a 15 min para asegurar que la superficie
del agar est completamente seca antes de aplicar las tiras. Debemos
asegurarnos que la tira contacte completamente con la superficie del
agar. No se deben mover las tiras una vez que han sido colocadas, ya que
el antibitico empieza a difundir rpidamente. Cuando se usa una placa
de Petri de 100 mm depositar solo una tira por placa y poner la tira en el
centro de la placa, si se usa una de 150 mm no se deben colocar ms de 6
tiras. Se incuba durante 16 a 20 hs a 37C o segn los requerimientos
ptimos de la cepa bacteriana en estudio. Si colocamos la tira al revs no
se observa elipse de inhibicin, ya que el gradiente de concentraciones se
sita solo sobre una de las caras de la tira. Se considera como un mtodo
alternativo para el estudio cuantitativo de la sensibilidad antimicrobiana
del que cabe destacar su sencillez y buena correlacin con la tcnica
estndar de dilucin en agar para el estudio de la CIM, que se detalla
ms adelante.

Mtodos de dilucin.
Las primeras determinaciones se realizaron empleando una cantidad
considerable de tubos con caldo de cultivo, a los cuales se le colocaban
diluciones crecientes de antibiticos con el mismo fundamento que el
descrito para el mtodo de dilucin en agar. Este procedimiento se
denomin macro dilucin en caldo. Esta metodologa es muy engorrosa,
por la cantidad de material y de manipulaciones necesarias para su
realizacin. La aparicin de un sistema de inoculacin mltiple para
placas de agar populariz el mtodo de dilucin en agar, en el que cada
placa, con una cierta concentracin de antimicrobiano, permite inocular
simultneamente un gran nmero de microorganismos. La utilizacin de
micro pipetas y de placas de micro titulacin facilit la utilizacin del
mtodo de micro dilucin en caldo; en la actualidad se han popularizado
los mtodos automatizados comerciales de micro dilucin en caldo,
fcilmente integrables en sistemas semiautomticos de lectura e
interpretacin de resultados, pero con el grave inconveniente del
incremento de su costo. Dentro de estos describiremos la macro dilucin
en caldo.

Macro dilucin en caldo.

Las pruebas de dilucin han sido utilizadas durante aos. Los
procedimientos iniciales eran realizados en tubos de ensayo grandes (13
por 100 mm) con volmenes de caldo de por lo menos 1 ml. Este mtodo
fue estandarizado en la dcada de los aos 70 por el Estudio Cooperativo
Internacional y luego la NCCLS public un estndar del mtodo. Este
mtodo es llamado macro dilucin en caldo. A partir de los aos 60 se
comenzaron a utilizar dispositivos serolgicos para dispensar y diluir.
Esta miniaturizacin simple de la tcnica se conoci como micro
dilucin en caldo.
Fundamentos: Consiste en exponer a las cepas a estudiar a diferentes
concentraciones de antimicrobianos, en diluciones a la mitad y observar
el crecimiento de los microorganismos para luego definir la CIM.
Materiales y mtodos: En el mtodo de macro dilucin se emplea por
cada combinacin de microorganismo con antimicrobiano, un juego de
 tubos. Habitualmente se prepara el juego de tubos con 1ml de caldo MH
suplementado con Ca++ y Mg++ estril sin antimicrobiano.
Para un pequeo nmero de pruebas se preparan diluciones al doble
directamente en los tubos, del modo siguiente. Se colocan 2 ml de
solucin de antibitico en el primer tubo de la serie de diluciones. En
cada uno de los tubos restantes se aade 1 ml de caldo MH. Con una
pipeta estril se transfiere 1 ml del primer tubo al segundo. Despus de
mezclar el contenido del segundo tubo, se transfiere 1 ml con una pipeta
diferente (en esta transferencia y en todas las sucesivas) al tercer tubo. El
proceso contina hasta el penltimo tubo, al que se le quita 1 ml, que se
descarta. El ltimo tubo no recibe solucin de antibitico y sirve de
control de crecimiento. Las concentraciones finales de antibiticos en
esta prueba son iguales a la mitad de la serie inicial de dilucin, debido
al agregado de una concentracin igual de inculo en el caldo. Se
prepara un inculo bacteriano que contenga 105 a 106 UFC/ml ajustando
la turbidez de un caldo de cultivo al estndar y diluyendo luego a 1:200
en caldo. Aadir a cada tubo 1ml del inculo ajustado. Incubar los tubos
a 35C entre 16 y 20 horas.

Lectura e interpretacin de la CIM.

La CIM corresponde a la mnima concentracin de antibitico en donde
no se observa desarrollo (turbidez). La CIM se expresa en g/ml. Luego
se debe recurrir, teniendo en cuenta el valor de CIM obtenido para esa
cepa, a las tablas para definir segn los valores de CIM que en ellas
aparecen si las cepas en estudio son sensibles o resistentes a un
determinado antibitico.

Interpretacin de los estudios de sensibilidad antibitica.

Los resultados de sensibilidad sern interpretados de acuerdo a las tablas
de la NCCLS. Se definen tres categoras: resistente, intermedio y
sensible. El resultado sensible significa que hay una alta probabilidad de
que el paciente responda al tratamiento con el antibitico testado.
 El resultado resistente implica alta chance de falla teraputica. La
categora intermedia puede tener varios significados. Con agentes que se
puede administrar a altas dosis, puede significar que se deben utilizar
altas dosis para que el tratamiento sea eficaz o que el agente puede ser
eficaz si se concentra en el sitio de infeccin. Tambin puede representar
una zona buffer que impide que cepas con sensibilidad borderline sean
categorizadas como resistentes.
Los breakpoints o puntos de quiebre son los valores de concentracin
que permiten la categorizacin en sensible, resistente o intermedio. Para
establecer el valor de estos breakpoints se utilizan cuatro fuentes:
1. La observacin de la distribucin de CIM que indica cmo se
comportan la mayora de las cepas y si hay distribuciones anormales que
pueden marcar la presencia de un mecanismo de resistencia.
2. Los parmetros farmacocinticos y farmacodinmicos que ya
mencionamos en el captulo de antibiticos.
3. La respuesta clnica y bacteriolgica a la utilizacin del antibitico en
cuestin. Se espera una tasa de respuesta favorable del 80% para que el
organismo sea clasificado como sensible.
4. Una vez se establecen los breakpoints para CIM se deben elegir los
breakpoints para la disco difusin. Esto se obtiene mediante una
regresin lineal.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Ferraro, M. J. Comit Nacional de Normas de Laboratorio Clnico. 2001.

Performance Estndares para la Prueba de Susceptibilidad Antimicrobiana;
Undcimo suplemento informativo. Vol.21, .N 1 M100-S11 NCCLS.
2. Ferraro, M.J. Comit Nacional de Estndares de Laboratorio Clnico. 2000.
Performance Estndares para pruebas de susceptibilidad de discos
antimicrobianos. Aprobado Estndar-Sptima Edicin. Vol 20, .N 1 M2-A7
NCCLS.
3. Ferraro, M.J. Comit Nacional de Estndares de Laboratorio Clnico. 2000.
Mtodos para la dilucin pruebas de susceptibilidad antimicrobiana para
bacterias que crecen aerbicamente; Aprobado Estndar-Quinto Edicin. Vol
20, N 2, M7-A5 NCCLS.