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PROYECTO DE INVESTIGACIN
INGENIERO FARMACUTICO
PRESENTA:
EVALUADOR
EVALUADOR
SUBDIRECCIN ACADMICA
COMISIN DE EVALUACIN
Mxico D.F, a 19 de Febrero del 2015
a
Autorizacin de uso de obra
Atentamente
b
AGRADECIMIENTOS
c
DEDICATORIAS
d
EVALUACIN FITOQUMICA Y PROPIEDADES NUTRACUTICAS DE Portulaca oleracea Y
Achillea millefolium.
% de inhibicin
defensiva e inespecfica del organismo (Tortora; Derrickson, 2002).
Hoy en da se hace la administracin de medicamentos anti- 40
inflamatorios no esteroideos (AINE`s) pero despus de una 30
administracin prolongada o dosis elevadas causan daos en el
tracto gastrointestinal, es por ello que el uso de fitofrmacos 20
provenientes de plantas medicinales ya que no causan estos daos. 10
Metodologa. Tamiz fitoqumico. Se obtiene las plantas
posteriormente se someten a un proceso de secado a 40C, 0
despus se hace la extraccin con 25 mL de ter de petrleo y TP HP HA FA FP I
metanol-agua. Actividad anti-inflamatoria por el mtodo de edema
inducido por aceite de crotn. Se obtienen extractos cetnicos del Figura 1. Representacin grfica del porciento de inhibicin de la
tallo, hoja y flor de Portulaca oleracea y hoja y flor de Achillea inflamacin donde (TP) tallo de Portulaca, (HP) hoja de Portulaca,
millefolium, se administran los extractos va oral a ratones CD1; (HA) hoja de Achillea, (FA) flor de Achillea, (FP) flor Portulaca e (I)
transcurrida una hora se induce el edema con una solucin de aceite Indometacina.
de croton al 5%; 3 hora despus de la induccin se sacrifica a los
ratones obteniendo discos auriculares y mediante ecuaciones se Cuadro 1. Porcientos de actividad antioxidante (%AAO) de extractos
determina el % de inhibicin de la inflamacin. La determinacin del cetnicos de Achillea millefolium y Portulaca oleracea.
porciento de actividad antioxidante se realiza mediante el mtodo del ABTS
2,2-Azinobis-3 Etilbenzotiazolin-6-cido Sulfnico (ABTS) para ello Extracto
se toma en un tubo de ensaye 980L del radical ABTS con %AAO
absorbancia de 0.7 (0.01) y 20L de la muestra, se agita con
vortex y se mide su absorbancia a longitud de 754nm. Hoja de Achillea millefolium 62.4520.685
Resultados y discusin. En la prueba de tamiz fitoqumico se Flor de Achillea millefolium 38.0760.735
obtuvo que la planta de Achillea millefolium y Portulaca oleracea
dieron positivo a presencia de Alcaloides, flavonoides, azcares Hoja de Portulaca oleracea 13.4360.133
reductores, saponinas, taninos, cumarinas, glicsidos cardiacos y Tallo de Portulaca oleracea 15.9910.177
esteroides. Los resultados de la actividad anti-inflamatoria se
muestran en la figura 1 en la cual se observa que la flor de Achillea Flor de Portulaca oleracea 8.5150.049
millefolium presento el mayor porciento de inhibicin de 64 .61%
mientras que la flor de Portulaca oleracea tuvo el menor Conclusiones y perspectivas. Los extractos cetnicos de ambas
porcentaje36.49%, pero de manera general todos los extractos plantas de estudio presentaron una buena actividad anti-inflamatoria
tienen efecto antiinflamatorio comparado con el frmaco comparada con Indometacina y de igual manera poseen
(Indometacina). En la determinacin de la capacidad antioxidante los propiedades antioxidantes debido a los compuestos fenlicos que
mejores resultados fueron hoja de Achillea millefolium con un poseen. Los flavonoides estn relacionados con la actividad anti-
62.45% y tallo de Portulaca oleracea con 15.99% esto quiere decir inflamatoria y estas plantas presentan cantidades significativas.
que tienen la funcin de estabilizar radicales libres y evitar daos Referencias.
celulares. 1. Santamara, L. (2011). Evaluacin de la actividad
antiinflamatoria de los extractos de verdolaga (Portulaca
oleracea) en ratas (Rattus Novergicus) con edema
inducido con carragenina. Escuela Superior Politcnica de
Chimborazo.
2. Tortora, G. J.; Grabowski, S.R. (2002). Principios de
Anatoma y Fisiologa. Mxico. Editorial OXFORD
UNIVERSITY PRESS.
e
NDICE GENERAL
CAPTULO I ............................................................................................................ 1
1.1 INTRODUCCIN ........................................................................................... 1
1.2 PROBLEMATIZACIN .................................................................................. 2
1.3 JUSTIFICACIN ............................................................................................ 4
1.4 OBJETIVOS ................................................................................................... 5
General ............................................................................................................. 5
Especficos ....................................................................................................... 5
1.5 HIPTESIS .................................................................................................... 6
1.6 ALCANCE ...................................................................................................... 6
CAPTULO II. ANTECEDENTES ............................................................................ 7
2.1 Portulaca oleracea (verdolaga) ...................................................................... 7
2.2 Achillea millefolium (milenrama)................................................................... 10
CAPTULO III. REVISIN LITERARIA .................................................................. 13
3.1 Tamz fitoqumico ......................................................................................... 13
a) Definicin de tamz fitoqumico (anlisis fitoqumico) ................................. 13
b) Preparacin de la muestra.......................................................................... 13
3.2 Evaluacin de la actividad antiinflamatoria .................................................. 14
a) Inflamacin ................................................................................................. 14
b) Mediadores qumicos de la inflamacin ...................................................... 15
c) Mtodos para evaluar la actividad antiinflamatoria ..................................... 16
3.3 Evaluacin de la actividad antioxidante ....................................................... 17
a) Radicales libres .......................................................................................... 17
b) Capacidad antioxidante .............................................................................. 17
c) Mtodos para evaluar la actividad antioxidante .......................................... 18
3.4 Evaluacin de la actividad antimicrobiana ................................................... 19
a) Capacidad antimicrobiana ........................................................................ 19
c) Mtodos para evaluacin antimicrobiana .................................................... 19
3.5 Producto Nutracutico y alimento funcional ................................................. 20
CAPTULO IV. MATERIALES Y METODOLOGA ................................................ 21
a) Reactivos, materiales y equipos .................................................................... 21
b) Cepas ............................................................................................................ 21
i
c) Metodologa ................................................................................................... 22
4.1 Preparacin de la muestra ........................................................................... 22
4.2 Pruebas cualitativas ..................................................................................... 22
4.2.1. Alcaloides ............................................................................................. 22
4.2.2. Flavonoides .......................................................................................... 22
4.2.3. Glicsidos cianognicos ....................................................................... 23
4.2.4. Azcares reductores ............................................................................. 23
4.2.5. Saponinas ............................................................................................. 23
4.2.6. Taninos ................................................................................................. 24
4.2.7. Quinonas .............................................................................................. 24
4.2.8. Cumarinas ............................................................................................ 25
4.2.9. Glucsidos cardiacos ............................................................................ 25
4.2.10. Sesquiterpenlactonas ......................................................................... 26
4.2.11. Esteroides ........................................................................................... 26
4.3 Pruebas cuantitativas ................................................................................... 26
4.3.1. Preparacin de la curva de calibracin de fenoles con cido glico ..... 26
Cuantificacin de fenoles en la muestra con cido glico .............................. 27
4.3.2. Preparacin de la curva de calibracin de fenoles con cido cafeco ... 27
Cuantificacin de fenoles totales con cido cafeco ....................................... 27
4.4 Cuantificacin de flavonoides totales con rutina .......................................... 28
4.4.1. Preparacin de la curva de calibracin de flavonoides con rutina ........ 28
Cuantificacin de flavonoides en una muestra ............................................... 28
4.5 Cuantificacin de taninos ............................................................................. 28
4.5.1 Preparacin de la curva de calibracin de taninos con cido tnico ...... 28
Cuantificacin de taninos en la muestra ......................................................... 29
4.6 Evaluacin antimicrobiana ........................................................................... 29
4.7 Evaluacin anti-inflamatoria ...................................................................... 30
4.7.1. Preparacin de la muestra .................................................................... 30
4.7.2. Edema auricular inducido con aceite de crotn .................................... 30
4.8 Determinacin de la actividad antioxidante por el mtodo 2,2-Azinobis-3
Etilbenzotiazolin-6-cido Sulfnico (ABTS) ....................................................... 31
4.8.1 Preparacin de la muestra ..................................................................... 31
ii
4.8.2. Preparacin del radical ABTS ............................................................... 31
4.8.3. Realizacin de la curva tipo con vitamina C ......................................... 31
4.8.4. Preparacin de la prueba ...................................................................... 31
4.9 Determinacin de la actividad antioxidante por el mtodo 2,2-Difenil-1-
picrilhidrazilo (DPPH) ......................................................................................... 32
4.9.1 Preparacin de la muestra ..................................................................... 32
4.9.2. Preparacin del radical DPPH .............................................................. 32
4.9.3. Realizacin de la curva tipo con vitamina C ......................................... 32
4.9.4. Preparacin de la prueba ...................................................................... 32
CAPTULO V. RESULTADOS Y DISCUSIN....................................................... 33
5.1. RESULTADOS Y DISCUSIN DE PRUEBAS CUALITATIVAS ................ 33
Alcaloides ....................................................................................................... 35
Flavonoides .................................................................................................... 36
Azcares reductores ....................................................................................... 37
Saponinas ....................................................................................................... 38
Taninos ........................................................................................................... 39
Cumarinas ...................................................................................................... 40
Glicsidos cardiacos ....................................................................................... 41
Esteroides ....................................................................................................... 42
5.2 RESULTADOS Y DISCUSIN DE PRUEBAS CUANTITATIVAS ............... 43
5.2.1. Cuantificacin de fenoles con cido glico ........................................... 43
5.2.2. Cuantificacin de fenoles con cido cafeco ......................................... 45
5.2.3. Cuantificacin de flavonoides con rutina ............................................... 47
5.2.4. Cuantificacin de taninos con cido tnico ........................................... 49
5.2.4. Cuantificacin de esteroides con colesterol .......................................... 51
5.3. RESULTADOS Y DISCUSIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA ... 53
5.4. RESULTADOS Y DISCUSIN DE LA ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA . 54
Mtodo de edema inducido por aceite de croton ............................................ 54
Porcentaje de inflamacin............................................................................... 55
Porcentaje de inhibicin de la inflamacin ...................................................... 56
5.5 RESULTADOS Y DISCUSIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ...... 59
5.5.1. Actividad antioxidante por el mtodo 2,2-Azinobis-3 Etilbenzotiazolin-6-
cido Sulfnico (ABTS) .................................................................................. 59
iii
5.5.2. Actividad antioxidante por el mtodo 2,2-Difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)
........................................................................................................................ 61
CAPTULO VII. CONCLUSIONES ........................................................................ 63
CAPTULO VIII. RECOMENDACIONES FUTURAS ............................................. 64
ANEXOS ............................................................................................................... 65
1) Preparacin de reactivos usados en el tamiz fitoqumico .............................. 65
2) Preparacin de radicales para evaluacin antioxidante. ................................ 66
REFERENCIAS ..................................................................................................... 67
NDICE DE TABLAS
Tabla 1.Reacciones utilizadas en el anlisis fitoqumico ....................................... 13
Tabla 2.Cantidades de soluciones utilizadas para curva estndar de fenoles ...... 27
Tabla 3. Cantidades de soluciones utilizadas para curva estndar de flavonoides28
Tabla 4. Cantidades de soluciones utilizadas para curva estndar de taninos ..... 29
Tabla 5.Resultados generales del tamiz fitoqumico ............................................. 33
Tabla 6.Resultado de prueba de alcaloides .......................................................... 35
Tabla 7.Resultados de flavonoides ....................................................................... 36
Tabla 8.Resultado de azcares reductores ........................................................... 37
Tabla 9.Resultado de saponinas ........................................................................... 38
Tabla 10.Resultado de taninos .............................................................................. 39
Tabla 11.Resultado de cumarinas ......................................................................... 40
Tabla 12.Resultado de glicsidos cardiacos ......................................................... 41
Tabla 13.Resultado de esteroides ......................................................................... 42
Tabla 14. Concentracin de fenoles en extractos cetnicos de Achillea millefolium
y Portulaca oleracea (cido glico) ................................................................. 44
Tabla 15. Concentracin de fenoles en extractos cetnicos de Achillea millefolium
y Portulaca oleracea (cido cafeco) ............................................................... 46
Tabla 16. Concentracin de flavonoides en extractos cetnicos de Achillea
millefolium y Portulaca oleracea ..................................................................... 48
Tabla 17. Concentracin de taninos en extractos cetnicos de Achillea millefolium
y Portulaca oleracea ....................................................................................... 50
Tabla 18.Concentracin de esteroides en extractos cetnicos de Achillea
millefolium y Portulaca oleracea ..................................................................... 52
Tabla 19. Halos de inhibicin obtenidos de los extractos ...................................... 53
Tabla 20. Pesos de los discos auriculares sin tratamiento .................................... 54
Tabla 21. Peso de los discos auriculares tratados (inflamados)............................ 55
Tabla 22. Porcentaje de inflamacin de extractos e Indometacina ....................... 55
Tabla 23. Porcentaje de inhibicin de la inflamacin de extractos e indometacina 57
iv
Tabla 24. Porcentaje de actividad antioxidante (ABTS) ........................................ 60
Tabla 25. Porcentaje de actividad antioxidante (DPPH) ........................................ 62
NDICE DE FIGURAS
v
CAPTULO I
1.1 INTRODUCCIN
Es importante sealar que las plantas medicinales han formado parte importante
en el tratamiento y prevencin de enfermedades desde hace miles de aos,
debido al tipo de vida nmada que tenan los antepasados se vean en la
necesidad de buscar plantas para alimentarse debido a esto fueron descubriendo
que algunas de ellas posean propiedades benficas como aliviar dolores, curar
heridas; y otras tenan como consecuencia intoxicaciones, causaban vmito o mal
estar, hoy en da se sabe esto por los escritos hallados de cada cultura.
Posteriormente se realizaron estudios para determinar el motivo de las
propiedades farmacolgicas de estas plantas y de ah se descubrieron que poseen
ciertas molculas o metabolitos secundarios que son los encargados de las
mltiples funciones como anti-inflamatorio, antioxidante, antimicrobiana, entre
otras.
1
1.2 PROBLEMATIZACIN
Debido al ritmo de vida a diario que conllevan estrs, fatiga, desgaste fsico entre
otros, es frecuente presentar problemas de inflamacin en diversas partes del
cuerpo o como consecuencia de alguna enfermedad; este proceso consiste
bsicamente en una serie de eventos inespecficos que pueden ser provocados
por numerosos estmulos o agresiones del medio (ej.: agentes biolgicos,
isquemia, interacciones antgeno - anticuerpo, traumatismos, lesiones trmicas o
fisicoqumicas de otra ndole, etc.). Cada tipo de estmulo provoca una respuesta
caracterstica que constituye una variante relativamente menor del mismo
fenmeno. A nivel macroscpico, la respuesta est usualmente acompaada por
conocidos signos clnicos como tumefaccin (edema), rubor, calor, dolor
espontneo a la palpacin y desorden de la funcin tisular.
Durante los ltimos aos se han realizado estudios donde se identific que existen
efectos adversos derivados de la administracin de medicamentos anti-
inflamatorios no esteroides (AINEs) el cido acetil-saliclico, ibuprofeno,
indometacina, diclofenaco, piroxicam, etc. Dentro de estos efectos se encuentran
ejemplos como la toxicidad gastrointestinal y renal, debido en parte, a la inhibicin
de la sntesis de prostaglandinas PGs1 en el estmago o en la mdula renal. El
hecho de la existencia de las dos isoenzimas de la COX 2 en el organismo, podra
explicar los efectos antiinflamatorios a travs de la inhibicin de la COX-23 y los
efectos indeseables (como los gastrointestinales y renales), por la inhibicin de la
COX-14.
1
PGs. Prostaglandinas conjunto de sustancias de carcter lipdico derivado de cidos grasos.
2
COX. Ciclooxigenasa es una enzima responsable de la formacin de mediadores biolgicos importantes. La
inhibicin farmacolgica de la ciclooxigenasa alivia los sntomas de la inflamacin.
3
COX-2. Ciclooxigenasa 2 encargada de mediar en los procesos de inflamacin y en la sealizacin.
4
COX-1. Ciclooxigenasa 1 presente en todos los tejidos especialmente en el rin y el tubo gastrointestinal y
participa en la produccin de prostaglandinas que intervienen en procesos fisiolgicos tales como:
proteccin del epitelio gstrico, mantenimiento del flujo renal, la agregacin plaquetaria.
2
no tener un tipo de gastroproteccin y estos casos se presentan a menudo en
personad adultas (65 aos o ms) ya que presentan enfermedades como
osteoartritis y artritis reumatoide, en las cuales el tratamiento est enfocado al uso
de antiinflamatorios.
Cabe mencionar que no todas las personas presentan estos problemas, ya que,
cada organismo tiene diferentes reacciones ante los AINEs, esta diferencia
depende de la edad del individuo, la frecuencia de la administracin, dosis de los
medicamentos, si el paciente presenta alguna enfermedad heptica, renal,
cardiovascular o metablica.
3
medicinales es su nico recurso con el que cuenta, ya que debido sus bajos
ingresos no tiene acceso a medicamentos sintetizados, existen poblaciones donde
debido a creencias religiosa no se les permite utilizar medicamentos para el
tratamiento de sus padecimientos, por tradicin o costumbres o porque en el lugar
donde habitan es difcil encontrar establecimientos del sector salud donde se
comercialicen medicamentos.
1.3 JUSTIFICACIN
Es por ello que el presente trabajo tiene como finalidad realizar la caracterizacin
Achillea millefolium y Portulaca oleracea y dar a conocer mediante la
experimentacin en un animal de prueba qu tan eficientes son los extractos
4
cetnicos de ambas plantas, conocer las concentraciones ptimas comparadas
con un medicamento comercial (Indometacina) y mediante la realizacin del tamiz
fitoqumico determinar que metabolitos secundarios presenta cada parte de las
plantas.
1.4 OBJETIVOS
General
Evaluar mediante tamiz fitoqumico los metabolitos secundarios que poseen las
plantas Achillea millefolium y Portulaca oleracea y determinar su actividad anti-
inflamatoria.
Especficos
Determinar si la concentracin administrada de los extractos de las plantas
Achillea millefolium y Portulaca oleracea tienen efecto anti-inflamatorio.
Evaluar si los extractos de las plantas Achillea millefolium y Portulaca
oleracea tienen actividad antioxidante y/o antimicrobiana.
Determinar si las plantas Achillea millefolium y Portulaca oleracea tienen
propiedades para ser un producto nutracutico.
5
1.5 HIPTESIS
Hi: La concentracin administrada por va oral a los ratones CD1 de los extractos
de las plantas Achillea millefolium y Portulaca oleracea tienen relacin con la
actividad anti-inflamatoria.
1.6 ALCANCE
6
CAPTULO II. ANTECEDENTES
2.1 Portulaca oleracea (verdolaga)
Uadela, Verdolaga.
Taxonoma
Distribucin en Mxico
7
Descripcin tcnica
Ciclo de vida
Planta anual.
Fenologa
Usos
8
Estudios previos reportados de Portulaca oleracea
9
2.2 Achillea millefolium (milenrama)
Taxonoma
Distribucin en Mxico
Descripcin tcnica
De acuerdo con estudios realizados por Rzedowski & Rzedowski, (2001), Achillea
millefolium presenta las siguientes caractersticas.
10
a) Hbito y forma de vida: Planta herbcea y perenne.
b) Tamao: Hasta un metro de alto.
c) Tallo: Erguido, simple o a veces ramificado superiormente, ms o menos
viloso (con pelos cortos).
d) Hojas: Alternas, hasta 20 cm de largo, divididas en segmentos finos, linear-
oblongas a lanceoladas en contorno general, las inferiores lanceoladas y
cortamente pecioladas, el resto ssiles.
e) Inflorescencia: Cabezuelas numerosas agrupadas en panculas
corimbiformes (con las flores ms o menos en un plano), densas,
pednculos de hasta 5 mm de largo.
f) Cabezuela/flores: Involucro campanulado de 3 a 5 mm de largo por 3 mm
de ancho, brcteas 15 a 20, graduadas en 4 series, las ms largas de 4 a 5
mm de largo, glabras o vilosas, con la nervadura central verde y los
mrgenes por lo general de color caf; receptculo cnico, pleas
oblongas, de 3 mm de largo; flores de dos formas: flores liguladas 5,
sus corolas por lo general blancas, femeninas, sus lminas orbiculares a
cuadrngulares, de 2 a 3 (4) mm de largo; flores del disco 20, sus corolas
amarillentas o blanquecinas, hermafroditas, tubulosas, o bien, con la
garganta campanulada, de 2 a 3 mm de largo.
g) Frutos y semillas: Fruto un aquenio oblongo a obovado, comprimido, de 2 a
3 mm de largo, glabro, blanco a gris, finamente estriado en forma
longitudinal.
Propagacin
Fenologa
Usos
Medicinal y ornamental.
11
Estudios previos reportados de Achillea millefolium
12
CAPTULO III. REVISIN LITERARIA
b) Preparacin de la muestra
Metabolitos/Reaccin Metabolitos/Reaccin
Flavonoides Quinonas
Reaccin de Shinoda Reaccin con hidrxido de amonio
Reaccin con hidrxido de sodio al 10% Reaccin de cido sulfrico
Cumarinas
Glicsidos cianognicos Reaccin de Erlich
13
Azcares reductores Glicsidos cardiacos
Reaccin de Fehling Reaccin Legal
Reaccin de Benedic Reaccin de Baljet
Taninos
Alcaloides
Reaccin de cloruro frrico
Reaccin de Dragendorff
Reaccin con gelatina
Reaccin de Sonneschain
Reaccin con ferrocianuro de potasio
Sesquiterpenlactonas Esteroides
Saponinas
Reaccin de Rosenthaler
Fuente: Elaboracin propia. Nota: Los nombres mostrados en negritas son los metabolitos
secundarios que se identifican y luego de ellos el nombre de las reacciones para su identificacin.
a) Inflamacin
Cuando un tejido presenta una lesin tisular ya sea por efecto de patgenos,
abrasiones, irritaciones qumicas, deformaciones o trastornos celulares y
exposicin a temperaturas extremas, se genera una inflamacin en dicho tejido
como respuesta defensiva e inespecfica del organismo. Existen cuatro sntomas o
signos que caracterizan al proceso de inflamatorio son: rubor, dolor, calor y
tumefaccin (Tortora; Derrickson, 2002).
Con base a lo reportado por Guyton y Hall la inflamacin presenta las siguientes
caractersticas:
14
b) Mediadores qumicos de la inflamacin
Histamina
Citoquinas
Serotonina
Prostaglandinas
15
c) Mtodos para evaluar la actividad antiinflamatoria
De acuerdo a lo reportado por Nez, Mateo, Agero, et al. (2007) algunos
mtodos empleados para determinar la actividad anti-inflamatoria son los
siguientes:
16
Granuloma inducido por pellets de algodn
a) Radicales libres
Envejecimiento
Ateroesclerosis
Lesiones en mucosas y estructuras celulares
Lesiones en cadena gentica
b) Capacidad antioxidante
17
diferentes mecanismos como es transformando los perxidos en especies menos
reactivas, disminuyendo la concentracin de oxidantes, disminuyendo la
propagacin, etc.
Mtodo ABTS
Mtodo DPPH
18
resultados se expresan en actividad equivalente a Trolox. El antioxidante sinttico
de referencia Trolox, a una concentracin de 0,08-1,28 mM en disolucin de
metanol al 80%, se ensaya en las mismas condiciones.
a) Capacidad antimicrobiana
Esta inhibicin puede ser ocasionada por los siguientes factores: inhibicin de la
sntesis de la pared celular, inhibicin de la traduccin de material gentico,
inhibicin de la sntesis de cidos nucleicos, etc.
De acuerdo a lo reportado por Prez, Rojas, Doncel, et al. (2011) algunos mtodos
empleados para determinar la actividad antimicrobiana son los siguientes:
19
24 horas a 37 C. Para cada microorganismo, se utilizan controles positivos de
Gentamicina 80 mg/ mL y negativos agua destilada. Los ensayos se realizan por
triplicado y la evaluacin se hace por medicin del dimetro de las zonas de
inhibicin de crecimiento alrededor de los orificios. El efecto inhibitorio de los
extractos vegetales son obtenidos por la diferencia con el etanol y su eficiencia se
compara con el control positivo.
20
CAPTULO IV. MATERIALES Y METODOLOGA
b) Cepas
21
c) Metodologa
4.2.1. Alcaloides
Se tom una porcin del extracto y se adicionaron entre 5 mL a 10 mL de cido
clorhdrico al 10%, se calent a ebullicin por cinco minutos, se enfri y filtro.
Posteriormente se dividi el filtrado en 3 tubos de ensaye, uno de los cuales fue el
tubo testigo.
a) Reaccin de Dragendorff
Se adicion una gota del reactivo de Dragendorff, la prueba se considera positiva
si se forma un precipitado naranja o blanco.
b) Reaccin de Sonneschain
Se adicion una gota del reactivo de Sonneschain, la prueba se considera positiva
si se forma un precipitado naranja.
4.2.2. Flavonoides
Se disolvieron 0.5 mL del extracto en 2 mL de etanol absoluto y se dividi en tres
tubos. El tercer tubo se utiliz como testigo.
a) Reaccin de Shinoda
Se adicionaron 2 gotas de cido clorhdrico concentrado, si se obtiene una
coloracin roja indica la presencia de auronas o chalconas.
22
b) Reaccin de hidrxido de sodio al 10%
Se adicionaron 3 gotas de hidrxido de sodio, si se forma una coloracin de
amarillo a rojo, indica la presencia de xantonas y flavonas; de caf a naranja de
flavonoles; de purpura a rojizo de chalconas y de azul de antocianinas.
a) Reaccin de Fehling
Se adicionaron 0.5 mL de solucin de Fehling A y 0.5mL de solucin de Fehling B
y 1 mL de agua destilada.
b) Reaccin de Benedict
Se adicionaron 0.5 mL del reactivo de Benedict y 1 mL de agua destilada.
Se prepar un blanco para cada tubo, sin extracto. Se colocaron los tubos en bao
Mara por 15 minutos. Cuando hay azucares en los tubos que contienen el
extracto se forma un precipitado de color naranja o rojo.
4.2.5. Saponinas
23
b) Reaccin de Lieberman Bouchard
Se concentraron 0.5 mL de extracto hasta 0.2 mL; despus se agregaron 2 gotas
de cido actico anhidro y se estratific con 2 gotas de cido sulfrico
concentrado. Al formarse una coloracin azul o verde en la interfase, se indica
presencia de saponinas esteroidales; si la coloracin es rosa, roja, magenta o
violeta indica presencia de saponinas triterpenoides.
c) Reaccin de Rosenthaler
A una porcin del extracto concentrado se adicionaron dos gotas del reactivo
Rosenthaler y se estratifico con dos gotas de cido sulfrico concentrado.
La formacin de una coloracin violeta, se considera positiva para saponinas
triterpenoides.
4.2.6. Taninos
A 1 mL del extracto se adicionaron 2 mL de agua destilada y 3 gotas de cloruro de
sodio al 2%, se calent el tubo a ebullicin por 1 minuto, se enfri y filtro.
Se dividi el filtrado en cuatro tubos de ensaye, el cuarto tubo se utiliz como
testigo.
4.2.7. Quinonas
Se colocaron 2 mL del extracto en una capsula de porcelana y se concentr a
sequedad, posterior a ello se dividi el extracto en tres porciones.
24
a) Reaccin de hidrxido de amonio
Se adicion una gota de hidrxido de amonio concentrado al extracto.
Se considera la prueba positiva para antraquinonas al tener la presencia de una
coloracin roja que aparece en los dos primeros minutos.
4.2.8. Cumarinas
a) Reaccin de Erlich
Se colocaron 0.5 mL de extracto en una capsula de porcelana, se concentr y se
agregaron dos gotas del reactivo de Erlich y una gota de cido clorhdrico
concentrado. La coloracin naranja indic presencia de cumarinas.
a) Reaccin de Legal
Se dej evaporar el disolvente y se adicionaron 2 o 3 gotas de piridina, se agrega
una gota de nitroprusiato de sodio al 5% y cuatro gotas de hidrxido de potasio,
una coloracin roja poco estable indica la presencia de glucsidos cardiacos.
b) Reaccin de Baljet
Se adicionaron 3 gotas del reactivo de Baljet. Una coloracin de naranja a rojo
obscuro indica presencia de Glucsidos cardiacos.
25
4.2.10. Sesquiterpenlactonas
4.2.11. Esteroides
a) Prueba de Lieberman-Bouchard
26
Tabla 2.Cantidades de soluciones utilizadas para curva estndar de fenoles
Solucin de
Agua
cido glico Folin 1N S Na2CO3 20% R
Tubo destilada
(0.1mg/mL) L O L E
L
L N P
Blanco 0 500 250 I 1250 O
1 20 500 250 C 1250 S
2 40 500 250 A 1250 A
3 60 500 250 R 1250 R
4 80 500 250 5 1250 2
5 100 500 250 M 1250 0
6 120 I M
500 250 1250
7 140 N I
500 250 1250
8 160 N
500 250 1250
27
4.4 Cuantificacin de flavonoides totales con rutina
28
Tabla 4. Cantidades de soluciones utilizadas para curva estndar de taninos
Reactivo de Solucin de
Solucin de cido Agua Concentracin de
Folin- carbonato de
Tubo tnico (0.1mg/mL) destilada cido tnico
Ciocalteu sodio
L L g
L L
Blanco 0 500 250 1250 0
1 20 480 250 1250 2
2 40 460 250 1250 4
3 60 440 250 1250 6
4 80 420 250 1250 8
5 100 400 250 1250 10
Fuente: Elaboracin propia.
Los discos fueron preparados con 100 L de extractos para despus incubarlos a
37C durante 24 horas. Pasando este tiempo se midi los halos de inhibicin.
29
4.7 Evaluacin anti-inflamatoria
( )
Donde:
T: oreja tratada
30
( )
Donde:
T: oreja tratada
C: control
31
4.9 Determinacin de la actividad antioxidante por el mtodo 2,2-Difenil-1-
picrilhidrazilo (DPPH)
32
CAPTULO V. RESULTADOS Y DISCUSIN
PLANTAS
METABOLITOS
Hoja Flor Hoja Tallo Flor
Achillea Achillea Portulaca Portulaca Portulaca
millefolium millefolium oleracea oleracea oleracea
Alcaloides
Reaccin de Dragendorff - - + + -
Reaccin de Wagner - - + ++ -
Reaccin de Mayer - - - - -
Flavonoides
Reaccin de Shinoda + + - - -
33
Quinonas
Reaccin con Hidrxido de
- - - - -
amonio
Reaccin con cido sulfrico - - - - -
Cumarinas
Reaccin Erlich _ _ _
Hidrxido de amonio _
Glicsidos cardiacos
Reaccin Legal - + + - -
Reaccin de Baljet - + + + +
Sesquiterpenlactonas - - - - -
Esteroides + + + + +
Fuente: Elaboracin propia.
Cabe sealar que los metabolitos secundarios que tienen mayor influencia en los
procesos inflamatorios son derivados de compuestos fenlicos, entre ellos las
cumarinas, fenoles, flavonoides y taninos; y como se observ en la tabla anterior
las plantas de estudios para este proyecto mostraron presencia de dichos
compuestos y esta podra la razn por la que se presenta la propiedad anti-
inflamatoria.
34
Alcaloides
Tabla 6.Resultado de prueba de alcaloides
PLANTAS
METABOLITOS Hoja Flor Hoja Tallo Flor
Achillea Achillea Portulaca Portulaca Portulaca
millefolium millefolium oleracea oleracea oleracea
Alcaloides
Reaccin de Dragendorff - - + + -
Reaccin de Wagner - - + ++ -
Reaccin de Mayer - - - - -
NOTA: poco presencia, + presencia, ++ elevada presencia y no hay presencia.
35
Flavonoides
Tabla 7.Resultados de flavonoides
PLANTAS
METABOLITOS
Hoja Flor Hoja Tallo Flor
Achillea Achillea Portulaca Portulaca Portulaca
millefolium millefolium oleracea oleracea oleracea
Flavonoides
Reaccin de Shinoda
+ + - -
Los flavonoides son un grupo de sustancias, que su estructura deriva del ncleo
aromtico flavano, pertenecen a la serie C6-C3-C6, consisten en dos grupos C6
(anillos de benceno) sustituidos por una cadena aliftica de tres carbonos
(Valencia, 1995).
36
Azcares reductores
Tabla 8.Resultado de azcares reductores
PLANTAS
METABOLITOS
Hoja Flor Hoja Tallo Flor
Achillea Achillea Portulaca Portulaca Portulaca
millefolium millefolium oleracea oleracea oleracea
Azcares reductores
Reaccin de Fehling
- - + -
Reaccin de Benedic - + - + -
En las plantas los azcares funcionan como fuente de energa, almacenan energa
en forma de almidones y apoyan al transporte de dicha energa en forma de
sacarosa, entre otras funciones (Valencia, 1995).
37
Saponinas
Tabla 9.Resultado de saponinas
PLANTAS
METABOLITOS
Hoja Flor Hoja Tallo Flor
Achillea Achillea Portulaca Portulaca Portulaca
millefolium millefolium oleracea oleracea oleracea
Saponinas
Reaccin de Liberman + + + +
-
Bouchard triterpenoides triterpenoides triterpenoides triterpenoides
Reaccin de Rosenthaler + + + +
-
triterpenoides triterpenoides triterpenoides triterpenoides
NOTA: poco presencia, + presencia, ++ elevada presencia y - no hay presencia.
En la tabla 7 podemos ver que tanto la hoja como flor de Achillea millefolium en la
reaccin de Liberman y Rosenthaler hay presencia de triterpenoides y en la planta
Portulaca oleracea hubo presencia en el tallo y en la flor. Los triterpenoides son
compuestos que derivan del escualeno, considerado como intermediario de la
biosntesis de esteroides (Valencia, 1995).
38
Taninos
Tabla 10.Resultado de taninos
PLANTAS
METABOLITOS
Hoja Flor Hoja Tallo Flor
Achillea Achillea Portulaca Portulaca Portulaca
millefolium millefolium oleracea oleracea oleracea
Taninos
Reaccin con gelatina
- + - - -
39
Cumarinas
Tabla 11.Resultado de cumarinas
PLANTAS
METABOLITOS
Hoja Flor Hoja Tallo Flor
Achillea Achillea Portulaca Portulaca Portulaca
millefolium millefolium oleracea oleracea oleracea
Cumarinas
Reaccin Erlich
_ _ _ _
Hidrxido de amonio
_ _
Las cumarinas son compuestos que se les consideran derivados del cido o-
hidroxicinmico y tienen en comn una estructura qumica de 2H-1-benzopiran-2-
ona ; fueron aisladas y purificadas por primera vez por Voleg, en 1822, a partir del
haba tonka (Dypteryx odorata), y deben su denominacin a la palabra coumarou,
nombre vernculo de esta haba (Valencia, 1995).
40
Estudios anteriores mencionan que la planta de Achillea millefolium tiene dentro
de su composicin de metabolitos secundarios a las cumarinas y coincide con los
resultados obtenidos en el presente trabajo, mientras que en el caso de Portulaca
oleracea se han reportado resultados negativos de este tipo de compuestos, y en
este caso se not una presencia de cumarinas pero muy baja.
Glicsidos cardiacos
Tabla 12.Resultado de glicsidos cardiacos
PLANTAS
METABOLITOS
Hoja Flor Hoja Tallo Flor
Achillea Achillea Portulaca Portulaca Portulaca
millefolium millefolium oleracea oleracea oleracea
Glicsidos cardiacos
Reaccin Legal
- + + - -
Reaccin de Baljet - + + + +
Son compuestos que en el pasado fueron usados como veneno para flechas y en
ceremonias religiosas, actualmente se son sustancias de gran importancia en la
regulacin de la actividad cardiaca.
Estudios antes realizados muestran la existencia de este grupo en los dos tipos de
plantas estudiadas.
41
Esteroides
Tabla 13.Resultado de esteroides
PLANTAS
METABOLITOS
Hoja Flor Hoja Tallo Flor
Achillea Achillea Portulaca Portulaca Portulaca
millefolium millefolium oleracea oleracea oleracea
+ + + + +
Esteroides
triterpenos esteroides esteroides esteroides triterpenos
NOTA: poco presencia, + presencia, ++ elevada presencia y - no hay presencia.
42
5.2 RESULTADOS Y DISCUSIN DE PRUEBAS CUANTITATIVAS
1
0.9
0.8
Absorbancia (nm)
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3 y = 0.0054x + 0.0069
R = 0.9979
0.2
0.1
0
0 50 100 150 200
Concentracin cido glico (g/mL)
43
Tabla 14. Concentracin de fenoles en extractos cetnicos de Achillea
millefolium y Portulaca oleracea (cido glico)
Concentracin
Absorbancia Concentracin[g
Planta Dilucin [mL] real[g cido
765nm cido glico/mL]
glico/mL]
Hoja
0.518 94.648 1:10 946.481
Achillea millefolium
Flor
0.194 34.648 1:10 346.481
Achillea millefolium
Hoja
0.188 33.537 1:10 335.370
Portulaca oleracea
Tallo
0.413 75.203 - 75.203
Portulaca oleracea
Flor
0.568 103.907 - 103.907
Portulaca oleracea
44
5.2.2. Cuantificacin de fenoles con cido cafeco
Para la cuantificacin de fenoles con cido cafeco se realiz un curva tipo para
determinar la concentracin equivalente que se encuentra en cada extracto, la
cual se muestra en la figura 4 en la que se grafic la concentracin que va desde
un valor de 10 a 100 g de cido cafeco vs la absorbancia y se observa que tiene
un coeficiente de correlacin aceptable de 0.995.
0.9
0.8
0.7
Absorbancia (nm)
0.6
0.5
0.4
y = 0.0048x + 0.0512
0.3
R = 0.995
0.2
0.1
0
0 50 100 150 200
Concentracin cido cafeco (g/mL)
45
Tabla 15. Concentracin de fenoles en extractos cetnicos de Achillea
millefolium y Portulaca oleracea (cido cafeco)
Concentracin
Absorbancia Concentracin[g
Planta Dilucin [mL] real[g cido
765nm cido cafeco/mL]
cafeco/mL]
Hoja
Achillea 0.291 49.958 1:3 149.874
millefolium
Flor
Achillea 0.975 192.458 1:3 577.374
millefolium
Hoja
Portulaca 0.274 46.416 1:10 464.160
oleracea
Tallo
Portulaca 0.523 98.291 1:10 982.916
oleracea
Flor
Portulaca 0.868 170.166 - 170.166
oleracea
46
5.2.3. Cuantificacin de flavonoides con rutina
Para la cuantificacin de flavonoides se realiz una curva tipo con rutina que se
muestra en la figura 5 con una concentracin que va de 20 a 100 g, el coeficiente
de correlacin obtenido en la grfica es aceptable de 0.997 la ecuacin dada en la
grfica se utiliz para obtener la concentracin de las muestras.
0.4
0.35
0.3
Absorbancia (nm)
0.25
0.2
y = 0.0035x + 0.0054
0.15 R = 0.9972
0.1
0.05
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentracin rutina (g/mL)
47
Tabla 16. Concentracin de flavonoides en extractos cetnicos de Achillea
millefolium y Portulaca oleracea
Absorbancia Concentracin[g
Planta
765nm rutina/mL]
Hoja
Achillea 0.230 64.171
millefolium
Flor
Achillea 0.108 29.314
millefolium
Hoja
Portulaca 0.109 29.600
oleracea
Tallo
Portulaca 0.413 116.314
oleracea
48
patrn (Quercetina) en el cual el resultado fue expresado como % de quercetina
en el extracto y fue de 1.94%, por lo tanto como tal no se puede hacer una
comparacin debido a la diferencia de patrn y la tcnica utilizada.
Para la cuantificacin de taninos se realiz una curva tipo como referencia la cual
se muestra en la figura 6 con una concentracin que va de 20 a 100 g, el
coeficiente de correlacin obtenido en la grfica es aceptable de 0.988 la ecuacin
dada en la grfica se utiliz para obtener la concentracin de las muestras.
0.7
0.6
Absorbancia (nm)
0.5
0.4
0.3
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentracin cido tnico (g/mL)
49
Tabla 17. Concentracin de taninos en extractos cetnicos de Achillea
millefolium y Portulaca oleracea
Concentracin
Absorbancia Concentracin[g
Planta Dilucin [mL] real[g cido
765nm cido tnico/mL]
tnico/mL]
Hoja
Achillea 0.553 96.759 1:10 967.592
millefolium
Flor
Achillea 0.385 65.648 1:10 656.481
millefolium
Hoja
Portulaca 0.281 46.388 1:10 463.888
oleracea
Tallo
Portulaca 0.552 96.574 - 96.574
oleracea
50
5.2.4. Cuantificacin de esteroides con colesterol
1.2
1
Absorbancia (nm)
0.8
0.6
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Concentracin colesterol (mg/mL)
51
Tabla 18.Concentracin de esteroides en extractos cetnicos de Achillea
millefolium y Portulaca oleracea
Absorbancia Concentracin[mg
Planta
765nm colesterol/mL]
52
Es por ello importante sealar que los valores de todas las cuantificaciones
realizadas en este proyecto pueden variar de acuerdo al lugar de recoleccin de
las plantas y temporada del ao de esta misma es por ello importante que se tome
en cuenta los meses de proliferacin de las plantas as como tipo de clima y suelo
donde se encuentran.
53
Como se observa en la tabla 19 los extractos solo tuvieron la capacidad
antimicrobiana para tres microorganismos; la hoja de Achillea millefolium fue el
nico extracto que mostr halo de inhibicin de 10 mm a B. subtillis.
Mientras que con B. cereus solo tres extractos tuvieron halo de inhibicin, la hoja
de Achillea millefolium con 14 mm y tanto para la hoja de Achillea millefolium como
el tallo de Portulaca oleracea el valor del halo fue de 11mm.
54
Tabla 21. Peso de los discos auriculares tratados (inflamados)
Extracto Peso (g)
Hoja de Achillea millefolium 0.0101
Flor de Achillea millefolium 0.0075
Hoja de Portulaca oleracea 0.0116
Tallo de Portulaca oleracea 0.0106
Flor de Portulaca oleracea 0.0106
Control 0.0211
Indometacina 0.0129
Porcentaje de inflamacin
( )
Dnde:
55
90
80
70
% de inflamacin
60
50
40
30
20
10
0
Tallo Portulaca Hoja Portulaca Flor Portulaca Hoja Achillea Flor Achillea Indometacina
oleracea oleracea oleracea milefolium milefolium
( )
Dnde:
56
Tabla 23. Porcentaje de inhibicin de la inflamacin de extractos e
indometacina
Dosis administrada % de inhibicin de la
Extracto
(mg/Kg) inflamacin
Hoja de Achillea millefolium 48 51.9744.675
Flor de Achillea millefolium 45 64.4122.736
Hoja de Portulaca oleracea 125 44.8651.664
Tallo de Portulaca oleracea 125 49.7632.843
Flor de Portulaca oleracea 79 36.42910.838
Indometacina 25 39.0204.140
70
% de inhibicin de la inflamacin
60
50
40
30
20
10
0
Tallo Portulaca Hoja Portulaca Hoja Achillea Flor Achillea Flor Portulaca Indometacina
oleracea oleracea milefolium milefolium oleracea
57
Es importante sealar que estos parmetros determinan la capacidad de los
extractos o frmaco para desinflamar o impedir que la inflamacin contine En la
tabla 22 se encuentran los resultados del porciento de inflamacin de los extractos
cetnicos de ambas plantas de estudio y podemos observar que para Achillea
millefolium la hoja tuvo el valor ms alto con 76.83% mientras que la flor fue de
13.13% y comparando este calor con el de la Indometacina de55.82% se puede
analizar que para poder llegar a tener un valor similar lo que se podra hacer es
aumentar la dosis administrada, en el caso de Portulaca oleracea el tallo fue el
ms alto con 68.25%, seguido de la flor con 67.59% y finalmente la hoja con
45.41% y comparados estos valores con el frmaco Indometacina presentan un
buen porcentaje de inflamacin, en trabajos anteriores a estos se ha reportado
resultados similares en los que mediante otro mtodo por ejemplo el edema
plantar se ha observado que los extractos tanto de Achillea millefolium como de
Portulaca oleracea tienen valores similares o por lo menos cercanos al frmaco de
comparacin.
58
inflamatorio en extractos etanlicos de Portulaca oleracea, cabe mencionar que la
administracin de esta concentracin se llev a cabo a diferentes tiempos, en
comparacin con este proyecto fue una nica dosis y el extracto fue cetnico, pero
los resultados de ambos estudios muestran que esta planta tiene un buen efecto y
puede ser comparado con el efecto de un anti-inflamatorio como la Indometacina.
59
120
100
% de Inhibicin
80
60
40 y = 1793.8x + 11.903
R = 0.9925
20
0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
Concentracin trolox (mM/mL)
60
5.5.2. Actividad antioxidante por el mtodo 2,2-Difenil-1-picrilhidrazilo
(DPPH)
100
90
80
70
60
%AAO
50
40
y = 423.86x + 24.09
R = 0.9968
30
20
10
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2
Concentacin Vitamina C (mg/mL)
61
Tabla 25. Porcentaje de actividad antioxidante (DPPH)
Concentracin
Absorbancia
Extracto %AAO Vitamina C
734 nm
(mg/mL)
Hoja de Achillea millefolium 0.456 80.0003.508 0.1320.008
Flor de Achillea millefolium 0.311 54.6490.438 0.0720.001
Hoja de Portulaca oleracea 0.243 42.6311.053 0.0440.002
Tallo de Portulaca oleracea 0.277 48.6841.316 0.0580.002
Flor de Portulaca oleracea 0.188 32.9820.351 0.0210.001
Esta prueba como ya se haba mencionado determina la capacidad que tienen los
extractos de estabilizar radicales libres y de esta manera ayudar al organismo ya
que se dice que cada vez que se logra estabilizar este tipo de molculas las
clulas del cuerpo sufren deterioros, es por ello que se da el proceso de
envejecimiento, por lo tanto la ingesta de este tipo de extractos es muy importante.
62
principalmente a la presencia de compuestos fenlicos como flavonoides, taninos,
cumarinas y los mismos fenoles y respecto a las cantidades obtenidas en las
cuantificaciones los extractos tienen cantidades significativas.
63
CAPTULO VIII. RECOMENDACIONES FUTURAS
64
ANEXOS
1) Preparacin de reactivos usados en el tamiz fitoqumico
65
Ferrocianuro de potasio al 1%: 0.5 g de ferrocianuro de potasio en 50 mL
de agua destilada.
Clorhidrato de hidroxilamina 2 N: 1.7375 g en 50 mL de agua destilada.
Reactivo de Sonneschain: solucin saturada de molibdato de amonio en
agua se aade lentamente a una solucin saturada de fosfato disdico a
40C, se forma un precipitado, este precipitado se lava con agua y se pasa
a un vaso donde se agrega una solucin concentrada de carbonato de
calcio.
Nota: se agregan 2.2 g de molibdato de amonio, 1.4 g de fosfato disdico y
20 g de carbonato de calcio.
66
REFERENCIAS
67
departamento de sucre sobre bacterias y levaduras patgenas. Revista
Colombiana cienc. Anim., (1), pp. 90-101.
12. Rzedowski, G. C. de y J. Rzedowski, (2001). Flora fanerogmica del Valle
de Mxico (2a Ed). Ptzcuaro, Michoacn, Mxico, Instituto de Ecologa y
Comisin Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad.
13. R. OKennedy, R. Thomes. (1997) Coumarins: Biology, Applications and
mode of action, John Wiley & Sons, Chichester.
14. Santamara, L. (2011). Evaluacin de la actividad antiinflamatoria de los
extractos de verdolaga (Portulaca oleracea) en ratas (Rattus Novergicus)
con edema inducido con carragenina. Escuela Superior Politcnica de
Chimborazo.
15. Tortora, G. J.; Grabowski, S.R. (2002). Principios de Anatoma y Fisiologa.
Mxico. Editorial OXFORD UNIVERSITY PRESS.
16. Valencia, C. (1995). Fundamentos de Fitoqumica. D.F., Mxico. Editorial
Trillas.
17. Vibrans, H., Tenorio, P. (2009). Melazas de Mxico, fichas de especies.
Recuperado de CONABIO. Colegio de Posgraduados
http://www.conabio.gob.mx/malezasdemexico/asteraceae/achillea-
millefolium/fichas/ficha.htm
18. Villaseor Ros, J. L. y F. J. Espinosa Garca, (1998). Catlogo de malezas
de Mxico. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Mxico, D.F.,
Consejo Nacional Consultivo Fitosanitario y Fondo de Cultura Econmica.
19. Yuequin, Z. (2007). Identificacin y actividad farmacolgica de principios de
especies antiinflamatorias. Universitat de Valencia.
68