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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERA QUMICA


CARRERA DE INGENIERA QUMICA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA INDUSTRIAL

PRCTICA 5

TCNICAS DE TINCION

RESUMEN / PALABRAS CLAVE

1. OBJETIVOS
Observar en el microscopio diferentes cultivos aplicando tincin.
Aplicar diferentes tcnicas de tincin.
Determinar el tipo de microorganismos observados.
2. TEORA
2.1.Tincin.
Los microorganismos, especialmente las bacterias, tienen poco contraste cuando se
observan sin teir al microscopio, por lo que se acostumbra teirlos para aumentar el
contraste con su entorno.
Para las tinciones bacterianas se utilizan colorantes, en esencia, son sales en las que uno
de los iones tiene color y se denomina cromforo. La tincin se da cuando se une el
cromforo a un componente celular. Los colorantes se clasifican en bsicos, cidos y
neutros segn sea la carga del grupo cromgeno.
La composicin qumica de la clula microbiana determina el colorante tomado por la
clula. Los componentes cidos se combinan con colorantes bsicos, mientras que los
componentes bsicos se combinan con colorantes cidos. Las bacterias usualmente se
tien con colorantes bsicos pues a pH neutro estn cargadas negativamente.
(Rodrguez, Gamboa, Hernndez, & Garca)
2.2.Tcnicas de tincin.
2.2.1. Tincin Simple: Esta es una tincin directa que utiliza solo un colorante, el
cual debe ser bsicos para que la clula bacteriana se tia. Permite demostrar la
morfologa general de una clula de manera rpida; al emplearse un nico
colorante, todas las clulas se observarn del color del colorante empleado.
(Rodrguez, Gamboa, Hernndez, & Garca)
2.2.2. Tincin Negativa: Este mtodo es ideal para observar inclusiones refrctiles
que no se tien fcilmente, tales como grnulos de azufre, acido poli--
hidroxibutrico, esporas o capsulas bacterianas. Por otra parte, no es adecuado
para medir bacterias, pues estas generalmente se observarn de mayor tamao,
debido a que las partculas de carbn empleadas en este procedimiento estn
cargadas negativamente y son repelidas por la carga negativa de la pared
bacteriana y delimitan una silueta mayor que el tamao real de la bacteria.
Para hacer esta tincin, se impregna una preparacin de bacterias con tinta china
o nigrosina. Las partculas de carbn no penetran la clula bacteriana, sino que
tien su entorno y la bacteria aparecer como un cuerpo refrctil sin teir. Con el
fin de facilitar la observacin de las clulas bacterianas se acostumbra a
combinar esta tincin con otra simple (Rodrguez, Gamboa, Hernndez, &
Garca)
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2.2.3. Tincin Diferencial: Las tinciones diferenciales reaccionan de modo diferente


con las distintas clases de bacterias, y por lo tanto pueden ser empleadas para
establecer una distincin entre ellas. Las tinciones diferenciales utilizadas con
ms frecuencia para las bacterias son la tincin de Gram y la tincin de cido-
alcohol resistencia. (Totora, Funke, & Case, 2007)
2.2.4. Tinciones Especiales: Las tinciones especiales se utilizan para colorear y aislar
partes especficas de microorganismos, como endosporas y flagelos, y para
detectar la presencia de cpsulas. (Totora, Funke, & Case, 2007)

2.3.Tincin Gram.
Esta tincin desarrollada por el doctor Christian Gram en 1884, es hoy la ms utilizada
en los laboratorios de bacteriologa y permite, de acuerdo con la estructura y grosor de la
pared bacteriana, agrupar las bacterias en Gram positivas y en Gram negativas. Las Gram
positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicn y carecen de membrana externa,
mientras que las Gram negativas tienen una capa ms delgada de peptidoglicn y poseen
una membrana externa.
Esta tincin, adems, correlaciona con otras propiedades como endotoxinas,
susceptibilidad a antibiticos, sensibilidad o resistencia a sales billares, punto isoelctrico
y tensin superficial.
Existen variaciones de esta tcnica, pero en trminos generales, la tincin de Gram
involucra varios pasos:
- Tincin inicial. Las clulas se tien con cristal violeta, el cual es el colorante
primario. En este paso todas las clulas se tien de morado.
- Mordente. Se adiciona yoduro (lugol) que reacciona con el cristal violeta y forma un
complejo cristal violeta-yoduro. En este punto todas las clulas continan de color
morado.
- Decoloracin. Se adiciona un solvente no polar, el cual acta lavando el complejo
cristal violeta-yoduro de las clulas Gram negativas. De esta manera las bacterias
Gram positivas continan moradas y las Gram negativas quedan incoloras.
- Contratincin. Se vuelve a teir con safranina o fucsina, de manera q las bacterias
Gram negativas, que haban sido decoloradas, se tien de rosado a fucsia segn el
color empleado; en tanto, las bacterias Gram positivas no se afectan con la
contratincion y permanecen moradas debido a lo intenso de esta coloracin.
(Rodrguez, Gamboa, Hernndez, & Garca)

3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Material y Equipos
Lmpara de alcohol
Microscopio
Porta y Cubre objetos.

3.2. Sustancias y reactivos


Cultivos.
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Agua destilada
Tinta china
Alcohol etlico 95%.
Solucin Gram
Azul de metileno
Violeta de metileno
Safranina

3.3. Procedimiento
3.3.1. Se siembra microorganismos en medios de cultivo.
3.3.2. Tincin negativa.
3.3.3. Se coloca en el portaobjetos una pequea gota de tinta china, esta no debe sobrepasar
los 4 milmetros.
3.3.4. Se coloca el inculo sobre la goa de tinta china.
3.3.5. Con otra placa de vidrio se realiza el frotis
3.3.6. Observar al microscopio.
3.3.7. Tincin simple.
3.3.8. Dependiendo del tipo de cultivo (slido o lquido) se coloca los microorganismos en
la placa de observacin.
3.3.9. Para medios lquidos
3.3.10. Se agita el tubo de muestra.
3.3.11. Se retira el tapon y se esteriliza con la lmpara de alcohol la boca del tubo al igual
que el asa de inoculacin.
3.3.12. Se toma la muestra y se coloca en la placa delimitando un crculo en la mitad.
3.3.13. Para medios slidos
3.3.14. Con el asa de inoculacin esterilizada se recoge una pequea cantidad de
microorganismos
3.3.15. Se coloca en la placa y se mezcla con agua. Dejar secar al T ambiente.
3.3.16. Una vez colocados los microorganismos se procede a colocar el tinte.
3.3.17. Se coloca el tinte (azul de metileno) por 1 minuto.
3.3.18. Se lava con agua el tinte, y el remanente en la placa se quita con cuidado con papel
absorbente.
3.3.19. Se observa al microscopio.
3.3.20. Tincin Gram
3.3.21. Se realiza el paso 3.3.10. dependiendo si el medio es slido o lquido.
3.3.22. Se cubre la muestra con violeta de metilo por 20 segundos.
3.3.23. Lavar por 2 segundos con agua destilada, remover el exceso de agua.
3.3.24. Se coloca la solucin de yodo. (Grams Iodine). De 30 segundos a 1 minuto.
3.3.25. Decolorar con alcohol etlico al 95% de 10 a 20 segundos.
3.3.26. Lavar con agua durante 2 segundos.
3.3.27. Cubrir con Safranina durante 20 segundos.
3.3.28. Lavar con agua durante 2 segundos, remover el exceso de agua usando papel
absorbente.
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3.3.29. Observar en el microscopio.


3.3.30. Tincin Capsular.
3.3.31. Colocar dos veces inculo sobre la gota de tinta china colocada en el porta objetos.
3.3.32. Realizar el frotis.
3.3.33. Secar en calor
3.3.34. Colocar violeta de metilo y dejar por un minuto.
3.3.35. Dejar secar y quitar el exceso de agua con papel absorbente
3.3.36. Observar en el microscopio.

4.1 Datos Experimentales.

Tabla 4.1-1
Observaciones de tcnicas de Tincin
Tcnica de Tincin Observacin.
Tincin Negativa (Ejemplo: Se debe anotar los cambios en coloracin de
la muestra a observar)

Tincin Simple

Tincin Gram

Tincin Capsular

4. RESULTADOS.
Tabla 4.1-1
Observaciones en el microscopio

Tcnica de Tincin Observacin.


Tincin Negativa Observaciones individuales.
(Ejemplo: Cambios en coloracin, morfologa de los
microorganismos observados, otras).
Tincin Simple

Tincin Gram
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Tincin Capsular

5. DISCUSIN
6. CONCLUSIONES
7. CUESTIONARIO.
8. ANEXOS
8.1.Diagrama del equipo.
8.2.Reporte fotogrfico de las observaciones realizadas.
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Dibuja: Facultad de Ingeniera Qumica
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