t3

11 Nmero de publicacin: 2 261 200
19 OFICINA ESPAOLA DE
PATENTES Y MARCAS
51 Int. Cl.:
C12N 9/12 (2006.01)
ESPAA A61K 38/45 (2006.01)
C07K 16/18 (2006.01)
C07K 16/40 (2006.01)

12 TRADUCCIN DE PATENTE EUROPEA T3

86 Nmero de solicitud europea: 00926537 .2

86 Fecha de presentacin : 12.05.2000

87 Nmero de publicacin de la solicitud: 1192247

87 Fecha de publicacin de la solicitud: 03.04.2002

54 Ttulo: Enzima esfingosina quinasa.

30 Prioridad: 13.05.1999 AU PQ0339/99
73 Titular/es: Johnson & Johnson Pharmaceutical
08.07.1999 AU PQ1504/99 Research and Development L.L.C.
1000 Route 202
Raritan, New Jersey 08869, US

45 Fecha de publicacin de la mencin BOPI:
72 Inventor/es: Pitson, Stuart, Maxwell;
16.11.2006 Wattenberg, Brian, Wolff;
Xia, Pu;
DAndrea, Richard, James;
Gamble, Jennifer, Ruth y
Vadas, Mathew, Alexander

45 Fecha de la publicacin del folleto de la patente:
74 Agente: Carvajal y Urquijo, Isabel
16.11.2006
ES 2 261 200 T3
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicacin en el Boletn europeo de patentes, de
la mencin de concesin de la patente europea, cualquier persona podr oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposicin deber formularse por escrito y estar motivada; slo se
considerar como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposicin (art. 99.1 del
Convenio sobre concesin de Patentes Europeas).
Venta de fascculos: Oficina Espaola de Patentes y Marcas. P de la Castellana, 75 28071 Madrid
ES 2 261 200 T3
DESCRIPCIN
Enzima esfingosina quinasa.
5 Campo de la invencin
La presente invencin se relaciona generalmente con nuevas molculas de protena y con derivados, anlogos,
equivalentes qumicos y mimticos de los mismos capaces de modular la actividad celular y, en particular, modular
la actividad celular a travs de la modulacin de transduccin de la seal. Ms particularmente, la presente invencin
10 se relaciona con la esfingosina quinasa humana y con derivados, anlogos, equivalentes qumicos y mimticos de los
mismos. La presente invencin tambin contempla secuencias genticas, que codifican a dichas molculas protena y
derivados, anlogos, equivalentes qumicos y mimticos de los mismos. Las molculas de la presente invencin son
tiles en un rango de aplicaciones teraputicas, profilcticas y de diagnstico.
15 Antecedentes de la invencin
Los detalles bibliogrficos de las publicaciones referidas por el autor en estas especificaciones se recogen alfabti-
camente al final de la descripcin.
20 La esfingosina quinasa es una enzima reguladora clave en una variedad de respuestas celulares. Su actividad puede
afectar la inflamacin, apoptosis y proliferacin celular y por lo tanto es un objetivo importante para intervencin
teraputica.
La esfingosina-1-fosfato es conocida por ser un importante segundo mensajero en la transduccin de seales (Me-
25 yer y colaboradores, 1997). Es mitognico en diferentes tipos de clulas (Alessenko, 1998; Spiegel y colaboradores,
1998) y parece disparar un rango diverso de importantes rutas reguladoras, incluida la prevencin de la apoptosis
inducida por la ceramida (Culliver y colaboradores, 1996), movilizacin del calcio intracelular por medio de una ruta
independiente IP3 , estimulacin de la sntesis de ADN, activacin de la ruta de la protena quinasa (MAP) activada por
mitgeno, activacin de la fosfolipasa D, y regulacin de la motilidad celular (para revisin ver Meyer y colaboradores,
30 1997; Spiegel y colaboradores, 1998; Igarashi, 1997).
Estudios recientes (Xia y colaboradores, 1998) han mostrado que la esfingosina-1-fosfato es un intermediario obli-
gatorio de sealamiento en la respuesta inflamatoria de las clulas endoteliales vasculares para el factor de necrosis
tumoral (TNF-). A pesar de su importancia obvia, se sabe muy poco de los mecanismos que controlan los niveles
35 de esfingosina-1-fosfato. Se sabe que los niveles de esfingosina-1-fosfato en la clula son mediados mayormente por
su formacin desde la esfingosina por la esfingosina quinasa, y en menor medida por su degradacin por el fosfato
de esfingosina-1-fosfato y la liasa de la esfingosina-1-fosfato asociadas al retculo endoplasmtico (Spiegel y cola-
boradores, 1998). Los niveles basales de la esfingosina-1-fosfato en la clula son generalmente bajos, pero pueden
incrementarse rpidamente y en forma transitoria cuando las clulas se exponen a agentes mitognicos. Esta respuesta
40 parece correlacionada con un incremento en la actividad de la esfingosina quinasa en el citosol y puede prevenirse
por medio de la adicin de las molculas inhibidoras de la esfingosina quinasa N,N-dimetilesfingosina y DL-treo-
dihidroesfingosina. Esto indica que la esfingosina quinasa es una molcula importante responsable de la regulacin de
los niveles celulares de la esfingosina-1-fosfato. Esto coloca a la esfingosina quinasa en un papel central y obligatorio
en la mediacin de los efectos atribuidos a la esfingosina-1-fosfato en la clula.
45
Por lo tanto, existe la necesidad de identificar y de clonar nuevas molculas de esfingosina quinasa para facilitar
el progreso hacia el control ms sensible de la seal intracelular a travs de transduccin, por ejemplo, la elucidacin
del mecanismo que controla la expresin y la actividad enzimtica de la esfingosina quinasa proveyendo as una
plataforma para el desarrollo de terapias de intervencin para regular la expresin o actividad de la esfingosina quinasa.
50 En el trabajo que conduce a la presente invencin, los inventores han purificado y clonado una nueva molcula de
esfingosina quinasa.
Resumen de la invencin
55 La especificacin del objetivo contiene informacin sobre la secuencia de aminocidos y de nucletidos preparada
utilizando el programa Patentin Versin 2.0, presentado aqu despus de la bibliografa: cada secuencia de aminocidos
o nucletidos se identifica en el listado de secuencia por medio del indicador numrico <210> seguido por el identi-
ficador de secuencia (por ejemplo, <210>1, <210>2, etc.). La longitud, el tipo de secuencia (ADN, protena (PRT),
etc.) y el organismo fuente para cada secuencia de aminocidos o nucletidos se indican por medio de la informacin
60 suministrada en los campos del indicador numrico <11>, <212> y <213>, respectivamente. Las secuencias de ami-
nocidos y de nucletidos mencionadas en la especificacin se definen por medio de la informacin suministrada en el
campo del indicador numrico <400> seguido por el identificador de secuencia (por ejemplo, <400>1, <400>2, etc.).
A travs de toda esta descripcin y de las reivindicaciones que le siguen, a manos que el contexto lo requiera de
65 otra manera, la palabra incluye, y variaciones tales como que incluye y que comprende, debern entenderse que
implican la inclusin de un entero establecido o etapa o grupo de enteros o de etapas, pero no la exclusin de cualquier
otro entero o etapa o grupo de enteros o de etapas.
2
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Un aspecto de la presente invencin provee una molcula aislada de cido nucleico que incluye una secuencia
de nucletidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica a una nueva protena de esfingosina
quinasa, la molcula de cido nucleico que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1.
5 An otro aspecto adicional de la presente invencin incluye una secuencia de aminocidos expuesta en <400>2.
An otro aspecto adicional de la presente invencin se relaciona con el uso de un antagonista de esfingosina
quinasa seleccionado de los cidos nucleicos antisentido, anticuerpos, ARN, ADNzimas, y aptmeros de ARN en
la fabricacin de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por la actividad de la esfin-
10 gosina quinasa, tal como artritis reumatoide, asma, arteriosclerosis, meningitis, esclerosis mltiple, choque sptico,
inflamacin, proliferacin celular y apoptosis.
Las abreviaturas de una y de tres letras utilizadas a todo lo largo de la descripcin se definen en la Tabla 1.
15
TABLA 1
Abreviaturas de los aminocidos de una y de tres letras
20
Aminocido Abreviatura de tres letras Smbolo de una letra
Alanina Ala A
Arginina Arg R
25 Asparagina Asn N
cido asprtico Asp D
Cistena Cys C
Glutamina Gln Q
30 cido glutmico Glu E
Glicina Gly G
Histidina His H
Isoleucina Ile I
35
Leucina Leu L
Lisina Lys K
Metionina Met M
Fenilalanina Phe F
Prolina Pro P
40
Serina Ser S
Treonina The T
Triptfano Trp W
Tirosina Tyr Y
45 Valina Val V
Cualquier residuo Xaa X
50
Breve descripcin de los dibujos
La Figura 1 es una representacin esquemtica de la ruta de la Esfingomielina.
55 La Figura 2 es una representacin grfica de una cromatografa de intercambio aninico de esfingosina quinasa
humana. A, Cromatografa de intercambio aninico con flujo rpido sobre Sefarosa Q de la fraccin precipitada (NH4 )2
SO4 del extracto de placenta humana que muestra dos picos de actividad de la esfingosina quinasa. Los extractos se
aplicaron en amortiguador A y se evalu la actividad de la esfingosina quinasa () con un gradiente de NaCl de 0 a
1M (----). La protena eluida fue seguida por medio de absorbancia a 280 nm (----).
60
La Figura 3 es una representacin grfica de la purificacin de placenta humana SK1 por medio de cromatografa
de intercambio aninico. La purificacin sobre una columna Mono-Q se mejora por medio de una nueva aplicacin
y elucin en la misma columna en presencia de ATP. A, Las fracciones de la columna de calmodulina-Sefarosa 4b
que contena actividad de esfingosina quinasa fueron reunidas, desalinizadas y aplicadas a la columna Mono-Q en
65 amortiguador A con ATP 1 mM y Mgl2 4 mM. En ambos casos la actividad de la esfingosina quinasa () se eluy con
un gradiente de NaCl de 0 a 1M (----), con elucin de protena seguida de absorbancia a 280 nm (----).
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La Figura 4 es una imagen de SDS-PAGE de esfingosina quinasa purificada de placenta humana. La fraccin
de la columna Superdex 75 contena la actividad ms alta de la esfingosina quinasa fue aplicada al SDS-PAGE con
coloracin de plata, produciendo una banda nica de 45 kDa.
5 La Figura 5 es una representacin grfica de una cromatografa preparativa de intercambio aninico. Solamente
est presente una isoforma de esfingosina quinasa identificada cromatogrficamente en HUVEC. La cromatografa
preparativa de intercambio aninico con columnas HiTrap-Q de placenta humana, HUVEC y extractos de HUVEC
tratados con TNF muestran, en HUVEC, la presencia de un pico sencillo de esfingosina quinasa que incrementa
su actividad despus del tratamiento de las clulas con TNF. Las clulas fueron cosechadas, lisadas y los extractos
10 solubles aplicados a la columna HiTrap-Q en amortiguador A. La actividad total de la esfingosina quinasa en placenta
humana, HUVEC y los extractos de HUVEC tratados con TNF fue de 51, 78 y 136 U/mg de protena, respectiva-
mente. La actividad de la esfingosina quinasa () se eluy con un gradiente de NaCl de 0 a 1M (----).
La Figura 6 es una representacin esquemtica de la estrategia utilizada para clonar esfingosina quinasa (SPHK) a
15 partir de HUVEC.
La Figura 7 es una representacin esquemtica de las secuencias del nucletido (<400>1) y del aminocido dedu-
cido (<400>2) y la estructura del dominio putativo de esfingosina quinasa humana. A, secuencia de cidos nucleicos
del ADNc y la secuencia deducida de los aminocidos de hSK. Los aminocidos se numeran desde el primer residuo
20 de metionina. El codn de detencin se indica por medio de un asterisco. La regin de codificacin de la esfingosina
quinasa est en letras maysculas (nucletidos 33-1197), mientras que las letras minsculas denotan una secuencia
no traducida y del vector. B, Representacin esquemtica de esfingosina quinasa humana que muestra las ubicaciones
del PKC putativo y los sitios de fosforilacin CKII, un posible sitio de N-miristoilacin, motivos de enlazamiento de
calcio/calmodulina y la regin con similitud para el dominio putativo cataltico de DGK.
25
La Figura 8 es una representacin grfica de la expresin y la estimulacin de TNF de la actividad de la es-
fingosina quinasa humana en clulas HEK293. Las clulas HEK293 transfectadas en forma transitoria ya sea con el
vector de expresin vaco de de ADNpc solamente (A) o con el ADNc de la esfingosina quinasa humana que contiene
ADNpc (B). Las clulas transfectadas fuero o tratadas o no tratadas con TNF durante 10 min, cosechadas y se deter-
30 min la actividad de la esfingosina quinasa en lisados celulares. Los resultados son la media de los duplicados y son
representativos de tres experimentos independientes.
La Figura 9 es una representacin esquemtica de la comparacin de la secuencia de la esfingosina quinasa humana

con otras esfingosina quinasas conocidas y putativas. La comparacin de la secuencia de aminocidos de la esfingosina
35 quinasa humana deducida con las secuencias de aminocidos de las esfingosina quinasas de murino (MSK1a y mSK1b;
Kohama y colaboradores, 1998) y S. cerevisiae (LCB4 y LCB5; Nagiec y colaboradores, 1998), y las secuencias EST
de las esfingosina quinasas putativas de S. pombe y C. elegans (nmeros de acceso Z98762 y Z66494 del GenbankTM ,
respectivamente). Aunque la similitud en la secuencia de aminocidos con la esfingosina quinasa humana fue alta
(identidad del 36%), la secuencia de la esfingosina quinasa putativa de A. thaliana (nmero de acceso AL022603 del
40 GenbankTM ) dio una alineacin relativamente pobre y por claridad, no se muestra. La secuencia de consenso representa
aminocidos que se conservan en al menos seis de las siete secuencias alineadas, mientras que la conservacin de los
aminocidos estructuralmente similares se denota con un asterisco. La alineacin mltiple de la secuencia se realiz
con CLUSTALW, y los porcentajes de identidades con la esfingosina quinasa humana se determinaron utilizando el
algoritmo GAP (Needleman & Wunsch, 1970).
45
La Figura 10 es una imagen de la expresin de la esfingosina quinasa humana recombinante en E. coli BL21. E.
coli BL21 fue transformada con la construccin de la expresin de la esfingosina quinasa humana pGEX4-2T y la
expresin de la protena de fusin GST-SK analizada despus de la induccin con IPTG 100 M. A, La actividad
de la esfingosina quinasa en extractos celulares de E. coli BL21 inducido con IPTG y no inducido. B, El gel SDS-
50 PAGE coloreado con Coomassie muestra la expresin de la protena de fusin GST-SK en lisados de clulas de E. coli.
C, Pureza de la esfingosina quinasa humana recombinante aislada. La fraccin de la columna Mono-Q que contiene
actividad de esfingosina quinasa fue aplicada a SDS-PAGE con coloracin de plata produciendo una banda nica de
45 kDa.
55 La Figura 11 es una imagen de la purificacin de la esfingosina quinasa humana recombinante. La calmodulina

Sefarosa 4B permite la separacin de la enzima activa y la inactiva. La protena de fusin GST-SK fue parcialmente
purificada utilizando glutationa-Sefarosa 4B, escindida por medio de trombina y aplicada a la columna de calmodulina-
Sefarosa 4B en Amortiguador B que contiene CaCl2 4 mM. La elucin () de la esfingosina quinasa activa enlazada
a la columna se llev a cabo con Amortiguador A que contena EGTA 2 mM y NaCl 1M. A, Anlisis SDS-PAGE
60 de las fracciones eluidas de la columna de calmodulina-Sefarosa 4B. B, La actividad de la esfingosina quinasa (|) en
fracciones de la columna que muestran la mayor parte de la protena esfingosina quinasa humana recombinante no se
enlaz a la columna y no mostr actividad cataltica.
La Figura 12 es una representacin grfica de las propiedades fisicoqumicas de las esfingosina quinasas nativa
65 y recombinante. A, pH ptimos. El efecto del pH sobre la actividad de SK se determin por medio del ensayo de la
actividad sobre el rango de pH de 4 a 11 en amortiguadores de 50 mM (acetato de sodio, pH 4,0-,0; Mes, pH 6,0-
7,0; hepes, pH 7,0-8,2; Tris/HCl, pH 8,2-10,0; Caps, pH 10,0-11,0). B, Estabilidad del pH. Los datos mostrados son
la actividad restante de SK despus de preincubacin de las enzimas a diferentes temperaturas (4 a 80C) durante 30
4
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min a pH 7,4 (Tris/HCl 50 mM conteniendo 10% de glicerol, NaCl 0,5M y 0,05% de Triton X-100). D, requerimiento
de in metlico. Los diferentes iones metlicos o EDTA se suministraron en la mezcla de ensayo a una concentracin
final de 10 mM. En todos los casos, las actividades mximas de las esfingosina quinasas nativa ( y barras rellenas)
y recombinante ( y barras abiertas) se establecieron arbitrariamente en 100% y corresponden a 2,65 kU y 7,43 kU,
5 respectivamente. Los datos son la media S.D.
La Figura 13 es una representacin grfica de la especificidad y cintica del sustrato de las esfingosina quinasas
nativa y recombinante. A, Especificidad del sustrato de las esfingosina quinasas nativa (barras rellenas) y recombinante
(barras abiertas) con anlogos de esfingosina y otros lpidos suministrados a 100 M en 0,25% de Triton X-100. Las
10 tasas de fosforilacin de la esfingosina por las Sks nativa y recombinante se establecieron arbitrariamente en 100%
y corresponden a 2,65 kU y 7,43 kU, respectivamente. La actividad contra otros sustratos potenciales se expres
en forma relativa a la actividad contra la esfingosina. No se observ fosforilacin con DL-treo-dihidroesfingosina,
N,N-dimetilesfingosina, N,N,N-trimetilesfingosina, N-acetilesfingosina (ceramida C2 ), diacilglicerol (1,2-dioctanoil-
sn-glicerol y 1,2-dioleoil-sn-glicerol), y fosfatidilinositol. B, Cinticas de sustrato de la esfingosina quinasa humana
15 recombinante con esfingosina () y D-eritro-dihidroesfingosina () como sustratos. C, Cinticas si la inhibicin de la
esfingosina quinasa humana recombinante con N,N,N-trimetilesfingosina a 5 M () y 25 M (H) y en ausencia de
N,N,N-trimetilesfingosina (). Intercalacin: Grfica de Lineweaver-Burk. Los datos son la media S.D.
La Figura 14 es una representacin grfica de los fosfolpidos cidos que estimulan la actividad de las esfingosina
20 quinasas nativa y recombinante. El efecto de diferentes esfingolpidos sobre la actividad de las esfingosina quinasas
nativa y recombinante se determin por medio de ensayos de la actividad bajo condiciones estndar en presencia de
esos fosfolpidos con 10 mol % de Triton X-100. Las actividades de la esfingosina quinasas nativa (barras rellenas)
y recombinante (barras abiertas) en ausencia de fosfolpidos se establecieron arbitrariamente en 100% y correspon-
den a 2,65 kU y 7,43 kU, respectivamente. PC, fosfatidilcolina; PS, fosfatidilserina; PE, fosfatidiletanolamina; PI,
25 fosfatidilinositol; PA, cido fosfatdico. Los datos son la media = S.D.
Descripcin detallada de la invencin
La presente invencin, se basa, en parte, en la purificacin y clonacin de una nueva molcula de esfingosina qui-
30 nasa. La identificacin de esta nueva molcula permite la identificacin y el diseo racional de un rango de productos
para ser usados en terapia, diagnstico y generacin de anticuerpos, por ejemplo para ser usados en transduccin de
seales. Estas molculas teraputicas pueden actuar tambin ya sea como antagonistas o como agonistas de la funcin
de la esfingosina quinasa y sern tiles, entre otros, en la modulacin de la activacin celular en el tratamiento de
condiciones de enfermedad caracterizadas por actividad celular indeseada.
35
Por lo tanto, un aspecto de la presente invencin provee una molcula una molcula aislada de cido nucleico
o derivado o anlogo de la misma que comprende una secuencia de nucletidos que codifica o complementa a una
secuencia que codifica a una nueva protena de esfingosina quinasa o un derivado o mimtico de dicha protena de
40
La referencia a la esfingosina quinasa debe entenderse como una referencia a la molcula que est, entre otras,
involucrada en la generacin de la esfingosina-1-fosfato durante la activacin de la ruta de sealamiento de la es-
fingosina quinasa. La referencia a la esfingosina quinasa en letra itlica debe entenderse como una referencia a la
molcula de cido nucleico de esfingosina quinasa. La referencia a la esfingosina quinasa en letra no itlica debe
45 entenderse como una referencia a la molcula de protena de esfingosina quinasa.
Ms particularmente, la presente invencin provee una molcula de cido nucleico aislada o derivada o anloga de
la misma que comprende una secuencia de nucletidos que codifica a una secuencia complementaria que codifica a
una protena de esfingosina quinasa humana o a un derivado o mimtico de dicha protena de esfingosina quinasa.
50
En una modalidad preferida, la presente invencin provee una molcula de cido nucleico o derivado o anlogo de
la misma que comprende una secuencia de nucletidos que codifica, o a una secuencia de nucletidos complementaria
a una secuencia de nucletidos que codifica, a una secuencia de aminocidos sustancialmente como la expuesta en
<400>2.
55
El trmino semejanza como se lo utiliza aqu, incluye la identidad exacta entre las secuencias comparadas en
el nucletido o a nivel de aminocidos. En donde no existe identidad a nivel de nucletidos, semejanza incluye
diferencias entre secuencias que resultan en diferentes aminocidos que sin embargo estn relacionados entre si a
nivel estructural, funcional, bioqumico y/o conformacional. El porcentaje de semejanza puede ser mayor al 50%, tal
60 como al menos el 70% o al menos el 80%, o al menos el 90%, o al menos el 95% o superior.
Otro aspecto de la presente invencin contempla una molcula de cido nucleico o derivado o anlogo de la misma
que comprende una secuencia de nucletidos sustancialmente como la expuesta en <400>1.
65 La referencia aqu a una baja escasez incluye y abarca desde aproximadamente al menos 0% v/v hasta aproxima-
damente al menos 15% v/v de formamida y al menos desde aproximadamente al menos 1M hasta aproximadamente al
menos 2M de sal para hibridacin, y aproximadamente al menos 1M hasta aproximadamente al menos 2M de sal para
condiciones de lavado. Pueden aplicarse condiciones de escasez alternativa en donde necesariamente, tal como la es-
5
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casez de medio, que incluye y barca desde aproximadamente al menos 16% v/v hasta aproximadamente al menos 30%
v/v de formamida y desde aproximadamente al menos 0,5M hasta aproximadamente al menos 0,9M de sal para hi-
bridacin, y aproximadamente al menos 0,5M hasta aproximadamente al menos 0,5 hasta aproximadamente al menos
0,9M de sal para condiciones para lavado, o alta escasez, que incluye y abarca desde aproximadamente al menos 31%
5 v/v hasta aproximadamente al menos 50% v/v de formamida y desde aproximadamente al menos 0,01M hasta apro-
ximadamente al menos 0,15M de sal para hibridacin, y aproximadamente al menos 0,01M hasta aproximadamente
al menos 0,15M de sal para condiciones de lavado. La escasez puede medirse utilizando un rango de temperatura tal
como aproximadamente desde 40C hasta aproximadamente 65C. Las condiciones de escasez particularmente tiles
son a 42C.
10
Ms particularmente, la presente invencin contempla una molcula de cido nucleico que comprende una secuen-
cia de nucletidos sustancialmente como la expuesta en <400>1.
La molcula de cido nucleico de acuerdo con este aspecto de la presente invencin corresponde aqu a esfingosina
15 quinasa humana. Sin limitar la presente invencin a ninguna teora o forma de accin, la protena codificada por la
esfingosina quinasa es un elemento clave en el funcionamiento de la ruta de sealamiento de la esfingosina quinasa.
La esfingosina quinasa acta para facilitar la generacin del segundo mensajero, esfingosina-1-fosfato, y puede ser
activado por medio de:
20 (a) modificaciones posteriores a la traduccin tales como fosforilacin o escisin proteoltica;
(b) interacciones protena-protena tales como dimerizacin, e interacciones mediadas por el receptor acoplado
a la protena G;
25 (c) eventos de transposicin en donde la enzima se dirige a un ambiente que incrementa la actividad cataltica
o permite el acceso a su sustrato.
El producto de expresin de la molcula de cido nucleico de la esfingosina quinasa humana es esfingosina quinasa
humana. La esfingosina quinasa se define por medio de la secuencia de aminocidos expuesta en <400>2. La secuen-
30 cia de ADNc para la esfingosina quinasa se define por medio de la secuencia de nucletidos expuesta en <400>1. La
molcula de cido nucleico que codifica a la esfingosina quinasa es preferiblemente una secuencia de cidos desoxirri-
bonucleicos tal como la secuencia de ADNc o una secuencia genmica. Una secuencia genmica puede comprender
tambin exones e intrones. Una secuencia genmica puede incluir tambin una regin promotora u otras regiones
reguladoras.
35
La referencia aqu a esfingosina quinasa y a esfingosina quinasa debe entenderse como una referencia a todas
las formas de esfingosina quinasa humana y esfingosina quinasa, respectivamente, incluido, por ejemplo, cualquier
pptido e isoformas de ADNc que surgen del empalme alternativo de ARNm de esfingosina quinasa, mutantes o
variantes polimrficas de esfingosina quinasa o esfingosina quinasa, la forma modificada de la traduccin posterior de
40 la esfingosina quinasa o La forma modificada sin traduccin posterior de la esfingosina quinasa. Para la extensin que
no se especifica, la referencia que se hace aqu a la esfingosina quinasa y a la esfingosina quinasa incluye la referencia
a los derivados, anlogos, equivalentes qumicos y mimticos de los mismos.
La protena y/o el gen son preferiblemente de humano. Sin embargo, la protena y/o l gen pueden aislarse tambin
45 a partir de otras especies animales o no animales.
Los derivados incluyen fragmentos, partes, porciones, mutantes, variantes y mimticos a partir de fuentes natura-
les, sintticas o recombinantes incluidas las protenas de fusin. Las partes o los fragmentos incluyen, por ejemplo,
regiones activas de esfingosina quinasa. Los derivados pueden derivarse de insercin, supresin o sustitucin de ami-
50 nocidos. Los derivados por insercin de aminocidos incluyen fusiones terminales amino y/o carboxlicas as como
inserciones intrasecuencia de aminocidos sencillos o mltiples. Las variantes de secuencia de aminocidos por in-
sercin son aquellas en las cuales uno o ms residuos de aminocidos se introducen en un sitio predeterminado en
la protena, aunque la insercin aleatoria tambin es posible con muestreo adecuado del producto resultante. Las va-
riantes por supresin se caracterizan por la remocin de uno o ms aminocidos de la secuencia. Las variantes de
55 aminocidos por sustitucin son aquellas en las cuales se ha removido al menos un residuo en la secuencia y se ha in-
sertado un residuo diferente en su lugar. Un ejemplo de variantes de aminocidos por sustitucin son las sustituciones
conservadoras de aminocidos. Las sustituciones conservadoras de aminocidos incluyen tpicamente sustituciones
dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; cido asprtico y cido glutmico; as-
paragina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Las adiciones a las secuencias de
60 aminocidos incluyen fusiones con otros pptidos, polipptidos o protenas.
Los equivalentes qumicos y funcionales de esfingosina quinasa o esfingosina quinasa deben entenderse como
molculas que exhiben una cualquiera o ms de las actividades funcionales de esfingosina quinasa o esfingosina
quinasa y pueden derivarse de cualquier fuente tal como ser qumicamente sintetizada o identificada a travs de un
65 proceso de muestreo tal como el muestreo del producto natural.
Los derivados de esfingosina quinasa incluyen fragmentos que tienen eptopos particulares o partes de la protena
esfingosina quinasa completa fusionada a pptidos, polipptidos u otras molculas proteinceas o no proteinceas.
6
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Los anlogos de esfingosina quinasa contemplados aqu incluyen, pero no se limitan a, modificaciones a cadenas
laterales, incorporacin de aminocidos no naturales y/o sus derivados durante la sntesis de pptidos, polipptidos o
protenas y el uso de entrelazadores y otros mtodos que imponen restricciones conformacionales sobre las molculas
proteinceas o sus anlogos.
5
Los derivados de las secuencias de cido nucleico pueden derivarse en forma similar de sustituciones sencillas o
mltiples de nucletidos, supresiones y/o adiciones que incluyen fusin con otras molculas de cido nucleico. Los
derivados de las molculas de cido nucleico de la presente invencin incluyen oligonucletidos, iniciadores de PCR,
molculas antisentido, molculas adecuadas para uso en cosupresin y fusin de molculas de cido nucleico. Los
10 derivados de las secuencias de cido nucleico tambin incluyen variantes degeneradas.
Los ejemplos de modificaciones de cadena lateral contempladas por la presente invencin incluyen modificaciones
de grupos amino tale como por medio de alquilacin reductiva por reaccin con un aldehdo seguido por reduccin
con NaBH4 ; amidacin con metilacetimidato; acilacin con anhdrido actico; carbamoilacin de grupos amino con
15 cianato; trinitrobencilacin de grupos mino con cido 2,4,6-trinitrobenceno sulfnico (TNBS); acilacin de grupos
amino con anhdrido succnico y anhdrido tetrahidroftlico, y piridoxilacin de lisina con piridoxal-5-fosfato seguido
por reduccin con NaBH4 .
El grupo guanidina de los residuos de arginina puede ser modificado por medio de la formacin de productos de
20 condensacin heterocclica con reactivos tales como 2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.
El grupo carboxlico puede ser modificado por medio de activacin con carbodiimida a travs de la formacin de
O-acilisourea seguido por derivacin posterior, por ejemplo, a una amida correspondiente.
25 Los grupos sulfhidrilo pueden ser modificados por medio de mtodos tales como carboximetilacin con cido yo-
doactico o yodoacetamida; oxidacin con cido perfrmico a cido cistico, formacin de disulfuros mezclados con
otros compuestos tiol; la reaccin con maleimida, anhdrido malico u otra maleimida sustituida; formacin de deriva-
dos mercuriales utilizando 4-cloromercuribenzoato, cido 4-cloromercurifenilsulfnico, cloruro de fenilmercurio, 2-
cloromercurio-4-nitrofenol y otros mercuriales; carbamoilacin con cianato a pH alcalino.
30
Los residuos de triptfano pueden modificarse, por ejemplo, por medio de oxidacin con N-bromosuccinimida o
alquilacin del anillo de indol con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfenilo. Los residuos de torosina
por otro lado, pueden ser alterados por nitracin con tetranitrometano para formar un derivado 3-nitrotirosina.
35 La modificacin del anillo de imidazol de un residuo de histidina puede lograrse por medio de alquilacin con
derivados de cido yodoactico o N-carboetoxilacin con dietilpirocarbonato.
Ejemplos de la incorporacin de aminocidos no naturales y de derivados durante la sntesis de protenas incluyen,

pero no se limitan a, el uso de norleucina, cido 4-aminobutrico, cido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanico, cido 6-
40 aminohexanico, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, cido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptani-
co, 2-tienil alanina y/o ismeros D de aminocidos. Una lista de los aminocidos no naturales contemplados aqu se
muestra en la Tabla 2.
45 TABLA 2
Aminocidos no convencionales Cdigo Aminocidos no convencionales Cdigo
50 cido -aminobutrico Abu L-N-metilalanina Nmala

-amino--metilbutirato Mgabu L-N-metilarginina Nmarg
aminociclopropano-carboxilato Cpro L-N-metilasparagina Nmasn
cido aminoisobutrico Aib cido L-N-metilasprtico Nmasp
55
aminonorbornil-carboxilato Norb L-N-metilcistena Nmcys
ciclohexilalanina L-N-metilglutamina Nmgln
ciclopentilalanina Cpen cido L-N-metilglutmico Nmglu
D-alanina Dal Chexa L-N-metilhistidina Nmhis
D-arginina Darg L-N-metilisoleucina Nmile
60
D-cido asprtico Dasp L-N-metilleucina Nmleu
D-cistena Dcys L-N-metillisina Nmlys
D-glutamina Dgln L-N-metilmetionina Nmmet
D-cido glutmico Dglu L-N-metilnorleucina Nmnle
65 D-histidina Dhis L-N-metilnorvalina Nmnva
D-isoleucina Dile L-N-metilornitina Nmorn
7
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TABLA 2 (continuacin)

5
D-leucina Dleu L-N-metilfenilalanina Nmphe
D-lisina Dlys L-N-metilprolina Nmpro
D-metionina Dmet L-N-metilserina Nmser
D-omitina Dom L-N-metiltreonina Nmthr
10
D-fenilalanina Dphe L-N-metiltriptfano Nmtrp
D-prolina Dpro L-N-metiltirosina Nmtyr
D-serina Dser L-N-metilvalina Nmval
D-treonina Dthr L-N-metiletilglicina Nmetg
15 D-triptfano Dtrp L-N-metil-t-butilglicina Nmtbug
D-tirosina Dtyr L-norleucina Nle
D-valina Dval L-norvalina Nva
D--metilalanina Dmala -metil-aminoisobutirato Maib
20 D--metilarginina Dmarg -metil--aminobutirato Mgabu
D--metilasparagina Dmasn -metilciclohexilalanina Mchexa
D--metilaspartato Dmasp -metilciclofenilalanina Mcpen
D--metilcistena Dmcys -metil--naftilalanina Manap
25 D--metilglutamina Dmgln -metilpenicilamina Mpen
D--metilhistidina Dmhis N-(4-aminobutil)glicina Nglu
D--metilisoleucina Dmile N-(2-aminoetil)glicina Naeg
D--metilleucina Dmleu N-(3-aminopropil)glicina Norn
30 D--metillisina Dmlys N-amino--metilbutirato Nmaabu
D--metilmetionina Dmmet -naftilalanina Anap
D--metilomitina Dmorn N-bencilglicina Nphe
D--metilfenilalanina Dmphe N-(2-carbamiletil)glicina Ngln
35
D--metilprolina Dmpro N-(carbamilmetil)glicina Nasn
D--metilserina Dmser N-(2-carboxietil)glicina Nglu
D--metiltreonina Dmthr N-(carboximetil)glicina Nasp
D--metiltriptofano Dmtrp N-ciclobutilglicina Ncbut
D--metiltirosina Dmty N-cicloheptilglicina Nchep
40
D--metilvalina Dmval N-ciclohexilglicina Nchex
D-N-metilalanina Dnmala N-ciclodecilglicina Ncdec
D-N-metilarginina Dnmarg N-ciclododecilglicina Ncdod
D-N-metilasparagina Dnmasn N-ciclooctilglicina Ncoct
45 D-N-metilaspartato Dnmasp N-ciclopropilglicina Ncpro
D-N-metilcistena Dnmcys N-cicloundecilglicina Ncund
D-N-metilglutamina Dnmgln N-(2,2-difeniletil)glicina Nbhm
D-N-metilglutamato Dnmglu N-(3,3-difenilpropil)glicina Nbhe
50 D-N-metilhistidina Dnmhis N-(3-guanidinopropil)glicina Narg
D-N-metilisoleucina Dnmile N-(1-hidroxietil)glicina Nthr
D-N-metilleucina Dnmleu N-(hidroxietil)glicina Nser
D-N-metillisina Dnmlys N-(imidazoliletil)glicina Nhis
55 N-metilciclohexilalanina Nmchexa N-(3-indoliletil)glicina Nhtrp
D-N-metilomitina Dnmom N-metil--aminobutirato Nmgabu
N-metilglicina Nala D-N-metilmetionina Dnmmet
N-metilaminoisobutirato Nmaib N-metilciclopentilalanina Nmcpen
60 N-(1-metilpropil)glicina Nile D-N-metilfenilalanina Dnmphe
N-(2-metilpropil)glicina Nleu D-N-metilprolina Dnmpro
D-N-metiltriptfano Dnmtrp D-N-metilserina Dnmser
D-N-metiltirosina Dnmtyr D-N-metiltreonina Dnmthr
65
D-N-metilvalina Dnmval N-(1-metiletil)glicina Nval
cido -aminobutrico Gabu N-metila-naftilalanina Nmanap
8
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TABLA 2 (continuacin)

5
L-t-butilglicina Tbug N-metilpenicilamina Nmpen
L-etilglicina Etg N-(p-hidroxifenil)glicina Nhtyr
L-homofenilalanina Hphe N-(tiometil)glicina Ncys
L--metilarginina Marg penicilamina Pen
10
L--metilaspartato Masp L--metilalanina Mala
L--metilcistena Mcys L--metilasparagina Masn
L--metilglutamina Mgln L--metil-t-butilglicina Mtbug
L--metilhistidina Mhis L-metiletilglicina Metg
15 L--metilisoleucina Mile L--metilglutamato Mglu
L--metilleucina Mleu L--metilhomofenilalanina Mhphe
L--metilmetionina Mmet N-(2-metiltioetil)glicina Nmet
L--metilnorvalina Mnva L--metillisina Mlys
20 L--metilfenilalanina Mphe L--metilnorleucina Mnle
L--metilserina Mser L--metilornitina Morn
L--metiltriptfano Mtrp L--metilprolina Mpro
L--metilvalina Mval L--metiltreonina Mthr
25 N-(N-(2,2-difeniletil) Nnbhm L--metiltirosina Mtyr
carbamilmetil) glicina L-N-metilhomofenilalanina Nmhphe
1-carboxil-1-(2,2-difenil-Nmbc N-(N-(3,3-difenilpropil)carbamil Nnbhe
etilamina)ciclopropano metil)glicina
30
Los entrelazadores pueden utilizarse, por ejemplo, para estabilizar conformaciones 3D, utilizando entrelazadores
homo-bifuncionales tales como los steres bifuncionales imido que tienen grupos espaciadores (CH2 )n con N = 1 hasta
n = 6, glutaraldehdo, steres N-hidroxisuccinimida y reactivos hetero-bifuncionales que usualmente contienen una
35 fraccin amino-reactiva tal como N-hidroxisuccinimida y otra fraccin con un grupo reactivo especfico.
La molcula de cido nucleico de la presente invencin est preferiblemente en forma aislada o ligada a un vector,
tal como un vector de expresin. Por aislado se entiende una molcula de cido nucleico que ha sufrido al menos
una etapa de purificacin y esta est convenientemente definida, por ejemplo, por medio de una composicin que com-
40 prende aproximadamente al menos 10% de la molcula de cido nucleico objetivo, preferiblemente aproximadamente
al menos 20%, ms preferiblemente aproximadamente al menos 30%, an ms preferiblemente aproximadamente al
menos 40-50%, incluso an ms preferiblemente aproximadamente al menos 60-70%, todava incluso an ms pre-
feriblemente 80-90% o mayor, de la molcula de cido nucleico objetivo con relacin a otros componentes como se
determina por medio del peso molecular, actividad codificadora, secuencia de nucletidos, composicin base u otros
45 medios convenientes. La molcula de cido nucleico de la presente invencin puede tambin ser considerada, en una
modalidad preferida, por ser biolgicamente pura.
El trmino protena debe entenderse que abarca pptidos, polipptidos y protenas. La protena puede ser glico-
silada o no glicosilada y/o puede contener un rango de otras molculas fusionadas, enlazadas, unidas o asociadas de
50 otra manera a la protena tal como aminocidos, lpidos, carbohidratos u otros pptidos, polipptidos o protenas. De
ahora en adelante la referencia a una protena incluye una protena que comprende una secuencia de aminocidos
as como una protena asociada con otras molculas tales como aminocidos, lpidos, carbohidratos u otros pptidos,
polipptidos o protenas.
55 En una modalidad particularmente preferida, la secuencia de nucletidos correspondiente a esfingosina quinasa es

una secuencia de ADNc que comprende una secuencia de nucletidos como la expuesta en <400>1 o un derivado o
anlogo de la misma incluida una secuencia de nucletidos que tiene semejanza con <400>1.
Un derivado de una molcula de cido nucleico de la presente invencin incluye tambin una molcula de cido
60 nucleico capaz de hibridarse a una secuencia de nucletidos como la expuesta en <400>1 bajo condiciones de baja
escasez. Preferiblemente, la baja escasez es a 42C.
La molcula de cido nucleico puede ligarse a un vector de expresin capaz de expresin en una clula procariota
(por ejemplo, E. coli) o una clula eucariota (por ejemplo, clulas de levadura, clulas de hongos, clulas de insectos,
65 clulas de mamferos o clulas de plantas). La molcula de cido nucleico puede estar ligada o fusionada o asociada de
alguna manera con una molcula de cido nucleico que codifica a otra entidad tal como, por ejemplo, un pptido seal.
Puede comprender tambin informacin de una secuencia adicional de nucletidos fusionada, enlazada o asociada de
cualquier otra manera ya sea con la porcin terminal 3 o la 5 o a ambas porciones terminales 3 y 5. La molcula
9
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de cido nucleico puede ser parte tambin de un vector, tal como un vector de expresin. La ltima modalidad facilita
la produccin de formas recombinantes de esfingosina quinasa cuyas formas estn comprendidas por la presente
invencin.
5 La presente invencin se extiende hasta el producto de expresin de las molculas de cido nucleico como se
defini aqu anteriormente.
El producto de expresin es esfingosina quinasa que tiene una secuencia de aminocidos expuesta en <400>2 o es
un derivado, anlogo o equivalente qumico o mimtico del mismo como se defini anteriormente o es un derivado o
10 mimtico que tiene una secuencia de aminocidos de al menos aproximadamente 45% de semejanza hasta al menos
10 aminocidos contiguos en la secuencia de aminocidos como la expuesta en <400>2 o un derivado o mimtico de
la misma.
Otro aspecto de la presente invencin est dirigido a una protena aislada seleccionada de la lista que consiste de:
15
(i) Una nueva protena de esfingosina quinasa o un derivado, anlogo, equivalente qumico o mimtico de la
misma.
(ii) Una protena de esfingosina quinasa humana o un derivado, anlogo, equivalente qumico o mimtico de la
20 misma.
(iii) Una protena que tiene una secuencia de aminocidos sustancialmente como la expuesta en <400>2 o un
derivado o mimtico de la misma o una secuencia que tiene aproximadamente al menos 45% de semejan-
za hasta al menos 10 aminocidos contiguos en <400>2 o un derivado, anlogo, equivalente qumico o
25 mimtico de dicha protena.
(iv) Una protena codificada por una secuencia de nucletidos sustancialmente como la expuesta en <400>1 o
un derivado o anlogo de la misma o una secuencia que codifica a una secuencia de aminocidos que tiene
aproximadamente al menos 45% de semejanza hasta al menos 10 aminocidos contiguos en <400>2 o un
30 derivado, anlogo, equivalente qumico o mimtico de dicha protena.
(v) Una protena codificada por una molcula de cido nucleico capaz de hibridarse hasta la secuencia de
nucletidos como la expuesta en <400>1 o un derivado o anlogo de la misma bajo condiciones de baja
escasez y que codifica a una secuencia de aminocidos sustancialmente como la expuesta en <400>2 o un
35 derivado o mimtico de la misma o una secuencia de aminocidos que tiene aproximadamente al menos
45% de semejanza hasta al menos 10 aminocidos contiguos en <400>2.
(vi) Una protena como la definida en los pargrafos (i) o (ii) o (iii) o (iv) o (v) en una forma homodimrica.
40 (vii) Una protena como la definida en los pargrafos (i) o (ii) o (iii) o (iv) o (v) en una forma heterodimrica.
La protena de la presente invencin est preferiblemente en forma aislada. Por aislada se entiende una protena
que ha sufrido al menos una etapa de purificacin y esta est convenientemente definida, por ejemplo, por medio de
una composicin que comprende aproximadamente al menos 10% de la protena objetivo, preferiblemente aproxima-
45 damente al menos 20%, ms preferiblemente aproximadamente al menos 30%, an ms preferiblemente aproximada-
mente al menos 40-50%, inclusive an ms preferiblemente aproximadamente al menos 60-70%, todava inclusive an
ms preferiblemente 80-90% o superior de la protena objetivo con relacin a otros componentes como se determina
por medio del peso molecular, la secuencia de aminocidos u otros medios convenientes. La protena de la presente
invencin puede ser considerada tambin, en una modalidad preferida, como biolgicamente pura.
50
La esfingosina quinasa de la presente invencin puede estar en forma multimrica lo cual significa que dos o ms
molculas estn asociadas juntas. En donde las mismas molculas de esfingosina quinasa estn asociadas juntas, el
complejo es un homomultmero. Un ejemplo de un homomultmero es un homodmero. Donde al menos una esfingo-
sina quinasa est asociada con al menos una molcula que no es de esfingosina quinasa, entonces el complejo es un
55 heteromultmero tal como un heterodmero.
La habilidad para producir esfingosina quinasa recombinante permite la produccin a gran escala de esfingosina
quinasa para uso comercial. La esfingosina quinasa puede necesitar ser producida como parte de un gran pptido,
polipptido o protena que puede ser utilizada como tal o puede necesitar primero ser procesada con el propsito
60 de remover las secuencias proteinceas extraas. Tal procesamiento incluye digestin con proteasas, peptidasas y
amidasas o un rango de tcnicas qumicas, electroqumicas, acsticas o mecnicas de rompimiento.
No obstante que la presente invencin abarca protenas recombinantes, s prefieren tambin las tcnicas de sntesis
qumica para la sntesis de la esfingosina quinasa.
65
La esfingosina quinasa de acuerdo con la presente invencin se sintetiza convenientemente con base en molculas
aisladas de humanos. El aislamiento de molculas humanas puede realizarse por medio de cualquier medio adecuado
tal como separacin cromatogrfica, utilizando por ejemplo cromatografa de intercambio inico sobre celulosa CM
10
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seguido por filtracin sobre Sefadex (por ejemplo, columna G-50). Muchas otras tcnicas estn disponibles incluidas
HPLC, PAGE entre otras.
La esfingosina quinasa pude sintetizarse por medio de sntesis en fase slida utilizando qumica F-moc como lo
5 describen Carpino y colaboradores (1991). La esfingosina quinasa y los fragmentos de la misma pueden sintetizarse
tambin por medio de qumicas alternativas incluida, pero no limitndose a, qumica t-Boc como lo describen Stewart
y colaboradores (1985) o por medio de mtodos clsicos de sntesis de pptidos en fase lquida.
Sin limitar la teora o el modo de accin de la presente invencin, la esfingosina quinasa es una enzima reguladora
10 clave en la actividad de la ruta de sealamiento de la esfingosina quinasa. Por ruta de sealamiento de la esfingosina
quinasa se entiende una ruta de sealamiento que utiliza una o ambas entre la esfingosina quinasa y/o la esfingosina-
1-quinasa. Se piensa que una cascada de la ruta de sealamiento de la esfingosina quinasa que resulta en la expresin
de adhesin molecular puede tomar la forma de:
15 (i) la generacin de ceramida a partir de esfingomielina a travs de la actividad de S. Mase, siendo dicha
ceramida convertida a esfingosina;
(ii) generacin de esfingosina-1-fosfato (mencionada de ahora en adelante como Sph-1-P) por medio de la
estimulacin de esfingosina quinasa; y
20
(iii) la activacin de MEK/ERK y transposicin nuclear de NF-B secuencia debajo de la generacin de Sph-1-
P.
La ruta de sealamiento de la esfingosina quinasa es conocida por regular actividades celulares tales como aquellas
25 que conducen a inflamacin, apoptosis y proliferacin celular. Por ejemplo, favorecer la expresin de la produccin de
mediadores inflamatorios tales como citoquinas, quemoquinas, eNOS y sobre regulacin de la expresin de adhesin
molecular. Dicho favorecimiento de la expresin puede ser inducido por una cierta cantidad de estmulos incluyendo,
por ejemplo, citoquinas inflamatorias tales como el factor de necrosis tumoral (TNF-) e interleuquina-1 (IL-1),
endotoxina, lpidos oxidados o modificados, radiacin o lesin en el tejido.
30
La clonacin y el secuenciamiento de este gen y su producto de expresin proveen ahora molculas adicionales para
ser usadas en tratamiento profilctico y teraputico de enfermedades caracterizadas por actividad celular no deseada,
cuya actividad est ya sea directa o indirectamente modulada a travs de la actividad de la ruta de sealamiento de la
esfingosina quinasa. Ejemplos de enfermedades que involucran actividad celular no deseada regulada por esfingosina
35 quinasa incluyen artritis reumatoide, asma, aterosclerosis, meningitis, esclerosis mltiple y choque sptico. Por lo
tanto, la presente invencin contempla usos teraputicos y profilcticos del aminocido de esfingosina quinasa y de
molculas de cido nucleico, adems de agentes agonistas y antagonistas de esfingosina quinasa, para la regulacin de
la actividad funcional celular, tal como por ejemplo, regulacin de inflamacin.
40 La presente invencin contempla, por lo tanto, un mtodo para expresin de modulacin de esfingosina quinasa
en un individuo, dicho mtodo comprendiendo poner en contacto al gen de la esfingosina quinasa con una cantidad
efectiva de un agente durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para favorecer la expresin o reducir la expre-
sin o modular la expresin o otra expresin de modulacin de esfingosina quinasa. Por ejemplo, pueden introducirse
en una clula secuencias antisentido de esfingosina quinasa tales como oligonucletidos para reducir la expresin de
45 una o ms actividades funcionales especficas de esa clula. Inversamente, puede introducirse una molcula de cido
nucleico que codifica a una esfingosina quinasa o un derivado de la misma, para favorecer la expresin de una o ms
actividades funcionales especficas de cualquier clula que no exprese al gen endgeno de la esfingosina quinasa.
Otro aspecto de la presente invencin contempla un mtodo de activacin de modulacin de la esfingosina qui-
50 nasa en un mamfero, dicho mtodo comprendiendo la activacin a dicho mamfero de una cantidad de modulacin
efectiva de un agente durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para incrementar o disminuir la actividad de la
La modulacin de dicha actividad por medio de la administracin de un agente a un mamfero puede lograrse por
55 medio de diferentes tcnicas, incluyendo pero no limitndose de ninguna manera a la introduccin dentro de dicho
mamfero de una molcula proteinacea o no proteinacea la cual:
(i) modula la expresin de la esfingosina quinasa;
60 (ii) funciona como un antagonista de esfingosina quinasa;
(iii) funciona como un agonista de esfingosina quinasa.
Dicha molcula proteinacea puede derivarse de fuentes naturales o recombinantes incluidas las protenas de fusin
65 o despus, por ejemplo, de seleccin de un producto natural. Dicha molcula no proteinacea puede ser, por ejem-
plo, una molcula de cido nucleico o puede derivarse de fuentes naturales, tales como por ejemplo la seleccin de
un producto natural o puede ser sintetizada qumicamente. La presente invencin contempla anlogos qumicos de
esfingosina quinasa o pequeas molculas capaces de actuar como agonistas o antagonistas de esfingosina quinasa.
11
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Los agonistas qumicos no necesariamente pueden derivarse de esfingosina quinasa sino que tambin pueden com-
partir ciertas semejanzas conformacionales. Alternativamente, los agonistas qumicos pueden disearse especfica-
mente para imitar ciertas propiedades fisicoqumicas de la esfingosina quinasa. Los antagonistas pueden ser cualquier
compuesto capaz de bloquear, inhibir o bien prevenir que la esfingosina quinasa lleve a cabo sus funciones biolgi-
5 cas normales. Los antagonistas incluyen anticuerpos monoclonales especficos para esfingosina quinasa, o partes de
esfingosina quinasa, y cidos nucleicos antisentido que previenen la transcripcin o traduccin de los genes de esfin-
gosina quinasa o ARNm en clulas de mamfero. La modulacin de la expresin de esfingosina quinasa puede lograse
tambin utilizando antgenos, ARN, ribosomas, ADNzimas, aptmeros de ARN o anticuerpos.
10 Dichas molculas proteinceas o no proteinceas pueden actuar ya sea directamente o indirectamente para modular
la expresin de la esfingosina quinasa o la actividad de esfingosina quinasa. Dicha molcula acta directamente si se
asocia con esfingosina quinasa o esfingosina quinasa para modular la expresin o actividad de la esfingosina quinasa
o esfingosina quinasa. Dicha molcula acta indirectamente si se asocia con una molcula diferente de esfingosina
quinasa o de esfingosina quinasa por lo cual otra molcula ya sea directa o indirectamente modula la expresin o
15 actividad de la esfingosina quinasa o la esfingosina quinasa. Por lo tanto, el mtodo de la presente invencin abarca la
regulacin de esfingosina quinasa o la expresin o actividad de la esfingosina quinasa a travs de la induccin de una
cascada de etapas reguladoras que conducen a la regulacin de la esfingosina quinasa o la expresin o actividad de la
Esfingosina quinasa.
20 Otro aspecto de la presente invencin contempla un mtodo de modular la actividad funcional celular en un mam-
fero, dicho mtodo comprendiendo administrar a dicho mamfero una cantidad efectiva de un agente durante un tiempo
y bajo condiciones suficientes para modular la expresin de una secuencia de nucletidos que codifican esfingosina
quinasa o suficiente para modular la actividad de esfingosina quinasa.
25 An otro aspecto de la presente invencin contempla un mtodo de modulacin de la actividad funcional celu-
lar en un mamfero, dicho mtodo comprendiendo la administracin a dicho mamfero de una cantidad efectiva de
esfingosina quinasa o esfingosina quinasa.
La esfingosina quinasa, esfingosina quinasa o el agente utilizado pueden tambin enlazarse a medios de recono-
30 cimiento tales como un anticuerpo monoclonal, que proporciona la liberacin especfica de la esfingosina quinasa,
esfingosina quinasa o agente para las clulas objetivo.
En una modalidad preferida de la presente invencin, la esfingosina quinasa, esfingosina quinasa o el agente
utilizado en el mtodo se enlazan a un anticuerpo especfico para dichas clulas objetivo para permitir la liberacin
35 especfica hacia esas clulas.
La referencia a modulacin de la actividad funcional celular es una referencia para favorecer la expresin, reducir
la expresin o bien alternar una cualquiera o ms de las actividades de que una clula es capaz de realizar tales como,
pero no limitado a, una o ms entre la produccin de quemoquina, produccin de citoquina, d xido ntrico sintasa, la
40 expresin de una molcula de adhesin y la produccin de otros moduladores inflamatorios.
La administracin de la esfingosina quinasa, esfingosina quinasa o agente, en la forma de una composicin farma-
cutica, puede llevarse a cabo por medio de cualquier medio conveniente. La esfingosina quinasa, esfingosina quinasa
o agente de la composicin farmacutica son contempladas por exhibir actividad teraputica cuando se los administra
45 en una cantidad que depende de cada caso particular. La variacin depende, por ejemplo, del humano o animal y de
la esfingosina quinasa, esfingosina quinasa o agente escogido. Puede aplicarse un amplio rango de dosis. Conside-
rando a un paciente, por ejemplo, puede administrarse aproximadamente desde 0,1 mg hasta aproximadamente 1 mg
de esfingosina quinasa o agente por kilogramo de peso corporal por da. Los regmenes de las dosis pueden ajustar-
se para suministrar la respuesta teraputica ptima. Por ejemplo, pueden administrarse diferentes dosis divididas en
50 forma diaria, semanal, mensual u otros intervalos de tiempo adecuados, o puede reducirse proporcionalmente la dosis
como lo indiquen las exigencias de la situacin. La esfingosina quinasa o el agente pueden administrarse en una forma
conveniente tal como oral, intravenosa (en el caso de ser solubles en agua), intranasal, intraperitoneal, intramuscular,
subcutnea, intradrmica o a travs de supositorio o implante (por ejemplo, utilizando molculas de liberacin lenta).
Con referencia particular al uso de esfingosina quinasa o agente, estos pptidos pueden administrarse en la forma de
55 sales no txicas farmacuticamente aceptables, tales como sales de adicin cida o complejos metlicos, por ejemplo,
con zinc, hiero o similares (que se consideran como sales para propsitos de esta solicitud). Ilustrativos de tales sales
de adicin cida son el clorhidrato, bromhidrato, sulfato, fosfato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, mala-
to, ascorbato, tartrato y similares. Si el ingrediente activo se administra en forma de tableta, la tableta puede contener
un aglomerante tal como tragacanto, almidn de maz o gelatina; un agente desintegrante, tal como cido algnico; y
60 un lubricante, tal como estearato de magnesio.
Un aspecto adicional de la presente invencin se relaciona con el uso de la invencin en relacin con condiciones
de enfermedad en mamferos. Por ejemplo, la presente invencin es particularmente til, pero no se limita de ninguna
manera al uso en enfermedades inflamatorias.
65
Por lo tanto, otro aspecto de la presente invencin se relaciona con un mtodo para tratar a un mamfero, dicho
mtodo comprendiendo administrar a dicho mamfero una cantidad efectiva de un agente durante un tiempo y bajo
12
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condiciones suficientes para modular la expresin de la esfingosina quinasa o suficiente para modular la actividad de
la esfingosina quinasa en donde dicha modulacin resulta en la modulacin de la actividad funcional celular.
En otro aspecto, la presente invencin se relaciona con un mtodo para tratar a un mamfero, dicho mtodo com-
5 prendiendo administrar a dicho mamfero una cantidad efectiva de esfingosina quinasa o esfingosina quinasa durante
un tiempo y bajo condiciones suficientes para modular la actividad funcional celular.
An otro aspecto de la presente invencin se relaciona con el uso de un agente capaz de modular la expresin de
esfingosina quinasa o la modulacin de la actividad de la esfingosina quinasa en la fabricacin de un medicamento
10 para la modulacin de la actividad funcional celular.
Un aspecto adicional de la presente invencin se relaciona con el uso de la esfingosina quinasa o la esfingosina
quinasa en la fabricacin de un medicamento para la modulacin de la actividad funcional celular.
15 An todava otro aspecto de la presente invencin se relaciona con agentes para ser usados en la modulacin de
la expresin de la esfingosina quinasa o actividad de la esfingosina quinasa en donde dicha modulacin resulta en la
modulacin de la actividad funcional celular.
Otro aspecto de la presente invencin se relaciona con la esfingosina quinasa o esfingosina quinasa para el uso en
20 la modulacin de la actividad funcional celular.
En un aspecto relacionado de la presente invencin, el mamfero que experimenta un tratamiento puede ser un
humano o un animal que necesite de tratamiento teraputico o profilctico.
25 En an otro aspecto adicional, la presente invencin contempla una composicin farmacutica que comprende
esfingosina quinasa, esfingosina quinasa o un agente capaces de modular la expresin de la esfingosina quinasa o
la actividad de la esfingosina quinasa junto con uno o ms portadores farmacuticamente aceptables y/o diluyentes.
Esfingosina quinasa, esfingosina quinasa o dicho agente se refieren a los ingredientes activos.
30 Las formas farmacuticas adecuadas para ser usadas como inyectables incluyen soluciones acuosas estriles (en
caso de ser solubles en agua) y polvos estriles para la preparacin extempornea de soluciones inyectables estriles
o dispersiones. En todos los casos la forma debe ser estril y debe ser fluida hasta el grado en que sea fcil de
inyectar. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricacin y almacenamiento y debe ser preservada contra la
accin contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio
35 de dispersin que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propiln glicol y polietiln glicol
lquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede ser mantenida,
por ejemplo, por medio del uso de un recubrimiento tal como licitina, por medio del mantenimiento del tamao de
partcula requerido en el caso de dispersin y por medio del uso de superfactantes. La prevencin de la accin de
los microorganismos puede ser lograda por medio de diferentes agentes antibacteriales y antihongos, por ejemplo,
40 parabenos, clorobutanol, fenol, cido srbico, timerosal y similares. En muchos casos, ser preferible incluir agentes
isotnicos, por ejemplo, azcares o cloruro de sodio. La absorcin prolongada de las composiciones inyectables puede
lograrse por medio del uso en las composiciones de agentes de absorcin retardada, por ejemplo, monoestearato de
aluminio y gelatina.
45 Las soluciones inyectables estriles se preparan por medio de la incorporacin de los compuestos activos en la can-
tidad requerida en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados ms arriba, segn se requiera,
seguido de esterilizacin por filtracin. Generalmente, las dispersiones se preparan por medio de la incorporacin de
diferentes ingredientes activos esterilizados dentro de un vehculo estril que contiene el medio de dispersin bsico
y los otros ingredientes requeridos a partir de aquellos enumerados ms arriba. En el caso de los polvos estriles para
50 la preparacin de soluciones inyectables estriles, los mtodos preferidos de preparacin son la tcnica de secado al
vaco y de secado por congelacin que producen un polvo del ingrediente activo ms cualquier ingrediente adicional
deseado a partir de la solucin previamente filtrada en forma estril de la misma.
Cuando la esfingosina quinasa, la esfingosina quinasa y los modulares de la esfingosina quinasa se protegen ade-
55 cuadamente, se los puede administrar en forma oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un portador asimilable
consumible, o se pueden incluir en cpsulas de capa de gelatina dura o blanda, o pueden comprimirse en tabletas, o
pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta. Para administracin teraputica oral, el compuesto activo
puede incorporarse con excipientes y usarse en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, troches, cpsulas, el-
xires, suspensiones, jarabes, pastillas, y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos 1%
60 en peso del compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede, desde luego, variarse puede
estar convenientemente aproximadamente entre 5 hasta aproximadamente 80% del peso de la unidad. La cantidad de
compuesto activo en tales composiciones teraputicamente tiles es tal que se obtendr una dosificacin adecuada.
Las composiciones o preparaciones preferidas de acuerdo a la presente invencin, se preparan de tal manera que la
forma unitaria de dosificacin oral contenga aproximadamente entre 0,1 g y 2000 mg de compuesto activo.
65
Las tabletas, troches, pldoras, cpsulas y similares, pueden contener tambin lo siguiente: un aglomerante tal
como goma de tragacanto, acacia, almidn de maz o gelatina; excipientes tales como fosfato diclcico; un agente
desintegrante tal como almidn de maz, almidn de papa, cido algnico y similares; un lubricante tal como estearato
13
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de magnesio; y puede aadirse un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina, o un agente saborizante
tal como menta, aceite de gaulteria, o saborizante de cereza. Cuando la forma de dosificacin unitaria es una cpsula,
puede contener, adems de los materiales del tipo anterior, un portador lquido. Varios otros materiales pueden estar
presentes como recubrimientos o bien para modificar la forma fsica de la unidad de dosificacin. Por ejemplo, tabletas,
5 pldoras, pueden ser recubiertas con laca, azcar o ambas. Un jarabe o elixir puede contener al compuesto activo,
sacarosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y saborizante tal como
sabor de cereza o de naranja. Desde luego, cualquier material utilizado para preparar cualquier forma unitaria de
dosificacin debe ser farmacuticamente puro y sustancialmente no txico en las cantidades empleadas. Adems, el
compuesto activo puede ser incorporado en preparaciones y formulaciones de liberacin prolongada.
10
Los portadores y/o diluyentes farmacuticamente aceptables incluyen a cualquiera y todos los solventes, medios
de dispersin, recubrimientos, agentes antibacterianos y antihongos, agentes isotnicos y de retraso en la absorcin,
y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacuticamente activas es bien conocido en el estado
de la tcnica. Excepto porque cualquier medio convencional o agente sea incompatible con el ingrediente activo,
15 se contempla el uso de los mismos en las composiciones teraputicas. Ingredientes activos suplementarios tambin
pueden incorporarse dentro de las composiciones.
Es especialmente conveniente formular composiciones parenterales en forma de dosificacin unitaria para una
fcil administracin y uniformidad en la dosificacin. La forma de dosificacin unitaria tal como se la utiliza aqu se
20 refiere a unidades fsicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el tratamiento de individuos mamferos;
cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculado para producir el efecto teraputico
deseado junto con portador farmacutico requerido. La especificacin para las nuevas formas unitarias de dosificacin
de la invencin es dictada por y depende directamente de (a) las caractersticas nicas del material activo y el efecto
teraputico particular que quiere lograrse, y (b) las limitaciones inherentes en el arte de la composicin de tal material
25 activo para el tratamiento de enfermedades en sujetos vivos que tienen condiciones de enfermedad en las cuales se
empeora la salud corporal.
El ingrediente activo principal se compone para una administracin efectiva y conveniente en cantidades efectivas
con un portador farmacuticamente aceptable adecuado en forma de dosis unitarias como se revel aqu ms arriba.
30 Una forma de dosificacin unitaria puede, por ejemplo, contener al compuesto activo principal en cantidades en el ran-
go entre 0,5 g hasta aproximadamente 2000 mg. Expresado en proporciones, el compuesto activo est generalmente
presente aproximadamente desde 0,5 g hasta aproximadamente 2000 mg/ml del portador. En el caso de composicio-
nes que contienen ingredientes activos suplementarios, las dosis se determinan por referencia con la dosis usual y la
forma de administracin de dichos ingredientes.
35
La composicin farmacutica puede incluir tambin molculas genticas tales como un vector capaz de transfectar
clulas objetivo en donde el vector porta una molcula de cido nucleico capaz de expresar esfingosina quinasa,
modulacin de la expresin de la esfingosina quinasa o la actividad de la esfingosina quinasa. El vector puede, por
ejemplo, ser un vector viral.
40
La esfingosina quinasa puede tambin ser utilizada para crear modelos con noqueado gnico o bien en clulas o en
animales no humanos, cuyo gen noqueado es el gen de la esfingosina quinasa expresado por dichas clulas o animales.
Por lo tanto, en otro aspecto la presente invencin debe entenderse que se extiende a los mtodos de crear clulas con
el gen de la esfingosina quinasa o modelos de noqueo de animales no humanos, en donde la esfingosina quinasa ha
45 sido utilizada para facilitar el noqueo del gen endgeno de la esfingosina quinasa de dicha clula o animal, y para los
modelos de noqueo producidos a partir de all.
An otro aspecto de la presente invencin est dirigido a anticuerpos para esfingosina quinasa que incluyen an-
ticuerpos catalticos. Tales anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden seleccionarse a partir de
50 anticuerpos de ocurrencia natural para esfingosina quinasa o pueden ser especficamente construidos para esfingosina
quinasa. En el ltimo caso, la esfingosina quinasa necesita primero estar asociada con una molcula portadora. Los
anticuerpos y/o la esfingosina quinasa recombinante de la presente invencin son particularmente tiles como agentes
teraputicos o de diagnstico.
55 Alternativamente, pueden utilizarse fragmentos de anticuerpos tales como los fragmentos Fab. Adems, la pre-
sente invencin se extiende hasta los anticuerpos recombinantes y sintticos y hasta los hbridos de anticuerpos. Un
anticuerpo sinttico es considerado aqu por incluir fragmentos e hbridos de anticuerpos. Los anticuerpos de este
aspecto de la presente invencin son particularmente tiles para inmunoterapia y pueden tambin ser utilizados como
una herramienta de diagnstico, por ejemplo, para hacer seguimiento al programa de un rgimen teraputico.
60
Por ejemplo, la esfingosina quinasa puede ser utilizada para muestrear a los anticuerpos de ocurrencia natural para
la esfingosina quinasa. Esto puede ocurrir, por ejemplo en algunos desordenes inflamatorios.
Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos especficos para muestrear las protenas de la esfingosina quinasa. Esto
65 ltimo sera importante, por ejemplo, como un medio para muestrear los niveles de esfingosina quinasa en un extracto
celular u otros fluidos biolgicos o la purificacin de la esfingosina quinasa hecha por medios recombinantes a partir
del cultivo del fluido sobrenadante. Las tcnicas para los ensayos contemplados aqu son conocidas en el estado de la
tcnica e incluyen, por ejemplo, ensayos tipo sndwich, ELISA y citometra de flujo.
14
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Est dentro del alcance de esta invencin incluir cualquier segundo anticuerpo (monoclonal, policlonal o fragmen-
tos de anticuerpos) dirigido a los primeros anticuerpos mencionados discutidos anteriormente. Tanto el primero como
el segundo anticuerpo pueden ser utilizados en los ensayos de deteccin, o un primer anticuerpo puede ser utilizado
con un anticuerpo antiinmunoglobulina disponible comercialmente. Un anticuerpo como el contemplado aqu incluye
5 a cualquier anticuerpo especfico para cualquier regin de la esfingosina quinasa.
Tanto los anticuerpos policlonales como los monoclonales se obtienen por medio de inmunizacin con los deriva-
dos de la protena o del pptido y cualquiera de los dos tipos puede ser utilizado para inmunoensayos. Los mtodos
para obtener ambos tipos de sueros son bien conocidos en el estado de la tcnica. Los sueros policlonales se prefieren
10 menos pero son relativamente fciles de preparar por medio de inyeccin a un animal de laboratorio adecuado con
una cantidad efectiva de esfingosina quinasa, o partes antignicas de la misma, recogiendo el suero del animal, y el
aislamiento de sueros especficos por medio de cualquiera de las tcnicas inmunoadsorbentes conocidas. Aunque los
anticuerpos producidos por este mtodo se pueden utilizar virtualmente en cualquier tipo de inmunoensayo, ellos son
generalmente menos favorables debido a la heterogeneidad potencial del producto.
15
Se prefiere particularmente el uso de anticuerpos monoclonales en un inmunoensayo debido a la capacidad para
producirlos en grandes cantidades y a la homogeneidad del producto. La preparacin de lneas celulares de hibridoma
para la produccin de anticuerpo monoclonal derivado por fusin a una lnea celular inmortal y de linfocitos sensibili-
zados contra la preparacin inmunognica, puede hacerse por medio de tcnicas que son bien conocidas por aquellos
20 entrenados en la tcnica (Ver, por ejemplo a Douillard y Hoffman, Basic Facts about Hybridomas, en el Compendium
of Immunology Vol II, editado por Schwarzt, 1981; Kohler y Milstein, Nature 256: 495-499, 1975; European Journal
of Immunology 6:511-519, 1976).
En otro aspecto de la presente invencin, las molculas de la presente invencin tambin son tiles como objetivos
25 para muestreo para ser usados en aplicaciones tales como los diagnsticos de desordenes que son regulados por la
An otro aspecto de la presente invencin contempla un mtodo para detectar esfingosina quinasa o ARNm de
esfingosina quinasa en una muestra biolgica de un individuo, dicho mtodo comprendiendo poner en contacto a
30 dicha muestra biolgica con un anticuerpo especfico para esfingosina quinasa o ARNm de esfingosina quinasa o sus
derivados u homlogos durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que un complejo esfingosina quinasa-
anticuerpo o de ARNm de esfingosina quinasa-anticuerpo formen, y luego detecten a dicho complejo.
La presencia de esfingosina quinasa puede ser determinada en diferentes formas tales como por medio de procedi-
35 mientos de borrones de Western, ELISA o citometra de flujo. El ARNm de la esfingosina quinasa puede detectarse,
por ejemplo, por medio de hibridacin in situ o por medio de borrones de Northern. Estos, por su puesto, incluyen
tanto a los ensayos en sndwich o en uno o en dos sitios de los tipos no competitivos, as como en los ensayos
tradicionales de enlazamiento competitivo. Estos ensayos tambin incluyen enlazamiento directo de un anticuerpo
marcado a un objetivo.
40
Los ensayos tipo sndwich se encuentran entre los ms tiles y comnmente utilizados y son favorables para ser
utilizados en la presente invencin. Existen un cierto nmero de variaciones de la tcnica de ensayo tipo sndwich,
y se pretende que se encuentren todas abarcadas por la presente invencin. En resumen, en un ensayo tpico directo,
se inmoviliza un anticuerpo no marcado sobre un sustrato slido y la muestra que va a ser analizada se pone en
45 contacto con la molcula enlazada. Despus de un perodo adecuado de incubacin, durante un perodo de tiempo
suficiente para permitir la formacin de un complejo antgeno-anticuerpo, se aade entonces un segundo anticuerpo
especfico para el antgeno, marcado con una molcula reportera capaz de producir una seal detectable, y se incuba,
permitiendo el tiempo suficiente para la formacin de otro complejo de anticuerpo marcado antgeno-anticuerpo.
Cualquier material no reaccionado es lavado, y se determina la presencia del antgeno por medio de la observacin de
50 una seal producida por la molcula reportera. Los resultados pueden ser ya sea cualitativos, por simple observacin
de lxenla visible, o pueden ser cuantificados por comparacin con una muestra de control que contiene cantidades
conocidas de hapteno. Las variaciones del ensayo directo incluyen un ensayo simultneo, en el cual tanto la muestra
como el anticuerpo marcado se aaden al mismo tiempo al anticuerpo enlazado. Estas tcnicas son bien conocidas por
aquellos entrenados en la tcnica, incluida cualquier variacin menor como ser fcilmente evidente. De acuerdo con
55 la presente invencin, la muestra es una que puede contener esfingosina quinasa incluido un extracto celular, biopsia
de tejido o posiblemente suero, saliva, secreciones mucosas, linfa, fluido tisular y fluido respiratorio. La muestra es,
por lo tanto, generalmente una muestra biolgica que comprende fluido biolgico pero tambin se extiende a fluido en
fermentacin y fluido sobrenadante tal como el de un cultivo celular.
60 En el ensayo tpico directo en sndwich, un primer anticuerpo que tiene especificidad por la esfingosina quinasa o
por partes antignicas de la misma, est o bien enlazado en forma covalente o en forma pasiva a una superficie slida.
La superficie slida es tpicamente vidrio o un polmero, siendo los polmeros ms comnmente usados celulosa, po-
liacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. Los soportes slidos pueden ser en la forma de
tubos, perlas, discos o microplacas, o cualquier otra superficie adecuada para conducir un inmunoensayo. Los procesos
65 de enlazamiento son bien conocidos en el estado de la tcnica y generalmente consisten de enlaces covalentemente
entrecruzados o fsicamente adsorbentes. El complejo polmero-anticuerpo se lava en preparacin para la muestra del
ensayo. Una alcuota de la muestra que va a ser analizada es aadida entonces al complejo en fase slida e incubada
por un perodo de tiempo suficiente (por ejemplo, 2-40 minutos) y bajo condiciones adecuadas (por ejemplo, 25C)
15
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para permitir el enlazamiento de cualquier subunidad presente en el anticuerpo. Despus del perodo de incubacin
se lava la subunidad del anticuerpo de la fase slida y se la seca y se la incuba con un segundo anticuerpo especfico
para una porcin del hapteno. El segundo anticuerpo se enlaza a una molcula reportera que es utilizada para indicar
el enlazamiento del segundo anticuerpo al hapteno.
5
Un mtodo alternativo involucra la inmovilizacin de las molculas objetivo en la muestra biolgica y luego expo-
ner el objetivo inmovilizado al anticuerpo especfico que puede estar o no estar marcado con una molcula reportera.
Dependiendo de la cantidad de objetivo y de la fuerza de la seal de la molcula reportera, puede detectarse un enlace
objetivo por marcacin directa con el anticuerpo. Alternativamente, un segundo anticuerpo marcado, especfico para
10 el primer anticuerpo, se expone al complejo objetivo-primer anticuerpo para formar un complejo terciario objetivo-
primer anticuerpo-segundo anticuerpo. El complejo se detecta por medio de la seal emitida por la molcula reportera.
Por molcula reportera como se la utiliza en la presente descripcin, se entiende una molcula que, por su na-
turaleza qumica, proporciona una seal analticamente identificable que permite la deteccin del anticuerpo enlazado
15 al antgeno. La deteccin puede ser o bien cualitativa o cuantitativa. Las molculas reporteras ms comnmente usa-
das en este tipo de ensayo son, o bien enzimas, fluorforos, o molculas que contienen radionclidos (por ejemplo,
radioistopos) y molculas quimioluminiscentes.
En el caso de un inmunoensayo con una enzima, una enzima se conjuga con el segundo anticuerpo, generalmente
20 por medio de glutaraldehdo o peryodato. Como se reconocer fcilmente, sin embargo, existen una gran variedad
de diferentes tcnicas de conjugacin, que estn fcilmente disponibles para la persona entrenada. Las enzimas co-
mnmente utilizadas incluyen peroxidasa de rbano peroxidasa, oxidasa de glucosa, beta galactosidasa y fosfatasa
alcalina, entre otras. Los sustratos que se utilizan con las enzimas especficas se escogen generalmente para la pro-
duccin, por hidrlisis por medio de la enzima correspondiente, con un cambio de color detectable. Los ejemplos de
25 enzimas adecuadas incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa. Tambin es posible emplear sustratos fluorognicos, que
rinden un producto fluorescente en vez de los sustratos cromognicos observados ms arriba. En todos los casos, el
anticuerpo marcado con la enzima se aade al primer complejo hapteno anticuerpo, se le permite que se enlace, y
luego se lava el exceso de reactivo. Se aade entonces una solucin que contiene al sustrato apropiado al complejo
anticuerpo-antgeno-anticuerpo. El sustrato reaccionar con la enzima enlazada al segundo anticuerpo, dando una se-
30 al visual cualitativa, que puede cuantificarse adems, usualmente espectrofotomtricamente, para dar una indicacin
de la cantidad de hapteno que estaba presente en la muestra. La molcula reportera tambin se extiende al uso de
aglutinacin celular o inhibicin de aglutinacin tal como los glbulos rojos sobre perlas de ltex, y similares.
Alternativamente, los compuestos fluorescentes, tales como fluorescena y rodamina, pueden acoplarse qumica-
35 mente a anticuerpos sin alterar su capacidad de enlazamiento. Cuando se activan por iluminacin con luz de una
longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo adsorbe la energa luminosa, induciendo un es-
tado de excitabilidad en la molcula, seguido por la emisin de luz a un color caracterstico visualmente detectable
con un microscopio de luz. Como en el EIA, al anticuerpo enlazado con fluorescena se le permite enlazarse al primer
complejo anticuerpo-hapteno. Despus de lavar el reactivo no enlazado, el complejo terciario remanente se expone
40 entonces a la luz a la luz de longitud de onda apropiada; la fluorescencia observada indica la presencia del hapteno de
inters. Las tcnicas de inmunofluorescencia y de EIA estn ambas muy bien establecidas en el estado de la tcnica
y son particularmente preferidas para el mtodo presente. Sin embargo, pueden emplearse tambin otras molculas
reporteras, tales como las molculas de radioistopos, quimioluminiscentes o bioluminiscentes.
45 La presente invencin tambin contempla ensayos genticos tales como los que involucran anlisis por PCR para
detectar esfingosina quinasa o sus derivados.
Otras caractersticas de la presente invencin se describen ms completamente en los siguientes ejemplos no limi-
tantes.
50
Ejemplo 1
Purificacin y clonacin de esfingosina quinasa humana - Procedimientos experimentales
55 Materiales
D-eritro-Esfingosina, D-eritro-dihidroesfingosina, DL-treo-dihidroesfingosina, N,N-dimetilesfingosina, N-aceti-

lesfingosina (C2 -ceramida), S1P y Fumosina B1 fueron adquiridas con Biomol Research Laboratories Inc. (Plymouth
Meeting, PA).
60
Fitoesfingosina, cido L--fosfatdico, L--fosfatidilinositol, L--fosfatidilserina, L--fosfatidilcolina, L--fos-
fatidiletanolamina, 1,2-dioctanoil-sn-glicerol, 1,2-dioleoil-sn-glicerol, ATP, calmodulina, glutationa y la albmina de
suero de bovino (BSA) lo fueron de Sigma. N,N,N-trimetilesfingosina y ADP fueron adquiridos con Calbiochem
(Band Soden, Alemania), [32 P]ATP con Geneworks (Adelaide, Sur de Australia), TNF con R&D Systems Inc.
65 (Minneapolis, MN), y el isopropil--D-tiogalactsido (IPTG) con Promega (Madison, WI). Las columnas preempaca-
das Mono-Q, Superosa 75 y HiTrap-Q, Q Sefarosa de flujo rpido, calmodulina Sefarosa 4B, glutationa Sefarosa 4B,
trombina y los estndares de protena de masa molecular para filtracin por gel lo fueron con Amersham Pharmacia
Biotech. Los estndares de protena de masa molecular para SDS-PAGE, la coloracin de plata ms el kit, el Azul
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Brillante de Coomassie R250 y el reactivo para protena de Coomassie se adquirieron con Bio-Rad. Los concentrado-
res Centricon fueron adquiridos con Amicon Inc. (Beverly, MA) y el reactivo para la protena BCA fue adquirido con
Pierce Chemical Company (Rockford, IL).
5 Ensayo de la enzima esfingosina quinasa
La actividad de la esfingosina quinasa fue determinada rutinariamente utilizando D-eritro-esfingosina y [32 P]ATP
como sustratos, esencialmente como se describi previamente (Olivera y colaboradores, 1998) con algunas modifi-
caciones. En resumen, los ensayos se realizaron por medio de la incubacin de las muestras a 37C durante 30 min
10 con esfingosina (se disolvi un estndar de 100 M en 5% de Triton X-100) y [32 P]ATP (1 mM; 10 Ci/ml) en
amortiguador de ensayo que contiene 100 mM de Tris/HCl (pH 7,4), 10 mM de MgCl2 al 10% (v/v) en glicerol, 1
mM de ditiotreitol, 1 mM de EGTA, 1 mM de Na3 VO4 , 15 mM de NaF, 0,5 mM de 4-desoxipiridoxina en volumen
total de 100 l. Las reacciones fueron terminadas y extrada la esfingosina-1-fosfato por medio de la adicin de 700
l de cloroformo/metanol/HCl (100:200:1, v/v), seguido de una mezcla vigorosa, la adicin de 200 l de cloroformo
15 y 200 l de KCl 2M, y separacin de fase por centrifugacin. La S1P marcada en la fase orgnica se aisl por medio
de TLC sobre Gel de Slice 60 con 1-butanol/etanol/cido actico/agua (8:2:1:2, v/v) y cuantificada por medio de un
generador de imgenes sobre fsforo (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Una unidad (U) de actividad se define
como 1 mol de S1P formada por minuto.
20 Purificacin de esfingosina quinasa a partir de placenta humana
La esfingosina quinasa se purific a partir de 1240 g de placenta humana (4 placentas), con todas las etapas
llevadas a cabo a 4C. Las placentas fueron cortadas en cubos, lavadas en amortiguador A (25 mM de amortiguador
Tris/HCl, pH 7,4 que contiene 10% (v/v) de glicerol, 0.05% de Triton X-100 y 1 mM de ditiotreitol), transferidas a
25 1,5 L de amortiguador fresco A que contiene un cctel inhibidor de proteasa (Complete; Boehringer Mannheim)
(amortiguador B), y desmenuzada en un mezclador Waring. El homogenizado resultante fue almacenado sobre hielo
durante 30 min para mejorar la extraccin de la enzima, y se aisl entonces la fraccin soluble del homogenizado
por medio d centrifugacin a 17.000 g durante 60 min. Se fraccion entonces esta preparacin por precipitacin con
(NH4 )2 SO4 por medio de la adicin de (NH4 )2 SO4 slido a pH 7,4 y recoleccin de las protenas precipitadas por
30 centrifugacin (17.000 g, 30 min). La fraccin saturada en (NH4 )2 SO4 al 25-35% se disolvi nuevamente entonces
en un amortiguador B, desalinizada por dilisis extensiva contra este mismo amortiguador, y centrifugada (17000 g,
30 min) para remover el material insoluble. Todas las etapas cromatogrficas posteriores se realizaron utilizando un
sistema FPLC (Pharmacia Biotech) a 4C.
35 La fraccin dializada (NH4 )2 SO4 fue aplicada a una columna de flujo rpido Q-Sefarosa (50 mm dimetro, 250
ml de volumen de lecho) preequilibrada con amortiguador A y una velocidad de flujo 7 ml/min. La actividad de la
esfingosina quinasa se eluy con un gradiente de NaCl de 0 a 1M en amortiguador A y se recolect en fracciones
de 10 ml. Las fracciones que contenan la ms alta actividad de SK1 se combinaron entonces, y se aadi CaCl2 y
NaCl para dar las concentraciones finales de 4 mM y 250 mM, respectivamente. Este extracto recolectado fue aplicado
40 entonces a una columna de calmodulina-Sefarosa 48 (16 mm dimetro, 10 ml de volumen de lecho), preequilibrada
con amortiguador A que contiene CaCl2 2 mM, a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se lav entonces la columna
con varios volmenes de columna de amortiguador para compensacin, seguido por un amortiguador A que contiene
EGTA 4 mM, y luego SKI eluido con amortiguador A que contiene EGTA 4 mM y NaCl 1M. se recolectaron las
fracciones que contenan la ms alta actividad de esfingosina quinasa, se desalinizaron sobre una columna Sefadex
45 G-25, y se aplicaron con una velocidad de flujo de 1 ml/min a una columna Mono-Q (5 mm de dimetro, 1 ml de
volumen de lecho) preequilibrada con amortiguador A. Se eluy la actividad de la esfingosina quinasa con un gradiente
de NaCl desde 0 hasta 1M en amortiguador A. Se aadi inmediatamente NaCl (hasta 500 mM) a las fracciones (1
ml) recolectadas para estabilizar la actividad de la enzima. Se combinaron las fracciones Mono-Q que contenan la
actividad ms alta de esfingosina quinasa y se desalinizaron sobre una columna Sefadex G-25. Se aadieron entonces
50 ATP y MgCl2 a las fracciones recolectadas hasta concentraciones finales de 1 mM y 5 mM, respectivamente, antes de
una nueva aplicacin a una velocidad de flujo de 1 ml/min a la columna Mono-Q preequilibrada con amortiguador A
que contena ATP 1 mM y MgCl2 5 mM. Se eluy la actividad de la esfingosina quinasa con un gradiente de NaCl
de 0 a 1M en el amortiguador de compensacin. Nuevamente, se aadi inmediatamente NaCl (hasta 500 mM) a las
fracciones (1 ml) recolectadas para estabilizar la actividad de la enzima. Se recolectaron las fracciones ATP-Mono-Q
55 que contenan la actividad ms alta de esfingosina quinasa y se concentraron 10 veces hasta un volumen final de 200
l en un concentrador Centricon-10 y se aplicaron con una velocidad de flujo de 0,4 ml/min a una columna Superdex
75 (10 mm de dimetro, 20 ml de volumen de lecho) preequilibrada con amortiguador A que contena NaCl 500 mM.
Se eluy la actividad de la esfingosina quinasa con el mismo amortiguador y se recolectaron fracciones de 0,4 ml. La
masa molecular de la enzima se estim a partir de esta columna por comparacin con los volmenes de elucin de la
60 ribonucleasa A, el quimotripsingeno A, ovoalbmina y BSA.
Clonacin de esfingosina quinasa humana
Se amplific la esfingosina quinasa humana (hSK) a partir de un banco de ADNc HUVEC l Zap utilizando ini-
65 ciadores PCR derivados de secuencias EST humanas (nmeros de acceso D31133, W63556, AA026479, AA232791,
AA081152, AI769914 y AI769914 del GenBank) alineadas con las esfingosina quinasas de murino (Olivera y co-
laboradores, 1998). Estos iniciadores, que abarcan un sitio SacII central (P1, 5-CGGAATTCCCAGTCGGCCGCGG
TA-3 [<400>3] y P2, 5-TAGAATTCTACCGCGGCCGACTGGCT-3 [<400>4]), fueron utilizados en combinacin
17
ES 2 261 200 T3
con iniciadores T3 y T7 para generar dos productos PCR por solapamiento de 669 pb y 550 pb que representan a
los extremos 5 y 3 de hSK, respectivamente. Estos dos productos PCR fueron entonces clonados separadamente
dentro de pGEM4Z. Un fragmento SacII de 584 pb del clon PCR 5 hSK fue subclonado entonces en la orientacin
correcta dentro del sitio SacII del clon PCR 3 hSK, para generar un clon parcial de ADNc de la hSK de 1130 pb. Se
5 gener entonces un clon de longitud completa que codifica a la hSK por medio de la subclonacin de un fragmento de
EcoRI/StuI de 120 pb a partir del clon de la 5hSK de 669 pb dentro de este clon pGEM4Z de 1130 pb digerido con
EcoRI/StuI. La secuenciacin del clon de ADNc en ambas direcciones verific la integridad de la secuencia del ADNc
de la hSK.
10 Para la expresin de la clula de mamfero, se marc el eptopo FLAG del ADNc de la hSK en el extremo
3 por medio de PCR de la PFU polimerasa con los iniciadores oligonucletidos T7 y 5-TAGAATTCACTTGT
CATCGTCGTCCTTGTAGTCTAAGGGCTCTTCTGGCGGT-3 [<400>5]. Este ADNc de la hSK marcado como
FLAG fue clonado entonces dentro de pCDNA3 por medio de digestin con EcoRI. La orientacin fue determinada
por medio de anlisis de restriccin y la secuenciacin verific la integridad de la secuencia del ADNc de FLAG de la
15 hSK. Para expresin bacterial, se subclon el ADNc complete de la hSK dentro de pGEX4T2. Se digiri el clon de la
hSK de pGEM4Z con BamHI y se despunt con 3U PFU polimerasa en amortiguador 1 x PFU, dNTP 50 M a 72C
durante 30 minutos. Se purific sobre gel el ADNc de la hSK de 1163 pb seguido de digestin con SalI y el fragmento
despuntado en SalI se lig entonces a pGEX4T2 SmaI/XhoI.
20 Anlisis de la secuencia de aminocidos de la esfingosina quinasa
La secuencia de aminocidos de la esfingosina quinasa humana fue investigada contra las bases de datos de la se-
cuencia de nucletidos y aminocidos no redundante en el Australian National Genome Information Service utilizando
los algoritmos blastp y tblastn (Altschul y colaboradores, 1990).
25
Cultivo celular
Las clulas endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) fueron aisladas como se describi previamente
(Wall y colaboradores, 1978) y cultivadas sobre frascos de cultivo recubiertos con gelatina en medio M199 con sales
30 de Earle suplementadas con 20% de suero fetal de ternera, 25 g/ml de suplemento endotelial de crecimiento (Colla-
borative Research) y 25 g/ml de heparina. Las clulas fueron pasadas tres veces y cultivadas hasta una confluencia del
80% antes del tratamiento y de cosecharlas. Las clulas embrionarias de rin humano (HEK293, ATCC CRL-1573)
fueron cultivadas sobre medio de Eagle modificado de Dulbecco que contena 10% de suero fetal de ternera, glutamina
2 mM, 0.2% (p/v) de bicarbonato de sodio, penicilina (1.2 mg/ml), y gentamicina (1.6 mg/ml). Las clulas HEK293
35 fueron transfectadas en forma transitoria utilizando el mtodo de precipitacin con fosfato de calcio (Graham & van
der Eb, 1973). El tratamiento de las clulas HUVEC y HEK293 con TNF (1 ng/ml) se realiz como se describi
anteriormente (Xia y colaboradores, 1998).
Ejemplo 2
40
Expresin y aislamiento de esfingosina quinasa humana recombinante a partir de E. coli - Procedimiento experimental
El ADNc clonado completo de SPHK dentro de pGEX4T2 se transform dentro de E. coli BL21. Los cultivos de
aislados transformados se desarrollaron durante la noche (100 ml) con agitacin (200 rpm) a 30C en Superbroth (20
45 g/L de glucosa, 35 g/L de triptona, 20 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, pH 7,5) un medio que contiene
ampicilina (100 mg/L). Los cultivos se diluyeron 1:20 en medio fresco y se desarrollaron a 30C con agitacin hasta
una OD600 de 0,6-0,7. Se indujo entonces la expresin de la esfingosina quinasa acoplada a glutationa-s-transferasa
(GST) (GST-SK) por medio de la adicin de isopropil--D-tiogalactosido 0,1 mM, e incubacin adicional de los
cultivos a 30C durante 3 h. Despus de este tiempo se cosecharon entonces las clulas bacteriales por medio de
50 centrifugacin a 6.000 g durante 20 min a 4C y se resuspendieron en 20 ml de amortiguador B que contena NaCl 250
mM, se lisaron luego las clulas con lisozima hasta una concentracin de 0,3 mg/ml durante 15 min a 25C seguido
de sonicacin, que consisti de tres ciclos de pulsos ultrasnicos de 20 s seguidos por un minuto de enfriamiento. Se
clarific entonces el lisado por medio de centrifugacin a 50.000 g durante 45 min a 4C, seguido por filtracin a travs
de filtros de 0,22 m. Para filtrarlo, se incub entonces el sobrenadante con 0,2 volmenes de glutationa-Sefarosa 4B al
55 50% (p/v) (Pharmacia) que se lav y preequilibr con amortiguador B, durante 60 min a 4C con mezclado constante.
Despus de este tiempo se verti la mezcla en una columna cromatogrfica de vidrio (10 mm de dimetro) y se lavaron
las perlas (con GST-SK enlazado) con 10 volmenes de columna de amortiguador B a 4C. La GST-SK se eluy
entonces desde la columna en 10 ml de amortiguador B que contenan glutationa reducida 10 mM. La escisin de la
GST fuera de la esfingosina quinasa fue realizada entonces por medio de incubacin con 20 g (30 unidades N.I.H.)
60 de trombina (Pharmacia) durante 3 h a 25C. La esfingosina quinasa liberada fue purificada entonces por medio de
la aplicacin de la mezcla escindida a una columna de calmodulina-Sefarosa y luego en una columna de intercambio
aninico Mono-Q para la purificacin de la esfingosina quinasa a partir de placenta humana. Estas columnas dieron
como resultado la purificacin de la esfingosina quinasa recombinante hasta homogeneidad.
65
18
ES 2 261 200 T3
Ejemplo 3
Caracterizacin de las esfingosina quinasas - Procedimientos experimentales
5 El efecto del pH sobre la actividad de las esfingosina quinasas aisladas fue determinado sobre el rango de pH de
4,0 a 11,0 en amortiguadores 50 mM (acetato de sodio, pH 4,0-5,0; Mes, pH 6,0-7,0; Hepes, pH 7,0-8,2; Tris/HCl,
pH 8,2-10,0; Caps, pH 10,0-11,0) a 37C. La estabilidad del pH se determine por medio del anlisis de la actividad
residual despus de la preincubacin de las enzimas en los mismos amortiguadores durante 5h a 4C. En forma similar,
las estabilidades trmicas se determinaron por medio del anlisis de la actividad residual despus de preincubacin
10 de las enzimas a diferentes temperaturas (4-80C) durante 30 min a pH 7,4 (Tris 50 mM/HCl que contena 10% de
glicerol, NaCl 0,5 M y 0,05% de Triton X-100). Las cinticas de los substratos se analizaron utilizando cinticas
de Michaelis-Menten con un programa pesado de regresin no lineal (Easterby, 1996). Ya que la esfingosina y sus
anlogos fueron aadidos a los anlisis de la enzima en micelas mezcladas con Triton X-100, en donde ellas exhiban
cinticas de dilucin de superficie (Buehrer y Bell, 1992), todos los valores Km y Ki obtenidos para estas molculas
15 fueron expresados como mol % de Triton X-100, en vez de cmo concentraciones a granel de la solucin. En los
anlisis para determinar el efecto del calcio/calmodulina sobre la actividad de la esfingosina quinasa, se aadieron
calcio y calmodulina a las mezclas patrn del ensayo que contenan 20 nM de esfingosina quinasa con concentraciones
finales de 4 mM y 0,6 M, respectivamente.
20 Ejemplo 4
Otros mtodos analticos
Se determine la protena utilizando o bien los reactivos Azul Brillante de Coomassie (Bradford y colaboradores,
25 1976) o el cido Bicinconnico (Smith y colaboradores, 1985) utilizando BSA como patrn. En algunos casos las esti-
maciones de la protena se realizaron despus de concentracin y remocin del detergente por medio de precipitacin
(Wessel y Flgge, 1984) para incrementar la sensibilidad y la precisin de las determinaciones. Se realiz SDS-PAGE
de acuerdo con el mtodo de Laemmli (1970), utilizando geles de acrilamida al 12%. Las bandas de protena sobre los
geles se visualizaron ya sea con Azul Brillante de Coomassie R250 o coloracin de plata. La masa molecular se esti-
30 m por medio de la comparacin con la movilidad electrofortica de la miosina, -galactosidasa, BSA, ovoalbmina,
anhidrasa carbnica, inhibidor de tripsina en las semillas de soja, lisozima y aprotinina.
Ejemplo 5
35 Purificacin de la esfingosina quinasa humana - Resultados
Justamente por encima de la mitad de la actividad total de la esfingosina quinasa en placenta humana estaba
presente en el citosol despus de la homogenizacin del tejido (Tabla 3). La purificacin de la esfingosina quinasa
a partir de placenta humana se resume en la Tabla 4. La fraccin soluble del homogenizado de cuatro placentas
40 humanas fue sometida inicialmente a precipitacin con sulfato de amonio. Esto dio como resultado una purificacin
notablemente buena de la esfingosina quinasa (33 veces), que precipit en la fraccin saturada de sulfato de amonio al
25-35%. Para la cromatogrfica de intercambio aninico, la fraccin en sulfato de amonio fue rpidamente desalinizada
a travs del uso de una columna Sefadex G25 y la fraccin desalinizada cargada inmediatamente sobre una columna Q
Sefarosa FF. La velocidad de esta etapa de desalinizacin parece crtica ya que la actividad de la esfingosina quinasa
45 parece muy inestable con concentraciones de NaCl aproximadamente por debajo de 0,2 M, lo cual significa menos
etapas de desalinizacin, tales como dilisis, dando como resultado una perdida sustancial de la actividad de la enzima.
La aplicacin de un gradiente de NaCl de 0 a 1 M a la columna Q Sefarosa FF da como resultado dos picos de actividad
de esfingosina quinasa, eluyendo aproximadamente a concentraciones de NaCl de 0,15 M y 0,6 M, y designadas SK1 y
SK2, respectivamente (Fig. 2). Para este estudio se seleccion SK1 para una purificacin adicional debido a su mayor
50 abundancia y estabilidad; la actividad de SK2 parece muy inestable y, a diferencia de SK1, podra no estabilizarse por
medio de la adicin de NaCl 0,5 M, 10% de glicerol y 0,05% de Triton X-100. Se escogi tambin SK1 ya que parece
ser la isoforma presente en HUVEC, como se discute ms adelante.
Las fracciones de la columna Q Sefarosa FF que contenan SK1 fueron purificadas entonces por afinidad por medio
55 de la aplicacin a una columna de calmodulina-Sefarosa 4B en presencia de CaCl2 4 mM, y la elucin de SK1 se
realiz con EGTA y NaCl, dando como resultado una purificacin sustancial adicional (38 veces) y altos rendimientos
de enzima. SK1 podra no ser eluida de la columna de calmodulina Sefarosa 4B con EGTA solamente, indicando
una asociacin inusual de la enzima con esta matriz de afinidad. Las fracciones activas que eluyeron de la columna
de calmodulina Sefarosa 4B fueron entonces desalinizadas y aplicadas en dos etapas posteriores de cromatografa
60 analtica de intercambio aninico sobre una columna Mono Q, con la segunda etapa realizada en presencia de ATP
1 mM y MgCl2 5 mM (Fig. 3). Las fracciones activas resultantes de estas etapas de intercambio aninico fueron
aplicadas entonces a cromatografa de filtracin por gel con una columna Superdex 75 como etapa de purificacin
final. SKI eluy de esta columna como un pico nico con una masa molecular correspondiente a 44 kDa. El anlisis
de la fraccin activa de esta columna final por medio de SDS-PAGE con coloracin de plata (Fig. 4) revel una banda
65 nica de masa molecular 45kDa, indicando una protena homognea que ha sido purificada ms de un milln de veces
a partir del extracto original de placenta con un rendimiento notablemente bueno del 7% de la actividad original de la
esfingosina quinasa (Tabla 4). Esta es la primera esfingosina quinasa en ser purificada hasta homogeneidad a partir de
una fuente humana.
19
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Ejemplo 6
Isoformas de esfingosina quinasa en HUVEC - Resultados
5 Ya que se identificaron dos actividades de esfingosina quinasa en placenta humana (Fig. 2) examinamos la multipli-
cidad de esta actividad de la enzima en HUVEC por medio del uso de columnas preparativas de intercambio aninico.
En contraste con otros tejidos humanos y clulas, la aplicacin de extractos de HUVEC a estas columnas resulta en la
aparicin de solamente un pico de esfingosina quinasa que eluy al mismo punto que SK1 de placenta humana (Fig.
5). En forma similar, solamente eluy un pico de esfingosina quinasa despus de la aplicacin de extractos de HUVEC
10 en el cual la actividad de la esfingosina quinasa haba sido estimulada por medio de un tratamiento de 10 min de HU-
VEC con TNF (Xia y colaboradores, 1999). Estos resultados indicaran que SK1, la esfingosina quinasa de placenta
humana aislada en este estudio, es probablemente la principal isoforma encontrada en HUVEC, y que el tratamiento
con TNF resulta en un incremento en la actividad de esta enzima, en vez de la activacin de otra isoforma, de otro
modo latente.
15
Ejemplo 7
Clonacin de esfingosina quinasa humana y expresin transitoria en clulas HEK293 - Resultados
20 Se gener ADNc de esfingosina quinasa humana a partir de una biblioteca Zap de HUVEC l utilizando iniciadores
diseados a partir de los EST humanos alineados con la secuencia publicada de la esfingosina quinasa de murino
(Kohama y colaboradores, 1998). La estrategia de clonacin se muestra en la Figura 6 (prov). El ADNc tiene un
marco aparente de lectura abierta que codifica 384 aminocidos (Fig. 7). Debe observarse que la secuencia carece de
un motivo de consenso reconocible Kozak, surgiendo la posibilidad de que la secuencia real de iniciacin pueda no
25 estar incluida en este ADNc. El ADNc de la esfingosina quinasa codifica una protena (hSK) con un punto isoelctrico
de 6,64 y una masa molecular de 42.550 kDa, consistente con la masa molecular determinada para la esfingosina
quinasa purificada de placenta humana (SK1). La subclonacin dentro de pcDNA3 y la expresin transitoria de hSK
en clulas HEK293 resulta en un incremento de 3200 veces en la actividad de la esfingosina quinasa en estas clulas
(Fig. 8), comparado con las clulas HEK293 no transfectadas o las clulas HEK293 transfectadas con un vector vaco,
30 indicando que el ADNc generado de hSK codifica a una esfingosina quinasa genuina. En forma muy interesante,
aunque las clulas HEK293 transfectadas con hSK tenan niveles 3200 veces superiores de actividad de esfingosina
quinasa, el tratamiento de estas clulas con TNF result en un rpido incremento (10 min) en la actividad de la
esfingosina quinasa en una proporcin similar (aproximadamente 2 veces) a aquella observada en clulas HEK293
no transfectadas (Fig. 8) (Xia y colaboradores, 1998). Esto indica que los altos niveles de esfingosina quinasa sobre
35 expresada no estn saturando el mecanismo de activacin mediado por TNF en estas clulas.
Ejemplo 8
Anlisis de la esfingosina quinasa humana - Resultados

40
Una bsqueda en las bases de datos muestra que hSK tiene una alta semejanza de secuencia de los aminocidos (28
a 36% de identidad) para dos esfingosina quinasas recientemente identificadas en Saccharomyces cerevisiae (Nagiec
y colaboradores, 1998) y varias otras protenas EST que codifican protenas putativas de esfingosina quinasa a partir
de Schizosaccharomyces pombe, Caenorhabditis elegans y Arabidopis thaliana. Mltiples alineamientos de secuencia
45 de hSK con estos homlogos (Fig. 9) revel diferentes regiones de aminocidos altamente conservadas a travs de la
protena, pero particularmente hacia el N-terminal.
Una bsqueda de las estructuras de dominio de la secuencia de la hSK revel tres motivos de enlazamiento
de calcio/calmodulina (Rhoads & Friedberg, 1997), uno de tipo A 1-8 14 ([FILVW]xxx{FAILVW]xx[FAILVW]
50 xxxxx{FILVW] con carga neta de +3 a +6) que abarca los residuos 290 a 303, y dos del tipo B 1-8 14 ([FILVW]
xxxxx{FAILVW]xxxxx[FILVW] con carga neta de +2 a +4) que se superponen entre los residuos 134 a 153. Otros
anlisis de la secuencia de la hSK revelaron un posible sitio de N-miristoilacin cerca del N-terminal (en Gly5) que
puede ser aplicable si la protena se somete a escisin proteoltica. Tambin se identificaron un sitio putativo de fosfo-
rilacin de casena quinasa II (CKII) (en Ser130) y cuatro sitios putativos de fosforilacin PKC (en Thr54 , Ser180 , Thr205
55 y Ser371 ) (Fig. 7). Estos sitios putativos de fosforilacin se encuentran tambin en ambas isoformas de la esfingosina
quinasa de murino, aunque las enzimas de ratn tambin muestran seis sitios posibles ms de fosforilacin; cuatro
para PKC, y uno para CKII y para la protena quinasa A, que no estn presentes en la hSK.
Una bsqueda de secuencias de dominio de sealamiento utilizando la herramienta de bsqueda SMART (Schultz
60 y colaboradores, 1998; Ponting y colaboradores, 1999) revel semejanza en los residuos 16 a 153 de la hSK para
el dominio cataltico putativo de la diacilglicerol quinasa (DGK). La hsk mostr una identidad total del 36% para la
secuencia de consenso de la familia del dominio cataltico DGK, y posea 17 de los 24 aminocidos muy altamente
conservados de este dominio. La hSK, sin embargo, no mostr homologa con el motivo de enlazamiento propuesto
de ATP de este dominio (GxGxxGxnK), aunque debe observarse que la aplicabilidad de este motivo del sitio de enla-
65 zamiento ATP de la protena quinasa (Hanks y colaboradores, 1988) para las DGK permanece contradictorio (Schaap
y colaboradores, 1994); Sakane y colaboradores, 1996; Masai y colaboradores, 1993). Otros anlisis de secuencia de
las esfingosina quinasas humanas tambin fallaron en encontrar regiones que muestren alguna semejanza marcada
con los motivos propuestos de enlazamiento a nucletidos encontrados en otras familias de protena (Saraste y co-
20
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laboradores, 1990; Walker y colaboradores, 1982). A parte de la semejanza con el dominio cataltico DGK, la hSK
no muestra semejanza con otras enzimas para enlazamiento de lpidos, y no parece tener ningn dominio reconocible
de enlazamiento de lpidos, tipo PKC C2 o dominios de homologa con la plecstrina. Existen tambin otros domi-
nios reguladores no obvios, con la posible excepcin de una regin rica en prolina en el C-terminal que tiene alguna
5 semejanza con los dominios de enlazamiento SH3 (Ren y colaboradores, 1993; Yu y colaboradores, 1994).
Ejemplo 9
Expresin en E. coli y aislamiento de esfingosina quinasa recombinante - Resultados

10
El ADNc de la hSK se subclon dentro del plsmido pGEX 4T-2 y la hSK expresada como una protena de
fusin de glutationa s-transferasa (GST) en E. coli BL21 por medio de induccin con IPTG (Fig. 10). Despus de
que la protena de fusin de la GST-hSK fue parcialmente purificada utilizando glutationa Sefarosa 4B, y la GST
removida por escisin de la trombina, la hSK fue purificada adicionalmente por medio de elusiones posteriores a
15 partir de columnas de intercambio aninico de calmodulina Sefarosa y Mono-Q. Esto dio como resultado una alta
recuperacin e la actividad de la esfingosina quinasa (mayor al 70% de la actividad inducida originalmente), y una
esfingosina quinasa electroforticamente pura (Fig. 10). Sin embargo, solamente podran obtenerse bajos rendimientos
de protena de la enzima recombinante ya que una gran proporcin de la IPTG inducida de la protena hSK escindida
de la trombina no se enlaz a la columna de calmodulina Sefarosa (Fig. 11). Esta forma no enlazada de hSK no tuvo
20 una actividad cataltica demostrable, sugiriendo que estaba incorrectamente plegada.
Ejemplo 10
Requisito para la modificacin posterior a la traduccin para la actividad funcional de la esfingosina quinasa
25
Para determinar si se requieren modificaciones posteriores a la traduccin para la actividad de la esfingosina qui-
nasa nativa, la molcula nativa ha sido comparada con la enzima recombinante producida en E. coli donde tales
modificaciones no ocurriran. Especficamente, las enzimas han sido examinadas por las diferencias en afinidad por el
sustrato y la accesibilidad. La premisa para este estudio fue que las modificaciones posteriores a la traduccin pueden
30 causar cambios conformacionales en la estructura de la esfingosina quinasa lo que puede resultar en cambios detecta-
bles en las propiedades catalticas o fisicoqumicas de la enzima. En resumen, se determin que la esfingosina quinasa
producida en forma recombinante retiene su actividad funcional an en ausencia de una modificacin posterior a la
traduccin.
35 Mtodos
La especificidad del sustrato de las esfingosina quinasas nativa y recombinante
Las tasas relativas de fosforilacin de esfingosina por las esfingosina quinasas nativa y recombinante fueron arbitra-
40 riamente establecidas en 100% y corresponden a 2,65 kU y 7,43 kU de las esfingosina quinasas nativa y recombinante,
respectivamente. Los sustratos examinados fueron aadidos hasta una concentracin final de 100 M en 0,25% (p/v)
de Triton X-100, y analizados bajo las condiciones estndar de ensayo reseadas antes.
Cinticas del sustrato y del inhibidor de las esfingosina quinasas nativa y recombinante
45
Las cinticas del sustrato se determinaron por medio del suministro de sustratos en el rango de concentraciones de
0,5 a 200 M para los anlogos de esfingosina, y 5 a 1000 M para ATP. Las cinticas de inhibicin se determinaron
por medio del uso de inhibidores en un rango de concentracin de 2 a 50 M (Tabla 5). En ambos casos se analizaron
los datos por medio de una regresin no lineal.
50
Estabilidades trmicas de las esfingosina quinasas nativa y recombinante
Las estabilidades trmicas de las esfingosina quinasas nativa y recombinante se determinaron por medio del anlisis
de la actividad residual restante despus de la preincubacin de las enzimas a diferentes temperaturas (4 a 80C)
55 durante 30 min a pH 7,4 (Tris/HCl 50 Mm que contena 10% de glicerol, NaCl 0,5M y 0,05% de Triton X-100). Las
actividades originales de las esfingosina quinasas nativa y recombinante fueron establecidas arbitrariamente en 100%
y corresponden a 2,65 kU y 7,43 kU, respectivamente.
Estabilidades con el pH de las esfingosina quinasas nativa y recombinante

60
Las estabilidades con el pH de las esfingosina quinasas nativa y recombinante se determinaron por medio del
anlisis de la actividad residual restante despus de la preincubacin de las enzimas a diferentes pH a 4C durante 5
horas. Las actividades originales de las esfingosina quinasas nativa y recombinante fueron establecidas arbitrariamente
en 100% y corresponden a 2,65 kU y 7,43 kU, respectivamente.
65
21
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El efecto del pH sobre la actividad de las esfingosina quinasas nativa y recombinante
El efecto del pH sobre la actividad de las esfingosina quinasas nativa y recombinante se determin por medio del
anlisis de la actividad en el rango de pH de 4 a 1 en amortiguadores 50 mM (acetato de sodio, pH 4,0-5,0; Mes,
5 pH 6,0-7,0; Hepes, pH 7,0-8,2; Tris, pH 8,2-10,0; Caps, pH 10,0-11,0). Las actividades mximas de las esfingosina
quinasas nativa y recombinante fueron establecidas arbitrariamente en 100% y corresponden a 2,65 kU y 7,43 kU,
respectivamente.
Efecto de iones metlicos sobre la actividad de las esfingosina quinasas nativa y recombinante
10
El efecto de iones metlicos sobre la actividad de las esfingosina quinasas nativa y recombinante se determin
por medio del anlisis de la actividad bajo condiciones estndar en presencia de diferentes iones metlicos o EDTA
a 10mM. Las actividades mximas de las esfingosina quinasas nativa y recombinante se establecieron arbitrariamente
en 100% y corresponden a 2,65 kU y 7,43 kU, respectivamente.
15
Efecto de los fosfolpidos sobre la actividad de las esfingosina quinasas nativa y recombinante
El efecto de diferentes fosfolpidos sobre la actividad de las esfingosina quinasas nativa y recombinante se deter-
min por medio del anlisis de la actividad bajo condiciones estndar en presencia de estos fosfolpidos a 10 mol %
20 de Triton X-100. Las actividades de las esfingosina quinasas nativa y recombinante en ausencia de fosfolpidos se
establecieron arbitrariamente en 100% y corresponden a 2,65 kU y 7,43 kU, respectivamente. PC, fosfatidilcolina; PS,
fosfatidilserina; PE, fosfatidiletanolamina; PI, fosfatidilinositol.
Resultados
25
La actividad mxima de las esfingosina quinasas nativa y recombinante fue observada a pH 7,4, con ambas enzimas
mostrando ms del 60% de actividad mxima en el rango de pH de 6,8 a 7,4 (Fig. 12). Ambas esfingosina quinasas
retuvieron ms del 90% de la actividad original despus de 5 h de incubacin a 4C en el rango de pH de 6 a 7,8 (Fig.
12), y a pH 7,4 en presencia de 10% de glicerol, NaCl 0,5 M y 0,05% de Triton X-100, ambas enzimas fueron estables
30 durante 30 min a temperaturas hasta de 37C (Fig. 12). Las enzimas fueron mucho menos estables en amortiguadores
que carecan de glicerol, NaCl y Triton X-100 (no se muestran los datos), consistente con observaciones previas de
las esfingosina quinasas de cerebro de bovino y rin de rata (Louie y colaboradores, 1976; Olivera y colaboradores,
1998). Ambas esfingosina quinasas humanas mostraron un requerimiento por iones metlicos divalentes ya que la
presencia de EDTA en los ensayos elimin la actividad (Fig. 12). As como otras esfingosina quinasas examinadas
35 (Louie y colaboradores, 1976; Buehrer & Bell, 1992; 1993; Olivera y colaboradores, 1998; Nagiec y colaboradores,
1998), ambas enzimas humanas mostraron la ms alta actividad con Mg2+ , una actividad algo menor con Mn2 , y
solamente una actividad muy baja con Ca2+ . Otros iones metlicos divalentes examinados , incluidos ZN2 , Cu2 y
Fe2+ , no soportaron la actividad de la esfingosina quinasa (Fig. 12).
40 Las esfingosina quinasas nativa y recombinante tienen especificidades de sustrato muy estrechas, y similares (Fig.
13), ambas mostrando la mayor actividad con el sustrato de mamfero de ocurrencia natural D-eritro-esfingosina as
como D-eritro-dihidroesfingosina. Se detect tambin baja actividad para ambas enzimas contra fitoesfingosina, mien-
tras que un rango de otros derivados de esfingosina y de molculas relacionadas no se fosforil. Estas incluyeron DL-
treodihidroesfingosina, N,N-dimetilesfingosina, N,N,N-trimetilesfingosina, N-acetilesfingosina (C2 -ceramida), diacil-
45 glicerol (1,2-dioctanoil-sn-glicerol y 1,2-dioleoil-sn-glicerol), y fosfatidilinositol. Otros anlisis de las esfingosina qui-
nasas humanas con D-eritro-esfingosina as como D-eritrodihidroesfingosina revelaron que las cinticas de Michaelis-
Menten en el rango de concentracin utilizado (Fig. 13), con ambas esfingosina quinasas nativa y recombinante ais-
ladas mostraron propiedades cinticas muy similares y una afinidad ligeramente superior por D-eritro-esfingosina as
como D-eritro-dihidroesfingosina (Tabla 5). Ambas enzimas mostraron tambin cinticas similares cuando se sumi-
50 nistr esfingosina como un complejo esfingosina-BSA, aunque la presentacin del sustrato en esta forma result en
valores ms bajos kcat para ambas enzimas (28 s1 y 39 s1 para las esfingosina quinasas nativa y recombinante, res-
pectivamente) comparado con su presentacin en micelas mezcladas con Triton X-100, como se utiliza para todos los
otros ensayos realizados en este estudio. La esfingosina suministrada como un complejo BSA con valores Km de 164
mM y 172 mM para las esfingosina quinasas nativa y recombinante, respectivamente. Ambas esfingosina quinasas
55 nativa y recombinante tenan la misma afinidad por ATP (Km aproximadamente de 80 mM (Tabla 5).
Ambas esfingosina quinasas nativa y recombinante fueron inhibidas por DL-treo-dihidroesfingosina, N,N-dime-
tilesfingosina y N,N,N-trimetilesfingosina (Fig. 13), con estas tres molculas mostrando inhibicin competitiva con
respecto a la esfingosina. Aunque las constantes de inhibicin para estas molculas fueron muy similares, N,N,N-
60 trimetilesfingosina produjo una inhibicin ligeramente ms eficiente que la de DL-treo-dihidroesfingosina, que era un
inhibidor marginalmente ms eficiente que N,N-dimetilesfingosina (Tabla 5).
ADP tambin mostr una inhibicin competitiva dbil, con respecto a ATP (Tabla 5). En todos los casos se obser-
varon constantes de inhibicin notablemente similares para las esfingosina quinasas nativa y recombinante (Tabla 5).
65 No se observ inhibicin con N-acetilesfingosina o Fumosina B1, un inhibidor de ceramida sintasa.
Se examin el efecto del calcio/calmodulina sobre la actividad de la esfingosina quinasa. Bajo las condiciones del
ensayo utilizado, el calcio/calmodulina no tuvieron efecto sobre la actividad de las esfingosina quinasas humanas ya
22
ES 2 261 200 T3
sea la nativa o la recombinante (no se muestran los datos). Mientras que este resultado indica una carencia de regu-
lacin de la actividad de la esfingosina quinasa por la calmodulina, existe la posibilidad de que la calmodulina pueda
estar involucrada en algunas otras funciones con la esfingosina quinasa, tales como la regulacin de su localizacin
subcelular.
5
Se examin la estimulacin de la actividad de la esfingosina quinasa por fosfolpidos cidos. La adicin de fosfo-
lpidos neutros de fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina a la mezcla de ensayo de la enzima no dio como resultado
ninguna diferencia detectable en la actividad de la esfingosina quinasa humana, sin embargo, se observaron incremen-
tos marcados de actividad (1,6 a 2 veces) con la fosfatidilserina de los fosfolpidos cidos, el fosfatidilinositol y el
10 cido fosfatdico (Fig. 14). Ambas esfingosina quinasas, la nativa y la recombinante se activaron en forma similar por
estos fosfolpidos cidos, con anlisis cinticos que revelan que los tres fosfolpidos causaron un incremento en la Kcat
de las enzimas, mientras que los valores de Km permanecieron sin cambio.
Aquellos entrenados en la tcnica apreciarn que la invencin descrita aqu es susceptible de variaciones y mo-
15 dificaciones diferentes de aquellas descritas especficamente. Se entiende que la invencin incluye todas aquellas
variaciones y modificaciones. La invencin tambin incluye todas las etapas, caractersticas, composiciones y com-
puestos referenciados para, o indicados en esta descripcin, individualmente o en forma colectiva, y cualquiera y todas
las combinaciones entre dos o ms de dichas etapas o caractersticas.
20 TABLA 3
Comparacin de la actividad de la esfingosina quinasa en placenta humana con diferentes tejidos animales
Se lavaron y homogeneizaron tejidos frescos de animal como se describi para la placenta humana. Se determin la
25 proporcin de actividad de la esfingosina quinasa citoslica por medio de comparacin de la actividad total de aquella
en el homogenizado a partir de la ultracentrifugacin del sobrenadante (100.000 x g, 60 min). La actividad especfica
de la esfingosina quinasa se expresa como pmol de S1P formada por minuto (U) por g de tejido.
Actividad especfica (U/g de tejido) Citoslico (%)

30
Placenta humana 13 51
Rin de rata 28 63
Hgado de rata 19 37
35
Cerebro de rata 13 52
Rin de oveja 38 58
Hgado de oveja 17 31
Cerebro de oveja 16 63
40 Bazo de oveja 9 34
TABLA 4
45
Purificacin de esfingosina quinasa a partir de placenta humana
La esfingosina quinasa se purific a partir de 1240 g de placenta humana fresca (4 placentas). Una unidad (U) de
actividad de esfingosina quinasa se define como 1 pmol de S1P formado a partir de esfingosina y ATP por minuto.
50
Actividad Protena Actividad Especfica Recuperacin Veces que
Etapa (U x 103 ) (mg) (U/mg) (%) se Purifica
Fraccin soluble de homogenizado 7943 123600 58 100

55
Sulfato de amonio (25-35%) 7723 3527 1966 97 33
Intercambio aninico sobre Q Sefarosa 4048 1098 4597 63 79

60 Calmodulina Sefarosa 3197 18,23 1,75 x 105 40 3,0 x 103
Intercambio del anin Mono Q 1706 2.921 5,84 x 105 21,5 1,0 x 104
Intercambio de anin Mono Q-ATP 1133 0,419 2,70 x 106 14,3 4,6 x 104
65
Filtracin sobre gel Superdex 75 549 0,008 6,64 x 107 6,9 1,1 x 106
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TABLA 5
Cinticas de sustrato e inhibicin de las esfingosina quinasas nativa y recombinante
5 Las cinticas del sustrato se determinaron por medio del suministro de sustratos en el rango de concentracin de
0,5 a 200 M (0,0125 a 5 mol %) para los anlogos de esfingosina, y de 5 a 1000 M para ATP. Las cinticas de
inhibicin se determinaron por medio del uso de inhibidores en un rango de concentracin de 2 a 50 M (0,05 a 1,25
mol %) para los anlogos de esfingosina y 0,1 a 5 mM para ADP. Para la comparacin con estudios previos, todos los
valores de Km y Ki para esfingosina y sus derivados se expresan como ambas concentraciones de la solucin a granel
10 y mol % de Triton X-100, en donde Triton X-100 estaba presente en todos los ensayos en una concentracin final de
0,25% (p/v). Todos los valores cinticos y los errores estndar (Duggleby, 1981) se obtuvieron a partir de anlisis de
regresin no lineal (Easterby, 1996).
SK Nativa SK Recombinante
15
Cinticas del sustrato
Esfingosina
20 Km (mol %) 0,350,05 0,300,07
-Km (M) 142 123
Kcat (S1 ) 50 85
Kcal /Km (105 S1 .M1 ) 36 71
25
Dihidroesfingosina
Km (mol %) 0,500,05 0,480,05
Km (M) 202 192
30 Kcat (S1 ) 35 76
Kcal /Km (105 S1 .M1 ) 18 39
ATP
Km (M) 7711 8612
35
Cinticas del inhibidor
N,N-dimetilesfingosina
40
Ki (mol %) 0,200,03 0,190,02
Ki (M) 7,81 7,51
DL-treo-dihidroesfingosina
Ki (mol %) 0,150,02 0,140,03
45 Ki (M) 3,91 5,71
N,N,N-trimetilesfingosina
Ki (mol %) 0,120,03 0,100,02
50 Ki (M) 461 3,81
Ki (mM) 1,10,3 0,90,2
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25
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REIVINDICACIONES
1. Una molcula aislada de cido nucleico que codifica a una esfingosina quinasa, la molcula de cido nucleico
5
comprendiendo.
(a) la secuencia de la SEQ ID NO: 1; o
(b) una secuencia que codifica a un polipptido que tiene la secuencia de aminocidos de la SEQ ID NO: 2; o
10
una secuencia de nucletidos complementaria a la secuencia de (a) 0 (b).
2. Una esfingosina aislada, protena Quinasa que comprende la secuencia de aminocidos de la SEQ ID NO: 2.
3. El uso de un antagonista de una protena esfingosina quinasa de la reivindicacin 2 seleccionado del grupo que
15
consiste de cidos nucleicos antisentido, anticuerpos, ARN, ADNzimas y ARN aptmeros en la fabricacin de un
medicamento para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por la actividad de esfingosina quinasa.
4. El uso de acuerdo a la reivindicacin 3 en donde la enfermedad se selecciona entre artritis reumatoide, asma,
aterosclerosis, meningitis, esclerosis mltiple, choque sptico, inflamacin, proliferacin celular y apoptosis.
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11 Nmero de publicacin: 2 261 200

La Figura 1 es una representacin esquemtica de la ruta de la Esfingomielina.

La Figura 9 es una representacin esquemtica de la comparacin de la secuencia de la esfingosina quinasa humana

55 La Figura 11 es una imagen de la purificacin de la esfingosina quinasa humana recombinante. La calmodulina

Descripcin detallada de la invencin

20 (a) modificaciones posteriores a la traduccin tales como fosforilacin o escisin proteoltica;

Ejemplos de la incorporacin de aminocidos no naturales y de derivados durante la sntesis de protenas incluyen,

Aminocidos no convencionales Cdigo Aminocidos no convencionales Cdigo

50 cido -aminobutrico Abu L-N-metilalanina Nmala

Aminocidos no convencionales Cdigo Aminocidos no convencionales Cdigo

Aminocidos no convencionales Cdigo Aminocidos no convencionales Cdigo

55 En una modalidad particularmente preferida, la secuencia de nucletidos correspondiente a esfingosina quinasa es

(i) modula la expresin de la esfingosina quinasa;

60 (ii) funciona como un antagonista de esfingosina quinasa;

(iii) funciona como un agonista de esfingosina quinasa.

Purificacin y clonacin de esfingosina quinasa humana - Procedimientos experimentales

D-eritro-Esfingosina, D-eritro-dihidroesfingosina, DL-treo-dihidroesfingosina, N,N-dimetilesfingosina, N-aceti-

5 Ensayo de la enzima esfingosina quinasa

20 Purificacin de esfingosina quinasa a partir de placenta humana

Clonacin de esfingosina quinasa humana

20 Anlisis de la secuencia de aminocidos de la esfingosina quinasa

Caracterizacin de las esfingosina quinasas - Procedimientos experimentales

Otros mtodos analticos

35 Purificacin de la esfingosina quinasa humana - Resultados

Isoformas de esfingosina quinasa en HUVEC - Resultados

Clonacin de esfingosina quinasa humana y expresin transitoria en clulas HEK293 - Resultados

Anlisis de la esfingosina quinasa humana - Resultados

Expresin en E. coli y aislamiento de esfingosina quinasa recombinante - Resultados

La especificidad del sustrato de las esfingosina quinasas nativa y recombinante

Estabilidades con el pH de las esfingosina quinasas nativa y recombinante

Actividad especfica (U/g de tejido) Citoslico (%)

Fraccin soluble de homogenizado 7943 123600 58 100

Intercambio aninico sobre Q Sefarosa 4048 1098 4597 63 79

Cinticas del inhibidor

15 Igarashi. Y., (1997) J. Biochem. 122:1080-1087

(a) la secuencia de la SEQ ID NO: 1; o

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