ESPECTROFOTOMETRIA

CONCEPTO:

Son mtodos, cuantitativos, de anlisis

qumico que utilizan la luz para medir la
concentracin de las sustancias qumicas.
Se conocen como mtodos
espectrofotomtricos y segn sea la
radiacin utilizada como
ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION
VISIBLE(COLORIMETRIA), ultravioleta,
infrarroja.
 ESPECTROFOTOMETRO

LEY DE LAMBERT Y BEER

La base de la espectrofotometra de absorcin UV-Vis y su uso en el anlisis

cuantitativo estn dados por la relacin conocida como ley de Lambert
Beer, que establece que la absorbancia de una solucin es directamente
proporcional a la concentracin del analito en esa solucin. Por lo tanto,
puede emplearse para determinar la concentracin de un compuesto en
una solucin. La longitud de onda de absorcin de la luz es especfica de
cada cromforo.

Cuando un haz de radiacin UV-Vis atraviesa una solucin que contiene un

analito absorbente, la intensidad (l)' que atraviesa la muestra es menor que
la del haz incidente (10). La fraccin de radiacin que ha traspasado la
muestra se denomina transmitancia (T = 1/10). La transmitancia T est
relacionada con la absorbancia (A) de acuerdo a la siguiente expresin:
A - -log T -log(l/lo)
Por aspectos prcticos, para las mediciones se usa la absorbancia (A) en
lugar de la transmitancia (T), debido a que, de acuerdo a la ley Lambert
Beer, A est linealmente relacionada con la concentracin del analito
absorbente a una determinada longitud de onda:

A = logo(l/lo) = ECI

donde:

A: absorbancia medida

l: intensidad de la luz transmitida

lo: intensidad de la luz incidente

e: coeficiente de absorcin molar, caracterstico de cada sustancia

absorbente a cada longitud de onda

I: longitud del camino ptico (distancia que atraviesa la luz dentro de la

muestra) c: concentracin de la sustancia absorbente (mol LA ).

El espectrofotmetro UV-Vis registra las longitudes de onda a las cuales se

cuantifica y registra la absorcin. El espectro se registra como absorbancia
(A) vs. longitud de onda

Establece que la absorbancia es proporcional al nmero de molculas absorbentes por las

que pasa la luz.

A = cl
A = absorbancia

c= concentracin

l=longitud de la celda

= coeficiente de extincin o absortividad molar

 DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE PROTEINA

Existen diversos mtodos que permiten cuantificar la concentracin de protena presente en

las muestras biolgicas, basados en las propiedades que muestran las protenas en solucin.

Los mtodos ms usuales son:

Absorcin en el ultravioleta.
Reaccin del Biuret. - Mtodo de Lowry.
Mtodo de Bradford.
Mtodo del cido Bicincnico.

1. ABSORCION EN EL ULTRAVIOLETA

Las protenas poseen una banda de absorcin a 280 nm como consecuencia de

la absorcin de los residuos de tirosilo y triptofanilo en esta regin del
espectro.
Es un mtodo no destructivo.
El rango de concentracin que se puede determinar depende del contenido de
los aminocidos Tyr y Trp, y oscila entre 0,05 y 2 mg/ml.
La presencia de sustancias absorbentes a 280 nm conduce a interferencias.
 2. METODO BIURET

El nombre de la reaccin procede del compuesto coloreado formado por la

condensacin de dos molculas de urea con eliminacin de amonaco.

Reaccin del Biuret

Si una solucin fuertemente alcalina de sulfato cprico (CuSO4) se aade a una solucin de
protena se forma una complejo entre el ion cprico y los enlaces peptdicos, con aparicin de
una coloracin violeta-prpura, que presenta un mximo de absorcin a 540 nm. Las
caractersticas ms importantes de la reaccin son:

La reaccin del Biuret se aplica, a partir de los tetrapptidos, a todos los

pptidos y protenas.
Su rango de determinacin es de 1 a 6 mg/ml.
No depende de la composicin de aminocidos.
Algunos compuestos (NH4 +, Tris, etc.) dan la reaccin.

3. METODO DE LOWRY

Para aumentar la sensibilidad de la reaccin del biuret, el complejo protena-Cu2+ se hace

reaccionar con el reactivo de Folin-Ciocalteu, dando una coloracin azul, con un mximo
de absorcin a 650 nm. Esta coloracin se atribuye a la reduccin del cido
fosfomolbdico/fosfotngstico a azul de heteropolimolibdeno de composicin no definida,
por medio de los residuos tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos
de las protenas que forman el complejo con el Cu2+.

Las caractersticas del mtodo son:

La intensidad de la coloracin vara con la composicin de aminocidos de la

protena.
Es ms sensible que el ensayo del biuret. El rango es de 0,1-1 mg/ml.
La modificacin de Hartree incrementa la sensibilidad de 0,015-0,15 mg/ml.
Presenta
muchas
interferencias.
4. METODO DE BRADFORD
Consiste en la formacin de un compuesto de adsorcin de coloracin azul
entre los residuos de aminocidos bsicos de las protenas y el colorante Azul
Coomassie.
Absorbe luz a 595 nm.
El rango de determinacin de protena es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de
0,5 -1,4 mg/ml (ensayo estndar).
La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos bsicos y
aromticos.

TABLA N1: PRINCIPALES METODOS PARA LA CUANTIFICACION DE PROTEINAS ,

PRINCIPALES VENTAJAS E INCONVENIENTES
 CURVA PATRON

Es un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de una sustancia

(por ejemplo la albmina srica bovina) que se utiliza para determinar la cantidad de
protenas presente en una muestra incgnita.