PREINFORME CULTIVOcorregido5

PRE-INFORME DEL EXPERIMENTO: CULTIVO CELULAR POR LOTE DE E.A.P. ING.
AGROINDUSTRIAL
Pichia Stipitis NRRLNY-7124E.A.P INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
MARACUY
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
PRE-INFORME:
CULTIVO CELULAR
POR LOTE DE
PICHIA STIPITIS
NRRL Y-7124
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Pgina 0

PRE-INFORME DEL EXPERIMENTO: CULTIVO CELULAR POR LOTE DE E.A.P. ING. AGROINDUSTRIAL
Pichia Stipitis NRRLNY-7124
MARACUY
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE INGENIERA
E. A. P. : INGENIERA AGROINDUSTRIAL
PRE-INFORME DEL EXPERIMENTO:

CULTIVO CELULAR POR LOTE DE Pichia
Stipitis NRRLNY-7124
ASIGNATURA : Lab. De Bioprocesos
DOCENTE : M.S. Augusto Castillo Caldern
INTEGRANTES :
Alza Paredes Antonella
Aurora Vigo Yuliana
Cha Concepcin Carol
Daz Paucar Blanca
Espinoza Ramos Iris
CICLO : VII
NUEVO CHIMBOTE 2016

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PRE-INFORME: CULTIVO CELULAR POR

LOTE DE PICHIA STIPITIS NRRL Y-7124
I. OBJETIVOS:
GENERAL:
- Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en

matraces empleando una cepa de Pichia stipitis Y-7124,
evalundose el efecto de la fuente de carbono y la velocidad de
agitacin en la cintica de crecimiento y la produccin de etanol.
ESPECIFICOS:
- Disear el medio de cultivo ptimo para el desarrollo de la cepa.

- Activacin celular y desarrollo del inculo.
- Determinar la cintica de crecimiento de biomasa.
- Determinar la cintica de consumo de la fuente de carbono.
- Determinar la cintica de generacin de etanol.
- Determinar y evaluar M, qS y los rendimientos del nutriente
limitante en clulas y en etanol, adems de las respectivas
productividades en clulas y en etanol.
- Evaluar el valor del pH al inicio y al final de la cintica.
- Determinacin del contenido de azcares reductores mediante el
mtodo del DNS.
- Determinacin de la concentracin celular por densidad ptica.

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II. METOLOGA EXPERIMENTAL
1. Preparacin del medio de mantencin.
Diseo de medio de mantencin:

Para la formulacin del diseo de medio de mantencin para el
cultivo Pichia stipitis NRRL Y-7124 se tiene en cuenta los siguientes
requerimientos nutricionales.
TABLA N01: Concentracin de nutrientes para el medio de mantencin (50ml)
Medio Nutriente Concentracin(g/l) Pesos (gr)

Extracto de levadura 3 0.15
Slido de Peptona 5 0.25
mantencin Extracto de malta 3 0.15
Agar 20 1.00
Preparacin del medio de mantencin:

Pesar las cantidades requeridas de cada compuesto.
Colocar los nutrientes en un matraz Erlenmeyer de 250 ml.
Agregar 50 ml de agua destilada, utilizando la probeta graduada.
Llevar a calentar la mezcla de 1-2 minutos en ebullicin con
agitacin constante.
Extraer en caliente, con la ayuda de una pipeta, 7 ml de solucin
en 6 tubos de ensayo con tapa y cerrarlos inmediatamente.
Colocar los tubos en un vaso de precipitado dentro de la olla a
presin, previamente aflojar las tapas para permitir el intercambio
de gases, y esterilizar hasta 121C durante 20 minutos (controlar
los 20 min a partir de la primera burbuja en la olla a presin).
Finalizada la esterilizacin, ajustar las tapas de los tubos y
retirarlos de la olla.
Colocar los tubos en posicin inclinada a temperatura ambiente
hasta el da siguiente.

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Cultivo del microorganismo:

Esterilizar la zona de trabajo y los instrumentos.
Extraer la cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124 con una asa
bacteriolgica.
Sembrar la cepa en forma de estras en el medio de mantencin,
siempre cerca del mechero para evitar la contaminacin de los
microorganismos del ambiente.
Dejar en la incubadora a 30C por 48 horas
Refrigerar para su posterior uso.
2. Preparacin del medio de activacin

Tener en cuenta las siguientes consideraciones:
El volumen del medio de activacin representa el 10% del volumen
del medio de fermentacin (200ml). As tenemos:
200 100%
10%
= 20
TABLA N 02: PARA UN MEDIO DE ACTIVACIN 20 ML
Medio Nutriente Concentracin(g/l) Peso para 30 ml

Glucosa 5 0.1
Extracto de levadura 3 0.06
Activacin Extracto de malta 5 0.1
Solucin de sales 5 ml/L 0.1 ml
N: 220 rpm
Tabla N 02: La tabla muestra el peso en gramos de los nutrientes necesarios para
la preparacin de 20 ml de un medio de activacin, regido en la concentracin de
cada nutriente. (Ver anexo, cuadro N01)

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PROCEDIMIENTO:
Pesar cada compuesto manteniendo los cuidados respectivos.

En un matraz de 125 ml adicionar la glucosa 10 ml de agua destilada.
En un tubo de ensayo adicionar los dems nutrientes y adicionar 10 ml
de agua destilada.
Esterilizar el medio de activacin en el autoclave por un tiempo de 15
minutos.
Dejar enfriar a temperatura ambiente.
Preparar el microorganismo antes de sembrarlo en el medio de
activacin (incubar por 1 hora a una temperatura de 30-35C). En
condiciones aspticas los medios lquidos y hacer el sembrado de la
levadura de medio slido a lquido.
3. Preparacin del medio de fermentacin.
Tener en cuenta las siguientes consideraciones:
Para un volumen de medio de 30% - 40% del volumen del

matraz.
Para una concentracin final de 2 g/L
Calcular la concentracin de nutrientes para el medio de

fermentacin, para ello se debe tener en cuenta conocer la
composicin elemental del M.O (ver tabla 01 anexos)
TABLA N03: COMPOSICIN DEL MEDIO MNIMO DE CULTIVO DE P.

STIPITIS NRRL Y-7124 PARA UN CRECIMIENTO EN BIOMASA DE 2G/L
% en
Nutriente Fuent
% en
compuest Y X S g S g S '
clula g l
e o
C6H12O6
C 46.57 40.00 0.52 3.88 3.88
Glucosa
(NH4)SO4
Sulfato de N 9.24 21.19 1.38 1.45 2.18
amonio
(NH4)SO4
Sulfato de S 0.55 24.25 26.46 0.08 0.11
amonio
KH2PO4
P 2.5 22.76 5.46 0.37 0.55
Fosfato dicido

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de potasio
KH2PO4
Fosfato dicido K 2.75 28.74 6.27 0.32 0.48
de potasio
MgSO4.7H2O
Sulfato de Mg 0.3 9.87 19.74 0.1 0.15
magnesio
MgSO4.7H2O
Sulfato de S 0.55 13.01 14.19 0.14 0.21
magnesio
Tener en cuenta que 1.45 g/L de sulfato de amonio destinado para el nitrgeno
que aporta lo requerido por el microorganismo en azufre; adems satisface el
0.37 g/L del fosfato dicido de potasio destinado para el fosforo por el potasio y
el 0.14g/L del sulfato de magnesio destinado para el azufre por el magnesio.
Determinacin de los pesos necesarios de los nutrientes para

200ml segn las concentraciones.
TABLA N04: COMPOSICIN DE MEDIO DE FERMENTACIN PARA PICHIA

STIPITIS NRRL Y-7124 DE 200ML
Nutriente Concentracin (g/l) Peso (g)

Glucosa 3.88 0.78
Extracto de Levadura 3 0.6
(NH4)2SO4 1.45 0.29
KH2PO4 0.37 0.074
MgSO4.7H2O 0.14 0.028
Solucin de Sales 5ml/L 1ml
Composicin de Solucin de sales utilizadas en los medios de cultivo en

g/L: 2.9 CaCl2.2H2O; 0,40 ZnO; 6.42 FeSO4.7H2O; 2.20 MgSO4; 0.25
CuSO4.5H2O; 0.24 CoCl2.6H2O; 0.06 H3BO3 y HCl conc.

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TABLA N05: COMPOSICIN DE SOLUCIN DE SALES PARA EL MEDIO

DE FERMENTACIN
Elemento Fuente S0 (g/l)
Ca CaCl2. 2H2O 2.9
Zn ZnO 0.4
Fe FeSO4.7H2O 6.42
Mg MgSO4.7H2O 2.2
Cu Cu SO45H2O 0.25
Co CoCl2.6H2O 0.24
B H3BO3 0.06
Preparacin del medio de fermentacin:
1. Pesar los componentes para el medio de Fermentacin de 200 mL

segn la TABLA N2 en la balanza analtica tomando como tara papel
metlico.
2. Preparar en un matraz de 125 ml el extracto de Levadura. Aadir
0.6 gr extracto de levadura y disolver con 20 ml de Tampn citrato.
Tapar el matraz con papel metlico.
3. Preparar en un tubo de ensayo 1ml de sales conc. y mezclar con 14ml
de agua destilada. Tapar el tubo de ensayo con tampn de gaza.
4. Preparar en un matraz de 500ml: 0.932 gr glucosa y mezclar con 130 ml
de agua destilada. Tapar el matraz con papel metlico.
5. En un tubo de ensayo grande mezclar el sulfato de amonio, fosfato
dicido de potasio y el sulfato de magnesio con 15 ml de agua destilada.
6. Esterilizar las preparaciones en una autoclave por 15min, el tiempo se
contar desde que empieza la ebullicin.
7. Dejar enfriar a temperatura ambiente. No mezclar las cuatro
preparaciones hasta el momento de la fermentacin.
8. En el momento de la fermentacin se mezclaran las preparaciones con
el caldo del inculo (20 ml).

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4. Determinacin de la cintica de crecimiento de la biomasa por

densidad ptica.
El mtodo se basa en el aumento de la turbidez del medio, al

incrementarse la concentracin de microorganismos, esto puede ser
detectado fcilmente por espectrofotometra a 640 nm. Para sta
determinacin es necesario que previamente se elabore una curva de
calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en el
medio son determinadas por peso seco.
PROCEDIMIENTO:
- Despus de haber sembrado la clula en el medio de

activacin y colocarlo en el Shaker:
En condiciones aspticas mezclar los medios lquidos de

fermentacin en el matraz de 1 litro.
Adicionar al matraz de 1litro el matraz que se encuentra en el
Shaker, mezclar y tomar una muestra de 5 ml con una pipeta
esterilizada (punto 0).
Colocar el matraz de 1 litro en el Shaker y proceder a tomar
muestras de 5 ml cada hora para determinar la curva de
crecimiento en biomasa.
Cada muestra de 5 ml es usada para leer en el
espectrofotmetro su absorbancia a 640nm. Y luego es
centrifugado por 15 minutos en la centrifuga para guardar el
sobrenadante en viales rotulados y poder usar estas muestras
en la determinacin de etanol en el cromatgrafo de gases y
la determinacin de azucares reductores.
Con la curva de calibrado de la biomasa (D.O) para la
Pichia stipitis NRRL Y-7124 se determinara la
concentracin final de la clula en cada punto.
Utilizando la ecuacin ln(X/ X0) = t, determinamos distintos
valores de .

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Se halla el valor de m.
dX / dt = m X
m = ln(X/ X0)/ t
Asi mismo al cabo del termino de la fermentacin se

determina la productividad, definida como :
X X0
QX / S
t t0
5. Determinacin de la produccin de etanol por cromatografa de

gases.
Construir una curva de calibracin estndar para el etanol,

usando como estndar interno n-propanol.
Con la ayuda de una jeringa, extraer una cierta cantidad de la
muestra a analizar, teniendo en cuenta el volumen del vial.
Filtrar dos veces la muestra contenida en la jeringa con dos
micro filtros.
Enumerar los viales del cromatgrafo de gases.
Tomar 1 ml de muestra a analizar y colocarlos en los viales
del cromatgrafo de gases segn numeracin.
Aadir 1 ml propanol.
Colocar el vial con 2 ml de muestra en el puerto de inyeccin
del cromatgrafo de gases y proceder a la lectura de etanol
en la muestra analizada.
6. Determinacin de la cintica de consumo (fuente de carbono

sacarosa) por el mtodo de azucares reductores (DNS).
El consumo de azcares se determinar mediante el mtodo de

azcares reductores del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS; Chaplin y
Kennedy, 1987)

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La preparacin del reactivo DNS se requiere de lo siguiente:
10 g /L de cido 3,5 dinitrosalicilico (DNS)
200 mL / L de NaOH 2N
300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en

aproximadamente 500 600 mI de agua, paralelamente se disuelve el
cido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1
litro y se agita hasta la completa disolucin de todos los componentes,
para posteriormente aforar hasta un litro.
PROCEDIMIENTO:
1. Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la

muestra:
2. Se aade un volumen del reactivo DNS a un volumen de
muestra a analizar.
3. Se mantiene la mezcla en un bao de agua a ebullicin durante
5 minutos para luego dejar enfriar.
4. Se aaden 10 volmenes de agua destilada.
5. Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.
6. La concentracin se obtiene interceptando la medida de
absorbancia en la curva de calibrado.
La curva de calibrado para el azcar se obtiene a partir de muestras

de concentracin conocida y analizadas segn este procedimiento.
III. MATERIALES, INTRUMENTOS Y REACTIVOS
Material Biolgico:
Cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124

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Componentes para Medios de Cultivos:
Solucin de Sales
Extracto de Malta
Extracto de Levadura
Agar
Extracto de
Solucin Tampn. levadura
Peptona
Peptona
Sacarosa
Agua destilada.
Reactivos:
Extracto de Malta
K2HPO4
(NH4)2 SO4
MgSO4.7H2O
DNS (ACIDO DINITROSALICILICO)
HCl cc. K2HPO4
NaOH 2 N
Tartrato de Sodio
Potasio Tetrahidratado
Instrumentos:
o Balanza analtica
o PHchimetro
o Autoclave
Espectrofotmetro
Balanza Analtica
o Espectrofotmetro
o Centrifuga refrigerada
o Agitador Orbital(Shaker)
o Papel metlico.
o Fiola 100ml.
o Esptula. Agitador orbital Centrifuga
(Shaker) refrigerada
o Mechero.
o Estufa Elctrica ( Incubadora)
o Olla a presin.

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o Cromatgrafo de Gases.
o Asa bacteriolgica.
o Mechero bunsen.
o Tubos de ensayo con tapa para medio de Incubadora
cultivo.
o Papel para hacer los capachos de muestra.
o Papel aluminio
o Micro pipeta.
o Matraz de 200ml.
o Vasos de precipitado.
o Piceta.
Micro Pipeta
o Tapones de algodn y gasa.
IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS
FECHA
ABRIL 2016
SEMANA 1 SEMANA 2 SEMANA3
11 12 13 14 15 18 19 20 21 22 25 26 27 28 29
Recoleccin de
informacin
Presentacin del
Pre informe
Acopio de
materiales
Esterilizacin de
materiales de
vidrio
Preparacin del
medio de
mantencin y
esterilizacin
Colocacin de la
cepa 1 hora
antes en la estufa
Resembrado de
clulas en el
medio de
mantencin

MARACUY
Preparacin de la
solucin tampn
Preparacin de
solucin de sales
Preparacin del
DNS
Preparacin del
DNS y obtencin
de la curva de
calibrado
FECHA
MAYO 2016
SEMANA4 SEMANA5 S.6
02 03 04 05 06 09 10 11 12 13 16 17
Esterilizacin y
acopio de
materiales
Preparacin del
medio de activacin
Inoculacin con asa
bacteriolgica a
medio rico de cultivo
Preparacin de los
medios de
fermentacin
Inoculacin de los
medios y
seguimiento de la
cintica de
crecimiento
microbiano
Determinacin de la
curva de calibracin
para la
determinacin de
biomasa celular
Evaluacin y
supervisin del
medio
Determinacin de la
produccin de
etanol por
cromatografa de
gases
Tiempo para

MARACUY
imprevistos
Presentacin del
informe final y
sustentacin
Martes 19 de abril:
Esterilizacin de materiales de vidrio: 9:00 9:30 a.m

Preparacin del medio de mantencin y esterilizacin 9:40
10:50 a.m
Colocacin de la cepa 1 hora antes en la estufa.
Resembrado de clulas en el medio de mantencin 11:00 11:15
a.m
Preparacin de la solucin tampn 11:20 1:00 pm.
Mircoles 20:
Preparacin de la solucin de sales.
Jueves 21:
Preparacin de DNS.
Martes 26 de abril:
Preparacin del DNS y obtencin de la curva de calibrado: 8:00
10:30 a.m.
Lunes 02 de mayo:
Esterilizacin del medio lquido para la cintica de crecimiento

microbiano.
Preparacin del medio de activacin e inoculacin con asa
bacteriolgica a medio rico de cultivo
Martes 03 de mayo:
Preparacin de los medios de fermentacin, inoculacin de los

medios y seguimiento de la cintica de crecimiento microbiano.
Determinacin de la curva de calibracin para la determinacin de
biomasa celular.

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Evaluacin y supervisin del medio. (Constantemente).

Determinacin de la produccin de etanol por cromatografa de
gases.
Martes 17 de mayo:
Presentacin del informe final y sustentacin. 8:00 8:30 am.
V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
- M. F. Chaplin y J. F. Kennedy. (1987). Carbohydrate analysis: A

practical approach Edited by IRL Press, Oxford.

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VI. ANEXOS
CUADRO 01: Clculo del peso en gramos de cada nutriente utilizado para la
preparacin de 20 ml de un medio de activacin.
Glucosa:
5g ------- 1000 ml
X -------- 20 ml
X = 0.1 g
Extracto de levadura:
3g ------- 1000 ml
X -------- 20 ml
X = 0.06 g
Extracto de Malta:
5g ------- 1000 ml
X -------- 20 ml
X = 0.1 g
Solucin de sales:
5ml ------- 1000 ml
X -------- 20 ml
X = 0.1 ml
CUADRO 02: Clculo de la composicin elemental del microorganismo

PichiaStipitis NRRL Y-124.
Frmula del microorganismo PichiaStipitis NRRL Y-124:
CH1.79 O0.60 N0.17
Peso molecular de los elementos y compuesto

Carbono (C) = 12
Hidrgeno (H) = 1
Oxgeno (O) = 16
Nitrgeno (N) = 14
CH1.79O0.6N0.17 = 12(1) + 1(1.79) + 16(0.6) + 14(0.17) = 25.77
Clculo del % composicin elemental para el m.oPichiaStipitis NRRL Y-124:

Tomando en cuenta solo los elementos segn los aportes de nutrientes: Carbono,
Nitrgeno, Azufre, Potasio, Fsforo, Magnesio.
Contina

MARACUY
Contina de cuadro 02
Para el carbono:
(Peso molar de C * nmero de elementos / Peso molecular de la cepa)*100%
(12*1/25.77)*100% = 46.57%
Para el Nitrgeno:
(Peso molar de N * nmero de elementos / Peso molecular de la cepa)*100%
(14*0.17/25.77)*100% = 9.24%
Para el fsforo:
Se toma en cuenta el promedio de los intervalos del componente elemental
para las levaduras (0.8-2.6), segn la tabla 01.
(0.8+2.6)/2 = 1.7%
Para el Azufre:
(0.01+0.24)/2 = 0.125%
Para el Magnesio:
(0.1-0.5)/2 = 0.3%
TABLA 06: Componentes elementales en bacterias, levaduras y hongos
ELEMENTO
Para el Potasio: BACTERIAS LEVADURAS HONGOS
Carbono
Se toma en cuenta el promedio50-55de los intervalos 45-50
del componente40-63
elemental
Hidrgeno 7 7
Nitrogeno 12-15 7.5-11 7-10
Fsforo (1.0+0.4)/2
2.0-3.0 = 2.5%0.8-2.6 0.1-1.5
Azufre
Para el Magnesio: 0.2-1.0 0.01-0.24 0.1-0.5
Potasio 1.0-4.5 1.0-4.0 0.2-2.5
Sodio 0.5-1.0 0.01-0.1 0.02-0.5
para las levaduras (0.1-0.5),
Calcio segn la tabla 01. 0.1-0.3
0.01-1.1 0.1-1.4
Magnesio 0.1-0.5
(0.1+0.5)/2 = 0.3% 0.1-0.5 0.1-0.5
Cloruro 0.5 --- ---
Hierro 0.02-0.2 0.01-0.5 0.1-0.2
Fuente: Principles of FermentationTechnology. Stanbury and A. Whitaker. 1989.

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TABLA 07: Composicin elemental del microorganismo PichiaStipitis NRRL Y-

7124.
% DE COMPOSICION
ELEMENTO
ELEMENTAL
Carbono 46.57
Nitrogeno 9.24
Magnesio 0.3
Azufre 0.125
Potasio 2.5
Fsforo 1.7
CUADRO 03: Clculos de la composicin del medio mnimo de cultivo de P.

Stipitis NRRL Y-7124 para un crecimiento en biomasa de 2g/L
Clculo nutriente:

( ) 100%

Ejemplo:
Compuesto: C6H12O6 PM: 180
Fuente: C PM: 12
6 12
( ) 100% = 40%
180
El mismo procedimiento se realiza para los dems compuestos
Clculo del rendimiento:

%
=
%
Solo al compuesto limitante se le multiplicars adems por un factor. Donde f para

metabolismo aerbico va de 0.5 0.6. Como el proceso se trata de condiciones
microareadas consideramos 0.5.
Contina

MARACUY
Contina de cuadro 03
Ejemplo:
Para la glucosa (fuente de carbono). Compuesto limitante.
%C en nutriente = 40%
%C en clula = 46.57%
40%
= 0.5 = 0.43/
46.57%
Para el sulfato de amonio (fuente de carbono).
%N en nutriente = 21.19%
%N en clula = 9.24%
21.19%
= 0.5 = 0.43/
9.24%
Clculo sustrato inicial:

0 = ( )

Ejemplo:
Biomasa = 2g/L (concentracin final

Rendimiento = 0.43g/g
2/
0 = ( ) = 4.66 /
0.43 /
El mismo procedimiento se realiza para los dems compuestos
Clculo sustrato inicial corregido con el sustrato limitante:

0 = 0
Exceso = 2
Sin embargo el exceso no lo multiplicamos al compuesto limitante (glucosa),

por su propia condicin
Ejemplo:
Sustrato inicial (S0) = 0.87g/L

0.87
0 = 2 = 1.74

Realizar el mismo procedimiento para los dems compuestos excepto la

glucosa.

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CUADRO 04: Clculo del peso en gramos de cada nutriente utilizado para la
preparacin de 200 ml de un medio de fermentacin.
Glucosa:
4.66g ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 0.931 g
Extracto de levadura:
3g ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 0.6 g
(NH4)2SO4:
1.74g ------- 1000 ml

X -------- 200 ml
X = 0.349 g
KH2PO4:
0.35g ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 0.070 g
MgSO4.7H2O:
0.12g ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 0.024 g
Solucin de sales:
5ml ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 1 ml
Tampn Citrato:
100ml ------- 1000 ml
X -------- 200 ml
X = 20 ml

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- Calculo del TFERMENTACION:
Hallando el mediante el Td:
2
=

Tiempo de duplicacin:
(Hacemos uso de la tabla N 8)
Tabla N 8: Tiempos de duplicacin caracterstico dependiendo

del tipo de microorganismo:
Tipo de celula Td (h-1)

Bacterias 0.3 20.5
Levaduras 1.0 4.0
Hongos 1.5 7.0
Hallando :
2 2
= =
1+4
2
= 0.277
Hallando TFERMENTACION:

( ) =
0
2
( ) = 0.277
0.2
= 8 31

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Preparacin Tampn Citrato pH: 4.5 a 0.2M
Preparar las soluciones A y B en un matraz:

Solucin:
A: 4.202 g Ac. Ctrico, diluido con 100 ml de agua destilada.
B: 5.882 g Citrato de Sodio, diluido con 100 ml de agua

destilada.
Preparacin del tampn:
80.25ml (A) 80.25ml (B)
MEZCLAR
AGREGAR 150ml de H20 destilada
Si la mezcla se
encuentra por debajo
AJUSTAR A 4.5pH de 4.5 agregar NaOH y
si se encuentra por
encima agregar HCl
Cantidades calculadas para 300ml de solucin tampn
NaOH al 0.1M
HCl al 0.1M

PRE-INFORME
ESQUEMA DEL DEL EXPERIMENTO:
PROCESO CULTIVO CELULAR
DE INOCULACION POR LOTE
EN EL MEDIO DE E.A.P. ING.
DE ACTIVACION Y FERMENTACION EN EL CULTIVO POR LOTE CON LA
AGROINDUSTRIAL
Pichia Stipitis
MARACUYNRRLNY-7124
CEPA PICHIA STIPITIS NRRL Y-7124.
Inculo Matraz (medio Inculo Fermentado

de activacin) (medio de fermentacin)
(medio de activacin) (medio de activacin)
Glucosa 0.1gr
Glucosa 0.93gr + 130ml
Extrac. de levadura 0.06gr Sol. de sales 0.1ml de H2O destilada
Extrac. de malta 0.1gr
Sol. de sales (NH4)2SO4
,etc. en gr + 15ml H2O Sol. de sales 1ml +14ml
destilada. de H2O destilada.
Extrac. de levadura
0.6gr+ tampn
(20ml)
20ml de medio Preparacin y esterilizacin de
medio de fermentacin para
x=2gr/L. (180ml)

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PRE-INFORME DEL EXPERIMENTO: CULTIVO CELULAR POR LOTE DE E.A.P. ING.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Pgina 0

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

PRE-INFORME DEL EXPERIMENTO:

NUEVO CHIMBOTE 2016

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PRE-INFORME: CULTIVO CELULAR POR

- Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en

- Disear el medio de cultivo ptimo para el desarrollo de la cepa.

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Pgina 2

II. METOLOGA EXPERIMENTAL

1. Preparacin del medio de mantencin.

Diseo de medio de mantencin:

Medio Nutriente Concentracin(g/l) Pesos (gr)

Preparacin del medio de mantencin:

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Pgina 3

Cultivo del microorganismo:

2. Preparacin del medio de activacin

TABLA N 02: PARA UN MEDIO DE ACTIVACIN 20 ML

Medio Nutriente Concentracin(g/l) Peso para 30 ml

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Pesar cada compuesto manteniendo los cuidados respectivos.

3. Preparacin del medio de fermentacin.

Tener en cuenta las siguientes consideraciones:

Para un volumen de medio de 30% - 40% del volumen del

Calcular la concentracin de nutrientes para el medio de

TABLA N03: COMPOSICIN DEL MEDIO MNIMO DE CULTIVO DE P.

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Determinacin de los pesos necesarios de los nutrientes para

TABLA N04: COMPOSICIN DE MEDIO DE FERMENTACIN PARA PICHIA

Nutriente Concentracin (g/l) Peso (g)

Composicin de Solucin de sales utilizadas en los medios de cultivo en

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TABLA N05: COMPOSICIN DE SOLUCIN DE SALES PARA EL MEDIO

Elemento Fuente S0 (g/l)

Ca CaCl2. 2H2O 2.9

Preparacin del medio de fermentacin:

1. Pesar los componentes para el medio de Fermentacin de 200 mL

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Pgina 7

4. Determinacin de la cintica de crecimiento de la biomasa por

El mtodo se basa en el aumento de la turbidez del medio, al

- Despus de haber sembrado la clula en el medio de

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Asi mismo al cabo del termino de la fermentacin se

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6. Determinacin de la cintica de consumo (fuente de carbono

El consumo de azcares se determinar mediante el mtodo de

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10 g /L de cido 3,5 dinitrosalicilico (DNS)

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1. Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la

La curva de calibrado para el azcar se obtiene a partir de muestras

III. MATERIALES, INTRUMENTOS Y REACTIVOS

Cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124

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Componentes para Medios de Cultivos:

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Pgina 11

IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS