GENES

MARCADORES:
LAS
LUCIFERASAS

Ana lvarez Gonzlez, Octavio Barrientos lvarez, Jaime Delgado Rodrguez y Alfonso Pearroya
Rodrguez.

Biotecnologa celular. Universidad de Oviedo. Octubre 2017.

0
ndice
Abstract ......................................................................................................................................... 2

Introduccin ................................................................................................................................... 2

Las luciferasas y las luciferinas ................................................................................................. 2

1. Benzotiazol: la luciferina de las lucirnagas ................................................................. 2

2. Tetrapirrol: la luciferina de los dinoflagelados y Euphausiidae ..................................... 2

3. Flavina: la luciferina de las bacterias ............................................................................ 3

4. Coelenterazina: la luciferina marina .............................................................................. 3

El proceso y el amplio espectro de emisin de luz ....................................................................... 3

Sistemas Reporter Celulares: Ensayos DualLuc .......................................................................... 4

Evaluacin de interacciones protena-protena in vivo ................................................................. 6

Sistema modificado para mamferos del doble hbrido ............................................................. 6

Transferencia de energa bioluminiscente por resonancia (BRET) .......................................... 7

Estrategias de split reporter ...................................................................................................... 7

Regulacin dependiente de pH de la actividad luciferasa ............................................................ 8

Miscelnea: Otras aplicaciones ..................................................................................................... 9

Plantas biomuliniscentes ........................................................................................................... 9

Aplicaciones en clnica ............................................................................................................ 10

Conclusiones ............................................................................................................................... 10

Bibliografa................................................................................................................................... 12

1
Abstract

In the following report we are to evaluate the variety of use possibilities related to the
emerging luciferase systems both in the research field and in the direct applications as a
biotechnological tool. We hereby described the different proteins coined under the term luciferase
and the biochemistry of their own reactions. Furthermore, we went through their combinatorial
use in order to determine expression levels by using them as reporter genes. We analysed their
faculties as reporter genes at in vivo experiments, mainly for protein-protein interaction analysis.
We concluded with an overview of generalities and putative applications in clinic as well as in
plant biotechnology.

Introduccin

Las luciferasas y las luciferinas

Luciferasa es un trmino que se emplea de forma genrica para referirse a ciertas

enzimas oxidativas asociados a bioluminiscencia y distintos de las fotoprotenas. stas ltimas
son polipptidos con capacidad de emisin biolumnica pero que no est asociada a la catlisis
de una reaccin enzimtica como en el caso de las luciferasas (luciferina-luciferasa, sustrato-
enzima). El mecanismo de accin de las fotoprotenas se basa en la formacin de un complejo
sustrato-fotoprotena que se activa en presencia de determinados cofactores, como por ejemplo
el Ca2+. El nombre de luciferasa fue utilizado por primera vez por Raphal Dubois, quien acu
los trminos este trmino junto al de luciferina para enzima y sustrato, respectivamente
(Lehninger, Nelson, & Cox, 2008; Encyclopdia Britannica: Photoprotein, 1998).

Tanto las luciferinas como las luciferasas son taxn-especficas. Al parecer los sistemas
bioluminiscentes no guardan relacin evolutiva entre ellos, pues tras llevar a cabo una gran
cantidad de estudios filogenticos de los sistemas luciferina-luciferasa, se han hallado ms de
30 orgenes independientes. Estos modelos se pueden agrupar en cuatro categoras:

1. Benzotiazol: la luciferina de las lucirnagas

Es el sistema de la lucirnaga Photinus pyralis, siendo el ms estudiado de ellos. En la

reaccin, el enzima cataliza la transformacin oxgeno-dependiente del sustrato D-luciferina.
Para que se produzca se requiere el uso de los cofactores ATP y Mg2+ (Shimomura, 2012). El
producto fluoresce con un mximo de emisin (max) a 537 nm. La reaccin sucede de manera
silvestre en los peroxisomas de las clulas del rgano lumnico (Keller, Gould, Deluca, &
Subramani, 1987). La luciferina de las lucirnagas tambin se presenta en otros insectos de las
familias Phengodidae (por ejemplo, Phrixothrix) y Elateridae (por ejemplo, el escarabajo click,
Pyrophorus noctilucus) (Shimomura, 2012).

2. Tetrapirrol: la luciferina de los dinoflagelados y Euphausiidae

La luciferina de los dinoflagelados es un tetrapirrol lineal y abierto. Los bioluminiscencia

en los mares de ardora (milky seas) se debe a estas algas microscpicas (Shimomura, 2012).

2
En este caso, para la emisin de luz interviene no solo la luciferina y su correspondiente
luciferasa, sino tambin las protenas de unin a luciferina (LBP) (Morse & Mittag, 2000). La
reaccin se lleva a cabo en orgnulos especiales, llamados scintillone (Fogel & Hastings, 1972).
La emisin oscila entre azul y verde, con un max cerca de 470 nm (Shimomura, 2012). Una
luciferina con estructura casi idntica se encontr en Euphausiidae (krill, crustceo marino). En
estos organismos se la denomina componente F, y es obtenida a travs su alimentacin a base
de fitoplancton como dinoflagelados. Tienen rganos especializados tras los ojos que permiten
donde se genera la bioluminiscencia (Greer & Szalay, 2002). El mecanismo de reaccin es
anlogo al comentado para dinoflagelados.

3. Flavina: la luciferina de las bacterias

Las bacterias bioluminiscentes emplean un flavn mononucletido (FMNH2) para la reaccin en

cuestin. Todas las identificadas hasta ahora son Gram-negativas, siendo la ms conocida
Aliivibrio fischeri. En muchos metazoos de las profundidades marinas estas bacterias se
encuentran como simbiontes en los fotforos (rganos especializados), otorgando cualidades
bioluminiscentes a estos animales. Para la reaccin se requieren cuatro sustratos: el FMNH2,
una luciferasa (monooxigenasa dependiente de flavina en este caso), oxgeno molecular y un
aldehdo de cadena carbonada larga y saturada. El FMNH2 y el aldehdo son transformados en
presencia de oxgeno en FMN+ y un cido carboxlico. El FMNH2 se genera endgenamente
mediante la riboflavinaquinasa con gasto de ATP a partir de la riboflavina (vitamina B2).
Asimismo, los aldehdos se regeneran de manera continua en la clula (Shimomura, 2012) (Tu,
2008).

4. Coelenterazina: la luciferina marina

La luciferina de algunas especies marinas bioluminiscentes es una coelenterazina. La

coelenterazina no se ha observado en animales terrestres y en algunos casos est presente en
pequeas cantidades en organismos que no producen luz, como en Microcina prolifera (porfero),
que carece de luciferasa. En la reaccin, la coelenterazina, en presencia de oxgeno, presenta
una descarboxilacin oxidativa y se forma coelenteramida, proporcionando luz en el espectro
azul. Esta reaccin puede ser catalizada por una luciferasa (bioluminiscencia), aunque
alternativamente puede originarse de manera espontnea (quimioluminiscencia) a menores
tasas. Algunas de estas luciferinas interaccionan con fotoprotenas en lugar de con luciferasas
para producir luz, como es el caso de la aequorina de Aequorea victoria (Shimomura, 2012).

El proceso y el amplio espectro de emisin de luz

Como se ha comentado, la luciferasa, mediante la utilizacin de oxgeno, modifica a las

luciferinas, haciendo uso habitualmente de cofactores como ATP o iones. La luciferina oxidada
pasa a un estado de transicin I, desencadenando una descarboxilacin a travs de varios pasos
intermedios hasta un sustrato activo elctricamente (P*). Este se estabiliza rpidamente ( en
pocos nanosegundos) en el sustrato base (P) emitiendo la energa sobrante en forma de fotones.

3
Para pasar a P* se requiere termodinmicamente de un aporte energtico externo, que
generalmente viene dado por la hidrlisis del cofactor o por la rampa de energa de Gibbs
favorable para alguno de los productos. Si la transformacin de una luciferina por su luciferasa
correspondiente es eficiente, se puede determinar la eficiencia cuntica (Q), definida como el
nmero de fotones emitidos por molcula transformada de luciferina. La mayor Q encontrada se
corresponde con la de la lucirnaga Photinus pyralis con un valor de 0,41 (White, 1971).

Como se ha mencionado, existen varios tipos de luciferasas y luciferinas que dan lugar
a un amplio espectro de emisin de luz con diferentes longitudes de emisin. Adems de las
luciferasas silvestres, tambin se han introducido modificaciones genticas para obtener nuevas
variantes con mayores Q o con alteraciones en sus espectros, lo que da pie a la diversificacin
de sus aplicaciones.

Sistemas Reporter Celulares: Ensayos DualLuc

Como hemos descrito, las mltiples enzimas que englobamos dentro del trmino
luciferasa poseen distintas propiedades tanto en cuanto a su bioluminiscencia como a nivel de la
qumica de las reacciones en que se fundamenta su accin. El verstil uso de estos sistemas
reporter est hacindose sitio ya en la actualidad en mltiples campos y su desarrollo hace que
las posibilidades de aplicacin aumenten de manera exponencial. Entre otros, el sistema simple
de evaluacin de expresin basado en el uso nico de este gen reporter y la medida indirecta de
su actividad con un posterior ensayo in vitro da un valor numrico absoluto que expresa la
cantidad de seal detectada por el luminmetro y que indica la expresin del gen en cuestin
bajo la regulacin de un determinado promotor. No obstante, si se trabaja con lneas celulares,
bien en ensayos de transfeccin transitoria, bien con lneas que hayan integrado el sistema en
su genoma, esta seal ser proporcional al nmero de clulas. Tericamente, puede parecer
relativamente sencillo uniformar dicho parmetro a travs de la siembra de una misma
concentracin celular a lo largo de todos los pocillos de ensayo tanto en controles como en
tratados y buscando el ms preciso seguimiento de un mismo protocolo en cada acercamiento
experimental. Sin embargo, el mero desarrollo del ensayo en cuestin puede alterar la viabilidad
de las clulas vase un ensayo de genotoxicidad- y con ello, disponer de resultados poco
robustos debido a la gran cantidad de factores que pueden hacer variar una medida de este tipo,
desde a nivel del cultivo, nmero de clulas por pocillo, tiempo de cultivo, mtodos de lisis,
tratamiento de las muestras, etc.

A este respecto aparecen en torno a 2005 ensayos que buscan relativizar estas medidas
para poder expresar en un mismo anlisis el nivel de expresin regulado por el promotor de
estudio en relacin a la expresin basal de otro gen housekeeping proporcional tericamente al
nmero de clulas ensayadas (Osamu, 2006). Para ello, se ha aprovechado la ya comentada
creciente variabilidad quimicofsica de los sistemas reporter basados en las distintas luciferasas,
y se han desarrollado diversos sistemas que utilizan simultneamente dos de ellas y que
permiten tomar medidas de expresin robustas y relativas conocidos como ensayos DualLuc o

4
DoubleDetection System. Distintas casas comerciales ofrecen variados vectores en los que, por
lo general, la expresin de la lucierasa Firefly (FLUC) -cuya reaccin es dependiente de ATP y
Mg2+- est regulada bajo un promotor de tipo constitutivo, lo que la hace un estimador del nmero
de clulas ensayadas, mientras que bajo el promotor a evaluar se incorpora otro tipo de luciferasa
que presente distinta emisin y cuya qumica no interaccione ni interfiera con el ensayo de la
anterior, por ejemplo enzimas como la Renille (RLuc), la Gaussia (GLuc) o la NanoLuc (NLuc)
(todas con similares caractersticas bioqumicas) que permitan medir simultneamente en un
mismo pocillo las distintas expresiones. La obtencin de una medida relativa permite la
comparacin de los resultados obtenidos en distintas situaciones, como por ejemplo varios
tiempos o bajo distintos tratamientos. Adems, si se desea, este vector puede utilizarse
suprimiendo la normalizacin que ofrece el promotor constitutivo a travs de la Firefly y
utilizndolo para la evaluacin simultanea de dos promotores de expresin variable, aunque ello
conlleve a la prdida de la robustez del sistema anteriormente descrito. Como ejemplo, la casa
comercial Thermo Fisher ofrece el PierceTM Renilla-Firefly Luciferase Dual Assay Kit, basado en
la combinacin del enzima Renilla verde, de alta intensidad bioluminiscente y estabilidad, y de
una forma mutante roja de la extrada de la lucirnaga Luciola cruciata (ThermoFisher
Pierce, 2013). El pico de absorbancia para la primera se corresponde con un max de 535 nm
y es producto de la oxidacin enzimtica del compuesto coelenterazina. Esta reaccin no
depende de ATP ni de cofactores como el Mg2+. Sin embargo, la segunda s depende de estos
factores y su emisin deriva de una reaccin qumica de oxidacin de la D- luciferina
completamente distinta en cuanto a requerimientos y con una emisin corrida hacia el rojo con
un mximo de emisin a 613 nm, con lo que se evitan interferencias espectrales y permite la
adicin de un nico mastermix sustrato para realizar ambas medidas de manera simultnea. El
sistema se basa en la transfeccin de las lneas celulares de estudio, bien de manera integrativa
o como plsmidos para experimentos transitorios, y la posterior lisis celular y ensayo de la
actividad a travs de la adicin de dichos sustratos reducidos. La casa comercial recomienda
realizar las medidas utilizando para la Renilla un filtro que recoja las longitudes entre 505 y
545 nm y para la Firefly toda la luz emitida a ms de 640 nm, pues de esta manera se asegura
una resolucin adecuada del espectro con interferencias entre los picos mnimas y una mxima
sensibilidad. En la prctica, los luminmetros suelen contener 3 reservorios que contienen
respectivamente los sustratos para el ensayo de la luciferasa roja (ATP, Mg2+, buffer), los propios
de la reaccin de la Renilla (coelenterazina, DCTA, buffer) y un tercero de cido sulfrico. Aunque
tericamente ambas medidas se pueden llevar a cabo simultneamente, el procedimiento tcnico
suele seguir un mtodo de 2 medidas consecutivas. ste consiste en la adicin en cada pocillo
inicialmente de un volumen del primero de los reservorios; la reaccin se inicia y a un tiempo
determinado, se toma la medida a la longitud apropiada. Es entonces cuando se agregar un
contenido del segundo, cuyo sustrato est disuelto en DCTA, potente quelante de los iones Mg 2+
y que ayuda a detener la reaccin del anterior ensayo para evitar interferencias. Asimismo, la
medida de este segundo subensayo se acompaa de la adicin de unas gotas de cido sulfrico
que detienen toda reaccin enzimtica en el pocillo ya evaluado. Otros sistemas anlogos con

5
variaciones en los complementos de los vectores aunque con idnticos fundamentos son
ofrecidos por otras casas comerciales como Promega (Promega, 2015) o PerkinElmer
(PerkinElmer, 2017).

Evaluacin de interacciones protena-protena in vivo

El conocimiento actual en desarrollo del proteoma no puede por s mismo representar la

complejidad funcional y las implicaciones fisiopatolgicas de la realidad celular, pues esto ltimo
es ms bien responsabilidad del estudio de las complejas interacciones pasajeras o estructurales
entre las distintas protenas en el interior celular. El estudio in vitro de dichas interacciones nos
da pistas sobre la de qu manera se jerarquizan estas relaciones moleculares; no obstante, la
idea de poder comprobar incluso a nivel de tejido la aparicin in vivo de estos complejos de
protenas puede ofrecer una visin directa de aspectos fisiolgicos derivados de los mismos. Por
todo ello, en la ltima dcada se ha hecho hincapi en la necesidad de desarrollar sistemas de
bioimaging que puedan seguir la pista de la ocurrencia de interacciones entre protenas en
organismos modelo mediante tcnicas no invasivas (Massoud, Paulmurugan, De, Ray, &
Gambhir, 2007). Segn Massoud et al. se describen 3 mtodos principales con este fin en la
evaluacin en mamferos vivos: el sistema modificado para mamferos del doble-hbrido, la
transferencia de energa bioluminiscente por resonancia (BRET) y las estrategias de Split
reporter.

Sistema modificado para mamferos del doble hbrido

En el desarrollo del primero de los sistemas citados, el mtodo del doble-hbrido se bas
en un ensayo que en respuesta a un inductor supusiese la expresin de un par de protenas
hbridas, y que en caso de interaccin, estas llevasen a la expresin de un gen reporter que
pudiese ser medido mediante alguna tcnica analtica de bioimaging por bioluminiscencia no
invasiva. La estrategia seguida se basa en el TNF, citoquina cuya presencia activa al NFB
para que acte en el ncleo activando la transcripcin de 2 protenas hbridas de conocida
interaccin in vivo: Id, suplementada con un dominio de unin a DNA (BD) GAL4, y MyoD,
modificada con un dominio de activacin (AD) VP16. Adems, en el genoma del modelo se
incluye el gen del sistema Firefly regulado bajo una secuencia de 5 copias de unin para GAL4
dispuesto en la protena hbrida Id-GAL4- y una caja TATA mnima, que por tanto reclutar en
caso de posible interaccin proteica Id-MyoD al dominio de activacin VP16 presente en MyoD,
expresndose la luciferasa. En resumen, la presencia de TNF lleva a travs del NFB a la
expresin de las dos protenas hbridas, a cuya interaccin sobre el elemento promotor de la
luciferasa le sigue la expresin de dicha enzima, capaz en ltima instancia de oxidar la luciferina
y generar una seal medible. Este sistema se puede utilizar para estudiar la interaccin proteica
entre un par de inters sustituyendo Id y MyoD por este. Tanto el inductor (TNF) como el
sustrato (D-luciferina) deben ser inyectados en el animal cuando se quiere realizar el ensayo
(Massoud, Paulmurugan, De, Ray, & Gambhir, 2007).

6
Transferencia de energa bioluminiscente por resonancia (BRET)

Los actuales mtodos de bioimaging en biomedicina aplicada o en cuanto a investigacin

en organismos utilizan las tcnicas de la medicina nuclear, mediante la que se sigue a un
radiofrmaco (un trazador radiactivo) por medidas de tomografa computarizada de emisin de
fotones (SPECT, single photon emission computed tomography) o por tomografa de emisin de
positrones (PET, positrn emission tomography). El de radiacin ionizante, el elevado coste de
las instalaciones y las dificultades tcnicas de la generacin en complejos ciclotrones de las
especies radiactivas utilizadas de cortas vidas medias (ejemplo tpico 18FDG, 18-
Fluordesoxiglucosa) han llevado en los ltimos aos a la bsqueda de tcnicas alternativas que
atajen estas desventajas (National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, 2016).

En este contexto, las tecnologas que involucran a una fuente no radiactiva de

transferencia energtica por el mecanismo de Frster se han posicionado como ideales
alternativas. Este fenmeno se produce cuando los espectros de emisin y excitacin de dos
especies se superponen y su proximidad espacial es menor de 100 (Massoud, Paulmurugan,
De, Ray, & Gambhir, 2007). Las protenas de estudio se marcan con fluorforos distintos que
cumplan este requisito y se estimulan con la energa de excitacin de uno de ellos, evaluando la
posible aparicin de una transferencia hacia el segundo, lo que informara de una proximidad
mnima asociada a una incipiente interaccin. En la actualidad se ha utilizado a RLuc como
donador de resonancia y a un mutante de la GFP2 como aceptor fluorescente adaptado a clulas
de mamfero, siendo la presencia del sustrato coelenterazina es el estmulo seal. Se ha probado
funcional tanto en clulas en cultivo como en muestras in vivo de organismos infiltrados con
clulas que incluan el sistema (De & Gambhir, 2005).

Estrategias de split reporter

La separacin artificial de fragmentos de algunos enzimas no impide la reconstitucin de

su actividad por reunificacin de los segmentos. Este proceso puede por tanto regenerar
protenas funcionales. Esta propiedad puede ser acoplada a un sistema reporter, fundamentando
con ello la base de ste mtodo. La estrategia de split reporter o del gen reporter dividido se basa
precisamente en la divisin de la protena reportera en dos segmentos, uniendo la porcin
N- terminal de uno de ellos a una de las protenas de estudio. sta debe interaccionar con su par
a evaluar, al cual se enlaza el segmento relativo a la porcin C-terminal. La interaccin de estas
dos protenas va a producir que los dos fragmentos de la protena reportera interaccionen y den
lugar a la protena funcional, que en nuestro caso es una luciferasa. Con este mtodo se observa
la interaccin de protenas a tiempo real. Esta estrategia de protena dividida puede funcionar a
travs de ensayos de complementacin de fragmentos de protena o mediante ensayos de
reconstitucin mediados por intena. Las molculas son fragmentos polipeptdicos que se
eliminan en el proceso de maduracin definitiva de las protenas. Varias protenas reporter del
grupo de las luciferasas han sido adaptadas a este mtodo, como la Fluc o la Rluc, encontrando
varios sitios en la secuencia proteica idneos para el corte. Estos sitios deben dar como resultado

7
dos fragmentos proteicos que no tengan excesiva afinidad el uno por el otro, para que no den
falsos positivos, y que den lugar a una seal slo en caso de interaccin entre las dos protenas
interactuantes (Massoud, Paulmurugan, De, Ray, & Gambhir, 2007). En estos ensayos, diversos
cientficos, han destacado el uso de la luciferasa de lucirnaga como una buena protena reporter
para el estudio de interacciones entre protenas en animales vivos. Se han identificado variados
puntos de corte en FLuc, todos ellos vlidos para la restauracin de la funcionalidad de la
protena.

Por su parte, RLuc o su anlogo sinttico humanizado hRLuc- tambin ha mostrado

una alta compatibilidad con este tipo de
ensayos. Esta protena de 36 kDa es un reporter
monomrico y bioluminiscente, en particular, el
ms pequeo de entre los identificados para el
estudio de la interaccin entre protenas con
ensayos de complementacin de fragmentos de
protena. Estos ensayos han funcionado en el
estudio de clulas en cultivo e in vivo con
diferentes patrones de corte de la protena
reportera. Adems, el sistema puede
implementarse con herramientas de
amplificacin de la seal mediante herramientas Ilustracin 1. Representacin equemtica de las dos
tcnicas de reporter dividido. (Paulmurugan,
de complementariedad con otros enzimas. Una Umezawa, & Gambhihr, 2002)
limitacin que tiene el uso de la Rluc es su veloz
cintica de reaccin, que supone la necesidad de equipamientos muy sensibles en la lnea
temporal. Tambin se ha indagado en la posibilidad de unin de varias protenas reporter para
aumentar la sensibilidad de los ensayos, como hRluc y GFP (Paulmurugan, Umezawa, &
Gambhihr, 2002).

Regulacin dependiente de pH de la actividad luciferasa

La luciferasa de Lingulodinium polyedrum, un dinoflagelado marino bioluminiscente
causante de la incorrectamente llamada fosforescencia de la superficie de ciertos ocanos se
basa en la interaccin de 3 dominios similares y que se encuentran en un nico polipptido sin
homlogos entre las otras enzimas conocidas. Cada uno de ellos representa una luciferasa activa
que cataliza la oxidacin de la luciferina correspondiente con una emisin en el azul. Tanto la
estructura del tercer dominio (un barril- para la unin del sustrato y catlisis) como la de un
paquete regulatorio de tres hlices son regulados por pH. Los residuos de histidina N-terminal
que parecen ser responsables de esta regulacin estn en la interfaz de las hlices en el haz.
Los clculos de dinmica molecular indican que, en respuesta a los cambios en el pH, estas
histidinas podran desencadenar un gran movimiento molecular del haz, exponiendo as el sitio
activo al sustrato (Li, Hong, & Hastings, 1997). El mecanismo de accin de esta bioluminiscencia
es de tipo mecnico, pues estos estmulos abren canales de protones en la membrana del

8
orgnulo especfico (los ya mencionados scintillone) suponiendo un cambio en el pH y la
separacin de la protena de unin a luciferasa del propio pptido activo. En particular, se
encontraron cuatro histidinas muy conservadas en los tres dominios, las cuales son las
responsables de la regulacin dependiente de pH. Asimismo, se observ la estructura cristalina
a pH 8 (previo estmulo y apertura de los canales) del dominio 3, en el cual el sitio activo estaba
tapado por un paquete de tres hlices. Tambin se comprob que stas cambian de
conformacin al acidificar el medio por la protonacin de las cuatro histidinas, que terminan por
dejar libre el sitio activo (Schultz, Lui, Cegielski, & Hastings, 2005). En cuanto a aplicaciones,
este organismo nos permite tener ensayos de bioluminiscencia que estudien la
mecanosensibilidad de las clulas (Tesson & Latz, 2015).

Miscelnea: Otras aplicaciones

El desarrollo de la tecnologa relacionada con la luciferasa ha permitido que actualmente

existan dos ramas principales de aplicacin. La ms importante es la referente al ya mencionado
uso de la luz emitida como marcador de distintos compuestos o localizaciones de inters, como
lugares de infeccin o antgenos; pero actualmente existe un creciente inters en utilizar las
propiedades del enzima en otras materias como plantas con fines ornamentales e incluso
urbansticos.
Plantas biomuliniscentes

Desde la dcada de 1980 hasta la actualidad se ha venido investigando la

bioluminiscencia artificial en plantas transgnicas producida por luciferasas (Ow, y otros, 1986).
Inicialmente se ide como marcador y de ah se dio el salto a las plantas ornamentales; no
obstante, hoy en da se busca aprovechar esta caracterstica para sustituir incluso al alumbrado
por menos contaminantes rboles bioluminiscentes. Adems, se han planteado aplicaciones ms
interesantes como implementacin un sistema de alerta ante condiciones de deshidratacin de
la planta o contaminantes atmosfricos.
Una idea propuesta es la de introducir el opern lux de Photobacterium leiognathi en el
genoma celular de forma que se recuperasen de forma natural los sustratos de la reaccin
(Krichevsky, Meyers, Vainstein, Maliga, & Citovsky, 2010). Este complejo se debe acoplar a la
deteccin de determinadas situaciones de estrs propias de la planta como la deshidratacin, o
comunes a los humanos, como la presencia de sustancias contaminantes en la atmsfera a
travs de la bsqueda de genes con promotores de respuesta especfica.
El uso de rboles como alumbrado alternativo parece a priori ms complicado por las
limitaciones termodinmicas de los sistemas actuales, los cuales no parecen suficientemente
eficaces como para iluminar espacios abiertos en noche cerrada. Se debe por tanto estudiar en
detalle la fisiologa de animales y microorganismos bioluminiscentes para buscar maneras de
implementacin. Un ejemplo es lo encontrado en las lucirnagas: la acumulacin de cido rico
propia de las lucirnagas parece actuar aumentando la luminiscencia propia del animal (Goh,
Sheu, Hua, Kang, & Li, 2013). En cuanto a mercadotecnia, el atractivo que resulta de una planta
luminiscente ha parecido interesar a muchos emprendedores. En los ltimos aos han surgido

9
diversas empresas orientadas a la comercializacin de stas que han acercado esta posibilidad
al consumidor. No obstante, debido al consumo anormalmente alto de ATP y NADH de la
luciferasa (en ltima instancia, energa), estas plantas presentan un crecimiento reducido y
menor esperanza de vida que los especmenes no mutados.
Aplicaciones en clnica

El desarrollo de la tecnologa relacionada con la luciferasa ha permitido grandes avances

en el marcaje de molculas de inters durante los ltimos 30 aos. En este caso, su crecimiento
ha beneficiado principalmente al campo de la medicina. Desde finales de la dcada de 1980 se
han sugerido diversas aplicaciones en el campo de las ciencias mdicas.

En cuanto a la deteccin de microorganismos, la liberacin de ATP por parte de stos

podra ser aprovechada aadiendo luciferasa, luciferina y ciertos cofactores adicionales,
detectando as su presencia. Adems, podra hacerse de manera especfica utilizando virus con
tropismos especficos que contengan el opern lux. Tambin se ha utilizado como test de
mutagenicidad; partiendo de una especie capaz de producir bioluminiscencia, se hara una
mutagnesis dirigida a los genes concretos responsables de la emisin de luz provocando un
knockout. Posteriormente se aplicara el supuesto agente mutagnico sujeto a estudio, pudiendo
confirmar su capacidad de mutagnesis por reversin del mutante. Asimismo, el enzima se ha
utilizado como reactivo de ensayo enzimtico de las reductasas de NAD +. En inmunoensayos y
sondas de ADN, se ha utilizado como marcador de las biomolculas, por ejemplo, en el
anticuerpo secundario de un ELISA.

De un modo similar, es posible acoplar la luciferasa a sondas de ADN (o ARN) que

hibriden selectivamente con secuencias concretas de ADN, como un gen de inters. De esta
forma puede determinarse la presencia o no de cierta secuencia en una muestra de cido
nucleico (Kricka, 1988). Adems de las ya citadas tcnicas de marcaje in vivo, se ha planteado
la posibilidad de utilizar virus que contengan el sistema de luciferasa con una emisin en el
infrarrojo mejor para medidas analticas in vivo por evitar el fondo biofluorescente- para trazar
la ruta de accin de los mismos, pues la localizacin de su expresin se puede computarizar con
tcnicas no invasivas sobre el animal de experimentacin. No obstante, esta tcnica est limitada
a pequeos animales de experimentacin y puede producirse una acumulacin de la luciferina
en tejidos tales como hueso o el cerebro (Luker & Luker, 2008).

Conclusiones

La biodiversidad de enzimas bioluminiscentes del tipo luciferasa ha permitido en los

ltimos aos el desarrollo de mltiples sistemas en diversos campos en los que cierta interaccin
molecular debe ser monitorizada. Estos enzimas han supuesto un antes y un despus facilitando
los mtodos de investigacin en las tcnicas de evaluacin de la expresin gnica o en campos
tan complejos como la interactmica. Las luciferasas se plantean como una potencial
herramienta para el seguimiento in vivo de procesos biolgicos -incluidos los patolgicos- de

10
manera no invasiva. En la actualidad los sistemas deben superar las barreras termodinmicas
que su eficiencia marca como sistema de bioluminiscencia para llegar a satisfacer muchas de
las aplicaciones en las que parecen encajar como molculas marcadoras, por lo que ms
esfuerzos deben ser invertidos en el desarrollo e investigacin de sus propiedades.

11
Bibliografa

De, A., & Gambhir, S. (2005). Noninvasive imaging of protein-protein interactions from live cells
and living subjects using bioluminiscence resonance energy transfer. FASER, 19, 2017-
19.

Encyclopdia Britannica: Photoprotein. (20 de Jul de 1998). Photoprotein. Recuperado el 10 de

Nov de 2017, de http://www.britannica.com/EBchecked/topic/458121/photoprotein

Fogel, M., & Hastings, J. (1972). Bioluminiscence: Mechanism and Mode of Control of Scintillon
Activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, 69(3), 690-693.

Goh, K., Sheu, H., Hua, T., Kang, M., & Li, C. (2013). Uric Acid Spherulites in the Reflector
Layer of Firefly Light Organs. PLoS ONE, 8(2), e56406.

Greer, I., & Szalay, A. (2002). Imaging of light emission from the expression of luciferase in
living cells and organisms: a review. Luminiscence, 17, 43-74.

Keller, G., Gould, S., Deluca, M., & Subramani, S. (1987). Firefly luciferase is targeted to
proxisomes in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America, 84(10), 3264-3268.

Krichevsky, A., Meyers, B., Vainstein, A., Maliga, P., & Citovsky, V. (2010). Autoluminiscent
Plants. PLoS ONE, 5(11), e15461.

Kricka, L. (1988). Clinical and Biochemical applications of luciferases and luciferins. Analytical
Biochemistry, 175(4), 14-21.

Lehninger, A., Nelson, D., & Cox, M. (2008). Principios de Bioqumica (6 Ed ed.). Barcelona:
Ediciones Omega, S.A.

Li, L., Hong, R., & Hastings, W. J. (1997). Three functional luciferase domains in a single
polypeptide chain. PNAS, 94(17), 8954-8958.

Luker, K., & Luker, G. (2008). Applications of bioluminiscence imaging to antiviral research and
therapy: Multiple luciferase enzymes and quantitation. Antiviral Research, 78(3), 179-
187.

Massoud, T., Paulmurugan, R., De, A., Ray, P., & Gambhir, S. S. (2007). Reporter gene
imaging of protein-protein interactions in living subjects. Current Opinion in
Biotechnology, 18, 31-37.

Morse, D., & Mittag, M. (2000). Dinoflagellate luciferin-binding protein. Methods Enzymol, 305,
258-276.

National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. (Jul de 2016). Nuclear Medicine.
Obtenido de
https://www.nibib.nih.gov/sites/default/files/Nuclear%20Medicine%20Fact%20Sheet%2
02016-english_FINAL.pdf

Osamu, S. (2006). Bioluminiscence: Chemical Principles and Methods. NJ: World Scientific
Publishing Co. Pte. Ltd Hakensack.

Ow, D., de Welt, J., Helsinki, D., Howell, S., Wood, K., & DeLuca, M. (1986). Transient and
Stable Expression of the Firefly Luciferase Gene in Plant Cells and Transgenic Plants.
Science, 234(4778), 856-859.

Paulmurugan, R., Umezawa, Y., & Gambhihr, S. (2002). Nonlinear partial differential equations
and applications: Noninvasive imaging of protein-protein interactions in living subjects

12
 by using reporter protein complementacin and reconstitution strategies. Proceedings
of the National Academy of Sciences, 99(24), 15608-15613.

PerkinElmer. (2017). Twinlite Reporter Gene Assay System. Waltham: PerkinElmer Health
Sciences.

Promega. (2015). Dual-Luciferase(R) Reporter Assay System Technical Manual TM040.

Madison: Promega Corporation.

Schultz, L., Lui, L., Cegielski, M., & Hastings, J. (2005). Crystal structure of a pH-regulated
luciferase catalyzing the bioluminiscent oxidation of an open tetrapyrrole. Proceedings
of the National Academy of Sciences, 102(5), 1378-1383.

Shimomura, O. (2012). Bioluminiscence: chemical principles and methods. Revised Edition.

World Scientific Publishing Co.

Tesson, B., & Latz, M. (2015). Mechanosensitivity of a Rapid Bioluminiscence Reporter System
Assessed by Atomic Force Microscopy. Biophysical Journal, 108(6), 1341-1351.

ThermoFisher Pierce. (2013). Pierce Renilla-Firefly Luciferase Dual Assay Kit

(Instructions). Rockford: Pierce Biotechnology.

Tu, S. (2008). Activity coupling and complex formation between bacterial luciferase and flavin
reductases. Photochem Photobiol Sci, 7(2), 183-188.

White, E. (1971). The chemi- and bioluminiscence of firefly luciferin: an efficient chemical
production of electronically excited states. Bioorg Chem, 92-122.

13