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UNIVERSIDAD NACIONAL
DE COLOMBIA
MANUAL DE
PROCEDIMIENTOS
INTRODUCCION
1. PRESERVACION DE
MICROORGANISMOS
1.1 METODOS
l.l. 1 SUBCULTIVO
1.1.2 TRANSFERENCIA
PERIODICA
1.1.2.1 TUBO DE ENSAYO
1.1.2.2 CON PARAFINA
LIQUIDA
1.1.2.3 EN SUELO ESTERIL
l. 1.3 CONGELAMIENTO
1.1.3.1 CONSERVACION A 4C
1.1.3.2 CONSERVACION A -20C Y -70C
1.1.3.3 CONSERVACION CON NITROGENO
LIQUIDO
1.1.4 LIOFILIZACION
2. PROCEDIMIENTO PARA LA
CONSERVACION DE
MICROORGANISMOS EN EL IBUN.
3. MEDIOS DE CULTIVO
4. COLORANTES Y TECNICAS
5. ANTIBIOTICOS
BIBLIOGRAFIA
INTRODUCCION
EI presente manual ha sido elaborado con el fin de orientar las actividades realizadas en el
laboratorio de Microbiologa del Instituto de Biotecnologa, con un nfasis especial en el
manejo tcnico del proyecto Banco de Cepas y Genes; dando a conocer los diferentes
mtodos o procedimientos requeridos en la conservacin y mantenimiento de
microorganismos, as como en los diversos medios de cultivo comnmente usados en el
laboratorio.
Esperamos que ste manual cumpla con los objetivos propuestos y sea la base
fundamental en el mejoramiento progresivo de ste proyecto.
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
BANCO DE CEPAS Y GENES
1. PRESERVACION DE MICROORGANISMOS
Hay varias formas de preservar una bacteria, algunas bacterias resultan ser muy delicadas
y requieren de mtodos especiales. Entre los mtodos tradicionalmente utilizados en
preservacin de microorganismos son el subcultivo, liofilizacin, congelamiento,
metabolismo reducido y transferencia peridica, entre otras. Algunas especies requieren
transferencia de das, semanas, meses o aos.
1.1 METODOS
1.1.1 SUBCULTIVO
1.1.3 CONGELAMIENTO
La mayora de las bacterias pueden ser preservadas por ste mtodo. La reduccin de la rata
metablica y las bajas temperaturas promueven poca disponibilidad de energa para las
reacciones bioqumicas del microorganismo.
1.1.3.1 CONSERVACION A 4C
Por ste mtodo puede la bacteria vivir por aos o mucho ms tiempo que a
temperatura ambiente o a 37 C.
Utilizando el medio adecuado para la bacteria en tubo inclinado.
Para la conservacin a -20C se hace con glicerol al 50%, relacin 1:1 partes iguales de
medio con suspensin de microorganismos.
Para la conservacin a -70C se utiliza el medio de Gherma que se basa en leche
descremada estril y glicerol, los cuales actan como crioprotectores de las clulas.
Hay un congelamiento inicial que puede ser de varias formas: con dixido de carbono,
alcohol, sales y hielo o metales dielctricos.
1) Cepa en agar o en medio liquido tomar con un asa una cantidad suficiente para
inocular en medio liquido L.B.
2) Incubar en agitacin l80 rpm a la temperatura y tiempo requerido para el
crecimiento del microorganismo.
espectrofotometro
Tomar 1 ml de suspencion
bacteriana y adicionarlos en
otro erlenmeyeer con 50 ml Hacer una primera lectura sin incubacin
de caldo L.B. o el medio siempre utilizando la celda blanco con
necesario. medio, leer cada hora hasta llegar a una
absorbancia de 0.6-0.8 a una longitud de
onda de 600 nm
2.3 CONSERVACION DE MICROORGANISMOS A - 70C
Microorganismo con
absorbancia de 0.6-0.8 En 5 crioviales con 1 ml de
medio
eliminar el
En un tubo de centrfuga sobrenadante
Microorganismo con verter el volumen de
absorbancia de 0.6-0.8 suspensin bacteriana y
centrifugar a 4000rpm
durante 10 minutos
RECUENTO EN PLACA
101 102 103 104 105 106 107 108 109 1010
Suspencin de diluciones
microorganismos
100
3. MEDIOS DE CULTIVO
NUTRITIVOS NO SELECTIVOS
MEDIO LB ( Luria Bertani Medium)
Triptona 10 g
Extracto de levadura 5 g
NaC1 10 g
Agua destilada 1000 ml
pH= 7.0
Agar 1.5 %
Esterilizar por autoclave 121C*20 MIN*15 Libras de presin
Etanol 3%
CaCO3 2 %
Agar 2%
Formacin de cidos formado por una zona clara alrededor del inculo
Otro medio es
Extracto de levadura 3 %
Etanol 2%
Bromocresol verde 0.0022%
Agar 2.0 %
El Gluconobacter cambia el indicador de verde a amarillo. El Acetobacter contina del
mismo color. Para diferenciar Acetobacter con el Gluconobacter es por la oxidacin del
etanol a cido actico y a CO2 H2 O en el caso del Acetobacter
MEDIO YM
( cells LBA 4404 )
Peptona de casena 5 g
Extracto de levadura 3 g
Agar 15 g/ l
Agua destilada 1000 ml
Esterilizar a 15 lbs de presin,121C por 20 minutos
Despus aadir :
Calcio estril solucin 10.47 g/100ml de Calcio ( CaC12*2H20 ), esta solucin
est concentrada 100x
c Nalidxico 20 mg/ml
Streptomicina 100mg/ml
gramos CaC12 = 10.47 g* PM.CaC12
PM CaC12*H2O
LB (para Agrobacteria)
MS30
MEDIO YEB
Extracto de levadura 1 g
Extracto de carne 5g
Peptona 5g
Sacarosa 5g
Sulfato de Magnesio 0.5g
Agua destilada 1000ml
Glucosa 10 g
Extracto de Levadura 10 g
(NH4)2SO4 1.0 g
KH2PO4 0.25 g
Agar 20 g
Agua destilada 1000 ml
Esterilizacin normal
Sacarosa 0.5 g
Caldo de Nutritivo 0.8 g
Extracto de levadura 0.1 g
Agua destilada 100ml
Esterililizar a 121C por 15 minutos.
STOCK DE MINERALES
NaMoO4 p/v
CaC12 0.24 %
CaC12 0 03/
FeCl3 0.15%
CuSO4 5H2O 0.27%
MgSO4 0.17%
H2SO4 0.10%
25ml (V/V)
MEDIO PARA CRECER Enterococcus faecalis. BM 411O : Tn 1545
YDC Agar
CETRIMIDE AGAR
Peptona de gelatina 20 g
MgCl2 1.5g
K2SO4 10g
N-cetyl N-N-N Trimetil Bromuro 0.3g
Agar 12 g
Agua destilada 1000 ml
BROLACIN AGAR
MEDIO YMB
Manitol 10.0g
K2HPO4 0.5 g
MgSO4* 7 H2 0.2 g
NaC1 0.1 g
Extracto de levadura 0.5 g
Agua destilada 1 litro
pH= 6.8
Esterilizar 121C*15 libras de presin * 30 min
MEDIO YMA
Manitol 10.0 g
K2HPO4 0.5 g
MgSO4 * 7 H2O 0.2 g
NaC1 0.1 g
Extracto de levadura 0.5 g
Agua destilada 1 litro
Agar 15 g
Rojo Congo ( 0.25 g / 100 ml ) 10 ml
* Azul de bromotimol ( 0.5 g / 100 ml ) 5 ml
Esterilizar 121C*15 libras de presin * 30 min
I
OTROS MEDIOS DE CULTIVO
Peptona 5.0g
Lactosa 4.0g
Selenito de sodio 4.0 g
Fosfato monocido de potasio 3.5 g
Fosfato dicido de potasio 6.5 g
pH = 7.0
Para rehidratar el medio se suspenden 23 gramos de polvo en 1000ml de
agua destilada fresca y se calienta hasta punto d ebullicin. No sobrecalentar
ni esterilizar el medio en autoclave. Refrigerar a 4C en lugar oscuro. Si
aparece un precipitado rojo el medio debe descartarse.
Peptona 5.0 g
Extracto de levadura 3.0 g
Glucosa 1.0 g
Lisina 10.0g
Citrato frrico de amonio 0.5 g
Tiosulfato de sodio 0.04g
Prpura de bromocresol l 0.02g
Agar 15.0g
Agua destilada 1000ml
Ajustar pH = 6.7 Esterilizar a 121C por 12 minutos Inclinar los tubos con un fondo de
2.5 cm y un tendido de 3.5 cm
AGAR UREA
Peptona 1.0g
Cloruro de sodio 5.0g
Glucosa 1.0g
Fosfato de potasio monobsico 2.0 g
Rojo de fenol 0.012g
Urea 20.0g
Agua destilada 100ml
Ajustar pH = 6.8-6.9
Esterilizar por filtracin.
Disolver 15g de agar en 900ml de agua destilada y esterilizar a 121C por 15
minutos. Enfriar a 50-55C. Agregar 100ml de la solucin filtrada. Mezclar y
didtribuir en tubos estriles.
AGUA PEPTONADA
Bactopeptona 20g
Cloruro de sodio 5g
Agua destilada 1000ml
No ajustar pH. Esterilizar a 121C por 15 min.
Bactotriptona al 1%,Casitona al 1.5%, o Tripticasa al 1.5% pueden sustituir
la bactopeptona.
MEDIO DE MOTILIDAD
Extracto de carne 3g
Peptona 10g
Cloruro de sodio 5 g
Agar 4 g
Agua destilada 1000ml
TERRIFIC BROTH
BactoTriptona 12 g
Extracto de levadura 24 g
Glicerol 4 ml
Agua desionizada 900 ml
Esterilizar 121C * 20 min* 15 lbs
Cuando la solucin est a 60C adicionar por lo menos a 100 ml de agua estril una
solucin de 0.17 M KH2PO4, 0.72 M K2HPO4. ( esta solucin es hecha para disolver
2.31 g de KH2PO4 y 12.54 g de K2HPO4 en 90 ml de agua desionizada)
Despus de que las sales estn disueltas se ajusta el volumen a 100 ml con agua
desionizada y se esteriliza en autoclave por 20 min 121C* 15 libras de presin
Glucosa 40.0g
Peptona 10.0g
Agar 20g
Agua destilada 1000ml
Ajustar pH = 5.6 y esterilizar a 120C por 15 minutos.
i
MEDIO PARA LA CONSERVACION DE -70C
MEDIO DE GHERNA
Caldo de Casoy 3g
Glucosa 0.5 g
Leche descremada pulverizada 2g
Glicero l 4ml
Agua destilada 100ml
Esterilizar a 10 libras de presin por 15 minutos.
COLORACION DE GRAM
c. Safranina o Fuscina
Safranina 25.0g
Etanol (96%) 10.0g
Agua destilada 100.0ml
disolver la safranina en el alcohol. Agregar el agua destilada y mezclar bien.
TECNICA:
Fijar el frotis con calor
Agregar cristal violeta, dejar un minuto.
Lavar.
Aplicar lugol, dejar un minuto.
Lavar.
Decolorar con etanol al 95 %
Agregar safranina o Fuscina, dejar diez segundos
Lavar y secar.
GIEMSA O WRIHT
Es til para la demostracin de H. capsulatum.
a. Buffer.
KHpPO4 1.63g
NaHPO4 3.20g
Agua destilada 1000ml
pH = 7.0
b. Colorante
Polvo Wright 0.3g
Glicerol 3.0g
Metanol 97.0ml
Preparacin
a. Macerar el polvo en un mortero.
b. Aadir el glicerol y seguir macerando.
c. Aadir alcohol y mezclar.
d. Dejar en la oscuridad aproximadamente un mes.
e. Filtrar.
TINTA CHINA
AZUL DE LACTOFENOL
Es el montaje ms usado para el estudio microscpico de cultivo de hongos. Azul de
algodn Azul de China Merck 0.05g
cido lctico 20.0g
Cristales de fenol 20.0g
Glicerina 40.0g
Agua destilada 20 ml
Preparacin :
a. Agregar el cido lctico y la glicerina al agua destilada, mezclando
fuertemente.
b. Agregar los cristales de fenol y agitar.
c. Calentar suavemente al bao mara, con agitacin constante, hasta que
desaparezcan los cristales.
d. Agregar el azul de algodn y mezclar fuertemente.
HIDROXIDO DE POTASIO AL 10% o AL 20%
KOH 10.0g
Agua destilada 100.0ml
Tinta Parker Azul-Negra. 11.5ml
Preparacin;
Agregar los cristales d hidrxido al agua destilada.
' Mezclar hasta disolver completamente.
Agregar la tinta parker azul-negra.
Mezclar bien.
TECNICA:
Colocar una gota de KOH en una lmina portaobjetos
*Adicionar la muestra a examinar
Colocar una laminilla
Calentar suavemente a la llama, sin dejar hervir.
Observar al microscopio
Se recomienda leer la lmina 15 o 20 minutos para permitir un a mejor penetracin
de la tinta. Cuando se usa en DMSO no se debe calentar.
ANTIBIOTICOS
AMPICILINA (Amp).
MODO DE ACCION:
MECANISMO DE RESISTENCIA:
100 mg de Ampicilina mas 1 ml de agua, pasar por filtro estril. Adicionar 1ml de
solucin stock, directamente a un litro de medio,(concentracin final: 100 mg/ml).
CLORANFENICOL (Cm).
MODO DE ACCION:
MECANISMO DE RESISTENCIA:
El gen de resistencia (cat), una acetil transferasa especifica, que acetila y a la vez inactiva
el antibitico.
MODO DE ACCION:
Es un agente bactericida, que se une a los ribosomas 70s, e interfiere en la lectura del
RNA mensajero.
MECANISMO DE RESISTENCIA:
El gen de resistencia (kan), una enzima especifica que modifica el antibitico y evita su
interaccin con ribosomas.
ESTREPTOMICINA (Sm).
MODO DE ACCION:
MECANISMO DE ACCION:
El gen de resistencia (str), una enzima especifica que modifica el antibitico e inhibe su
unin al ribosoma.
TETRACICLINA (Te).
MODO DE ACCION:
El gen de resistencia (tet), una protena especifica que modifica la membrana bacterial y
evita el transporte del antibitico al interior de la clula.
15 mg de tetraciclina y disolver en 0.5 ml de agua y 0.5 de etanol, sellar muy bien los
frascos. Adicionar 1 ml de solucin Stock, directamente a 1 litro de medio (concentracin
final:
15 mg/ml).
OTROS ANTIBITICOS.
ACIDO NALIDIXICO
100 mg de cido nalidxico y disolver en NaOH 1N. Adicionar 0.3 ml de solucin Stock
directamente a 1 litro de medio, (concentracin final: 30 mg/mL).
BIBLIOGRAFIA
ANDREW M.E.H. ; RUSELL A.D. The Revival of Injured Microbes. Academic Press.
1984. captulo 6.
LAPAGE S.P AND JEAN E. SHELTON . Culture collections.cap II, pag 136.