Facultad de Bioqumica, Qumica y Farmacia

Universidad Nacional de Tucumn

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

N 7 y 8

Citoqumica hematolgica
 2

CITOQUMICA-GENERALIDADES

La citoqumica hemtica contribuye a la identificacin de las clulas de la

sangre y de los rganos hematolgicos. Se considera como un nexo de unin
entre la morfologa y la bioqumica. Ayuda a confirmar el tipo celular que puede
estar sospechndose en un frotis.
Reaccin citoqumica es la reaccin que por el empleo de uno o ms
reactivos qumicos aplicados a la clula, en condiciones definidas, determina la
formacin de productos coloreados, insolubles, no difusibles; que permiten el
reconocimiento microscpico de sustancias o grupos qumicamente definidos
en su real ubicacin citolgica, por lo que no deben destruir la clula, o si lo
hacen deben reemplazar la sustancia identificada en su topografa.
Las finalidades primordiales de la citoqumica son:
a) El reconocimiento y diagnstico celular
b) El estudio de la fisiologa y fisiopatologa celulares
c) El diagnstico de la patologa
Las reacciones histoqumicas son de gran utilidad para la correcta identificacin
de las clulas de la sangre y de los rganos hematopoyticos, es decir que se
aplica para el diagnstico diferencial celular.
En la actualidad existe una gran cantidad de tcnicas citoqumicas, algunas
relacionadas con procedimientos especiales como marcacin con anticuerpos
fluorescentes o con istopos, etc., pero nosotros nos referiremos a aquellas
que tienen importancia diagnstica general.
En casos especiales, cuando la microscopa comn es insuficiente para
demostrar la localizacin del producto de reaccin, es necesario aplicar
mtodos de citoqumica ultraestructural.

Se pueden clasificar aunque en forma algo arbitraria en 7 grandes grupos:

Reacciones citoqumicas enzimticas: de las peroxidasas, de la fosfatasa
alcalina leucocitaria, fosfatasa cida leucocitaria y esterasas inespecficas y
especficas
Reacciones citoqumicas para cidos nucleicos: ADN: reaccin de Feulgen;
ARN: mtodo de extincin del azul de metileno; ADN y ARN: mtodo
combinado de Brachet y de Kurnick.
Reacciones citoqumicas para polisacridos: en especial glucgeno y
mucopolisacridos: reaccin de PAS o del cido peridico de Schiff.
Reacciones citoqumicas para protenas
Reacciones citoqumicas para lpidos: mtodo del Negro Sudn B.
Reacciones citoqumicas para reconocer hemoglobina fetal: mtodo de
Kleinhauer y Betke.
Reacciones citoqumicas para la determinacin de metales: reaccin de
Perls para hierro no hemnico.

Para realizar una reaccin citoqumica es importante tener en cuenta:

Usar siempre un frotis control, extrado y conservado en las mismas
condiciones que el frotis a investigar. El frotis control nos permite controlar si se
realiz correctamente la reaccin (deteccin de fallas en reactivos,
temperatura, conservacin de la muestra, etc).
Conservacin de los frotis. Lo ideal es someter la muestra a la reaccin
citoqumica inmediatamente despus de su extraccin, si esto no es posible,
 3

los frotis deben conservarse envueltos en papel absorbente, y en algunos

casos refrigerados a 4C.
Reactivo a emplear para la fijacin: no debe extraer ni inhibir la sustancia
a detectar.
Tiempo de fijacin: algunos fijadores pueden daar las enzimas, por lo
que es importante respetar el tiempo de fijacin, que por lo general es de
segundos.
Tiempo y temperatura de incubacin.
Recordar que si la reaccin es citoplasmtica, se debe contracolorear el
ncleo para identificar las clulas. Si la reaccin es nuclear se debe
contracolorear el citoplasma.

Muestras posibles de estudiar:

Frotis de:
sangre perifrica,
mdula sea,
improntas de tejidos (reaccin histoqumica),
clulas (procedentes de diversos lquidos biolgicos) impactadas
mediante citocentrifugacin.
Se describirn algunas de las determinaciones ms utilizadas.

CITOQUMICA DE LAS ENZIMAS

a)- MIELOPEROXIDASAS

Son especficas de la serie mieloide. La mieloperoxidasa (MPO) es una enzima

lisosmica localizada en los grnulos azurfilos de los neutrfilos y monocitos.
En la serie granuloctica dichos grnulos corresponden a los grnulos
primarios. En la serie monoctica son ms pequeos y no son los primeros en
aparecer durante la maduracin en estas clulas, por lo que la denominacin
de primarios es inapropiada. La MPO tambin puede ser demostrada en los
grnulos especficos de los eosinfilos y basfilos. En el eosinfilo los grnulos
especficos derivan de los grnulos primarios, los cuales son MPO positivos, y
esta enzima es qumica e inmunolgicamente distinta de la neutrfila.
Las peroxidasas granulocticas comprenden 2 enzimas:
a) la neutrfila: se encuentra en estos elementos y en los monocitos y basfilos
positivos, y se caracteriza por ser sensible al cianuro de potasio.
b) la eosinfila: es exclusiva de los eosinfilos y se caracteriza por ser
resistente al cianuro de potasio.
Ambas son inactivadas por el alcohol metlico.
Para diferenciarlas: se toman 2 preparados, uno de ellos se fija con etanol
absoluto y se cubre con CNK 0,04 g/dL dejar 15 min lavar con agua
destilada y luego ambos preparados se someten a la reaccin de peroxidasas:
En el 1er preparado: neutrfilos negativos y eosinfilos positivos.
En el 2 preparado: neutrfilos y eosinfilos positivos.

Fundamento de la Peroxidasa leucocitaria (Mtodo de Washburn)

Las peroxidasas son enzimas de xido-reduccin. Su mecanismo de accin
consiste en liberar oxgeno naciente del agua oxigenada:
 4

H2O2 + bencidina (sustrato) Peroxidasa H2O + O

Nitroprusiato de sodio
El oxgeno que se libera oxida la bencidina dando un compuesto azul oscuro
que luego vira a negro, apareciendo un precipitado (no difusible) en el lugar del
citoplasma en donde se ha producido la reaccin.
Para la demostracin de la MPO leucocitaria es imprescindible un catalizador
metlico. En este caso se usa el Nitroprusiato de sodio.
Hay peroxidasas leucocitarias y eritrocitarias que se pueden diferenciar por una
pequea variacin en la tcnica, ya que esta ltima es resistente a la accin del
alcohol metlico.

Reactivos
Solucin A :
Bencidina base ........................................30 mg
Sol. Saturada de Nitroprusiato de Na..........0,1 mL
Alcohol etlico absoluto o de 96...............9,9 mL
Solucin B (solucin preparada en el momento):
H2O2 20-30 vol...........................................1 gota
H2O destilada............................................10 mL
No debe usarse una concentracin mayor de agua oxigenada porque en ese
caso se produce la rpida oxidacin de la bencidina y precipita como agujas el
derivado azul.

Tcnica
-Verter sobre el preparado 10 gotas de la solucin A y dejar actuar entre 3 y 5
minutos.
Este paso tiene como finalidad fijar los elementos e impregnar con bencidina la
totalidad de las clulas.
-Sin volcar agregar 10 gotas de la solucin B, homogeneizar suavemente y
dejar actuar de 3 a 5 minutos.
En el segundo paso, en los lugares donde hay peroxidasa, la bencidina es
oxidada por el O2 liberado del H2O2, en presencia de Nitroprusiato de Na.
-Controlar, al microscopio con mnimo aumento y con objetivo a seco, el
preparado hmedo y sin lavar, para observar el desarrollo de la reaccin. Si la
reaccin es dbil, se procede a efectuar nuevamente la reaccin en el mismo
frotis.
-Lavar el portaobjetos con agua corriente y dejar secar.
-Contracolorear (realizar la coloracin de fondo) con May Grnwald-Giemsa o
Giemsa diluido 1/10. Se debe dejar que el colorante acte un tiempo ms
prolongado que lo habitual porque las soluciones anteriores hacen ms
resistentes a las clulas a tomar los colorantes.

Resultados
Se observa un patrn granular negro-parduzco citoplasmtico en las clulas
positivas.
Los elementos de la progenie granuloctica (desde promielocito hasta
neutrfilo) muestran un patrn de MPO granular intensamente positivos, siendo
la positividad del neutrfilo del 100%. El eosinfilo tambin es positivo pero de
 5

color pardo amarillento. Los basfilos, en un 50%, muestran una positividad

semejante al neutrfilo.
Los monocitos pueden ser positivos (patrn de escasos grnulos o disperso) o
negativos.
Las series eritroide, linfoide y plaquetaria dan siempre reaccin negativa.

Interpretacin
El valor principal de la reaccin de MPO es la diferenciacin entre una leucemia
mieloblstica aguda (LMA) de una leucemia linfoblstica aguda (LLA). Con
fines prcticos se puede decir que slo las clulas blsticas que muestran
positividad a la reaccin de MPO pueden ser referidas como mieloblastos.
Pero si la reaccin es negativa no excluye la leucemia mieloblstica, pues un
mieloblasto temprano con MPO negativa por microscopa ptica, puede
expresar MPO o antgenos mieloides que son detectados por citometra de flujo
usando anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos.
Si la reaccin es positiva con un patrn granular polar (casquete o copete),
en un mnimo de 3% de blastos en mdula sea, la leucemia es mieloblstica
(Figura 1).
Los bastones de Auer son ndice de una diferenciacin mieloblstica y
reaccionan positivamente a la MPO.
La deleccin parcial o total de peroxidasa en los neutrfilos tambin es
indicativa de leucemia de estirpe mieloide.
En las leucemias monocticas la reaccin de las peroxidasas suele mostrar un
patrn granular positivo dbil de tipo disperso.
La enzima MPO puede ser demostrada tambin por citoqumica ultraestructural
(microscopa electrnica) y usando anticuerpos monoclonales marcados con
fluorocromos (citometra de flujo), que tienen mayor sensibilidad que los
mtodos citoqumicos convencionales (microscopia ptica).

FIGURA 1: Blastos mieloides con reaccin positiva de mieloperoxidasa en copete y

granular disperso
 6

b)- ESTERASAS

Son enzimas encargadas de catalizar la hidrlisis de steres alifticos u

aromticos en sus componentes cidos y alcoholes.
Para demostrar su actividad el Comit Internacional de Estandarizacin en
Hematologa recomienda usar fundamentalmente los siguientes sustratos:
El cloroacetato de naftol AS-D
El alfa naftil acetato (pH 6)
El alfa naftil butirato
El naftol acetato AS-D
Dichos sustratos reconocen los tres tipos de esterasas mieloides: la esterasa
especfica de los granulocitos demostrada usando CAE; la esterasa especfica
de los monocitos, y un grupo de esterasas que son expresadas por muchas
clulas hematopoyticas llamadas esterasas comunes.
Segn el Comit de hematologa, las esterasas monocticas y comunes son
consideradas esterasas inespecficas, ya que ambas pueden reaccionar con un
mismo sustrato. Solo la granuloctica es especfica.
La Cloroacetoesterasa (CAE): es especfica de la serie granuloctica
neutrfila. Su sustrato es el Naftol AS-D Cloroacetato. Esta reaccin si bien en
especificidad corre paralela a la reaccin de la mieloperoxidasa y de Sudn
black B, es menos sensible que ambas, porque ontognicamente es posterior a
la MPO. Por lo tanto es: siempre Negativa en Leucemias linfoblsticas y
puede ser Positiva o Negativa en Leucemias mieloblsticas, dependiendo
del grado de maduracin de los mieloblastos.
Los bastones de Auer reaccionan positivamente.
La CAE es negativa en los eosinfilos en condiciones normales y en las
reacciones leucemoides eosinfilas; en cambio, en la rara leucemia LMA-M4
eosinfila, stos seran fuertemente positivos.
La lnea monoctica es negativa.

La -naftil acetatoesterasa (ANAE): detecta las esterasas monocito

especfica (EME) y esterasas comunes (ECOM); pues el -naftil acetato es
sustrato de ambas esterasas, pero no lo es de la granuloctica. Una reaccin
positiva refleja la presencia de una o de ambas esterasas.
La ANAE da distintos patrones de reaccin:
---En los monocitos, la reaccin es positiva intensa con patrn difuso y es
inhibida con NaF (reaccin floruro sensible).
---En los linfocitos T cooperadores la reaccin es positiva con patrn de
punto focal en la zona del Golgi y puede o no ser inhibida por NaF (tienen
diferente grado de resistencia).
La EME es muy sensible a la presencia de NaF y por ello se inhibe. Las ECOM
muestran grados variables de resistencia. Por lo tanto, si un blasto muestra
reaccin de ANAE (+) y es NaF resistente, se podra concluir que se trata de
ECOM. En cambio si un blasto muestra reaccin de ANAE (+) y es NaF
sensible, puede ser EME o ECOM. Estos casos problemticos se deberan
resolver usando ANBE. Pero no olvidar que el patrn de la reaccin positiva
es fundamental para interpretar los resultados. Si un blasto es ANAE (+) con
patrn difuso y adems es sensible al NaF, estamos en presencia de un
monoblasto.
 7

La -naftil butiratoesterasa (ANBE): es fuertemente positiva y NaF

sensible en los monocitos (patrn difuso), y dbil o negativa en los
granulocitos. El -Naftil butirato es el sustrato especfico para las esterasas
monoctica. Al igual que ANAE, es tambin positiva en los linfocitos T
cooperadores (patrn de punto focal). No es recomendada por el Comit
Internacional de Estandarizacin en Hematologa por la forma lquida del
sustrato (fcilmente evaporable, lo que dificulta la realizacin de la reaccin) y
por su alto costo.

La naftol AS-D acetoesterasa (NASDA): utiliza naftol AS-D acetato como

sustrato. Ya no se recomienda realizarla, pues el inconveniente que presenta
es que detecta las 3 esterasas (granuloctica, EME y ECOM) y se debe hacer
una inhibicin con NaF para darle especificidad: la esterasa monoctica es
fluoruro sensible, la granuloctica es en general resistente y las comunes tienen
un comportamiento variable frente al NaF (pueden o no ser inhibidas).

Alfa-naftol acetato esterasa (ANAE) a pH cido

Fundamento
ANAE
-naftil acetato -naftilo-PRH (compuesto color rojo-parduzco)
pararosanilina hexazotizada

La hidrlisis en medio cido del alfa naftil acetato produce dos productos de
reaccin: un grupo alfa naftilo no difusible en el citoplasma celular y un grupo
fosfato difusible. El producto no difusible es conjugado con un azo colorante
(pararosanilina hexazotizada) dando una reaccin de color rojo-parduzco en el
interior de la clula, proporcional al contenido enzimtico.

Reactivos
a) Fijador
1-Acetona pursima al 60% en agua enfriada a una temperatura de 0-5C.
2-Vapores de formol (optativos)
b) Sustrato revelador
1-Clorhidrato de pararosanilina al 4% en HCl 2N
2-Nitrito de sodio al 4% en agua destilada (de reciente preparacin)
3-Etilenglicol monometilter
4-Buffer de fosfatos M/15 a pH 7,6

Reactivo de trabajo
Solucin A: Etilenglicol monometilter..............................................0,5 mL
Alfa naftil acetato..............................................................4 mg
Solucin B: Clorhidrato de pararosanilina al 4% en HCl 2N..............0,3 mL
Nitrito de sodio al 4%.....................................................0,3 mL
Esperar 1 minuto y agregar:
Buffer de fosfatos pH 7,6................................................8,9 mL
Mezclar las soluciones A y B y filtrar. Ajustar a pH 6 con NaOH 0,1 N.

Tcnica
-Fijar los preparados durante 30 segundos con acetona 60% enfriada a 0-5C
5 minutos en vapores de formol.
 8

-Lavar rpido y dejar secar.

-Incubar 45 minutos con el sustrato revelador a 37C, en cmara hmeda.
-Lavar y secar.
-Contracolorear con verde de metilo o hemalumbre de Mayer durante 10
minutos.
-Lavar y secar en posicin vertical. Observar con inmersin.
Resultados
Reaccin positiva: se observa un patrn citoplasmtico granular o difuso rojo-
parduzco en las clulas positivas y los ncleos teidos de color verde.
La reaccin es positiva en los linfocitos T cooperadores (patrn granular
o punto focal) y en los monocitos (patrn difuso).

Inhibicin con Fluoruro de Sodio

Luego de la fijacin se tratan los preparados con Fluoruro de Sodio disuelto
en Buffer Fosfatos pH 6,4 en la proporcin 1,5 mg/mL. Incubar a 37C durante
30 minutos. Luego se procede con la tcnica anterior.
Resultados: La reaccin se inhibe en los monocitos. En los linfocitos la
reaccin puede o no inhibirse.

Interpretacin
La ANAE es empleada frecuentemente para el estudio de clulas leucmicas.
En las muestras normales ayuda a distinguir los linfocitos T y los monocitos,
debido al diferente patrn de reaccin y a la diferente sensibilidad al NaF.
En las leucemias y sndromes linfoproliferativos tiene 3 aplicaciones
principales:
1- En las LMA facilita el diagnstico de la leucemia monoctica (LMA-M5),
cuyas clulas dan una fuerte reaccin positiva difusa sensible al NaF. En la
eritroleucemia (LMA-M6) y en la leucemia megacarioblstica (LMA-M7), los
blastos dan una reaccin positiva con patrn de punto focal en la zona del
Golgi y sensible al NaF. Si se realiza ANBE, la reaccin en M6 y M7 es
negativa o positiva muy dbil, mientras que en M5 es positiva intensa difusa.
2- En las LLA, junto a la fosfatasa cida, ayuda a identificar las LLA-T.
3- En las leucemias linfoides crnicas, ayuda a distinguir la leucemia
prolinfoctica T (LLP-T, reaccin positiva fuerte) de la LLP-B (reaccin
negativa). Sin embargo, el tpico patrn de punto focal no es observado en
las leucemias de linfocitos granulares grandes de clulas T (LGL). Este
hallazgo se verifica tambin en los linfocitos grandes granulares normales
(linfocitos T citotxicos/supresores CD8 +).
Nota: normalmente los eritroblastos son ANAE negativos. Sin embargo, ellos
pueden reaccionar en la anemia megaloblstica, y tambin se han descripto
reacciones dbiles en talasemias y anemia sideroblstica.

c)- FOSFATASA ALCALINA LEUCOCITARIA O GRANULOCTICA

La fosfatasa alcalina (FA) es una fosfomonoesterasa que es activa a pH

francamente alcalino. Acta sobre steres fosforados liberando el in fosfato
como in especfico. Como este in es muy difusible, no conserva su
ubicacin citoplasmtica y difunde hacia el ncleo, razn por la cual se deben
emplear sustratos como el alfa-naftil fosfato cido de sodio, cuyo in
 9

inespecfico, liberado por escisin de la molcula por accin de la fosfatasa,

no es difusible y puede ser revelado in situ. La actividad de la FA granuloctica
es marcadora de la granulacin especfica de los neutrfilos.
Inicialmente se pens que la FA estaba localizada en los grnulos especficos
(secundarios), pero se demostr que est asociada con un componente
membranoso del citoplasma identificado como una estructura tubular de forma
irregular distinta de los grnulos primarios o secundarios y otras organelas
citoplasmticas.

Fundamento del mtodo de Menten-Kaplow

La fosfatasa de los granulocitos en medio alcalino desdobla el alfa-naftil fosfato
cido de sodio en dos iones: naftilo (in inespecfico) y fosfato (in especfico).
El grupo naftilo liberado se copula con un colorante diazoico, el azul rpido RR,
formando un compuesto diazotado que precipita en el sitio de accin de la
enzima.

Reactivos
Solucin fijadora:
Formol al 40%...............................................10 mL
Metanol absoluto...........................................90 mL
Conservar a 0C.
Solucin de veronal:
Veronal sdico 6%. Controlar el pH que debe ser entre 9 y 10.
Solucin sustrato:
Alfa-naftil fosfato cido de Na........................5 mg
Fast Blue .....................................................5 mg
Solucin de veronal sdico pH 9.....................6 mL
Filtrar y usar inmediatamente.
El alfa-naftil fosfato cido de sodio debe ser de color blanco, cuando se oxida
toma color rosado y debe purificarse.
Solucin acuosa de verde de metilo:
Verde de metilo 2,5 % (purificado)
Purificacin: el verde de metilo se oxida rpidamente al aire a violeta de metilo
perdiendo su especificidad por el ncleo. Por este motivo es necesario
purificarlo. La purificacin se basa en que el verde de metilo es hidrosoluble y
el violeta de metilo no, siendo en cambio soluble en cloroformo.
Disolviendo verde de metilo en agua destilada y agregando igual volumen de
cloroformo, al agitar este ltimo extrae el violeta de metilo y al decantar lo
arrastra al fondo del frasco. El cloroformo sedimenta en el fondo y la solucin
acuosa sobrenadante est constituida por verde de metilo purificado.

Muestra
Efectuar la reaccin en frotis de no ms de 24 horas de obtenidos. Se pueden
conservar los preparados secos y envueltos en papel absorbente (de filtro o
higinico) hasta un mes en heladera con un desecador. Siempre se debe
procesar en paralelo un frotis control conservado en idnticas condiciones al
frotis problema.

Tcnica
 10

-Colocar un borrel con la solucin fijadora en la heladera hasta temperatura

entre 0 y 5 C.
-Sumergir los extendidos de sangre en la solucin fijadora durante 30
segundos.
-Lavar con agua destilada.
-Incubar en la solucin sustrato durante 15 minutos exactos a 37 C.
-Lavar con agua destilada y efectuar una coloracin nuclear de fondo con verde
de metilo durante 5 minutos.
Nota: El precipitado es liposoluble por lo que cuando se lo observa con aceite
ste quita algo de la intensidad de la coloracin

Resultados
Se observa un patrn citoplasmtico difuso o granular que vara desde el
grisceo al negro-parduzco intenso en las clulas positivas y los ncleos
teidos de color verde (Figura 2).
La reaccin es positiva nicamente en los granulocitos neutrfilos en cayado y
segmentados; y excepcionalmente en metamielocitos.
No todos los neutrfilos presentan el mismo grado de positividad, por ello, para
evaluar los resultados se practica una scorificacin o puntaje de acuerdo con el
siguiente criterio:
Grado 0: Sin reaccin. Citoplasma amarillento (igual que los hemates).
Grado I: Citoplasma grisceo difuso (homogneo sin grnulos).
Grado II: Citoplasma grisceo ms oscuro, a veces con escasos grnulos
Grado III: Precipitado granuloso negro, dejando ver zonas grisceas entre l.
Grado IV: Citoplasma totalmente cubierto de grnulos negros.

FIGURA 2: Resultado de la reaccin fosfatasa alcalina leucocitaria

 11

Score o ndice de actividad del frotis: es la suma de los grados de

positividad de 100 neutrfilos. Para determinarlo debe observarse 100
neutrfilos en un frotis y establecer el grado de positividad de cada uno de
ellos. El nmero de neutrfilos correspondiente a cada grado se multiplica por
el coeficiente respectivo, por ejemplo:

Neutrfilos
Grado Coeficiente
contados
0 30 X 0 = 0
I 25 X 1 = 25
II 30 X 2 = 60
III 10 X 3 = 30
IV 5 X 4 = 20
Total: 100 Score: 135

Valores de referencia
Score: 95 20 (lmites extremos normales: 26 a 169).
Los recin nacidos, los nios y las mujeres embarazadas tienen valores
elevados y las mujeres premenopusicas tienen valores que son un tercio
superiores a los de los hombres. En el recin nacido el rango es de 150-300.

Interpretacin
Se encuentran puntajes altos en las neutrofilias secundarias a infecciones o
neoplasias, en las reacciones leucemoides, cirrosis heptica y sndrome de
Down. La enzima parece ser influenciada por los estrgenos y
corticoesteroides, los cuales podran explicar el gradual aumento que sufre el
score durante el embarazo. Tambin est aumentada en la policitemia vera
(pero normal en poliglobulias secundarias no complicadas), en enfermedad de
Hodgkin, crisis blsticas terminales de la leucemia granuloctica crnica, infarto
de miocardio, sndrome de Cushing.
Se encuentran puntajes disminuidos en el sndrome de Addison, lupus
eritematoso diseminado (LES), a veces en la Hemoglobinuria Paroxstica
Nocturna (HPN), leucemias mieloblsticas, en algunas anemias sideroblsticas
y en eritroleucemias.

Esta reaccin presenta el mximo inters para diferenciar:

Leucemias Mieloides Crnicas (LMC) valores bajos o nulos, de

Reacciones Leucemoides valores aumentados

Con el uso de las tcnicas citogenticas y de biologa molecular para confirmar

el diagnstico de la LMC, la valoracin de la FA es mucho menos necesaria.

d)- FOSFATASA CIDA LEUCOCITARIA

Se trata tambin de una fosfomonoesterasa con un pH ptimo de accin que

oscila entre 4,7 y 5,0. Se utiliza el mtodo de Loeffler modificado. La actividad
de fosfatasa cida est presente en los lisosomas de muchos tipos de clulas
hemopoyticas, como los mielocitos, polimorfonucleares neutrfilos, linfocitos,
 12

clulas plasmticas, megacariocitos, plaquetas y todas las clulas del sistema

mononuclear fagoctico (monoblastos, promonocitos, monocitos y macrfagos).

Mtodo de Loeffler modificado:

Fundamento
Es el mismo que para la alcalina, pero a pH cido. Emplea como sustrato el
alfa naftil fosfato cido de sodio disuelto en un tampn de citrato a pH 4,9 y
como colorante diazoico se usa el Fast Garnett GBC o granate fijo, ya que el
Fast Blue RR da un tipo de grnulos excesivamente groseros a pH cido.

Resultados
La reaccin positiva se revela por la presencia de granulaciones de color rojo-
parduzco esparcidos en todo el citoplasma.
La reaccin es positiva en todos los elementos figurados de la sangre, incluidas
las plaquetas, con excepcin de los eritrocitos. De los granulocitos, el eosinfilo
es el ms intensamente positivo.
Los linfocitos T revelan una elevada positividad; en cambio en los linfocitos B
la reaccin est francamente disminuida o es negativa. Los monocitos
muestran la positividad intensa.
En los linfocitos vellosos la fosfatasa cida es intensamente positiva (++++) y
es tartrato resistente. Estos linfocitos se observan en la leucemia a linfocitos
vellosos o tricoleucemia.

Interpretacin
La reaccin de la fosfatasa cida es de alto valor para diferenciar una poblacin
linfoctica T en la cual la positividad est aumentada, de una B en la cual est
francamente disminuida. As, la mayora de los linfoproliferativos de origen T
agudos y crnicos se caracterizan por una fuerte reaccin de la fosfatasa cida.
En los desrdenes de origen B, la reaccin es frecuentemente dbil o negativa
con excepcin de la tricoleucemia, cuyas clulas son fuertemente positivas y
resistentes a la inhibicin por tartrato. Esta enzima corresponde a la isoenzima
5 encontrada en los tricoleucocitos.
Las clulas de Baccareda-Szary dan una reaccin intensamente positiva.

FOSFATASA CIDA TARTRATO RESISTENTE.

Consiste en agregar a la solucin de sustrato revelador cido-l-tartrico en la
proporcin de 5 mg/mL. La reaccin en este caso es inhibida en todos los
elementos menos en los tricoleucocitos.

e)--GLUCURONIDASA

Es una enzima lisosmica que forma parte de la granulacin A de Bagglioni

cuando los lisosomas confluyen para formarla. En caso contrario permanece
distribuida en el citoplasma con los lisosomas. Ha sido observada en paralelo
con la fosfatasa cida, con excepcin de los tricoleucocitos en los que la
fosfatasa cida est aumentada y la -glucuronidasa disminuida.
 13

La enzima est presente en todos los tipos leucocitarios y en la serie roja salvo
los eritrocitos.

Fundamento
-glucuronidasa
Naftol AS-BI -D glucurnido Naftol AS-BI-HPR (complejo
Pararosanilina
hexazotizada cromognico insoluble Rojo)

Resultados
Una reaccin positiva se observa como un patrn focal o granular difuso de
color rojo.
La coloracin positiva se asocia a timocitos maduros, linfocitos T
circulantes y una subpoblacin de linfocitos B inmaduros.
Los monocitos y granulocitos usualmente son negativos.

CITOQUMICA PARA HIDRATOS DE CARBONO

a)- REACCION DE P.A.S. (cido Peridico de Schiff)

Fundamento
Por oxidacin con cido peridico, el glucgeno y la porcin hidrocarbonada de
los mucopolisacridos liberan grupos aldehdos que reaccionan con el
reactivo de Schiff o fucsina decolorada formando un compuesto de color
rojo magenta. La estructura atacada es el grupo 1-2 glicol y derivados. En el
ADN el glicol est unido al dister fosfrico, unin que resiste la accin del
cido peridico, por lo que hay que usar HCl a 60C para exponer los grupos
aldehdos.

Reactivos
Alcohol metlico absoluto
Solucin de cido peridico
cido peridico............................................800 mg
Acetato de sodio (3 H2O) al 2,7 %.................10 mL
Agua destilada..............................................90 mL
Solucin reductora
Hiposulfito de sodio.......................................3 g
Ioduro de potasio..........................................3 g
Agua destilada............................................60 mL
Agregar alcohol de 96............................ ...90 mL
Acido clorhdrico N.......................................3 mL
Reactivo de Schiff
-Disolver en caliente (100C durante 5 minutos) 1 g de fucsina bsica (puede
usarse fucsina diamante, Merck, magenta, de Grbler y parafucsina) en 200 mL
de agua destilada. Tener en cuenta que la reaccin puede producir bastante
espuma y proyectarse, por lo que se aconseja trabajar con matraz de mayor
volumen.
-Agregar 5 g de carbn activado en caliente.
-Agitar y filtrar.
-Enfriar a 50C y agregar 20 mL de cido clorhdrico N.
 14

-Enfriar a 25C y agregar 1 g de metabisulfito de sodio seco p.a.

-Trasvasar a un frasco color caramelo y conservar en heladera en la oscuridad.
El reactivo tarda 24-48 horas para decolorarse. Debe resultar incoloro o
ligeramente amarillo pero no rosado.
Solucin sulfurosa
Metabisulfito de sodio al 10 %............................5 mL
cido clorhdrico N.............................................5 mL
Agua destilada................................................100 mL
Solucin de Verde de Metilo al 2,5 %

Tcnica
-Fijar los extendidos con alcohol metlico absoluto durante 3 a 5 minutos (No se
pueden usar fijadores hdricos porque extraen las sustancias a demostrar).
Tambin se puede usar una doble fijacin: 3 minutos en alcohol metlico
absoluto y luego con vapores de formol 10 minutos. Para este ltimo paso se
debe colocar en un recipiente con tapa, un trozo de algodn al que se le agrega
formol. Se coloca a 37C para desprender los vapores. Recin entonces
colocar verticalmente los preparados. Conservarlo tapado.
-Lavar con agua destilada.
-Colocarlos en la solucin de cido peridico durante 5 minutos exactos,
superado este tiempo se destruyen los aldehdos liberados.
-Lavar con agua destilada.
-Volcar y cubrir con el reductor exactamente 1 minuto.
-Lavar con agua destilada, escurrir y secar el dorso.
-Sumergir el preparado en el reactivo de Schiff durante 1 hora en la oscuridad.
-Escurrir y pasar a la solucin sulfurosa durante 3 a 5 minutos cambiando la
solucin 2 3 veces hasta que del preparado no ceda ms color.
-Enjuagar con agua destilada.
-Efectuar coloracin de contraste con solucin de Verde de Metilo al 2,5 %
durante 5-10 minutos.
-Lavar muy rpido con agua corriente, (el verde de metilo es hidrosoluble) dejar
secar y observar con inmersin.

Resultados
Clulas positivas con patrn citoplasmtico difuso, granular o en bloque de
acuerdo a la progenie, de color fucsia intenso.
- La serie granuloctica normal es positiva con patrn difuso, intensificndose la
reaccin con la madurez celular (Figura 3). El eosinfilo presenta una
positividad intergranular intensa por su abundante contenido de glucgeno. El
basfilo es PAS positivo en grnulos gruesos o negativo dependiendo del
grado de sulfatacin (heparina mono o polisulfatada). La heparina
monosulfatada le confiere la positividad en forma de grnulos groseros; la
heparina polisulfatada es PAS negativa.
- La progenie eritroide normal es negativa.
- La progenie monoctica es positiva con patrn en grnulos sobre un fondo
difuso.
- La progenie linfoctica normal es negativa en sus formas inmaduras. El
linfocito en un 70% aproximadamente es negativo y el resto tiene diferentes
grados de positividad con patrn granular (coronas de grnulos) y
excepcionalmente con patrn difuso.
 15

- Los megacariocitos presentan una PAS positividad en bloques o granular,

siendo ms intensa en el rea perinuclear. Las plaquetas son intensamente
positivas con patrn en grnulos sobre un fondo difuso. Existe un paralelismo
entre la actividad funcional de los megacariocitos y el contenido de glucgeno.

FIGURA 3: Reaccin de PAS positiva en un polimorfonuclear neutrfilo y en una

macroplaqueta

Interpretacin
Segn Dacie, los linfoblastos pueden dar una reaccin PAS positiva en
bloques o mazacotes. Esta reaccin es tpica de la LLA tipo comn de la
infancia. Sin embargo la reaccin de PAS no es recomendada para la
clasificacin de leucemias agudas ya que las leucemias monocticas dan
algunas veces PAS positividad en bloque en algunos monoblastos.
En algunas patologas la progenie eritroide se torna PAS-glucgeno-
dependiente positiva, como en los eritroblastos de la Eritroleucemia (LMA-M6)
que presentan una coloracin PAS difusa intensa o en bloques; y tambin en
las talasemias mayor y menor. Excepcionalmente los eritroblastos en las
anemias ferropnica, megaloblstica y sideroblstica pueden presentar una
reaccin PAS positiva difusa dbil.

NOTA:
Para la identificacin de la naturaleza de la PAS positividad se pueden emplear
tcnicas de inhibicin:
- Considerando que la amilasa salival degrada el glucgeno, se puede usar
saliva como fuente enzimtica para la inhibicin.
- Los mucopolisacridos PAS positivos pueden ser degradados con
hialuronidasa.

b)- METACROMASIA
 16

La coloracin metacromtica es aquella que tie selectivamente determinadas

estructuras de un color distinto al del colorante.
La metacromasia se produce utilizando colorantes bsicos derivados de las
tiazinas como ser azul de metileno, tionina y azul de toluidina. El ms usado
para su reconocimiento es el azul de toluidina.
Este fenmeno se produce en las sustancias que contienen en su superficie
cargas electronegativas cidas en una concentracin mnima que atraigan a los
grupos polares de las molculas del colorante, las cuales quedan prximas
entre s, polimerizndose.
Las verdaderas metacromasias son las designadas -metacromasia (violcea)
alcohol lbil y la -metacromasia (roja) alcohol resistente.
La llamada metacromasia no es tal porque es un monmero del colorante.
Los mucopolisacridos cidos sulfatados son los nicos que dan la
metacromasia fuertemente alcohol resistente, de modo que es
prcticamente diagnstica granulaciones de los basfilos y mastocitos.

Reconocimiento de la Metacromasia con Azul de Toluidina

Reactivos
Solucin fijadora (fijador de Motta)
Subacetato de plomo...........................1 g
Alcohol etlico 96.................................50 mL
Agua destilada......................................50 mL
cido actico glacial.............................0,5 mL
Solucin acuosa de azul de toluidina al 0,5 %

Tcnica
- Fijar las extensiones de sangre o de mdula sea con el lquido de Mota
durante 30 minutos.
- Lavar con agua destilada.
- Colorear con la solucin de azul de toluidina durante 1 hora.
- Escurrir y lavar con agua destilada.
- Secar y observar.
Resultados
Los ncleos se tien de azul.
Las granulaciones de los basfilos y de los mastocitos se tien de rojo.
Las granulaciones de los neutrfilos se tien de violeta.
Las granulaciones eosinfilas no se colorean.

CITOQUMICA PARA LPIDOS

MTODO DEL NEGRO SUDN B

Se basa en el empleo de un colorante liposoluble, el Negro Sudn B, en

solucin hidroalcohlica. Este colorante, al ponerse en contacto con los lpidos
de las clulas, por su mayor afinidad, abandona la solucin pasando a
aquellos, que se ponen en evidencia como granulaciones sudanfilas.
La tincin de las grasas comunes obedece simplemente al fenmeno fsico de
difusin en un mejor solvente mientras que para las grasas leucocitarias se
 17

necesitara adems el blanco de la peroxidasa sobre el que actuara el Sudn

Black por mecanismo qumico.
Toda la serie granuloctica es profundamente sudanfila y peroxidasa positivas,
mientras que los linfocitos son por completo negativos para ambas reacciones,
a pesar de que contienen lpidos similares. Parecera que al estar ausente la
peroxidasa en la serie linfoctica le faltara el blanco para revelarse a la
sudanoflia.

Resultados
Las granulaciones sudanfilas se tien de color negro intenso.
Hay una estrecha relacin con la reaccin de peroxidasa.
Serie granuloctica (neutrfilos y eosinfilos): positiva (citoplasma totalmente
cubierto de grnulos)
Monocitos: positiva dbil en grnulos dispersos
Basfilos y mieloblastos: positiva en un 40%
Serie linfoctica: negativa

HIERRO NO HEMNICO: Mtodo de Perls

Esta reaccin se emplea para la determinacin de hierro hemosidernico (no

hemnico).
Los siderocitos son eritrocitos que contienen grnulos de hierro no hemnico,
los cuales estn formados por un complejo de hierro frrico, lpido, protena y
carbohidrato llamado hemosiderina que es insoluble en agua. Por el contrario,
la ferritina, es un compuesto no hemnico hidrosoluble formado por hierro y
apoferritina (protena), que no es detectable por la reaccin de Perls.
Normalmente la ferritina est presente en todas las clulas del cuerpo mientras
que la hemosiderina se encuentra principalmente en las clulas monocito-
macrfago de la mdula sea, hgado (clulas de Kuppfer) y bazo.
El hierro es transportado en el plasma unido a una beta globulina, la
transferrina, y pasa selectivamente a la mdula sea donde, en la superficie del
eritroblasto, es liberado y entra a la clula. All la mayora del hierro es
convertido en hem en la mitocondria, y el residuo no hemnico queda en la
forma de ferritina. Algo de ferritina es degradada y se transforma en
hemosiderina que puede ser coloreada por la reaccin de Perls.

Fundamento
El Fe+++ no hemnico reacciona con ferrocianuro de potasio en solucin
clorhdrica, dando ferrocianuro frrico o Azul de Prusia.

Reactivos
* Alcohol metlico absoluto
* Ferrocianuro de potasio al 2 %
* cido clorhdrico al 2 % (Exento de hierro)
* Agua bicarbonatada
Solucin de bicarbonato de sodio pH 7,5 - 8
* Safranina al 0,5 %
Safranina................................0,5 g
Agua bicarbonatada..............100 mL
 18

El pH debe oscilar entre 7,5 y 8 para evitar que se disuelva el precipitado de

azul de Prusia.

Tcnica
- Los portaobjetos y todo el material a emplear deben ser lavados con HCl al
10%, durante un mnimo de 6 hs, para eliminar toda traza de hierro y quedar
reservados para efectuar esta reaccin.
- Fijar los extendidos con alcohol metlico durante 3 minutos.
- Lavar con agua destilada 2 3 veces.
- Cubrir con una mezcla en partes iguales de ferrocianuro de potasio y cido
clorhdrico al 5 % durante 30 minutos, cambiando el reactivo y volvindolo a
dejar otros 30 minutos. Puede colocarse a 37C.
- Variante: preparar una solucin de ferrocianuro de potasio al 2% en cido
clorhdrico directamente y dejar actuar durante 2 horas sin cambiar la solucin.
- Lavar los extendidos con agua bicarbonatada, cubrirlos y dejarlos unos
minutos.
- Escurrirlos y sin lavar agregar solucin de safranina como colorante de fondo.
Dejar actuar durante 3 a 5 minutos.
- Lavar y secar.

Resultados
Se observan grnulos azules de hierro no hemnico en eritroblastos (si rodean
al ncleo se denomina en anillo).
Los siderocitos contienen 1 2 (raramente muchos) grnulos pequeos. En
sangre perifrica se observa normalmente hasta un 0,5 % de siderocitos, o sea
que normalmente no son vistos en la misma.
En condiciones normales, en la mdula sea puede haber hasta un 30-40 % de
sideroblastos (eritroblastos con 1 a 4 grnulos muy pequeos).
El porcentaje de sideroblastos est aumentado en las anemias hemolticas y
megaloblsticas, en la hemocromatosis y hemosiderosis, proporcionalmente al
grado de saturacin de la transferrina, es decir del hierro disponible.
Un aumento desproporcionado en el nmero de sideroblastos ocurre cuando
est afectada la sntesis de hemoglobina, en cuyo caso los grnulos son ms
numerosos y ms grandes que lo normal.
Cuando hay un defecto en la sntesis del hem, los grnulos se depositan en la
mitocondria y frecuentemente se disponen como un collar alrededor del ncleo,
dando los sideroblastos en anillo caractersticos de las anemias
sideroblsticas y de los sndromes mielodisplsicos (anemia refractaria y
citopenia refractaria con sideroblastos en anillo).
En contraste, la distribucin de los grnulos dentro de la clula tiende a ser
normal cuando est afectada slo la sntesis de globina como en las talasemias
o cuando hay una sobrecarga de hierro.
La cantidad de hemosiderina est aumentada en pacientes con grandes
depsitos de hierro y reducida o ausente en las anemias ferropnicas. En las
infecciones los depsitos de hierro podran estar aumentados, con mucho
material sidertico en los macrfagos pero poco o no visible en los eritroblastos
(anemias de los trastornos crnicos).
 19

DEMOSTRACIN DE HEMOSIDERINA EN ORINA

Si la hemosiderina estuviera presente, aparece en la forma de grnulos de
color azul aislados o agrupados, usualmente de un tamao de 1-3 m (Figura
4).

Interpretacin
La hemosiderinuria es consecuencia de la presencia de hemoglobina en el
filtrado glomerular. Es un valioso signo de hemlisis intravascular crnica,
especialmente en los casos en que no hay hemoglobinuria simultneamente.
Sin embargo, la hemosiderinuria es negativa al comienzo del ataque
hemoltico, an si va acompaado de hemoglobinemia y hemoglobinuria, ya
que la hemoglobina debe ser primero absorbida por las clulas de los tbulos
renales. La ruptura intracelular de la hemoglobina libera hierro el cual es luego
reexcretado. La hemosiderinuria podra persistir por varias semanas despus
del episodio hemoltico.

FIGURA 4: Reaccin de Perls en orina intensamente positiva

CITOQUMICA PARA HEMOGLOBINA FETAL

Mtodo de Kleinhauer y Betke:

Fundamento
La demostracin citoqumica de la Hemoglobina fetal (HbF), se basa en que los
eritrocitos que contienen HbF, sometidos a una solucin tamponada cida,
resisten a este tratamiento y se tien posteriormente con eritrosina en forma
intensa. En cambio, los glbulos rojos que contienen HbA aparecen como
sombras, muy levemente coloreados, puesto que esta Hb se eluye.

NOTA: es necesario procesar 2 frotis control: uno de sangre de cordn (control

positivo) y otro de un adulto normal (control negativo).

Resultados
Se observan eritrocitos con HbF en los extendidos de sangre de mujeres
embarazadas, a partir del 5 mes, aunque en muy pequea cantidad. En la
 20

sangre de cordn umbilical y en los recin nacidos se encuentra en proporcin

muy elevada (60-96%). Despus del nacimiento desciende bruscamente y al
cabo del 6 mes no alcanzan al 10%. Hasta los 10 aos pueden encontrarse
cifras inferiores al 2%, para desaparecer despus o no sobrepasar dicho valor.

Interpretacin
Patolgicamente puede hallarse un porcentaje alto de eritrocitos con HbF en la
talasemia mayor (20-90%), mientras que en la talasemia menor slo se tien
del 2-5%.
En la anemia drepanoctica los eritrocitos con HbF pueden variar del 1 al
30%, segn la gravedad de la enfermedad.
En la anemia perniciosa genuina sin tratamiento es variable y en la
microesferocitosis hereditaria es de 0,5-7%.
En la persistencia hereditaria de hemoglobina fetal (PHHF), de origen
africano, hay una sntesis casi nula de cadenas y los individuos afectados
tienen una tasa muy elevada de HbF, alcanzando el 100% en los homocigotos
y del 20-30% en los heterocigotos, siendo el resto HbA y HbA 2. No hay ningn
trastorno clnico en estos individuos por lo general de raza negra.
El estudio citoqumico es til para diferenciar una -talasemia heterocigota de
una PHHF, ya que en este ltimo caso hay una distribucin homognea de la
HbF en los eritrocitos (distribucin pancelular); en cambio en la -talasemia
heterocigoto, la HbF se reparte muy irregularmente en los glbulos rojos
(distribucin heterocelular).
Los aumentos adquiridos de HbF se pueden dividir en dos grupos:
1) Trastornos de la serie roja como la anemia megaloblstica, sideroblsticas
adquiridas, hemolticas y aplsicas.
2) Trastornos de la serie blanca como leucemias agudas, crnicas y
eritroleucemia.
La causa en estas ltimas es poco conocida pero se cree que se debe a una
mutacin neoplsica de los genes reguladores de la sntesis de hemoglobina.

BIBLIOGRAFA

Bain Barbara. Leukaemia diagnosis. 4th edition. 2010.

Dacie and Lewis Practical haematology. 11th edition. 2011.
Vives Corrons Joan y Aguilar Bascompte Josep. Manual de tcnicas de
laboratorio en hematologa. 3 edicin. Masson S.A. 2006.
Grignaschi. Diagnstico citolgico de las hemopatas. Editorial Mdica
Panamericana, S.A. 1991.
Osorio Sols Guido. Hematologa. Tcnicas y procedimientos de laboratorio.
Publicaciones tcnicas Mediterrneo Ltda. 1996.
Iglesias Edgardo. Citoqumica hematolgica. Facultad de Bioqumica, Qumica
y Farmacia. UNT. 1984.