Cultivo In Vitro

de

Plantas

Medicinales

Resumen
El trmino cultivo in vitro es un trmino muy genrico que se
refiere ms bien a la metodologa usada que al propio objetivo
de ese mtodo. En sentido estricto, in vitro quiere decir dentro
de vidrio. Es decir, el cultivo de plantas o de algunas de sus partes
dentro de recipientes de vidrio en condiciones estriles de ambiente
controlado, (pero tambin de clulas y tejidos animales).
El cultivo in vitro de plantas superiores es una tcnica que exige
un control absoluto del ambiente, tanto fsico cmo qumico, en
el que se sita el explanto. Reproducir en condiciones de laboratorio
todos los factores que conforman el bitopo de la planta en la
naturaleza es tcnicamente muy complejo, por lo que se hace
necesario investigar cules son los principales factores que debern
ser controlados para el ptimo desarrollo del explanto.
Se realizar la micropropagacin va cultivo in vitro de porciones
nodales de plantas medicinales utilizadas frecuentemente en los
hogares de los alumnos que participan en esta investigacin. Para
ello, se instalar un pequeo invernadero en el colegio del cul
se obtendrn las muestras para realizar el estudio. Esto asegurara
un gran porcentaje de seguridad en las muestras, ya que no seran
manipuladas por agentes externos.
Se extraern diferentes tipos de tejido somticos y se espera
obtener a partir de ellos microplantas viables para ser llevadas a
invernadero y luego a viveros, huertos o jardines.

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Investigadores Escolares
Patricio Farfn Muoz (11 aos)
Cristbal Villalobos San Martn (11 aos)
Nicols Oate Schneider (11 aos)
Profesoras Guas
Leticia Williams P.
Patricia Salazar S.
Establecimiento
Colegio Concepcin,
San Pedro de la Paz
Asesores Cientficos
Darcy Ros L., Doctora en Biologa, Docente de
la Facultad de Ciencias Forestales, Universidad
de Concepcin
Introduccin
La micropropagacin ha revolucionado la
produccin vegetal silvoagronmica en los
ltimos aos, ya que gracias a esta tcnica se
pueden generar clones de variedades lite en
grandes cantidades, con un conjunto de
beneficios adicionales respecto a la propagacin
tradicional.
La tcnica de propagacin in vitro de
material vegetal es sencilla, pero necesita de un
laboratorio equipado y personal calificado,
representando una inversin inicial considerable.
Esto a largo plazo genera varios beneficios, pero
restringe su acceso en pases pobres. La
micropropagacin tambin permite un control
fitosanitario estricto, en especial en lo que se
refiere a la obtencin de plantas libres de virus,
siendo una herramienta de utilidad para el
fitomejoramiento.
La micropropagacin permite reproducir in
vitro cientos de clones de una misma especie,
los cuales posteriormente son llevados a un vivero
y luego al campo de cultivo, donde se
desarrollarn y darn lugar al producto de inters
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econmico que se busca obtener.
Esta tcnica permite optimizar la obtencin
de clones resistentes y de elevada produccin,
en grandes cantidades y en un tiempo menor.
Las condiciones de laboratorio en las que se
realiza la micropropagacin permiten obtener
nuevas plntulas todo el ao, independien-
temente del factor climtico, (temperatura, luz,
humedad, etc.). Gracias a esto se pueden
abastecer los viveros en cualquier temporada.
Micropropagar, es el proceso de multiplicar
plantas in vitro a partir de un fragmento de una
planta madre y de la cual se obtiene una
descendencia uniforme en condiciones de
asepsia.
Este proceso incluye seis fases:
Fase 0 : Preparacin de la planta madre.
Fase I : Establecimiento de embriones
maduros.
Fase II : Proliferacin de los brotes.
Fase III: Elongacin.
Fase IV: Enraizamiento.
Fase V : Aclimatacin.
En la presente revisin se pretende dar un
enfoque global al proceso de micropropagacin
de plantas medicinales herbceas con el objetivo
de poder obtener plantas a partir de tejidos
somticos, (fragmento de tallo y hoja). Las
especies en estudio son: menta, hinojo y toronjil.
A partir de tejido somtico se pueden obtener
plantas adultas en un medio de cultivo
adecuado.
Materiales
Planta de menta, toronjil e hinojo provenientes
del invernadero del colegio
Medio de cultivo MSd(Medio Murashige y
Skoog, 1962)
Material de diseccin: tijera, bistur y pinzas
Mechero de alcohol
Cmara de flujo laminar
Cmara de crecimiento
Horno elctrico
 Cmara fotogrfica
Papel de aluminio
Frasco de vidrio 200 ml
Sustancias qumicas: hipoclorito, alcohol.
Jabn desinfectante
Mascarillas
Delantal
Papel alusa plas
Lpiz marcador punta fina
Agitador magntico
pHmetro
Probeta 1000cc Pirex
Matraz 500ml
Vaso de precipitado 250 ml
Agua destilada esterilizada
Autoclave
Mtodo
Las actividades se desarrollaron en el Centro
de Biotecnologa de la Universidad de
Concepcin, en el laboratorio a cargo de la Dra.
Darcy Ros.
PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO
El medio utilizado es el de Murashige y Skoog
(1962). Se utilizaron stock de micro y macro
nutrientes refrigerados a 4C. (La preparacin
del medio se adjunta en el anexo).
Fase 0 : Preparacin de la Planta Madre:
Para lograr establecer el cultivo en
condiciones de asepsia, se deben obtener
explantos con un nivel nutricional y un grado de
desarrollo adecuado. En nuestro caso las plantas
fueron llevadas al laboratorio de biotecnologa
vegetal directo del invernadero del colegio.
Tambin fueron lavadas con agua, para remover
posibles contaminantes.
Fase I: Establecimiento del Tejido de los Nudos
del Tallo:
Se eligieron las plantas madre, se procedi
a cortar las mejores hojas y aquellos tallos que
presentaban yemas de las que se extrajeron los
fragmentos a partir de los cuales se obtuvieron
los explantos. Antes de extraer stos se hizo una
desinfeccin de los fragmentos de planta madre
para eliminar los contaminantes externos,
siguiendo el procedimiento establecidos en el
Laboratorio. Ya en condiciones de asepsia, bajo
cmara de flujo laminar y siguiendo los
procedimientos establecidos, se extrajeron los
explantos del material vegetal y se pusieron en
cultivo en un medio de iniciacin dentro de un
frasco de cultivo para poder controlar la sanidad
y la viabilidad de los explanaos, (2 explantos en
cada unidad de investigacin o frasco).
Para los explantos de hojas se cort la parte
basal de la hoja y se descart el borde y el pice,
debido a que pudieron ser daados en el
tratamiento de asepsia. Para los explanatos de
micro-estacas se colocaron 2 estacas en cada
frasco, cuidando que la parte basal del tallo
quedase inserta en el medio de cultivo.
Fase II : Proliferacin de los brotes:
Una vez que se tienen rotulados con fecha
y especificado el nombre de la planta, y que se
encuentran los dos explantos en los frascos, cada
uno de ellos es trasladado a la cmara de
crecimiento donde se mantuvieron las siguientes
condiciones:
- Fotoperodo: 16 horas luz- 9 horas oscuridad,
- Humedad relativa: 37%,
- Temperatura: 24C +- 2C,
-Intensidad lumnica: 32 mol/m 2 /s.
Se trabaj con el siguiente material biolgico:
- HINOJO: 6 unidades de investigacin con
microestacas, 6 unidades de investigacin con
hoja;
- MENTA: 6 unidades de investigacin con
microestaca, 8 unidades de investigacin con
hoja;
- TORONJIL: 4 unidades de investigacin con
microestaca, 6 unidades de investigacin con
hojas.
Se colocaron los frascos en la cmara de
crecimiento y se observan 2 veces por semana
las caractersticas: Sobrevivencia, Oxidacin,
Contaminacin y Crecimiento de brote o callos.
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Resultados
Las observaciones cualitativas fueron tabuladas como se muestra mas abajo, se incluyen los
resultados para Toronjil. Los resultados para Menta e Hinojo de incluyen en los anexos.

I.- SOBREVIVENCIA

0= ningn explanto de las unidades de investigacin sobrevive

50% = 1 explanto de la unidad de investigacin sobrevive
100%= 2 explantos de la unidad de investigacin sobrevive

Tabla 1: Registro Sobrevivencia v/s tiempo en hoja (Hj) y microestaca (Me) de Toronjil

Sobrevivencia (%) Hj Me Hj Me Hj Me Hj Me Hj Me
17-Dic 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
19-Dic 100 50 100 50 100 100 50 0 100 100
21-Dic 100 50 100 0 100 100 50 0 50 50
27-Dic 0 0 50 0 100 50 50 0 50 50
02-Ene 0 0 50 0 100 0 0 0 0 0

II.- OXIDACIN
0= ningn explanto de las unidades de investigacin est oxidado
50% = 1 explanto de la unidad de investigacin est oxidado
100%= 2 explantos de la unidad de investigacin sestn oxidados

Tabla 2: Registro % Oxidacin v/s tiempo en hoja (Hj) y Microestaca (Me) de Toronjil

Oxidacin Hj Me Hj Me Hj Me Hj Me Hj Me
17-Dic 0 100 50 100 0 50 50 100 50 50
19-Dic 0 100 50 100 0 50 50 100 50 50
21-Dic 0 100 50 100 0 50 50 100 100 50
27-Dic 0 100 50 100 0 50 50 100 100 50
02-Ene 0 * 50 * 50 100 * 100 *

III.- CONTAMINACIN

H= unidad de investigacin contaminada con hongos, B= unidad de investigacin contaminada con

bacterias, 0= sin contaminacin, (1) = 1 explanto contaminado
(2)= 2 explantos contaminados

Tabla 5: Registro Contaminacin v/s tiempo en hoja (Hj) y Microestaca (Me) de Toronjil

Contaminacin Hj Me Hj Me Hj Me Hj Me Hj Me
17-Dic 0 0 0 0 0 0 0 B 0 0
19-Dic H 0 0 0 0 0 H(1) B-H B 0
21-Dic H H(1) 0 0 0 0 H(1) B-H B-H H(1)
27-Dic H H(2) 0 H(2) 0 H(2) H(1) B-H B-H H(2)
02-Ene * * H * 0 * H(2) * B-H *

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IV.- CRECIMIENTO
0 = no hay crecimiento,
1 = 1 explanto de la unidad de investigacin presenta crecimiento (microestaca: brote, hoja: callo),
2 = 2 explantos de la unidad de investigacin presentan crecimiento (microestaca: brote, hoja: callo).

Tabla 7: Registro Crecimiento v/s tiempo en hoja (Hj) y Microestaca (Me) de Toronjil

Crecimiento Hj Me Hj Me Hj Me Hj Me Hj Me
17-Dic 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
19-Dic 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
21-Dic 0 1 0 0 0 2 0 1 0 2
27-Dic 0 2 0 0 0 2 0 2 0 2
02-Ene * * 1 * 1 * 0 * * *

* = unidades de investigacin que fueron retiradas por estar muy contaminadas.

Discusin
Debido a sus logros, el cultivo in vitro de tejidos
vegetales, y su utilizacin en las actividades
agrcolas, ha tomado auge en forma paulatina
y ascendente en las ltimas dcadas, (Montoya,
1991).
El objetivo de esta investigacin fue aprender
el mtodo de cultivo in vitro y especficamente
obtener plantas a partir de tallos y hojas, siendo
las especies en estudio: menta, hinojo y toronjil.
En primera instancia se puede afirmar que
el mtodo de cultivo in vitro es un mtodo viable
en la obtencin de plantas y se logr aprender
a utilizarlo.
Los resultados no fueron los esperados, el
mejor logro se obtuvo en los explantos de hinojo,
luego los de menta y finalmente los de toronjil.
Al analizar las observaciones, se puede ver
que en relacin a sobrevivencia el hinojo obtuvo
un mayor porcentaje (aproximadamente 70%),
luego la menta (hoja 20% y microestaca 50%
aproximadamente) y finalmente el toronjil (hoja
40% y microestaca 0%).
Si se considera el % de oxidacin, los
resultados indican que al menos en el 50% de los
explantos se presentaba ste fenmeno. En hojas
de toronjil un 60% de los explantos estaban
oxidados, mayor oxidacin presentaban las
microestacas de sta planta (90%). En el toronjil
se observ un 50% en hoja y 70% en microestaca.
Finalmente, en menta un 85% en hoja y 65%
aprox. en microestaca.
Como se observa en los datos obtenidos ms
del 50% de los explantos estaban oxidados, lo
que afect el crecimiento y desarrollo de stos
evitando que llegaran a formar brotes o callos.
Uno de los principales problemas que afecta
la tcnica de cultivo in vitro de tejido es la
contaminacin, particularmente de tipo
endgena, ocasionada por hongos y bacterias.
Estos microorganismos al encontrarse en el interior
del tejido, hacen sumamente difcil la utilizacin
del material vegetal.
Ms del 50% del total de los explantos fueron
contaminados por hongos, bacterias o ambos,
debiendo ser eliminados 12 unidades de
investigacin debido al grado de contaminacin
que presentaban. Estos resultados pueden
haberse dado por algn error en el mtodo de
asepsia o por mala manipulacin de los explantos
y la higiene de los estudiantes al trabajar con
ellos. Por ejemplo: el uso inadecuado de
mascarillas, una mala asepsia en el lavado de
manos, o el hecho que los estudiantes trabajaran
con el material vegetal muy cerca de la boca,

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pues no tenan prctica en ello.
En relacin al crecimiento, el hinojo respondi
muy bien, tanto en cultivo de hojas como de
microestacas.
En el caso del toronjil no result como se
esperaba lo que pudo deberse a que la planta
madre de toronjil no fue seleccionada en forma
adecuada (estaba deteriorada).
Se obtuvieron brotes y callos en menta, siendo
ms notable el crecimiento en explanaos de
microestaca. En explanaos de hojas slo 2
unidades de investigacin tuvieron xito, lo que
pudo deberse al grado de oxidacin que
presentaban las hojas o a la contaminacin. Con
ms tiempo para proseguir la investigacin se
podra observar mas claramente el crecimiento
de los explantos, que en algunos casos lleg a
6 cm y con varias ramificaciones, o bien de los
callos en el caso de los explantos de hojas. Esto
queda pendiente para una futura investigacin.
plantas medicinales entre los alumnos y la
comunidad de San Pedro de la Paz, regalando
plantas y folletos explicativos de sus beneficios.
Para lograr esto, se espera seguir trabajado con
el apoyo de la Universidad de Concepcin,
especialmente de la Dra. Darcy Ros del Centro
de Biotecnologa
Literatura Citada
Fontrbel Francisco, Micropropagacin de
un cultivo perenne.
Montoya, L. (1991) Cultivo de tejidos
vegetales. Medelln. Universidad Nacional de
Colombia.
Anexos
Resultados para Menta e Hinojo:
www.udec.cl/pasantias

Conclusiones
Si bien la micropropagacin tiene una gran
cantidad de ventajas, el principal problema para
su aplicacin en la agricultura es la limitacin
econmica y tecnolgica.
Es posible cultivar plantas herbceas como
la menta, hinojo y toronjil a partir de tejidos
somticos, (micropropagacin).
La gran cantidad de hongos y bacterias que
se presentaron en el cultivo, fueron producto de
la manipulacin del material vegetal y de la
propia carga de microorganismos de las plantas.
Para solucionar este problema la planta madre
debe tratarse antes con funguicidas y
bactericidas en el invernadero o lugar de cultivo.
Es necesario hacer notar que es una primera
etapa de desarrollo de la propuesta, a partir de
los conocimientos adquiridos se pretende
implementar una cmara de flujo laminar
artesanal en dependencias del colegio. En primer
lugar se espera desarrollar la tcnica y afinar la
manipulacin. Luego, se promover el uso de

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