UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROALIMENTARIAS

ESCUELA DE TECNOLOGA DE ALIMENTOS

Proyecto final de graduacin presentado a la Escuela de Tecnologa de

Alimentos como requisito parcial para optar por el grado de Licenciatura en
Ingeniera de Alimentos

Obtencin de bioetanol a partir de desecho agroindustrial de pulpa de

banano (Musa cavendish) va fermentacin utilizando Saccharomyces
cerevisiae

Hazel Vanessa Leiva Mora

A53025

Ciudad Universitaria Rodrigo Facio

Agosto, 2012
 ii

Hoja de aprobaci6n del Tribunal Examinador

Proyecto de graduaci6n presentado a Ia Escuela de Tecnologia de Aliment os como

requisite parcial para optar por el grado de Ucenciatura en lngenieria de Alimentos.

~
M.Sc. Alicia Hernandez Penaranda
Directora del Proyecto

Centro de Investigaciones en Productos Naturales, Universidad de Cost a Rica

&~~v
lie. Eduardo Thompson Vicente

Asesor del Proyecto

Escuela de Tecnologia de Alimentos, Universidad de Costa Rica

M.Sc. Carmela Velazquez carrillo

Asesora del Proyecto

Centro Nacional de Ciencia y Tecnologia de Alimentos, Universidad de Costa Rica

MGA. Yorleny Araya Quesada

Presidente del Tribunal Examinador

Escuela de Tecnologia de Alimentos, Universidad de Costa Rica

rl 6./k
Dr. Max Reynes Gasquet

Profesor Designado

Centro Nacional de Ciencia y Tecnologia de Alimentos, Universidad de Costa Rica

Agriculture Research for Development, CIRAD, Montpellier

 iii

Derechos de la propiedad intelectual

La presente investigacin se considera de confidencialidad parcial, pues existen intereses

comerciales en el proyecto.
 iv

Dedicatoria

Con mucho amor a mis paps, quienes adems de darme la oportunidad de estudiar, me
inculcaron un sinfn de valores y representan mi mayor ejemplo de superacin, fe y humildad.
 v

Agradecimientos

A mi mam, mi pap, mi hermano, mis hermanas, cuados, sobrinas y sobrinos A toda mi

linda familia por llenarme tanto de amor, creer en m, apoyarme en los momentos ms difciles y
darme tantas razones por las que sentirme feliz y agradecida, da tras da.
A Doa Alicia, por depositar su confianza en m para emprender esta investigacin, y
por todo el tiempo y esfuerzo invertido para la exitosa finalizacin del proyecto.
Agradecer de igual forma, al seor Eduardo Thompson y la seora Carmela Velzquez por
su asesoramiento en la culminacin de la investigacin.
Especiales agradecimientos a la Universidad de Costa Rica, institucin que a travs del
importante apoyo de las Vicerrectoras de Investigacin y Accin social, as como de los
centros de investigacin CIPRONA y CITA, aportaron el financiamiento econmico,
equipo, materiales y recurso humano necesarios, para la realizacin de esta investigacin.
En esta misma direccin, extensos agradecimientos al CENIBiot, por los mltiples
recursos aportados: equipo, reactivos, personal, tiempo, entre otros, para hacer posible
emprender este proyecto. Gracias especiales a Luis Alonso, Iray, Soledad y Andrs, por el
esfuerzo, ayuda y paciencia que tuvieron durante todo el proyecto y principalmente por
hacer que jornadas tan arduas, llegaran a sentirse hasta divertidas.
Al personal del CIPRONA, que con toda calidez me acogi durante tres aos en el
Centro e hicieron de mi paso por la Universidad, una mejor etapa: Diego, Fabin, Godo,
Doa Kattia, Lore y Juan Carlos. Adicionalmente, a Alonso y Camacho, quienes
desinteresadamente apoyan da tras da a tesiarios como yo, en el trabajo en la Planta
Piloto del CITA.
Cmo no agradecer a todos mis amigos, quienes hicieron que la etapa universitaria,
pese a su alta exigencia acadmica, estuviera llena de bellos recuerdos y salpicada de
alegras. A mis amigos, colegas y compaeros de aventuras: Mari, Cata, Pame, Nane, Adri,
Kiki, Pame R., Naty A., Marvin y a mis compaeras de laboratorio: Maricel, Ale, Mariela,
Mara Beln, Glenda, Elisa y Jos.
A mi curioso y particular grupo de amigos de hace casi una dcada: Cate, Lilli, Mila,
Mari, Eli, Carlos, Carter y Tije, porque mutuamente nos hemos apoyado y acompaado en
 vi

este largo caminar universitario, sustituyendo el estrs y la presin, con risas, buenos
momentos y excelente compaa. En especial a Lu, porque adems de ser la amiga
incondicional que sabe ser, fue un gran apoyo como colega durante toda la U, mi paso
por Tecnologa de Alimentos no hubiera sido jams tan memorable como lo fue con vos.
A Garca por la paciencia, apoyo y comprensin que me extendi plenamente, desde
el principio hasta el fin de la tesis, por siempre tener confianza en m y porque con su
extrao humor siempre me hace rer an cuando el estrs me invada, gracias por
ayudarme a conseguir y ser parte de esta importante meta.
A Dios, por darme todo cuanto tengo, llenarme de paciencia y sabidura para culminar
mi carrera y por rodearme de tantas personas lindas en mi vida.

Nuestra recompensa se encuentra

en el esfuerzo y no en el resultado.
Un esfuerzo total es una victoria completa.
Mahatma Gandhi (1869-1948)
 vii

ndice general

HOJA DE APROBACIN DEL TRIBUNAL EXAMINADOR............................................................................II

DERECHOS DE LA PROPIEDAD INTELECTUAL .........................................................................................III

DEDICATORIA....................................................................................................................................... IV

AGRADECIMIENTOS .............................................................................................................................. V

NDICE GENERAL ................................................................................................................................. VII

NDICE DE CUADROS ............................................................................................................................ IX

NDICE DE FIGURAS .............................................................................................................................. XI

RESUMEN .......................................................................................................................................... XIII

1. JUSTIFICACIN ................................................................................................................................... 1

2. OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 4

2.1 OBJETIVO GENERAL .......................................................................................................................................4

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ..................................................................................................................................4

3. MARCO TERICO ............................................................................................................................... 5

4. MATERIALES Y MTODOS................................................................................................................. 45

4.1 LOCALIZACIN DEL TRABAJO ..........................................................................................................................45

4.2 MATERIALES ..............................................................................................................................................46
4.2.1 Materia Prima .........................................................................................................................................46
4.2.2 Enzimas ...................................................................................................................................................46
4.2.3 Microorganismo para la fermentacin ...................................................................................................47
4.3 METODOLOGA ...........................................................................................................................................47
4.3.1 Caracterizacin fsica y qumica del residuo de pur ...............................................................................47
4.3.1.1 Humedad ................................................................................................................................................. 48
4.3.1.2 Cenizas ..................................................................................................................................................... 48
4.3.1.3 Concentracin de azcares totales, expresados como la suma de glucosa, fructosa y sacarosa ............ 48
4.3.1.4 Slidos solubles expresados como grados Brix ........................................................................................ 48
4.3.1.5 Slidos solubles por gravimetra .............................................................................................................. 48
4.3.1.6 pH ............................................................................................................................................................ 49
4.3.1.7 Acidez titulable ........................................................................................................................................ 49
4.3.1.8 Material insoluble en alcohol (MIA)......................................................................................................... 49
4.3.1.9 Material insoluble en agua y alcohol (MIAA) ........................................................................................... 49
4.3.1.10 Determinacin de lignina extrada del MIAA ......................................................................................... 49
4.3.1.11 Celulosa y hemicelulosa extrada del MIAA ........................................................................................... 49
4.3.2 Caracterizacin fsica y qumica del jugo de banano A y B ......................................................................50
4.3.3 Pretratamiento de la materia prima (residuo de pur de banano y jugo concentrado de banano) .......52
4.3.3.1 Residuo de pur de banano ..................................................................................................................... 52
4.3.3.2 Jugo de banano B ..................................................................................................................................... 52
4.3.4 Establecimiento de las condiciones para la mxima liberacin de azcares fermentables de la pulpa de
banano .............................................................................................................................................................53
 viii

4.3.4.1 Produccin de dextrinas y oligosacridos a partir del almidn presente en el pur de banano ............. 53
4.3.4.2 Produccin de azcares fermentables a partir de dextrinas del pur de banano ................................... 54
4.3.4.3 Degradacin de pectinas y celulosa presentes en el pur de banano ..................................................... 56
4.3.4.4 Escalamiento del tratamiento enzimtico del pur de banano ............................................................... 58
4.3.5 Produccin de bioetanol a partir de Saccharomyces cerevisiae ..............................................................59
4.3.5.1 Flujo de proceso propuesto ..................................................................................................................... 60
4.3.5.2 Especificaciones de flujo de proceso de la etapa fermentativa ............................................................... 64
4.3.5.3 Mtodos de anlisis para la fermentacin ............................................................................................... 65
4.3.5.4 Diseo Experimental ................................................................................................................................ 67
4.3.5.5 Variables y curvas respuesta .................................................................................................................... 70

5. RESULTADOS Y DISCUSIN ............................................................................................................... 74

5.1 CARACTERIZACIN DE LA MATERIA PRIMA ........................................................................................................74

5.2 PRE-TRATAMIENTO ENZIMTICO DE LA MATERIA PRIMA PARA LA FERMENTACIN.....................................................81
5.2.1 PRODUCCIN DE DEXTRINAS Y OLIGOSACRIDOS A PARTIR DEL ALMIDN PRESENTE EN EL RESIDUO DE PUR DE BANANO
.....................................................................................................................................................................83
5.2.2 PRODUCCIN DE AZCARES FERMENTABLES A PARTIR DE DEXTRINAS DEL PUR DE BANANO.....................................86
5.2.3 DEGRADACIN DE PECTINAS Y CELULOSA PRESENTES EN EL PUR DE BANANO .......................................................89
5. 3 PRE-TRATAMIENTO FSICO DE LA MATERIA PRIMA PARA LA FERMENTACIN ..........................................................101
5.4 FERMENTACIN ALCOHLICA DE JUGO DE BANANO VA SACCHAROMYCES CEREVISIAE .............................................103
5.4.1 Pruebas preliminares .............................................................................................................................103
5.4.2 Pruebas definitivas de fermentacin alcohlica de jugo de banano con S. cerevisiae ..........................107

6. CONCLUSIONES .............................................................................................................................. 133

7. RECOMENDACIONES ...................................................................................................................... 136

8. BIBLIOGRAFA ................................................................................................................................ 138

9. ANEXOS ......................................................................................................................................... 152

ANEXO A: MTODOS FSICOS Y QUMICOS PARA CARACTERIZACIN Y TRATAMIENTO DEL PUR DE BANANO.......................152
ANEXO B: DATOS EXPERIMENTALES ....................................................................................................................160
ANEXO C: MODELOS PARA LA ESTIMACIN DEL TIEMPO FINAL DE FERMENTACIN .......................................................179
 ix

ndice de cuadros

Cuadro I. Composicin qumica de la pulpa de banano en bases hmeda y seca, reportada por dos
autores..............7
Cuadro II. Caracterizacin qumica del banano segn su grado de madurez ........7
Cuadro III. Funcin de las enzimas pectinolticas, pectn-esterasa, poligalacturonasa y pectn-liasa.............21
Cuadro IV. Enzimas de inters industrial, clasificacin, fuente de extraccin y algunas aplicaciones en el
procesamiento de alimentos ...24
Cuadro V. Principales propiedades fsicas y qumicas del etanol ...25
Cuadro VI. Descripcin de la codificacin asignada al proyecto ......45
Cuadro VII. Sntesis de los principales mtodos utilizados para la caracterizacin fsica y qumica del
pur ...51
Cuadro VIII. Diseo experimental para establecer las condiciones de tratamiento del pur de banano
con la enzima 1 .......54
Cuadro IX. Diseo experimental para establecer las condiciones de tratamiento del pur de banano
con la enzima 2 ..56
Cuadro X. Diseo experimental para establecer las condiciones de tratamiento del pur de banano
con la enzima 3 ...57
Cuadro XI. Medio de cultivo a utilizar para la fermentacin alcohlica de jugo de banano con
Saccharomyces cerevisiae ..64
Cuadro XII. Frecuencia de toma de muestras en la fermentacin alcohlica de jugo de banano con
Saccharomyces cerevisiae ..66
Cuadro XIII. Diseo experimental para la evaluacin de la produccin de bioetanol a partir de jugo de
banano utilizando Saccharomyces cerevisiae ..69
Cuadro XIV. Caracterizacin fsica y qumica del pur de banano previo al tratamiento enzimtico y de
los jugos de banano utilizados como medio de fermentacin para la produccin de bioetanol ..74
Cuadro XV. Efecto de la concentracin y el tiempo de aplicacin de la enzima 1 sobre los azcares totales
y slidos solubles (gravimtricamente y como grados Brix) de la pulpa de banano..83
Cuadro XVI. Efecto de la concentracin y el tiempo de aplicacin del preparado enzimtico Enzima 2
sobre los azcares totales y slidos solubles (gravimtricamente y como grados Brix) de la pulpa de
banano.86
Cuadro XVII. Efecto de la concentracin y el tiempo de aplicacin de la enzima 3 sobre los azcares
totales y slidos solubles (gravimtricamente y como grados Brix) de la pulpa de banano ...90
Cuadro XVIII. Efecto del tratamiento enzimtico con la enzima 3 sobre la viscosidad de la pulpa de
banano, medido con un viscosmetro de rotacin tipo Brookfield .93
 x

Cuadro XIX. Comparacin de las caractersticas fsicas y qumicas de la pulpa de banano antes y despus
de macerar con tres cocteles enzimticos ..........................98
Cuadro XX. Rendimiento de las operaciones unitarias de prensado y clarificacin centrfuga utilizadas
para la extraccin de jugo de banano a partir de pulpa de banano macerada ...101
Cuadro XXI. Resultados de las pruebas de fermentacin alcohlica utilizando Saccharomyces cerevisiae
a partir de jugo de banano proveniente de dos empresas productoras ....125
 xi

ndice de figuras

Figura 1. Variacin de las exportaciones de banano en millones de dlares en el 2005-2010.. ..11

Figura 2. Destinos de exportacin de banano para el 2011 .....11
Figura 3. Metabolismo aerobio para el consumo de azcares y la produccin de etanol ...36
Figura 4. Metabolismo anaerobio para el consumo de azcares y la produccin de etanol ..37
Figura 5. Pruebas de caracterizacin fsica y qumica del residuo de pur de banano previo al tratamiento
enzimtico y la fermentacin ..47
Figura 6. Pruebas de caracterizacin fsica y qumica del jugo de banano previo a la
fermentacin......50
Figura 7. Flujo de proceso propuesto para la obtencin de bioetanol a partir de pulpa de banano va
fermentacin .....62
Figura 8. Flujo de proceso para la obtencin de bioetanol a partir de jugo de banano B va
fermentacin ..63
Figura 9. Anlisis para la evaluacin de la fermentacin de pulpa de banano para la produccin
de bioetanol .67
Figura 10. Variables y curvas respuesta para el anlisis de la fermentacin de pulpa de banano
para la obtencin de bioetanol .....70
Figura 11. Hidrlisis y oxidacin del almidn en la prueba de antrona realizada a las aguas de lavado del
material insoluble en alcohol y agua .78
Figura 12. Flujo de proceso propuesto para la obtencin de bioetanol a partir de pulpa de banano va
fermentacin a) Condiciones de tratamiento enzimtico definidas b) Condiciones de tratamiento
utilizadas en plata piloto.96
Figura 13. Variacin de la poblacin de levaduras en funcin del tiempo, para la fermentacin alcohlica
de jugo de banano con S.cerevisiae, con y sin suplemento nutricional y con dos concentraciones iniciales
de levadura 104
Figura 14. Variacin de slidos solubles (expresados como grados Brix) en funcin del tiempo, para la
fermentacin alcohlica de jugo de banano con S.cerevisiae, con y sin suplemento nutricional y con dos
concentraciones iniciales de levadura 104
Figura 15. Variacin de la concentracin de azcares y etanol en funcin del tiempo, para la fermentacin
alcohlica de jugo de banano con S.cerevisiae, con y sin suplemento nutricional y con dos concentraciones
iniciales de levadura 105
Figura 16. Variacin de la poblacin microbiana en funcin del tiempo de fermentacin con
Saccharomyces cerevisiae en jugo de banano A y B, suplementado y sin suplementar ...107
 xii

Figura 17. Variacin de la concentracin de azcares totales y etanol en funcin del tiempo de
fermentacin con Saccharomyces cerevisiae en jugo de banano B, suplementado y sin suplementar,
a una temperatura de fermentacin de 30 C y con una concentracin de inculo inicial de 1,5 g/L.112
Figura 18. Variacin de la concentracin de azcares totales y etanol en funcin del tiempo de
fermentacin con Saccharomyces cerevisiae en jugo de banano A, suplementado y sin suplementar,
a una temperatura de fermentacin de 30 C y con una concentracin de inculo inicial de 1,5 g/L.113
Figura 19. Variacin de los slidos solubles (expresados como grados Brix) en funcin del tiempo de
fermentacin con Saccharomyces cerevisiae en jugo de banano suplementado y sin suplementar
para jugo de banano A y B..117
Figura 20. Comparacin de las curvas de azcares totales medidos por HPLC y expresados como
grados Brix para la fermentacin alcohlica de jugo de banano B suplementado..119
Figura 21. Variacin de la concentracin de glicerol en funcin del tiempo de fermentacin con
Saccharomyces cerevisiae en jugo de banano suplementado y sin suplementar, proveniente de
dos empresas productoras....120
 xiii

Resumen

Se evalu la utilizacin de un desecho agroindustrial de banano para ser fermentado con

Saccharomyces cerevisiae para producir etanol utilizando dos jugos de banano distintos: uno
producido a partir de desecho agroindustrial de pur de banano y el otro un jugo de produccin
industrial.
Primeramente se caracteriz el residuo de pur de banano del cual se extrajo el jugo A, previo
al tratamiento de maceracin enzimtica. Se defini el tratamiento enzimtico aplicado al residuo
y luego de esto se caracteriz nuevamente para evaluar el efecto de las enzimas, asimismo, se
realiz la caracterizacin proximal de los jugos de banano, tanto el A como el B, utilizados como
sustrato en la fermentacin.
Al respecto, el residuo de pur destac por su alto contenido de azcares fermentables (104
g/L) y su elevado contenido de fibra y material insoluble en alcohol (48 g/100 g b.s.), de ah que se
procedi a disear un tratamiento enzimtico apropiado. La maceracin consisti en el uso
secuencial de tres preparados enzimticos: Enzima 1 en una concentracin de 300 mg/kg y
durante 30 minutos, seguido de la aplicacin de Enzima 2 en una concentracin de 560 mg/kg
durante 24 horas y finalmente se aplic la enzima 3 por 60 minutos en una concentracin de 240
mg/kg. Este tratamiento desemboc en un aumento a 166 g/L de azcares, una reduccin del
material insoluble en alcohol a 38 g/100 g b.s. y especficamente el uso de la enzima 3 permiti la
reduccin de la viscosidad en un 11 %.
Luego, la caracterizacin de los jugos de banano de A y B, mostr condiciones de acidez y
contenido de azcares favorables para la fermentacin alcohlica. As pues el contenido de
azcares de los jugos fue de 182-190 g/L para los jugos de A y B respectivamente, un pH de 4,84 y
4,64 y una acidez de 0,80 y 0,68 g cido ctrico/100 mL, ambos parmetros en el mismo orden
citado.
En cuanto a la fermentacin, se evaluaron dos tipos de jugo y el uso de suplementos para el
medio de fermentacin. El rendimiento de etanol con respecto a los azcares fermentables se
mantuvo entre 43 y 46 %m/m, siendo mayor en las fermentaciones en las que se utiliz jugo de
banano A y menor cuando el sustrato fue el jugo de banano B. La productividad mxima estuvo
entre 1,48 y 2,56 g/(Lh), y se observ que fue mayor cuando se utilizaron los medios
suplementados, con respecto a sus contrapartes sin suplementar. La mayor productividad se
obtuvo con el jugo suplementado A en tanto que la menor con el jugo no suplementado B. En
 xiv

relacin con la concentracin de etanol, esta oscil entre 61 y 74 g/L, donde la mayor se obtuvo
con el jugo de banano B. Finalmente el tiempo de fermentacin s fue considerablemente menor
con los jugos de banano A y tambin menor al suplementar el medio, el tiempo vari entre 31 y
48 horas.
Con esto, el jugo de banano proveniente de desecho agroindustrial de banano constituye una
buena alternativa para la produccin de bioetanol a partir de fermentacin alcohlica con
Saccharomyces cerevisiae.
 1

1. Justificacin

Gracias a su estratgica posicin geogrfica, Costa Rica goza de condiciones climticas y

suelo idneo para el cultivo de banano, predominantemente en las zonas Norte y Atlntica
(Mora, 1997). Tal es la magnitud de su produccin que, la actividad bananera es un pilar
importante que sostiene la economa de nuestro pas, constituyendo as, el primer producto
agrcola de exportacin, con un aporte de 778,3 millones de dlares, cifra que corresponde a
una participacin de 32,6 % sobre el total de las exportaciones de productos agrcolas
(PROCOMER, 2011).
Se estima que se dedican ms de 40 000 hectreas a la produccin de este fruto, con una
tendencia al incremento que obedece principalmente a una mayor superficie de cultivo en
algunas fincas. De dicha produccin, entre 300 y 400 toneladas mtricas no cumplen con los
parmetros necesarios para exportacin (CORBANA, 2011).
Parte de este excedente se comercializa en el interior del pas a un menor precio, ya sea
para alimentacin humana o animal. Otra parte de lo que no se comercializa directamente se
emplea para elaborar productos derivados ms estables y por tanto con mayor vida de
anaquel, dentro de los que se encuentran harinas, almidones, purs, concentrados y jugos
(Chan, 2001; Gonzlez, 2002).
La elaboracin de dichos productos, a la vez, genera residuos secundarios que se han
convertido en una amenaza para el ambiente, pues se descartan de forma inadecuada, sin
ningn tratamiento previo. Una empresa industrializadora de banano estima que sus desechos
de pur de banano ascendieron a 350 toneladas mtricas para el 2011, mismos que se
destinan para consumo animal.
Recientemente, se ha estudiado la oportunidad de emplear estos residuos secundarios,
como sustrato para fermentaciones alcohlicas y lcticas, debido a la riqueza en su
composicin qumica y al amplio espectro de utilizacin de los productos de estas vas
metablicas, particularmente del etanol y el cido lctico (Chan, 2001; Gonzlez, 2002;
Thompson, 2004).
Con la implementacin de estas prcticas se pueden disminuir notablemente los
volmenes de las prdidas post cosecha y esto a la vez, podra reducir la contaminacin
 2

ambiental y promover el desarrollo de las reas de cultivo y las agroindustrias, con la

consecuente generacin de empleo en zonas rurales (Gonzlez, 2002).
Uno de los productos de la fermentacin que ha encontrado mayor comercializacin es el
etanol. Ms del 95 % del total de etanol que se produce a nivel mundial proviene de esta va,
tradicionalmente con sustratos como maz, remolacha azucarera y melazas de la caa de
azcar, debido a que la produccin por va qumica es ms compleja y menos rentable. Dentro
de las aplicaciones a las que se destina el etanol se encuentran su uso como combustible, en
bebidas alcohlicas y para uso industrial, en esta ltima principalmente como disolvente
(Thompson, 2004).
La sustitucin parcial de las gasolinas a base de petrleo con etanol ha experimentado un
crecimiento significativo en los ltimos aos, puesto que se considera un combustible
renovable. Esta combinacin no solo permite atenuar la dependencia del petrleo, sino que
mejora el octanaje del combustible sin recurrir a compuestos de plomo y reduce la emisin de
contaminantes atmosfricos como el metil-ter-butil ter (MTBE) (Gonzlez, 2002).
Bajo esta premisa es que en pases como Brasil, la gasolina se mezcla hasta con un 35 % de
etanol, mientras que en los Estados Unidos la sustitucin asciende al 30 % (Thompson, 2004).
Es as como Costa Rica no es la excepcin, ya que en el artculo 4 del Reglamento de
Biocombustibles, Decreto 35091 MAG-MINAET, el gobierno promulg que las gasolinas
distribuidas en el pas tendrn hasta un 8 % de etanol para reducir costos y disminuir la
emisin de gases responsables del efecto invernadero. Esta sustitucin parcial se ha venido
aplicando en Guanacaste desde el primer semestre del 2009 (MAG & MINAET, 2009).
Tradicionalmente se ha empleado la levadura Saccharomyces cerevisiae en las
fermentaciones alcohlicas. Este microorganismo es anaerobio facultativo, lo que significa que
es capaz de crecer en presencia o ausencia de oxgeno; por la ruta anaerobia fermenta glucosa
produciendo etanol y dixido de carbono, mientras que por la ruta aerobia incrementa su
biomasa. Al ser considerado un microorganismo GRAS (Generally Recognized As Safe) se
emplea para la elaboracin de productos lderes a nivel mundial, destinados para el consumo
humano, tales como el vino, la cerveza y licores destilados, adems de emplearse para
productos no comestibles como alcohol combustible y protena unicelular (Melndez, 2002;
Thompson, 2004).
 3

Como se mencion anteriormente, en el pas se producen importantes desechos de pulpa

de banano, que consiste bsicamente en pur de banano pues es libre de cscara, como
subproducto de procesos industriales, por lo que resulta particularmente interesante estudiar
la viabilidad del uso de este sustrato, ms an cuando se consideran las materias primas
generadas por varias de estas empresas nacionales, puesto que las diferencias fsicas y
qumicas en estos sustratos pueden conducir a diferencias en cuanto a rendimiento y
productividad, factores que determinan la posibilidad de ejecucin del proyecto a gran escala.
En particular y como ya se mencion, la empresa proveedora del residuo de pur de banano
que se utiliz en este proyecto, estim que para el 2011 el total de desecho de pur de banano
ascendi a 350 TM.
Por esto, el objetivo de la presente investigacin consiste en definir las condiciones de
tratamiento enzimtico para el residuo de pur de banano y posteriormente evaluar el
proceso fermentativo del jarabe obtenido empleando Saccharomyces cerevisiae, utilizando
tanto el jugo obtenido del tratamiento enzimtico y fsico del residuo de pur de banano,
como jugo de banano producido a nivel industrial, con el fin de proponer un proceso eficaz y
eficiente que pueda ser llevado a mayor escala.
 4

2. Objetivos

2.1 Objetivo general

Estudiar la produccin biotecnolgica de etanol a partir del desecho industrial de pur de

banano utilizando Saccharomyces cerevisiae.

2.2 Objetivos especficos

Determinar las condiciones de las operaciones previas, congelacin, liofilizacin y

esterilizacin, del residuo de pur de banano para ser utilizado como sustrato en la obtencin
del bioetanol y determinar las operaciones unitarias necesarias para la extraccin del jugo a
partir del residuo de pur de banano.

Establecer las condiciones de utilizacin de los preparados enzimticos 1, 2 y 3 para

incrementar la cantidad de azcares fermentables del residuo de pur de banano.

Comparar las caractersticas fsicas y qumicas del residuo de pur de banano inicial con
respecto al jarabe de banano posterior al tratamiento con los cocteles enzimticos y adems,
caracterizar los jugos utilizados como sustratos para la fermentacin.

Evaluar la produccin de bioetanol utilizando Saccharomyces cerevisiae y comparar los

rendimientos y productividad con dos sustratos con diferente grado de purificacin, uno
obtenido a partir de residuo de pur de banano y el otro un jugo industrial.
 5

3. Marco terico

3.1 Banano (Musa cavendish)

3.1.1 Aspectos generales

El banano, cuyo nombre cientfico corresponde a Musa cavendish se clasifica en la familia
Musaceae, dentro del orden Zingiberales; en este grupo se comprenden las principales y ms
comunes especies de banano comestible (Gonzlez, 1992).
El banano no es fcil de cultivar ni de transportar, pues se trata de una planta herbcea
que se desarrolla en condiciones ptimas en climas tropicales hmedos y clidos. Requiere de
una temperatura cercana a 27 C, aproximadamente 5 cm de lluvia por semana y suelos
hmedos pero con buen drenaje. Adems, dado que el tallo del banano no es leoso, puede
ser derribado con facilidad an con vientos a 40 km/h, finalmente, es una planta sujeta a dao
por plagas y pestes (Chiquita Brands International, 1998).
Pese a lo anterior, es un producto ampliamente consumido y distribuido a nivel mundial,
incluso, se cree que el banano silvestre ha sido utilizado como alimento en el sureste de Asia
por tanto tiempo como el hombre ha habitado esta regin (Mora, 1997).
En Costa Rica, el banano es cultivado en las zonas Norte y Caribe, pues su clima clido y las
buenas condiciones de sus suelos, las convierten en las mejores regiones del rea
centroamericana para la produccin de banano (Crespo 2000; CORBANA, 2011). En particular,
en nuestro pas la especie ms sobresaliente es Musa cavendish (Crespo, 2000).
Adems de consumirse de forma directa como fruta, el banano se utiliza para producir
derivados ms estables y con mayor vida til, tales como harinas, almidones, purs,
concentrados y jugos (Chan, 2001).
Concretamente, el desarrollo de jugos de frutas ha experimentado un creciente aumento,
debido al incremento del consumo de jugos naturales en lugar de bebidas con cafena o
carbonatadas. En el caso del banano, gracias a su perfil de aromas y sabores, su jugo tiene
posibilidades de competir en el mercado, ya sea como jugo puro o como una mezcla con otras
frutas tropicales (Lee et al., 2006).
Sin embargo, debido a que se trata de un jugo turbio, grisceo y muy viscoso, usualmente
la etapa de extraccin de jugo va seguida por una operacin de clarificacin, la cual puede
 6

requerir el uso de enzimas. Esto debido a que la turbidez y viscosidad del jugo de banano
provienen principalmente de los polisacridos propios de la fruta, como pectina y almidn.
Muchos investigadores reportan que el uso de pectinasas puede contribuir efectivamente en
la clarificacin de este jugo, con la consecuente obtencin de un lquido menos viscoso y con
menor turbidez (Lee et al., 2006).

3.1.2 Composicin qumica

El banano es rico en carbohidratos no estructurales, acompaados por pequeas
porciones de fibra y es precisamente esta abundancia de carbohidratos sencillos lo que lo
perfila como un sustrato adecuado como fuente de carbono en fermentaciones
biotecnolgicas. Otros componentes como protena y lpidos estn presentes como
constituyentes minoritarios (Hammond et al., 1996; Aurore et al., 2008).
La composicin del banano vara considerablemente en funcin del estado de madurez,
dado que se trata de una fruta con un climaterio muy marcado. Quizs el cambio de mayor
importancia, desde los puntos de vista comercial e industrial, es la conversin del almidn en
azcares simples, gracias a mltiples reacciones de hidrlisis (Crespo, 2000).
En el fruto verde, la concentracin inicial de almidn asciende hasta un 18 % m/m y la de
azcares es de tan slo 1-2 % m/m, pero posterior al climaterio la situacin se revierte, de
manera que el almidn alcanza apenas un 1-2 %m/m, en tanto que los azcares aumentan
hasta un 15-20 %m/m, donde predominan la sacarosa, glucosa y fructosa. Estos tres azcares
se incrementan durante la maduracin en proporciones casi constantes de 62-68 % sacarosa,
12-17 % de fructosa y 19-22 % de glucosa (Hammond et al., 1996; Crespo, 2000).
A la vez, en estados avanzados de maduracin, la tasa de respiracin incrementa debido a
la liberacin de etileno, compuesto reconocido como una fitohormona importante en frutas
climatricas. En el proceso de respiracin, las clulas vegetales consumen carbohidratos para
generar energa en forma de calor y por ello, los carbohidratos totales del banano descienden
a 2-5 %m/m, ya que se consumen en esta va metablica. La tasa de transpiracin tambin
aumenta y por ello se libera agua, de manera que la pulpa posee mayor humedad (Crespo,
2000; Hammond et al., 1996).
 7

La composicin de la pulpa de banano citada por Hammond et al., (1996) se detalla a

continuacin en el Cuadro I, adems, en el Cuadro II se muestra la composicin segn los
diferentes estados de madurez, reportados por Chacn et al., (1987).

Cuadro I. Composicin qumica de la pulpa de banano en bases hmeda y seca, reportada por
dos autores.
Composicin pulpa (NAS, 1972) Composicin pulpa (FAO, 1990)
Parmetro Porcentaje en Porcentaje en Porcentaje en Porcentaje en
peso hmedo (%) peso seco (%) peso hmedo (%) peso seco (%)
Materia seca 24,3 NR 28,4 NR
Cenizas 0,8 3,3 0,8 2,8
Grasa (extracto
0,2 0,8 0,3 1,1
etreo)
Protena cruda 1,1 4,5 1,2 4,2
Fibra cruda 0,5 2,1 0,6 2,1
Carbohidratos 21,7 89,8 25,5 89,8
NR: No reportado

Cuadro II. Caracterizacin qumica del banano segn su grado de madurez (Chacn et
al.,1987)

Grado de madurez
Caractersticas
1 2 3 4 5 6 7
Ms Ms
Verde y Amarillo, Totalmente
verde amarillo Totalmente
Color de cscara Verde trazas extremos amarillo
que que amarillo
amarillo verdes con pecas
amarillo verde
Porcentaje de
17,73 13,68 8,76 4,96 2,65 1,73 0,82
almidn (%)
Porcentaje azcares
1,32 3,21 6,57 11,26 16,18 19,50 19,71
totales (%)
Slidos solubles
4,69 7,28 12,48 17,78 20,81 22,1 22,61
(Brix)
pH 5,24 5,02 4,87 4,77 4,75 4,78 4,88
Acidez (como
porcentaje de cido 0,41 0,54 0,63 0,67 0,67 0,62 0,52
mlico, %)
Razn pulpa/cscara 1,37 1,45 1,53 1,61 1,69 1,78 1,96
Porcentaje de
72,00 72,32 72,64 72,97 73,28 73,61 73,92
humedad (%)
 8

Asimismo, se han reportado resultados de anlisis de fibra en pulpa de banano. Franquin

(2002) reporta que el contenido de material insoluble en alcohol (MIA) es de 4,5 %m/v, el cual
a su vez, est compuesto por 31 % de almidn, 12 % de protena y 22 % de material insoluble
en alcohol y agua (MIAA).

El material insoluble en alcohol y agua (MIAA) corresponde a un 0,97 %m/v de la parte

comestible del banano, y est conformado por 35,5 % pectinas, 38,9 % celulosas, 6,8 %
hemicelulosas y 0,45 % ligninas. El MIAA proviene de la pared celular a la que se le han
removido el almidn y la protena, de ah que sea rico en polisacridos estructurales (Franquin,
2002).

El almidn es un polisacrido que sirve como reserva de energa en tejidos vegetales y

responde a la frmula qumica (C6H10O5)x. Se encuentra almacenado en el interior de las
clulas como grnulos insolubles y densos (Mora, 1997). Para el caso del banano, estos
grnulos pueden ser esferoidales o alargados: los primeros poseen un dimetro de entre 15 a
40 m, en tanto que las estructuras alargadas tienen una longitud de entre 20 y 50 m y un
ancho de 7-25 m (Crespo, 2000).

Un aspecto importante que se debe tomar en cuenta es que la temperatura origina

importantes cambios sobre los grnulos de almidn. Por ejemplo a bajas temperaturas, entre
0 y 40 C, estos se hinchan y absorben agua, pero el proceso es reversible, es decir, cuando se
enfran retornan a su tamao original, sin embargo, al alcanzar cierta temperatura el proceso
se convierte en irreversible ocasionando que las molculas se hidraten y solubilicen (Crespo,
2000).

A la temperatura a la que ocurre esta solubilizacin se le conoce como temperatura de

gelatinizacin y, se reporta como un rango puesto que no todos los grnulos se disuelven a la
misma temperatura. Para el caso del banano, el mbito est entre 74 y 81 C, ms all de esta
temperatura el almidn se convierte en una pasta muy viscosa y de difcil agitacin (Crespo,
2000).

Antes de realizar el tratamiento enzimtico, es necesario realizar la gelatinizacin del

almidn ya que las enzimas reaccionan pobremente con sustratos insolubles, de manera que
el almidn debe solubilizarse a travs de un tratamiento trmico apropiado (Crespo, 2000).
 9

Tambin debe considerarse el contenido de fibra del banano, puesto que es un

componente importante en esta matriz, ms an en estados de maduracin tempranos. En
trminos generales, la fibra abarca un grupo complejo con una amplia diversidad de
estructuras tanto qumicas como morfolgicas, pero de manera universal se les reconoce
como polisacridos no almidonosos, que no pueden ser digeridos por las enzimas del intestino
delgado y que por ende, poseen importantes efectos fisiolgicos y nutricionales (Vquez,
1999).
La fibra se puede clasificar en: soluble e insoluble. La fraccin insoluble la constituyen la
celulosa, hemicelulosa insoluble y lignina, en tanto que la pectina, hemicelulosa soluble,
gomas y muclagos componen la porcin soluble de la fibra diettica (Vquez, 1999).
Para el banano, la fibra est constituida por lignina (0,5 %), celulosa (2,0-3,0 %),
hemicelulosa (8,0-10,0 %) y protopectina (0,6 %), principalmente (Mora, 1997). Sin embargo,
esta composicin puede variar con el avance del proceso de maduracin, por la accin de
enzimas endgenas.
Cabe hacer la aclaracin de que, la lignina es un polmero complejo formado por unidades
de fenilpropano (derivado de los alcoholes fenlicos sinapol, coumarol, coniferol y cinamol),
as que de manera estricta no es un polisacrido, pero tradicionalmente se asocia con los
polisacridos parietales debido a que tambin es resistente a la digestin. Es importante
estudiar la cantidad de este grupo de compuestos fenlicos, debido a que pueden interactuar
con otros polisacridos e inhibir la accin de ciertas enzimas, de ah que se debe cuantificar su
contenido en la pulpa de banano (Vquez, 1999).

3.1.3 Produccin de banano en Costa Rica

Los orgenes de la actividad bananera en Costa Rica se remontan al ao 1870, cuando se
construy la va frrea desde el Valle Central hasta Limn. El objetivo original de dicho
desarrollo ferroviario era darle una salida pronta a la produccin cafetalera que se exportaba a
Inglaterra y Alemania (CORBANA, 2011).
La construccin de la lnea frrea estuvo a cargo del estadounidense Minor Keith, que
posteriormente consigui la concesin para la explotacin de dicha va. Este ingeniero, pronto
descubri que para que el tren funcionase, dependa de la existencia de carga continua,
 10

requisito que el caf no satisface, dado que se trata de una cosecha estacional. All es donde
surgi el desarrollo bananero, favorecido por el suelo y clima de Costa Rica (CORBANA, 2011).
El fuerte de las exportaciones en nuestro pas es el sector industrial, principalmente
componentes de computacin, y abarca ms de tres cuartas partes del total de las
exportaciones. En segundo lugar se ubica el sector agrcola, con una contribucin de alrededor
20-21 % (Lpez, 2010).
La lista de los productos agrcolas de exportacin la encabeza el banano, que en los
ltimos aos ha tenido un aporte de 680,2-744,6 millones de dlares, dato muy significativo,
de ah que se considera que esta muscea es uno de los productos claves para la economa
nacional. En segundo plano se ubica la pia y en tercera instancia el grano de oro (Lpez,
2010).
El mximo de exportacin se alcanz en 1999, con un total de 116 millones de cajas, que
superaron los 2,1 millones de toneladas mtricas, pero posterior a ello la exportacin
descendi un poco y se ha ido estabilizando (CORBANA, 2011).
En la actualidad, la exportacin bananera alcanza un promedio de 100 millones de cajas
anuales, esto es 1,8 millones de toneladas mtricas; cifra que se mantiene relativamente
constante, a excepcin de algunos aos donde las condiciones climticas desfavorecen la
produccin de la fruta (CORBANA, 2011).
En materia de productividad (volumen de exportacin/hectreas en produccin), Costa
Rica lidera la industria bananera, pese a que, como se mencion anteriormente, la situacin se
ha complicado en los ltimos aos debido a condiciones climticas adversas (CORBANA, 2011).
En la Figura 1, se puede observar la evolucin de las exportaciones de banano en los
ltimos aos.
 11

800
Millones de US$ 700
600
500
400
300
200
100
0
2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011

Figura 1. Variacin de las exportaciones de banano en millones de dlares en el perodo 2005-

2010 (Lpez, 2010; Comex, 2012; Procomer, 2012)

En cuanto al destino de las exportaciones, tradicionalmente se destinaban exclusivamente

a Estados Unidos y a la Unin Europea, empero, en el 2009 se ampli el comercio y ahora
adems se exporta un 5 % a otros puertos distintos de los dos citados con anterioridad, como
se puede apreciar en la Figura 2 (CORBANA, 2011).

Turqua
Suecia
3% Otros
5%
Italia 10%
6%
Estados Unidos
47%

Blgica
9%
Reino Unido
13%

Alemania
7%

Figura 2. Destinos de exportacin de banano para el 2011 (Procomer, 2011)

 12

Los estrictos controles de calidad de los mercados internacionales, hacen que gran parte
de la produccin de banano sea descartada, por no cumplir parmetros fsicos como tamao,
color, grado de madurez, entre otros. Este excedente no exportable constituye cerca del 15 %
del total producido, parte de este residuos se comercializa a nivel interno, pero otra porcin,
se convierte en un desecho con el que es difcil lidiar, pues constituye una fuente de
contaminacin importante (Crespo, 2000).
A raz de lo anterior, como estrategia para utilizar el banano de rechazo que no cumple
con las especificaciones de exportacin, empresas privadas y centros de investigacin han
puesto su atencin en el desarrollo de productos como harinas, hojuelas para cereales, jugos,
nctares, bocadillos fritos, vinagres, purs, entre otros (Gonzlez, 1992; Mora, 1997).
Como parte de este compromiso social y con el ambiente, en 1992 se cre la Comisin
Ambiental Bananera (CAB), integrada por representantes de los siguientes rganos:
Corporacin Bananera Nacional (CORBANA), Cmara Nacional de Productores Independientes
de Banano (ANAPROBAN), Cmara Nacional de Bananeros (CANABA), Chiquita Brands
International, Standard Fruit Company, Del Monte, Banacol, Ministerio de Agricultura y
Ganadera, Ministerio de Ambiente, Energa y Telecomunicaciones, Ministerio de Salud,
Cmara de Insumos Agropecuarios, Cmara de Productos Genricos y finalmente, Centro de
Investigacin en Contaminacin Ambiental de la Universidad de Costa Rica (CORBANA, 2011).
El objetivo de la CAB es velar por implementar una poltica de responsabilidad y
compromiso con el ambiente, adems proteger la salud de los trabajadores de este gremio y
las comunidades vecinas a las plantaciones. Para ello, una actividad fundamental es la visita
frecuente a las fincas bananeras, con el fin de dar seguimiento a este compromiso y garantizar
que perdure, de modo que futuras generaciones profesen una agricultura responsable y de
conservacin de los recursos naturales (CORBANA, 2011).
El documento Principios y metas ambientales del sector bananero costarricense,
respalda las labores y metas de dicha comisin, y fue actualizado en el 2007 de acuerdo con
los avances y nuevas necesidades que han surgido en el camino, como parte de una mejora
continua del desarrollo bananero acoplado a un sistema amigable con el ambiente (CORBANA,
2011).
 13

3.2 Las enzimas como pre-tratamiento a la fermentacin

La historia de la enzimologa nace en 1833, cuando Payen y Persoz identificaron una
sustancia termolbil que converta el almidn en azcar, durante la produccin de alcohol. A
dicha sustancia, una enzima, la llamaron amilasa (Kilara & Desai, 2001). Actualmente, esa
aplicacin ha cobrado gran importancia, debido a que el almidn abunda en plantas y
alimentos, por lo que constituye una fuente primordial de carbohidratos en la alimentacin
humana (Ravi-Kumar & Umesh-Kumar, 2005; Belitz et al., 2009).
Al mismo tiempo, durante siglos se han fabricado bebidas alcohlicas a partir de materias
primas con alto contenido de almidn, pues este polmero se compone de cadenas largas de
molculas de glucosa que se deben degradar a molculas ms pequeas, que la levadura
pueda transformar en alcohol. Para dicha catlisis es necesario el uso de enzimas, ms an,
desde los aos 60 se han venido utilizando enzimas exgenas, en lugar de las endgenas,
presentes en la materia prima para la obtencin de etanol (Novozymes, 2004b).
Las enzimas son biocatalticos que actan sobre sustratos especficos para dar un producto
determinado. Estas molculas orgnicas son ubicuas, y su importancia se resume en que sin su
existencia, muchos procesos naturales no podran ocurrir, pues estn encargadas de acelerar
reacciones bioqumicas, que bajo condiciones naturales no ocurriran a la velocidad necesaria
para preservar la vida (Kilara & Desai, 2001).
La expansin de la enzimologa se atribuye a sus numerosas ventajas, dentro de las que se
encuentran: se requiere poca cantidad de enzima para el tratamiento de gran cantidad de
materia prima; ahorro del 20-30 % en materias primas (por ejemplo, pocos litros de coctel
enzimtico sustituyen hasta 100 kilos de malta en la industria cervecera); las enzimas
industriales tienen una actividad uniforme, lo que facilita la estandarizacin de procesos; las
enzimas producen sustancias que de otra forma no estaran presentes en la materia prima,
mejora en la calidad de los productos y adems, globalmente el proceso suele ser ms
econmico (Kilara & Desai, 2001; Novozymes, 2004b).
Con todo lo anterior, las enzimas se han convertido en herramientas ideales para la
manipulacin de material biolgico; desde principios de siglo se utilizaron enzimas en
industrias como la de cuero y la cerveza, sin embargo, pocas enzimas se utilizaban
comercialmente, debido a limitaciones como inestabilidad trmica, condiciones inadecuadas
 14

de reaccin y el alto costo que conlleva obtener grandes cantidades de enzimas puras (Yildiz,
2009).
El avance de la ciencia y de los procesos industriales debe ir de la mano con el uso de
tecnologas ms modernas, por ello ha cobrado fuerza el uso de enzimas. Sus aplicaciones son
muy variadas, como sigue: se emplean para reducir la viscosidad, mejorar extracciones, llevar
a cabo bioconversiones, aadir valor agregado a productos y crear nuevos y ms intensos
sabores y aromas en los alimentos, entre otros (Yildiz, 2009).
Las enzimas pueden utilizarse tambin como coadyuvantes tecnolgicos, por ejemplo, la
adicin de una pequea cantidad de una enzima disgregante de protena, contribuye a la
liberacin de compuestos nitrogenados, mismos que favorecen el crecimiento de la levadura
por mayor tiempo, en caso de fermentaciones alcohlicas (Novozymes, 2004b).
Dadas sus caractersticas se utilizan tambin en el procesamiento moderno de alimentos,
donde se emplean preparados enzimticos, que pueden ser de origen fngico o bacteriano,
con actividades especficas, para por ejemplo, mejorar el rendimiento de obtencin de pulpas
y jugos de frutas (Faigh, 1995; Badilla, 2005; Venkatesh & Umesh, 2005).
En jugos y pulpas de frutas, el uso de enzimas ha tenido especial importancia, pues desde
que en 1930 se utilizaron enzimas para clarificar jugos prensados, esta industria he hecho
amplio uso de enzimas como adyuvantes en la produccin de jugos clarificados. En las ltimas
dos dcadas se han presenciado avances en la tecnologa de enzimas, con el desarrollo de
preparados enzimticos que contienen pectinasas, celulasas y hemicelulasas que actan
sinrgicamente en el tejido de la fruta (Faigh, 1995; Kyamuhangire et al., 2002), sin modificar
caractersticas como sabor y olor de la materia prima original (Prez & Vaillant, 2003).
Las mejoras observadas al aplicar pre-tratamientos enzimticos en jugos se detallan a
continuacin: el incremento del volumen total de jugo y de slidos solubles, la disminucin de
viscosidad de la pulpa, el incremento del rendimiento de obtencin de jugo, la disminucin de
humedad en los residuos slidos y el mejoramiento de la eficiencia de centrifugacin y
ultrafiltracin (Valley Research Inc, s.f.). Adems, disminuyen la cantidad de slidos insolubles
en suspensin, solubilizndolos parcialmente en la fase acuosa. Esto se debe a la hidrlisis de
los principales polisacridos solubles responsables de la alta viscosidad y a la licuefaccin de
polisacridos insolubles de la pared celular (Badilla, 2005).
 15

3.2.1 Factores que influyen en el tratamiento enzimtico

Cuando se utilizan enzimas como parte de un proceso industrial o comercial, deben
evaluarse mltiples factores, ya que la mayora de enzimas son protenas, y por ende, su
actividad est condicionada en gran medida a las condiciones del medio de reaccin, como
temperatura, pH e inclusive la concentracin del sustrato y de la enzima misma, adems, la
presencia de otras sustancias pueden activar o inhibir la accin de estos biocatalticos (Kilara &
Desai, 2001).
Una prctica comn y recomendable al emplear preparados enzimticos es la
determinacin de la actividad, bajo condiciones normales de uso. En estos ensayos se mide la
concentracin de sustrato consumido o de producto producido en lapsos cortos de tiempo,
as, esta velocidad se relaciona con la actividad de dicha enzima en condiciones controladas
(Wrolstad et al., 2005).

3.2.1.1 Concentracin de enzima

Es uno de los factores clave que influencia la actividad enzimtica, pues conforme
aumenta la concentracin del cataltico, aumenta la velocidad de reaccin. Sin embargo, llega
un punto en que el sustrato se satura de enzima, de modo que los incrementos en la
concentracin enzimtica no producen ningn efecto en la velocidad de reaccin. De ah la
importancia de estudiar distintas concentraciones, con el fin de aumentar la actividad sin
incurrir en gastos innecesarios (Lee et al., 2006; Miranda, 2007).

3.2.1.2 Concentracin de sustrato

Esta variable influye de manera similar que la anterior, pues el aumento en la
concentracin de sustrato se traduce en un aumento en la velocidad de reaccin, hasta el
punto en que la enzima se satura de sustrato y por ende, los cambios posteriores no producen
efecto alguno en la velocidad (Miranda, 2007).

3.2.1.3 Temperatura
La velocidad de las reacciones enzimticas aumenta de forma lineal con la temperatura,
pero slo en el intervalo en el que la enzima permanece activa y siempre que retenga su
capacidad cataltica, pues cuando se supera la temperatura mxima de la enzima, se induce la
 16

desnaturalizacin proteica y la enzima pierde su actividad, consecuentemente (Crespo, 2000;

Miranda, 2007).
Dado el efecto de la alta temperatura sobre las enzimas, usualmente se utilizan
tratamientos trmicos de mayor o menor intensidad para inactivar enzimas. El tiempo y
temperatura necesarios para dicha inactivacin dependern de la termoestabilidad propia de
cada enzima, aunque tambin influyen otros factores como pH, presencia de sales y grado de
aireacin (Crespo, 2000).

3.2.1.4 pH
Una caracterstica importante de las enzimas es que funcionan como catalticas en un
intervalo amplio de pH, de 2 a 10, por ejemplo, la enzima poligalacturonasa extrada de
Corticium rolfsii acta a un pH de 2,5 y a la vez, en el otro extremo del intervalo, existen
enzimas de tipo liasas que actan a pH alcalinos de entre 8 y 10 (Kilara & Desai, 2001; Scragg,
1996). Sin embargo, para muchas enzimas, este mbito de accin se limita a un pH de entre 5 y
9, pues en condiciones extremas, los aminocidos que constituyen la enzima pueden
protonarse o desprotonarse y esto suscita la prdida de actividad (Miranda, 2007).
Valga hacer la aclaracin de que el ajuste del pH no es una prctica comercial comn para
la obtencin de jugo, salvo en casos muy extremos, pero con sustratos como banano cuyo pH
ronda los 4,5-4,8, se suele mantener el pH natural de la materia prima y esta variable no se
incluye en el diseo experimental (Lee et al., 2006).

3.2.1.5 Tiempo de reaccin

El tiempo de reaccin es otro factor clave en la actividad de las enzimas ya que conforme
mayor es el tiempo de reaccin enzima-sustrato, mayor es la concentracin final de productos,
pero llega un tiempo en el que el aumento es muy pequeo o tiende a disminuir ya que las
reacciones son reversibles, de modo tal que un incremento en el perodo de incubacin no
genera mejores resultados (Miranda, 2007).

3.2.1.6 Presencia de taninos

Los taninos son compuestos polifenlicos que se ubican en arterias de ltex y recorren la
fruta, tanto pulpa como cscara, en forma axial, tambin se encuentran en las hojas, races y
 17

en la corteza de algunos rboles (Hagerman et al., 1998; Okuda & Ito, 2011). Para el banano
verde, el polifenol ms abundante es la dopamina (3,4-dihidroxifeniletilamina), la cscara
contiene aproximadamente 700 g/g y la pulpa 8 g/g (Mora, 1997).
Los taninos participan en las reacciones de pardeamiento enzimtico, catalizadas por la
polifenoloxidasa, en la que los polifenoles se oxidan a quinonas, que a su vez, se transforman
en compuestos coloreados, lo que produce el oscurecimiento en el banano. Pero adems, los
taninos presentan un gran efecto inhibitorio sobre las enzimas, ya que forman complejos
estables con polipptidos y protenas (Mora, 1997).
Existen dos mecanismos por los que se cree que las protenas interaccionan con los
compuestos fenlicos. En primer lugar, los grupos hidroxilo de los polifenoles forman puentes
de hidrgeno con los grupos carbonilo de las protenas. La segunda interaccin importante
consiste en una neutralizacin de cargas, las protenas en medios de pH cido poseen cargas
positivas, que neutralizan con las cargas negativas de los polifenoles, los complejos producidos
precipitan rpidamente (Mora, 1997).
En ambos casos, las enzimas quedan inhabilitadas para catalizar reacciones, tal como lo
reporta Mora (1997), los taninos son los responsables de la inhibicin de diferentes
preparados enzimticos comerciales (Pectinex Ultra SP-L, Celluclast 1,5L, Hemicellulase,
Pectinex 3XL, Ultrazym, entre otros). Esta aseveracin deriva de un estudio previo, en el que
se encontr que al utilizar estos preparados enzimticos sobre pur de banano verde al que no
se le extrajeron los compuestos polifenlicos, la reduccin de la viscosidad fue de 36 %
respecto al control, pero cuando se aplicaron estos preparados enzimticos a pur de banano
al que se le extrajeron los compuestos polifenlicos la reduccin de viscosidad fue de 71 %
respecto al control (Mora, 1997).

3.2.2 Produccin de jarabes glucosados a partir de almidn

Desde principios del Siglo XIX, el qumico alemn Kirchoff descubri que al hervir el
almidn con cido, el polmero se convierte en una mezcla dulce compuesta principalmente
por glucosa. Sin embargo, durante los ltimos 30 aos, a medida que surgen y se extraen
nuevas enzimas, la hidrlisis cida ha pasado a segundo plano, desplazada por la hidrlisis
enzimtica (Novozymes, 2004b).
 18

Desde entonces, la hidrlisis cida ha perdido aplicacin, principalmente por la formacin

de subproductos no deseados, poca flexibilidad y adems, la necesidad de equipamiento capaz
de soportar el cido empleado a temperaturas hasta de 140-150 C (Novozymes, 2004b).
Es as que, en los aos 70, la tcnica enzimtica permiti la produccin de jarabe con alto
contenido de fructosa a partir de almidn y, con un dulzor similar a la sacarosa o azcar de
mesa. La produccin de este jarabe ha contribuido con el crecimiento de la industria
almidonera en algunos pases. Por ello, esta industria es el segundo campo de aplicacin de las
enzimas, superado solo por las enzimas detersivas (que sirven para limpiar o purificar). La
evolucin en la produccin de jarabes fructosados y/o glucosados se debe a que constituyen
una fuente edulcorante con menores costos que la extraccin del azcar de caa (Novozymes,
2004b; Snchez et al., 2005).
Segn la enzima empleada, se pueden obtener jarabes con diferentes composiciones y
propiedades, pese a que provengan de un mismo almidn. Por ejemplo, el dulzor del jarabe se
puede variar en funcin del grado de hidrlisis y, segn sea el resultado final puede utilizarse
en una amplia gama de alimentos: cereales, productos de confitera, jugos, derivados de
frutas, entre otros (Novozymes, 2004b).
Igualmente, la hidrlisis enzimtica exhibe las siguientes ventajas: no se da la
retrogradacin de almidones as que la viscosidad no aumenta, no corroe equipos y es libre de
riesgo de accidentes. En contraparte, el coste econmico es mayor, pues las enzimas poseen
precios ms elevados que los cidos sulfrico o clorhdrico que usualmente se emplean en las
hidrlisis cidas y adems, el tiempo de reaccin es mayor (Miranda, 2007).
La produccin de estos jarabes involucra tres etapas principales: licuefaccin,
sacarificacin e isomerizacin. Esta ltima es de inters para la produccin de jarabes de uso
alimentario, como edulcorante, pues se generan molculas de fructosa con un poder
edulcorante mucho mayor que el de la glucosa, de ah que son jarabes con alto dulzor (poder
edulcorante: fructosa=114 > glucosa=69) que se pueden utilizar en la industria de alimentos.
Para el caso de produccin de sustratos viables para la fermentacin no es necesario realizar la
etapa de isomerizacin, de manera que se obviar en el presente estudio.
Licuefaccin
En esta etapa se recurre a enzimas tipo -amilasas, lo que permite la conversin del
almidn en una mezcla de maltodextrinas, oligosacridos y dextrinas. Dicha combinacin es
 19

poco dulce y por lo general, es necesaria una etapa ulterior (Kelsall & Lyons, 2003; Novozymes,
2004b).
En esta etapa, la viscosidad de la disolucin de almidn disminuye rpidamente por la
hidrlisis efectuada con la -amilasa y las dextrinas producidas pueden ser hidrolizadas si se
contina la incubacin, y como producto final aparecen azcares reductores,
fundamentalmente -maltosa. Cabe considerar que la actividad de la enzima decae
considerablemente con el menor grado de polimerizacin del sustrato (Belitz et al., 2009).
La licuefaccin, es un proceso extensivo, con un requerimiento elevado de enzimas, ms
an cuando se combinan las amilasas con preparados enzimticos que degradan la pared
celular, con el fin de disminuir la viscosidad del sustrato y convertirlo en uno de ms fcil
manipulacin (Faigh, 1995).
Sacarificacin
La mayora del almidn tratado con -amilasa, se dulcifica en una etapa posterior con una
amiloglucosidasa o glucoamilasa. Este proceso se conoce como sacarificacin, y tericamente
la glucoamilasa hidroliza completamente el almidn en glucosa, pero en la prctica se produce
tambin una pequea parte de isomaltosa (Kelsall & Lyons, 2003; Novozymes, 2004b).
El trmino equivalentes de dextrosa (DE), consiste en una indicacin del grado de
hidrlisis del jarabe. Por ejemplo, el valor de DE del almidn es 0, mientras que el de la
dextrosa es 100, segn el grado de dulzor que se desee y la aplicacin que tenga este, as
variar su DE, aunque los jarabes con DE entre 35-43, poseen mltiples y variadas aplicaciones,
a la vez, el grado de hidrlisis est sujeto a las condiciones del tratamiento de sacarificacin
(Novozymes, 2004b).

3.2.3 Pectinasas
La pectina es un carbohidrato coloidal complejo, formado por unidades de cido -D-
galacturnico, acopladas por enlaces -1,4, espaciados por unidades de ramnosa, aunque en la
cadena lateral tambin pueden encontrarse unidades de arabinosa y galactosa (Vquez, 1999).
Los grupos carboxilo de los restos galacturnicos estn esterificados en diferentes
proporciones con metanol, formando pectinas de bajo, medio y alto metoxilo, segn sea el
grado de sustitucin (Belitz et al., 2009).
 20

Este polmero se encuentra en las plantas, especficamente en la lamela media y en la

pared celular primaria, junto con la celulosa, y cumple por ello, un importante rol en mantener
la estructura, rigidez y textura de las clulas (Mora, 1997). Las pectinas se caracterizan por su
solubilidad en agua caliente y la formacin de geles al enfriarse, cuando estn en la pared
celular son ligeramente solubles ya que forman complejos con calcio (Vquez, 1999).
En algunas ocasiones, como en la produccin de jugos de frutas, es necesario degradar la
pectina, pues adems de formar parte de la estructura que contiene los fluidos de inters,
acta como un coloide protector que sostiene las pequeas partculas de la pared celular y las
protenas del citoplasma en suspensin, lo cual hace que la pulpa sea muy viscosa y turbia
(Faigh, 1995; Ovando & Waliszewski, 2005).
Las pectinasas al ser enzimas que hidrolizan la pectina, permiten la degradacin de la
pared celular, con la consecuente liberacin de fluidos internos de las clulas vegetales
(Venkatesh & Umesh, 2005). Al mismo tiempo, con la hidrlisis se reduce la capacidad de
retencin de agua del polmero, consecuentemente se libera agua al sistema y esto reduce la
viscosidad (Lee et al., 2006).
En el mbito de alimentos, el uso de las pectinasas abarca el mejoramiento de la velocidad
de filtracin, el incremento en la extraccin de pulpas de frutas, la reduccin de la turbidez y la
facilitacin de la clarificacin ulterior de jugos (Kilara & Desai, 2001).
La experiencia en el uso de enzimas pectinolticas en pulpas y jugos de banano, demuestra
que se obtiene una disminucin importante de la viscosidad, un incremento de hasta 10 % en
los slidos solubles (expresados como grados Brix), atribuidos al aumento de glucosa y
fructosa. Se han empleado preparados comerciales, como Pectinex Ultra SP-L, Fungamyl 800
L, AMG 200 L y Ultrazym, como tratamiento previo a la fermentacin y para la produccin
de jugo clarificado de banano, destinado a consumo humano (Kyamuhangire et al., 2002).
Dentro del grupo de enzimas pectinolticas se encuentran los siguientes tipos: pectin-
esterasas, poligalacturonasas y pectn-liasas cuya funcin se detalla seguidamente en el
Cuadro III.
 21

Cuadro III. Funcin de las enzimas pectinolticas, pectn-esterasa, poligalacturonasa y pectn-

liasa
Enzima Funcin
Hidroliza grupos metoxilo, transformando la pectina en una de bajo
Pectn-esterasa metoxilo. Libera cido poligalaturnico. Ayuda a disminuir la turbidez y la
floculacin no deseada en zumos de frutas y verduras.
Hidroliza unidades de cido poligalacturnico no esterificadas, al azar o
secuencialmente a partir de sus extremos. Existe en forma exo (hidroliza a
partir del extremo no reductor de la cadena), como endo (rompe en
Poligalacturonasa
cualquier parte interna de la cadena). Esta ltima resulta ms til desde el
punto de vista comercial pues su velocidad de depolimerizacin es ms
elevada.
Rompe los enlaces entre unidades de cido galacturnico esterificadas. Se
Pectn-liasa
utilizan para la obtencin de jugos clarificados de frutas
Fuente: Fellows, 2000; Novozymes, 2004b; Belitz et al., 2009.

3.2.4 Celulasas
La celulosa est conformada por ms de 10 000 unidades de D-glucosa, conectadas a
travs de enlaces -1,4 (Vquez, 1999). La mayora de la celulosa que se encuentra disponible
en la naturaleza contiene cerca de un 10 % en masa de polisacridos no celulsicos, protenas
y minerales. Las molculas adyacentes de este polmero estn empaquetadas muy juntas en
largas filas, estabilizadas por fuerzas intermoleculares qumicas muy fuertes, de ah que es
altamente insoluble (Belitz et al., 2009; Kilara & Desai, 2001).
Este polisacrido es el ms abundante de la pared celular de las plantas, donde se
encuentra asociado a hemicelulosas, pectina y lignina, confiere rigidez y forma a las clulas
vegetales (Vquez, 1999).
Las enzimas responsables de la ruptura de los enlaces -1,4 de la celulosa son las celulasas,
cuyo producto principal es la glucosa, por tanto su actividad se puede medir como la
concentracin de esta que produce o bien, en trminos de reduccin de viscosidad en un
sustrato dado (Kilara & Desai, 2001).
Las enzimas celulsicas son producidas por un amplio espectro de bacterias y hongos tanto
aerobios como anaerobios, mesfilos o termfilos, pero, pese a que muchos microorganismos
la producen, slo algunos la liberan. Tpicamente sobresalen los hongos Trichoderma viride,
Trichoderma reesei, Penicillium pinophilu y Fusarium solani, donde destaca T. reesei, pues la
enzima que produce tiene la capacidad de degradar la celulosa nativa y la cristalina gracias a
 22

un complejo celuloltico que produce y excreta, conformado por endo--1,4-glucanasa, exo--

1,4-glucanasa y -1,4-glucosidasa. Adems, sus celulasas son resistentes a inhibidores
qumicos y estables en bioreactores agitados a pH de 4,8 y 50 C por 48 horas (Ovando &
Waliszewski, 2005; Kovacs et al., 2009).
Es importante resaltar que muchos preparados de celulasas contienen adems pectinasas
y hemicelulasas. Esto porque como se mencion a priori, las hemicelulosas se encuentran
unidas a la celulosa, rellenando los espacios entre fibrillas (Belitz et al., 2009). Estas enzimas,
las hemicelulasas, contribuyen con la disminucin de la viscosidad al convertir los D-xilanos a
xil-oligosacridos, D-xilosa y L-arabinosa (Fellows, 2000).
Dentro de las ventajas que ofrece el uso de estas enzimas, entindase celulasas y
hemicelulasas, se encuentran: reduccin de la viscosidad, mejora en el rendimiento de
extraccin de jugos, aceites esenciales, especias y otros extractos de plantas. De ah que se
han encontrado aplicaciones especficas como: reduccin de la viscosidad de caf
concentrado, extraccin y clarificacin de zumos ctricos, hidrlisis de pur y jugo de manzana,
mejora la filtracin de extractos de vainilla, mejora la dureza de los vegetales antes de su
coccin, degradacin de la cubierta de nueces antes de extraer sus aceites esenciales y
facilitacin de la extraccin de compuestos aromticos de vegetales (Fellows, 2000).

3.2.5 -amilasas
El almidn es un carbohidrato de reserva que se encuentra en plantas y alimentos, tanto
es as que es considerado como la fuente ms abundante en la naturaleza de carbohidratos
para la dieta humana (Belitz et al., 2009).
El almidn es un polisacrido conformado por unidades de glucosa, que se empacan de
manera distinta y por ello se dividen en dos tipos de molculas: amilosa y amilopectina. La
amilosa es lineal y compacta, pues las glucosas que la componen estn unidas por enlaces -
(1,4); en tanto que la amilopectina es ramificada y ms voluminosa, pues en ella la glucosa
forma ramificaciones a travs de enlaces -(1,6) (Belitz et al., 2009; Blanchard & Katz, 2006).
Una de las enzimas encargadas de la hidrlisis del almidn, es la -amilasa, una endo-
enzima extracelular que participa en la ruptura de almidn, glucgeno y otros 1,4- -glucanos,
que al partir azarosamente los enlaces -1,4 glicosdicos en el interior de la molcula, libera
oligosacridos de 6-7 unidades de glucosa (Crueger & Crueger, 1993; Belitz et al., 2009).
 23

La accin de estas enzimas no es inhibida por los enlaces -1,6 glicosdicos, mas no es
capaz de hidrolizarlos, razn por la cual no altera las dextrinas de bajo peso molecular (Crueger
& Crueger, 1993; Fellows, 2000).
Las -amilasas son sintetizadas por muchas bacterias y hongos, siendo las de mayor uso
industrial las producidas por Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis y Aspergillus
oryzae; pero las de Bacillus se utilizan ms ampliamente que las de Aspergillus (Crueger &
Crueger, 1993). Esto se debe a que las enzimas bacterianas son termoestables, por lo que la
prdida de la actividad es insignificante an luego de procesos como gelatinizacin. Adems,
dicha estabilidad es acentuada en presencia de iones calcio (Crespo, 2000; Belitz et al., 2009).
Este tipo de enzimas se utilizan en elaboracin del mosto de cerveza, la fabricacin de
productos de panadera, reduccin de la viscosidad en pulpas y jugos de algunas frutas y
verduras ricas en almidn y en la fabricacin de jarabes de glucosa y/o fructosa (Crespo, 2000;
Fellows, 2000; Belitz et al., 2009).
Durante el tratamiento enzimtico del almidn para la liberacin de azcares simples, es
necesario el monitoreo de ambas sustancias, almidn y glucosa. El almidn puede ser
determinado mediante la tradicional prueba con yodo-yoduro, pues estas especies forman un
complejo color prpura con la estructura helicoidal del almidn, cuya intensidad depender de
la cantidad de almidn presente, y que adems es fcil de cuantificar mediante tcnicas
espectrofotomtricas (Wrolstad et al., 2005).

3.2.6 Glucoamilasas
Las glucoamilasas, tambin conocidas como amiloglucosidasas, son enzimas que liberan
unidades de -D-glucosa a partir de 1,4--D-glucanos, es decir, es un tipo de enzima
sacarificante, que libera glucosa terminal a partir de extremos no reductores de molculas de
almidn. A diferencia de la -amilasa, esta enzima es capaz de degradar tanto estructuras
lineales como ramificadas, reducindolas todas a glucosa; sin embargo, las ramificaciones de la
amilopectina se hidrolizan 30 veces ms lentamente que los enlaces lineales (Crueger &
Crueger, 1993; Fellows, 2000; Belitz et al., 2009).
Como se mencion, este tipo de enzimas son las que se emplean en la sacarificacin, que
generalmente se realiza a pH de entre 5,0 y 5,5 y con temperaturas que oscilan entre 50 y 55
C (Crespo, 2000). Los microorganismos que se utilizan para producir glucoamilasa son
 24

Aspergillus niger, A. oryzae, A. awamori, Rhizopus niveus, R. delemar, R. formosaensis y R.

javanicus, pero el ms sobresaliente es A. oryzae (Crueger & Crueger, 1993).
Adems de su uso en la produccin de jarabes de almidn, las glucoamilasas se emplean
para aumentar el contenido de alcohol y reducir el contenido de carbohidratos en la cerveza,
esto mediante la transformacin de casi la totalidad de las dextrinas en azcares fermentables,
dando como resultado las llamadas cervezas light (Fellows, 2000).
En el Cuadro IV se muestra una sntesis de las enzimas discutidas, junto con su utilizacin,
fuente y clasificacin.

Cuadro IV. Enzimas de inters industrial, clasificacin, fuente de extraccin y algunas

aplicaciones en el procesamiento de alimentos
Clasificacin
Nombre Origen biolgico Usos
EC

Bacillus licheniformis, Grasas, cereales y almidn, frutas

B.subtilis, Aspergillus oryzae, y verduras, bebidas, azcar y
3.2.1.1 -amilasa
A. niger, Rhizophus delemar y miel, bombones y productos de
R. oryzae panadera

Exo-1,4- -D- Aspergillus oryzae, A. niger, Grasas, frutas y verduras,

glucosidasa Rhizophus arrhizus, R. bebidas, azcar y miel, bombones
3.2.1.3
delegar, R. niveus, R.oryzae y y productos de panadera,
(Glucoamilasa) Trichoderma reesei alimentos dietticos

Aspergillus niger, A. oryzae,

Frutas y verduras, bebidas (zumos
Rhizophus delemar, R. oryzae,
3.2.1.4 Celulasa de frutas, cerveza y vino),
Sporotrichum
alimentos dietticos
dimorohosporum

Frutas y verduras, bebidas (zumos

3.1.1.11 Pectn-esterasa Aspergillus niger de frutas, cerveza, vino),especias
y aromas

Aspergillus niger, Penicillium

Grasas y aceites, frutas y
simplicissimum, Trichoderma
3.2.1.15 Poligalacturonasa verduras, bebidas y especias y
reesei, Aspergillus niger,
aromas
A.oryzae y Rhizopus oryzae

Fuente: Belitz et al., 2009

 25

3.3 Etanol

3.3.1 Propiedades fsicas y qumicas

El etanol o alcohol etlico, es un lquido incoloro, voltil, inflamable y miscible en agua,
cuya frmula molecular es CH3CH2OH y tiene una masa molar de 46,1 g/mol (Miranda, 2007).
Algunas de sus propiedades fsicas y qumicas se muestran de manera puntual en el Cuadro V.

Cuadro V. Principales propiedades fsicas y qumicas del etanol

Temperatura
Gravedad Temperatura Punto de Calor de Lmite de
Composicin de
especfica de ebullicin inflamacin combustin inflamabilidad
porcentual autoignicin
a 25 C (C) (C) (kcal/L) (%v/v)
(C)
52,2%-C
4,3 (inferior)-
13,1%-H 0,79 78 423 13 5,048
19,0 (superior)
34,7%-O
Fuente: Miranda, 2007.

3.3.2 Tecnologas de produccin

Es posible producir etanol mediante dos rutas: sntesis qumica o por la ruta fermentativa.
En la era posterior a la II Guerra Mundial, debido a los bajos costes de los derivados del
petrleo, se prest poca atencin a la produccin microbiana de materiales orgnicos a partir
de productos vegetales. Posteriormente, desde mediados de la dcada de los 70, debido al
elevado precio del llamado oro negro y los conflictos econmicos y sociales que giran en torno
a este, la produccin biotecnolgica ha recobrado importancia (Crueger & Crueger, 1993;
Soetaert & Vandamme, 2004).
La va qumica comprende la sntesis del etanol a partir del eteno, gas que se obtiene como
subproducto de las refineras de petrleo; tambin puede producirse a travs de la hidratacin
cataltica del etileno (Crueger & Crueger, 1993; Miranda, 2007).
Por su parte, la fermentacin es una de las tecnologas ms antiguas, que se ha utilizado
para preservar alimentos desde hace ms de seis mil aos. En esta, se hace uso de la accin
controlada de microorganismos seleccionados para modificar su textura, conservarlos o
producir cidos o alcohol y desarrollar en ellos delicados aromas o bouquet que aumenten su
 26

calidad y su valor nutritivo. Con esta metodologa se han desarrollado productos cosmticos,
farmaceticos y alimenticios, como panes, galletas, bebidas alcohlicas, entre otros (Fellows,
2000; Melndez, 2002).
En la actualidad, se produce etanol a partir de granos como trigo, cebada, maz y caa de
azcar; sin embargo, se han realizado estudios a nivel piloto y semi-industrial a partir de
madera y otros residuos forestales. Esta sntesis biotecnolgica tiene la gran ventaja de
provenir de fuentes renovables, por ello, al etanol obtenido por esta va y con sustratos
biodegradables se llama bioetanol (Melndez, 2002).
Dentro de las ventajas que citan Fellows (2000) y Miranda (2007) para la produccin de
bioetanol se encuentran:
Bajo consumo energtico.
Bajo costo econmico en instalacin, funcionamiento, transporte, recuperacin,
concentracin y en la conversin de los polmeros a monosacridos consumibles por
los microorganismos.
Tecnologa sencilla y adaptable a procesos en continuo.
Posibilidad de uso de cultivos mixtos, con el fin de catabolizar sustratos diferentes y
convertirlos en los productos deseados.
Uso de cepas termfilas para ahorrar costes en el enfriamiento, aumentar la velocidad
de conversin y reducir los riesgos de contaminacin.

3.3.3 Aplicaciones del etanol

Adems de su tradicional uso en bebidas alcohlicas para consumo humano, el etanol se
emplea como materia prima y auxiliar en las industrias farmacutica, alimentaria, medicinal y
cosmtica (Crueger & Crueger, 1993).
El etanol, con una pureza del 92,4 %v/v se utiliza como solvente en las industrias
cosmtica, farmacetica y qumica y al 99,2 %v/v de pureza como combustible de motores,
aplicacin en la que se adentrar seguidamente (Crueger & Crueger, 1993).

3.3.4 Etanol como combustible: situacin mundial y nacional

La forma ms popular de transporte en la actualidad es el uso de vehculos automotores,
pero lastimosamente, esta actividad est ligada a un alto grado de contaminacin ambiental,
 27

debido a que libera al ambiente gran cantidad de gases, producto de las reacciones de
combustin que ocurren en el motor. Aunado a este problema de contaminacin, se
encuentra la situacin inestable del mercado petrolero y el alto costo de los combustibles
derivados de esta mezcla hidrocarburada (Demirbas, 2009).
Con tales antecedentes, muchos pases se han sumado a los esfuerzos por hallar fuentes
energticas alternas y renovables, con el propsito de atenuar los efectos adversos del uso de
gasolina regular, adems de desarrollar sistemas de certificacin para el mercadeo de sus
biocombustibles. Estas investigaciones han cobrado mayor mpetu y aceptacin en los ltimos
aos, de manera que el desarrollo tecnolgico en este mbito ha venido en crecimiento
(OECD, 2008).
Sin embargo, esta bsqueda de un combustible ms amigable con el ambiente y con
menor costo asociado no es nueva: ya desde 1897, Louis Renault, Armand Peugeot y Henry
Ford, investigaron la adaptacin del motor de combustin interna para utilizar alcohol como
combustible, es decir, el etanol ha sido utilizado como combustible desde la propia creacin de
los vehculos automotores. Desde aquel entonces, el uso de etanol ha venido en aumento y
presenta grandes avances tecnolgicos, dado la necesidad de reducir la dependencia del
precio del crudo (Melndez, 2002).
En la actualidad, las investigaciones se dirigen hacia la produccin de bioetanol, es decir
aquel que proviene de biomasa, pues puede representar un sustituto o diluyente conveniente
de la gasolina comn, ms an cuando se obtiene de sustratos renovables, siempre que el pas
cuente con capacidad agrcola excesiva (Melndez, 2002). A la vez, el alcohol es una fuente
energtica valiosa pues aumenta el octanaje de la gasolina (Bentez & Codn, 2004).
Costa Rica no es la excepcin, el gobierno ha implementado un plan de contingencia para
reducir el consumo de gasolina, de ah surge la restriccin vehicular y una serie de proyectos
de investigacin para impulsar la produccin nacional de biocombustibles, como recurso para
sustituir, al menos parcialmente, la gasolina y reducir as, la importacin de crudo (Miranda,
2007).
As, el Plan de Desarrollo 2002-2006, tena por objetivo justamente la promocin de
proyectos a escala piloto del uso de fuentes combustibles alternativas para reducir la
dependencia externa. Ms tarde, en el Plan de Desarrollo 2006-2010, se plante la necesidad
de potenciar y dar a conocer en el sector agropecuario, los beneficios tanto econmicos como
 28

ambientales del uso de combustibles de fuentes renovables, aprovechando recursos del agro
costarricense (Miranda, 2007).
Otra iniciativa fue la creacin por Decreto Ejecutivo de las Comisin Tcnica de Trabajo
MAG-MINAE-RECOPE-LAICA en el 2003, y la Comisin Tcnica de Trabajo del Estudio de
Biodiesel en el 2004. Posteriormente, ambos equipos de trabajo se amalgamaron en la
Comisin Nacional de Biocombustibles, que tiene por objetivo proponer reformas legales para
la produccin y uso de combustibles (Miranda, 2007).
En cuanto a los alcances logrados, en febrero del 2006 se implement un proyecto para
distribuir etanol en las regiones Pacfico Central y Guanacaste: gracias a esto, 64 gasolineras
distribuyen una mezcla con un 5-8 % de etanol, lo que ha permitido familiarizarse con la
logstica y el manejo de esta mezcla, pues en algunos pases con gran capacidad, como Brasil,
una de las principales limitantes que se han encontrado es la falta de conocimiento tcnico y
microbiolgico (Miranda, 2007).
La produccin de etanol se concentra en las plantas destiladoras de los Ingenios Taboga y
CATSA y en la planta de deshidratacin y rectificacin LAICA. Seguidamente se muestran
algunos usos, ventajas y desventajas del etanol como combustible, reportados por Melndez
(2002) y Miranda (2007).

Usos:
Para la fabricacin de etil-ter-butil ter.
Mezcla directa con gasolina en una proporcin 90:10, gasolina: etanol, combinacin
que se conoce como E10.
Se utiliza para la pila de combustible, una pila electroqumica que convierte la energa
qumica del etanol en energa elctrica para proporcionar una fuente de energa limpia
y altamente eficiente.
Se mezcla con diesel en una proporcin de 15 %, composicin que se conoce como E-
diesel, con esta sustitucin se reducen las emisiones de partculas y otros
contaminantes y se mejora el arranque en fro.

Ventajas:
Reduccin de hasta 25-30 % de las emisiones de CO.
 29

Contrarresta las emisiones de CO2, ya que pese a que este gas se libera cuando se
quema etanol, tambin es fijado por las fuentes vegetales fotosintticas a partir de las
que se produce.
Reactivacin y fortalecimiento del agro, al aumentar las reas de plantacin de fuentes
amilceas.
Aumento en el octanaje.
Mejoramiento de la biodegradabilidad de la gasolina.
Reduccin del nmero de compuestos aromticos de la gasolina, de manera que
disminuyen las emisiones de benceno a la atmsfera.
El tanque debe llenarse con menor frecuencia, ya que etanol es ms denso que la
gasolina.
Menores prdidas por evaporacin, pues la gasolina es ms voltil que el bioetanol
(menor entalpa de vaporizacin).

Desventajas
Corrosin de partes metlicas y sellos.
Presenta problemas de encendido en climas fros.
Puede emitir xidos de nitrgeno y aldehdos.
Difcil manejo del combustible, pues debe estar al 99,5 % de pureza, con mayor
cantidad de agua se oxidara.
Para satisfacer la demanda del 7 % se deben triplicar las reas de siembra de las
fuentes amilceas.

3.4 Microorganismos productores de etanol

Tradicionalmente, se han empleado tanto bacterias como levaduras para la produccin de
etanol, donde destaca la levadura Saccharomyces cerevisiae, que es la ms comn para tales
fines, pero tambin se ha empleado Kluyveromycces fragilis, as como otras especies de
Saccharomyces, a saber S. ellypsoideus, S. carlbergensis, S. fragilis y Schizosaccharomyces
pombe. Recientemente se han estudiado bacterias con gran capacidad de produccin de
etanol, como Zymomonas mobilis, Clostridium thermohydrosulfuricum, Thermoanaerobium
 30

brockii y Thermoanaerobacter ethanoliticus (Gottschalk, 1986; Crueger & Crueger, 1993;

Thompson, 2004).

3.4.1 Requisitos de los microorganismos productores de etanol

Si bien es cierto muchos microorganismos son capaces de producir alcohol, como parte de
su metabolismo, son pocas las cepas que cumplen todos los requisitos para ser empleadas a
nivel industrial. Los microorganismos deben poseer varias caractersticas importantes para ser
utilizadas en este campo, que se enumeran a continuacin (Maiorella, 1985; Thompson, 2004):
Tasas de crecimiento y de fermentacin altas.
Fermentacin eficiente, esto es, alto rendimiento de etanol producido con respecto a
los carbohidratos consumidos.
Produccin y tolerancia de altas concentraciones de etanol.
Estabilidad trmica.
Osmoresistente, capaz de fermentar soluciones concentradas de carbohidratos.
pH cido de fermentacin.
Alta viabilidad celular.
Caractersticas apropiadas de floculacin y sedimentacin.
Estabilidad gentica, baja tasa de mutacin.
La tolerancia a altas concentraciones de etanol y azcares, permite la conversin de
sustratos muy concentrados y a la vez, el caldo de fermentacin es ms rico en etanol, de
manera que se reducen los costos energticos para la destilacin y el manejo de los residuos.
Tambin, si la levadura tolera pH de operacin bajo, se inhiben muchos microorganismos que
pueden competir por el sustrato. La termoestabilidad simplifica el enfriamiento del bioreactor
y finalmente, la resistencia mecnica de las levaduras permite que sobrevivan al stress de
centrifugacin y operaciones iniciales de remojo (Maiorella, 1985; Thompson, 2004).

3.4.2 Requerimientos nutricionales

Para el adecuado funcionamiento de estos microorganismos, es vital fortificar el medio
con algunos nutrientes como: azcares simples como fuente de carbono, donde prevalece la
glucosa; nitrgeno por ser necesario para la sntesis proteica que usualmente se obtiene a
 31

travs de sales de amonio, urea o aminocidos; oxgeno molecular an si la cepa es anaerobia

facultativa, pues en etapas iniciales se requiere para favorecer la reproduccin; vitaminas
especialmente las del complejo B, e iones orgnicos como fosfatos, magnesio, potasio,
manganeso y cinc (Rusell, 2003; Araya, 2010).
Por ello, para que 100 kg de levadura crezcan adecuadamente, se requieren 6,6-8,0 kg de
nitrgeno, 1,1 kg de fsforo y apenas pequeas cantidades de potasio, magnesio y calcio. De
estos minerales es importante acotar que los fosfatos juegan un papel especialmente
importante porque influyen directamente en la velocidad de fermentacin y el calcio
insolubiliza productos txicos como el cido oxlico (Melndez, 2002; Miranda, 2007).
Un complemento nutricional importante es el extracto de levadura, que es fuente de
nitrgeno y estimula la reproduccin celular, pues es rico en factores de crecimiento como
vitaminas del complejo B (cido flico, piridoxina, niacina, cido pantotnico, tiamina y
riboflavina). Estos micronutrientes son esenciales para el desarrollo de la masa celular, adems
se ha encontrado que la presencia de tiamina acelera la velocidad de fermentacin (Melndez,
2002; Miranda, 2007; Araya, 2010).

3.4.3 Curva de crecimiento microbiano

Se necesita un entendimiento claro de la cintica del crecimiento microbiano cuando se
desea manejar adecuadamente un proceso a gran escala, ms an debido a que la cintica es
distinta en funcin de que el proceso sea continuo, discontinuo o fed-batch. Luego de la
inoculacin de una solucin nutritiva estril con microorganismos, se observan cuatro fases
claramente distinguibles: lag o de latencia, log o logartmica, estacionaria y de muerte (Crueger
& Crueger, 1993; Shuler & Kargi, 2002).
En la fase lag los microorganismos se adaptan a su nuevo ambiente, se inducen nuevos
sistemas de transporte y las enzimas del metabolismo primario deben ajustarse a nuevas
condiciones. Estas alteraciones generan cambios en el medio, como variaciones en el valor del
pH, aumento en el suministro de nutrientes y descenso en los inhibidores del crecimiento. Son
diversos los factores que tiene influencia en la duracin de la fase lag; por ejemplo, una alta
concentracin de sustrato (mayor a 15-25 %) altera la presin osmtica del medio, lo que a su
vez causa deshidratacin en las levaduras y esto afecta su desempeo, por lo que la fase lag se
prolonga (Bentez & Codn, 2004).
 32

Adems, la condicin fisiolgica del inculo es crucial respecto a la duracin de la fase de

latencia. Si el cultivo que se va a utilizar como inculo se encuentra todava en la fase
logartmica, puede no existir perodo de latencia y el crecimiento puede empezar
inmediatamente. Sin embargo, si el inculo se toma de un cultivo en el que se ha detenido el
crecimiento debido a una limitacin del sustrato, requerir ms tiempo para adaptarse a una
nueva solucin de nutrientes. La concentracin del inculo tambin tiene influencia en la fase
de latencia y un nivel adecuado mejora el proceso y reduce las posibilidades de infeccin
(Crueger & Crueger, 1993; Rusell, 2003).
La siguiente etapa, la fase logartimica, deriva su nombre de que al graficar la poblacin
frente al tiempo en una escala semi-logartmica, se obtiene una lnea recta, esto porque el
crecimiento del microorganismo en este punto es exponencial. Aunque las clulas alteran el
medio debido a la toma de sustratos y a la secrecin de productos metablicos, la velocidad de
crecimiento permanece constante durante la fase logartmica y, es independiente de la
concentracin de sustrato en tanto que exista un exceso de este (Crueger & Crueger, 1993).
Desde una perspectiva industrial, es importante conocer las velocidades mximas de
crecimiento, que se relacionan tanto con el microorganismo como con varias de las
condiciones de la fermentacin. Esto sucede por ejemplo, con la composicin del medio de
fermentacin, ya que el microorganismo necesita energa adicional para degradar sustratos
con cadenas largas. La velocidad especfica de crecimiento para sustratos sencillos es mayor
que para molculas de cadenas largas (Crueger & Crueger, 1993).
Una de las formas de calcular la velocidad mxima de crecimiento es a travs de la ecuacin
de Monod, que describe la velocidad especfica de crecimiento , en funcin de tres parmetros:
la concentracin de sustrato limitante S, la velocidad de crecimiento mximo mx y una
constante especfica de cada sustrato KS, que equivale a la constante de Michaelis en cintica
enzimtica. Si existe un exceso de todos los sustratos, entonces =mx y el cultivo est en fase
logartmica. Por el contrario, si se ha agotado un sustrato pero est presente otro, puede existir
una segunda fase logartmica, con otra velocidad especfica de crecimiento (Crueger & Crueger,
1993).
Estas curvas, en las que se observan dos fases logartmicas separadas por una segunda
fase de latencia, representan un comportamiento diuxico. Esto es que, con sustratos
complejos, que contienen dos o ms fuentes de carbono, el microorganismo metaboliza en
 33

primera instancia su sustrato preferente, que es el de mayor rendimiento energtico y suele

ser glucosa, pero cuando esta se agota consume otros sustratos ms complejos. Para
metabolizar estos nuevos sustratos el microorganismo deber sintetizar un nuevo paquete
enzimtico durante una segunda fase de latencia (Crueger & Crueger, 1993).
En la siguiente fase, la estacionaria, todos los nutrientes esenciales han sido metabolizados
y se empiezan a generar sustancias txicas, que descienden o detienen por completo el
crecimiento microbiano (Scragg, 1996). Pero al mismo tiempo, debido a la lisis celular, se
liberan nuevos sustratos, carbohidratos y protenas, que pueden servir como fuente de energa
para el crecimiento lento de los sobrevivientes, as que en trminos globales la velocidad de
reproduccin es igual a la velocidad de muerte as que la tasa de crecimiento es cero (Shuler &
Kargi, 2002). Esta fase en algunos casos es de inters puesto que, los metabolitos formados
suelen ser de gran inters biotecnolgico (Crueger & Crueger, 1993).
Finalmente, cuando las reservas de energa se agotan y la concentracin de sustancias
txicas alcanza su concentracin mxima, las clulas empiezan a morir a velocidad exponencial
(Hernndez, 2003). Desde el punto de vista industrial y econmico, no es el inters mantener
una fermentacin hasta el punto de muerte, pues el tiempo se alarga considerablemente y el
rendimiento no aumenta o aumenta de manera insignificante. Debe anotarse adems que, el
tiempo entre la fase estacionaria y la fase de muerte dependen del organismo y de las
mltiples condiciones del proceso utilizado (Crueger & Crueger, 1993).
Muchas veces, la muerte de la levadura se da por la intoxicacin con el metabolito mismo,
por ejemplo, el etanol es txico para las clulas a tal punto que concentraciones superiores al
15 % conducen a la inactivacin de la mayora de los microorganismos (en el caso de la
levadura S. cerevisiae este lmite desciende a 10-13 %), pues el etanol es un inhibidor no
competitivo de la velocidad de crecimiento e inhibe el transporte de azcar, aminocidos y
otros compuestos lipdicos a la clula (Bentez & Codn, 2004). Algunos autores reportan
adems que el rendimiento se ve ms afectado por el decaimiento de los nutrientes (Bentez &
Codn, 2004). Tambin, algunas cepas de Saccharomyces secretan una toxina protenica
llamada zymocida, capaz de matar a las propias levaduras; la presencia de esta toxina est
determinada por plsmidos citoplasmticos localizados en el ARN (Rusell, 2003).
Es frecuente que las fermentaciones se clasifiquen de acuerdo con la dependencia de la
formacin del producto respecto al metabolismo energtico, como sigue:
 34

Tipo I: el producto que inclusive puede ser la propia biomasa deriva directamente
del metabolismo primario utilizado para la produccin de energa. El crecimiento o
tropofase, el catabolismo del carbohidrato y la formacin del producto o idiofase se
llevan a cabo casi en paralelo. Ejemplos de ello son la produccin de protena
unicelular, el etanol y el cido glucnico (Crueger & Crueger, 1993).

Tipo II: en este caso el producto deriva de una va secundaria separada del catabolismo
primario. En las fermentaciones de este tipo se produce un buen crecimiento
acompaado por alto consumo de sustrato y poca o ninguna formacin de producto.
Luego el crecimiento decrece y comienza la formacin de producto acompaado por
una alta velocidad de consumo de sustrato. La idiofase y la tropofase estn separadas
en el tiempo (Crueger & Crueger, 1993).

Tipo III: en estas fermentaciones el metabolismo primario y la formacin de producto

se producen en tiempos completamente separados. El producto no deriva del
catabolismo sino de vas anfiblicas. En este tipo de fermentacin opera primero el
metabolismo primario, acompaado por el consumo de sustrato y el crecimiento.
Despus se forma el producto mediante reacciones de metabolismo intermediario.
Muchos antibiticos y vitaminas son producidas por este tipo de fermentacin
(Crueger & Crueger, 1993).

Para el control del curso de la fermentacin es til realizar curvas que muestren la
variacin del contenido de slidos solubles (expresados como grados Brix), de azcares, de
etanol y del crecimiento celular con el tiempo, por lo que se precisa la toma de muestras con
frecuencia con el fin de estudiar la cintica de la fermentacin (Livermore et al., 2003; Rusell,
2003). La medicin de grados Brix indica la cantidad de slidos solubles disueltos y son una
variable fcil de medir y cuyo resultado es casi inmediato, por lo que su determinacin resulta
de particular importancia como una forma de monitoreo en tiempo real del curso de la
fermentacin (Rusell, 2003; Bentez & Codn, 2004; Thompson, 2004).
Livermore et al. (2003) sugieren tambin el monitoreo de la fermentacin mediante
anlisis de muestras en HPLC (High Pressure Liquid Chromatography), pues se obtienen
simultneamente las concentraciones de azcares, glicerol y etanol, pero algunas limitaciones
 35

de este equipo son que requiere alta capacitacin para su manejo, los accesorios son caros, se
requiere al menos 20 minutos para obtener los resultados del anlisis y nicamente se analiza
la fraccin soluble en agua y no la porcin que queda adherida a los slidos.
Para el seguimiento de la poblacin microbiana es usual recurrir al conteo empleando
cmaras de Petroff-Hauser o de Neubauer. Las mismas, diseadas para conteo de glbulos
rojos en sangre, constan de una cuadrcula con un volumen conocido, y al verlas al microscopio
es posible distinguir y cuantificar las levaduras. Este mtodo es rpido y sencillo, mas no
permite identificar clulas vivas inmviles de clulas muertas, excepto cuando se utiliza una
tincin con azul de metileno, pues en estos casos las clulas vivas reducen el azul de metileno
y se observan incoloras (Rusell, 2003).

3.4.4 Vas metablicas

Como se mencion anteriormente, la fermentacin es un proceso biotecnolgico en el que
se utilizan microorganismos para la produccin de derivados con valor agregado de inters
comercial (Kordylas, 1992). Particularmente, la fermentacin alcohlica donde se obtiene
etanol como derivado principal, ha cobrado suma importancia y ha sido objeto de
investigacin desde la antigedad, cuando en 1897 los hermanos Bchner descubrieron que
un extracto de levadura macerada convierte glucosa en etanol, hecho que demostr que
reacciones muy complejas ocurren en la clula (Gottschalk, 1986).
Las levaduras poseen la capacidad de metabolizar los azcares por la ruta aerbica en
presencia de oxgeno o cuando la concentracin inicial de los mismos es baja, bajo estas
condiciones se produce ms energa. Mientras que, cuando se remueve el oxgeno del medio o
la concentracin de azcares inicial es muy elevada, se presenta el metabolismo anaerobio y
es as como se da la fermentacin alcohlica (Rusell, 2003).
En las Figuras 3 y 4 se muestra un esquema simplificado de las vas aerbica y anaerbica.
 36

Figura 3. Metabolismo aerobio para el consumo de azcares y la produccin de etanol

 37

Figura 4. Metabolismo anaerobio para el consumo de azcares y la produccin de etanol

En ambas rutas, como se puede apreciar, el metabolismo inicia con el transporte de la

glucosa hacia el interior de la clula, donde se fosforila y pasa a ser glucosa-6-fosfato. De igual
forma, en ambos procesos, tanto en la respiracin como en la fermentacin, una cascada de
reacciones catalizadas a travs de mltiples complejos enzimticos degradan la glucosa a
piruvato, en una ruta denominada gliclisis o ruta de Embden-Meyerhof-Parnas, que pese a
 38

que fue descubierta en tejido muscular, ocurre en plantas, animales y muchos

microorganismos (Gottschalk, 1986).
Propiamente en la Figura 3 se puede ver que en la respiracin el piruvato es convertido a
acetil coenzima CoA por el complejo piruvato deshidrogenasa, tras esta conversin el acetil
coenzima A puede ingresar a la mitocondria para el ciclo de los cidos tricarboxlicos o ciclo de
Krebs (Gottschalk, 1986).
En este ciclo conformado por una serie de reacciones, se lleva a cabo la oxidacin
completa del acetil CoA a dixido de carbono y agua, con la transferencia de equivalentes de
NAD+, NADP+ y FAD. En resumen, la reaccin global para la oxidacin de glucosa es la
siguiente (Gottschalk, 1986):

(Ecuacin 1)
En tanto que en la Figura 4 se muestra la ruta fermentativa, en la que el piruvato es
decarboxilado a acetaldehdo por la piruvato decarboxilasa, que puede considerarse la enzima
clave de la fermentacin alcohlica. Como no hay un aceptor externo de electrones como el
oxgeno, las reacciones que consumen y producen NADH se deben balancear y la formacin de
NADH es evitada en anaerobiosis. La ecuacin global de la fermentacin se presenta
seguidamente (Gottschalk, 1986; Rusell, 2003).
(Ecuacin 2)

Cabe recalcar que, pese a que anteriormente se hizo referencia al mecanismo de

produccin de energa a partir de glucosa, la fructosa tambin es un excelente sustrato para el
crecimiento de muchos microorganismos, este azcar ingresa a la clula mediante un
complejo enzimtico y sigue la gliclisis de la misma forma que lo hace la glucosa. Lo mismo
sucede con la sacarosa, en este caso una enzima invertasa es la responsable de desdoblar la
molcula en sus correspondientes monosacridos para que estos sean metabolizados como ya
se indic (Gottschalk, 1986).
El rendimiento terico de la fermentacin alcohlica es de 51 %, esto es, que se producen
51 g de etanol a partir de 100 g de glucosa. Sin embargo, en la prctica cerca de un 10 % de la
glucosa se destina para la produccin de biomasa, as que se alcanza como mximo un 90 %
del rendimiento terico. Adems, otros factores como la capacidad industrial de la levadura y
 39

la pureza de la materia prima inicial, tambin pueden influir en el rendimiento mximo que se
logre en una fermentacin (Crueger & Crueger, 1993; Thompson, 2004; Miranda, 2007).

3.4.5 Saccharomyces cerevisiae

La levadura Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo anaerobio facultativo, lo que
significa que es capaz de crecer en ausencia o presencia de oxgeno. En condiciones de
aerobiosis parte del sustrato es oxidado hasta CO2 y O2, en un metabolismo exergnico para la
sntesis celular que produce gran cantidad de energa en forma de ATP (Gottschalk, 1986).
Por otra parte, cuando las levaduras son transferidas de un medio con condiciones
aerobias a otro con condiciones anaerobias, se incrementa la velocidad de rompimiento de la
glucosa en un factor de tres a cuatro, y la va metablica que prevalece es la anaerobia, que
aporta menor cantidad de energa a la clula, pero le permite subsistir a pesar de la ausencia
de oxgeno. A este comportamiento se le llama efecto Pasteur y por este, en fermentaciones
alcohlicas se modifican los parmetros de aireacin, de aerobiosis a anaerobiosis, con el fin
de favorecer la reproduccin celular en las etapas iniciales del proceso y luego, someter las
levaduras a fermentacin alcohlica inducida (Gottschalk, 1986).
Otro efecto interesante que se ha encontrado en levaduras es que, an en condiciones
aerobias siguen la ruta fermentativa, siempre que la concentracin de glucosa o azcares en el
medio sea bastante alta. A este particularmente se le conoce como efecto Crabtree
(Gottschalk, 1986).

3.5 Equipo y variables del proceso

La fermentacin es un proceso complejo y como tal, su xito est condicionado a muchos
factores, que afectan la eficiencia y el rendimiento, como la temperatura, concentracin de
azcares, presencia de nutrientes, presin osmtica, agitacin, aireacin, pH, nivel de
inoculacin inicial del microorganismo y cepa utilizada (Bentez & Codn, 2004; Thompson,
2004; Araya, 2010).

3.5.1 Cepa empleada

La cepa, adems de satisfacer los requerimientos de un microorganismo de uso industrial,
debe ser efectiva en la liberacin de un solo producto, encontrarse cultivos aislados y puros,
 40

debe ser fcil de mantener y cultivar y ms recientemente, se ha puesto especial inters en

emplear microorganismos que requieran un medio de cultivo con pocas exigencias
nutricionales, y que por tanto, puedan utilizarse con desechos agroindustriales (Araya, 2010).

3.5.2 Temperatura
Esta variable afecta tanto el crecimiento de la levadura como la produccin de etanol, as
que debe escogerse una apropiada para conseguir el mximo crecimiento por una parte y la
mxima formacin del producto por otra. Las fermentaciones se llevan a cabo en el rango
mesfilo (20-45 C) y en el caso de la fermentacin con S. cerevisiae la temperatura ptima
para el crecimiento celular es de 29 C, en tanto que para la produccin de etanol la ptima es
de 31 C (Crueger & Crueger, 1993; Melndez, 2002; Miranda, 2007).

3.5.3 pH
El pH del mosto debe ajustarse entre 4,0 y 4,8, pues as se favorece el crecimiento de las
levaduras y al mismo tiempo, se inhiben muchas bacterias que pueden entorpecer el proceso
(Melndez, 2002; Miranda, 2007).

3.5.4 Concentracin de azcares en el sustrato

Una concentracin de glucosa mayor a 150 g/L por lo general, inhibe el funcionamiento de
las enzimas responsables de la fermentacin alcohlica, debido a inhibicin por sustrato, sin
embargo esto depende de la cepa empleada, pues algunas son ms tolerantes a altas
presiones osmticas y soportan concentraciones de hasta 200 g/L. A concentraciones entre 3 y
100 g/L, la glucosa inhibe la respiracin aerbica y se sigue la ruta anaerobia, de produccin de
etanol, gracias al efecto Crabtree, mientras que, a concentraciones inferiores a 2 g/L el
metabolismo predominante es el aerobio (Melndez, 2002; Miranda, 2007).
Se puede decir que en el mbito entre 3 y 100 g/L, el sustrato funciona como inductor, as
que dentro de este rango, al aumentar la concentracin del sustrato aumenta la concentracin
de las enzimas necesarias para la fermentacin y su consecuente formacin de etanol
(Gottschalk, 1986).
 41

3.5.5 Concentracin de etanol producido

El etanol es inhibitorio a altas concentraciones y la tolerancia al alcohol de las levaduras es
crtica para obtener rendimientos altos. A medida que aumenta la concentracin de etanol, se
inhibe tanto la velocidad de crecimiento como la propia biosntesis del mismo, ya que se trata
de un inhibidor no competitivo. Sin embargo, los microorganismos son ms sensibles al etanol
producido endgenamente que al que se aade exteriormente al sistema de fermentacin. El
crecimiento generalmente cesa al 5 % de etanol y la velocidad de produccin se reduce a cero
a concentraciones superiores al 10 %, aunque se han encontrado mutantes tolerantes al
etanol que pueden producir 12-13 % de etanol y que estn siendo estudiados a mayor escala
para su produccin (Crueger & Crueger, 1993).
Este tipo de inhibicin se conoce como represin por producto final, adems, otros
metabolitos secundarios tambin pueden afectar el crecimiento celular y la produccin de
etanol, como el cido lctico y el actico (Maiorella, 1985; Gottschalk, 1986).
Es interesante que la accin inhibitoria del alcohol es proporcional al tamao de la
molcula. Por ejemplo, para inhibir la fermentacin de glucosa se requiere un 20 % de
metanol, 16 % de etanol, 10 % de propanol, 2,5 % de butanol y apenas 1 % de alcohol amlico
(Melndez, 2002; Miranda, 2007).

3.5.6 Presin osmtica

Conforme aumenta la presin osmtica del medio de fermentacin, disminuye la tasa de
fermentacin y el crecimiento de levaduras, hasta el punto que la fermentacin se detiene o
resulta en un aumento en la produccin de glicerol, como respuesta para contrarrestar los
efectos del estrs osmtico y para mantener la turgencia celular (DAmore et al., 1988;
Thomas et al., 1994; Buescher et al., 2001)
El glicerol es un triol soluble en agua, no txico que es producido principalmente por la
levadura S. cerevisiae. En este microorganismo, el glicerol cumple un importante papel
combatiendo el estrs osmtico, regulando los niveles de fosfato citoslico y manteniendo el
balance redox NAD+/NADH. La produccin de glicerol se ve favorecida a altas temperaturas y
valores de pH, con una elevada concentracin de azcares en el medio y en los medios que no
se suplementan o que carecen de nutrientes (Scanes et al., 1998).
 42

Con concentraciones ms elevadas de levadura en el caldo de fermentacin (ms de 1x10 8

lev/mL) se han encontrado mayores niveles de glicerol en hasta un 10-20 %, en comparacin
con los caldos donde se coloc un inculo 100 veces menor (Scanes et al., 1998)
A la vez, la composicin del medio incide directamente sobre la habilidad de las levaduras
para llevar a cabo la fermentacin en sustratos con alta presin osmtica. Con tales fines es
til la adicin de nutrientes como extracto de peptona-levadura, sales de magnesio y potasio,
adems la adicin de algunos osmoprotectores como prolina, glicina y betana, as como
materiales particulados, mejoran la viabilidad celular y las tasas de consumo de azcares y de
produccin de etanol en medios concentrados (DAmore et al., 1990; Thomas et al., 1994).

3.5.7 Aireacin, presin y agitacin

Los sistemas discontinuos para la produccin de etanol inician en condiciones aerbicas
para favorecer la reproduccin del microorganismo, ya que si las condiciones anaerobias
comienzan apresuradamente, la poblacin no ser lo suficientemente alta para obtener una
buena velocidad de conversin. El punto ptimo inicial para estimular la tasa de reaccin y el
crecimiento de la levadura es 0,07 mm Hg (Crueger & Crueger, 1993; Melndez, 2002;
Miranda, 2007).
La velocidad de dicha aireacin debe ser ajustada segn la cantidad de oxgeno requerida y
se recomienda un flujo de 0,25-1,00 vvm (volumen de aire/volumen de lquido por minuto)
(Crueger & Crueger, 1993).
En cuanto a la presin, con el fin de minimizar el riesgo de contaminacin, se utiliza una
sobrepresin de 150-375 mm Hg en el medio. La presin hidrosttica tambin debe tomarse
en cuenta en los fermentadores grandes, ya que influye en la solubilidad del O2 y el CO2 del
medio de fermentacin enriquecido. A la vez, la produccin de gases durante la fermentacin,
altera la presin del sistema, de ah que en algunos casos no es recomendable utilizar los
bioreactores al mximo de capacidad (Crueger & Crueger, 1993).
En lo que respecta a la agitacin, es deseable la instalacin de un sistema continuo, que
favorezca el contacto de los sustratos con el microorganismo (Crueger & Crueger, 1993).
 43

3.5.8 Nivel de inoculacin

Una cantidad adecuada de inculo asegura la conversin eficiente de todo el azcar,
mejora la eficiencia del proceso, reduce costos, garantiza un bajo nivel de contaminacin e
influye en la mxima densidad celular que se alcanza al final de la fase exponencial de
crecimiento (Lallemand, 2002).
Normalmente se inocula la levadura acondicionada para dar una concentracin entre 0,12
y 0,25 g levadura seca/litro mosto (5 x 106 a 2 x 107 clulas viables/L). La levadura seca activa
que se utiliza en plantas de alcohol combustible y de destilacin en tasas de inoculacin
recomendadas entre 1,0 y 2,0 x 106 clulas viables/ Brix de mosto. Adems, cuando los
carbohidratos del sustrato superen los 25 Brix, es recomendable un aumento en la tasa de
inoculacin a 0,35 g/L, lo que equivale a una concentracin de 2,8 x107 (Russell, 2003).

3.5.9 Modalidad de fermentacin

El proceso de fermentacin puede realizarse bajo distintas modalidades, siendo que la
fermentacin puede ser continua, por lote o semi-continua.
Una fermentacin discontinua, por lote, puede ser considerada como un sistema cerrado,
en el que no hay flujos de entrada ni salida. Al inicio una solucin estril del mosto con
nutrientes se inocula con el microorganismo y durante toda la fermentacin lo nico que se
aade es oxgeno en forma de aire, un agente antiespumante y cido o base para controlar el
pH, pero la composicin del medio de cultivo, la concentracin de la biomasa y la
concentracin de metabolitos cambia nicamente como resultado del metabolismo de las
clulas (Araya, 2010; Crueger & Crueger, 1993).
En las fermentaciones continuas el sistema es abierto, es decir, existen flujos de entrada y
de salida, pero el volumen del bioreactor se mantiene constante. El ambiente externo al
microorganismo se mantiene controlado e invariable de manera que se controla mejor la
velocidad de crecimiento, razn por la cual se obtienen concentraciones ms altas del
producto de inters en comparacin con una fermentacin por lote (Araya, 2010).
Una alternativa intermedia entre ambos tipos de fermentaciones es la semi-continua
comnmente denominada fed-batch o lote alimentado. En esta, se repiten de manera sucesiva
varios procesos batch, mediante la sustitucin de sustrato fermentado por nuevo sustrato
 44

estril. El microorganismo se reutiliza en disolucin o bien, se puede inmovilizar en una matriz

(Araya, 2010).
A escala industrial, las fermentaciones por lote son las que se utilizan ms, debido a que
permiten tener un mejor control sobre todos los factores que afectan el proceso, y a la vez,
presentan mejores rendimientos globales, pues todo el sustrato es consumido, mientras que
en una continua siempre queda una concentracin residual de sustrato. (Araya, 2010).
Sin embargo, la seleccin de una u otra forma de fermentacin no es sencilla. La
evaluacin de los costos asociados y la factibilidad econmica de un proceso fermentativo
depende de muchos factores, como el tiempo de produccin de la fermentacin, el tiempo
requerido para limpiar y poner a punto el fermentador, el tiempo de esterilizacin y la
duracin de la fase de latencia. Tambin, el detener la fermentacin al tiempo de la
productividad mxima o ms tarde, depender de los costos de operacin, que incluyen la
energa, gastos generales, costes de mano de obra, gastos en personal y la capacidad del
sistema (Crueger & Crueger, 1993).
 45

4. Materiales y Mtodos

Debido al inters comercial que existe en el proyecto, algunos caracteres se codificaron

con el fin de mantener la confidencialidad de los resultados, de manera que en el Cuadro VI se
detalla la codificacin empleada.

Cuadro VI. Descripcin de la codificacin asignada al proyecto

Cdigo Descripcin
Enzima 1 Preparado comercial con actividad -amilasa
Preparados Enzima 2 Enzima con actividad glucoamilasa
enzimticos Coctel enzimtico con actividad pectinasa y
Enzima 3
celulasa
Jugo de banano obtenido del prensado y
clarificacin de residuo de pur de banano
Jugo A
tratado enzimticamente, mayor contenido de
slidos insolubles que el jugo B
Jugos
Jugo de banano comercial y concentrado (70-
72 Brix), diluido para el momento de la
Jugo B
fermentacin, menor contenido de slidos
insolubles
Nutriente 1 Fuente de protena y vitaminas
Enriquecimiento
Nutriente 2 Aporta fsforo y nitrgeno
del medio de
Nutriente 3 Fuente de nitrgeno
cultivo
Nutriente 4 Fuente de magnesio

4.1 Localizacin del trabajo

La fase experimental se desarroll en los laboratorios del Centro de Investigaciones en

Productos Naturales (CIPRONA). Adems se efectuaron algunas pruebas en los laboratorios de
Qumica y Microbiologa de la Escuela de Tecnologa de Alimentos, as como en la plata piloto
 46

del Centro Nacional de Investigacin en Tecnologa de Alimentos (CITA), todos situados en la

Ciudad de la Investigacin de la Universidad de Costa Rica, Sede Rodrigo Facio.
Las pruebas de fermentacin a nivel de bioreactor se realizaron en el Centro Nacional de
Innovaciones Biotecnolgicas (CENIBiot) ubicado en el edificio Dr. Franklin Chang Daz, en
Pavas.

4.2 Materiales

4.2.1 Materia Prima

Se utiliz pulpa de banano obtenida como subproducto del proceso de elaboracin del
pur de banano, esto es el residuo procedente de la remocin de la semilla de dicho fruto.
Este pur se utiliz para el tratamiento enzimtico y adems se proces para obtener jugo de
banano que se utiliz como medio de cultivo para la fermentacin (jugo A). Adems se utiliz
jugo de banano comercial concentrado proveniente de otra empresa nacional para el proceso
de fermentacin (jugo B).

4.2.2 Enzimas

Se emplearon tres enzimas comerciales para los tratamientos de sacarificacin y

licuefaccin de la pulpa de banano, con accin -amilasa, glucoamilasa, pectinasa y celulasa.
Enzima 1 (Bacillus licheniformis). Enzima de tipo -amilasa, con una actividad
reportada por la casa comercial de 300 KNU/g. 1 KNU corresponde a la cantidad de la
enzima que hidroliza 5,26 g de almidn soluble por hora a 37 C y pH=5,6.
Enzima 2 (Aspergillus niger). Enzima glucoamilasa, con una actividad reportada de 400
AGU/g. 1 AGU (unidad de amiloglucosidasa) es la cantidad de enzima que a
condiciones estndar de enzima hidroliza un micromol de maltosa por minuto a 25 C
y con un pH de 4,3.
Enzima 3 (Aspergillus niger y Trichoderma reesei). Enzima con un amplio espectro de
actividad pectinoltica y celulsica, de hasta 3 400 FDU20/mL, donde 1 FDU
corresponde a la cantidad de enzima que depolimeriza 33,3 mL de jugo estndar que
contiene 0,4 g/L de pectina a un pH de 3,5 y una temperatura de 20 C.
 47

4.2.3 Microorganismo para la fermentacin

Saccharomyces cerevisiae: cultivo Superstart procedente de Lallemand, Canad.

Levadura seca activa utilizada para fermentaciones alcohlicas para bebidas y
bioetanol. Es una selecta cepa de Saccharomyces muy estable y tolerante a altas
concentraciones de alcohol (Lallemand, s.a.).

4.3 Metodologa

4.3.1 Caracterizacin fsica y qumica del residuo de pur

La Figura 5 que se muestra a continuacin esquematiza las distintas pruebas fsicas y

qumicas que se realizaron sobre el pur de banano inicial, para la produccin de bioetanol
mediante la ruta fermentativa.

Humedad

Cenizas
Celulosa y hemicelulosa
en MIAA
Azcares
totales
Lignina en MIAA

Slidos solubles

Material insoluble en
alcohol y agua pH y acidez

Material insoluble en
alcohol

Figura 5. Pruebas de caracterizacin fsica y qumica del residuo de pur de banano previo al
tratamiento enzimtico y la fermentacin.

Cada parmetro se determin por triplicado para cada uno de los lotes analizados, de
modo que se report el dato con su respectivo intervalo de confianza al 95 %, los
procedimientos utilizados se detallan a continuacin.
 48

4.3.1.1 Humedad
El mtodo que se emple para la determinacin de humedad es el 920.151 de la AOAC
(2005) y acreditado en el Laboratorio de Qumica del CITA (2009a) por el Ente de Acreditacin
Costarricense (ECA), segn norma INTE-ISO/IEC 17 025.

4.3.1.2 Cenizas
Para la determinacin de cenizas se sigui el mtodo 940.26 de la AOAC (2005) y
acreditado en el Laboratorio de Qumica del CITA (2009b) por el Ente de Acreditacin
Costarricense (ECA), segn norma INTE-ISO/IEC 17 025.

4.3.1.3 Concentracin de azcares totales, expresados como la suma de glucosa, fructosa y

sacarosa
Se consideraron los azcares totales como la suma de glucosa, fructosa y sacarosa. Para
su determinacin se utiliz la tcnica de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), con el
mtodo desarrollado en el CIPRONA por Arce (2004). El cromatgrafo es marca Merck Hitachi
(bomba modelo L-6200A, detector de ndice de refraccin modelo 2414, graficador modelo D-
2500A) y con un detector de ndice de refraccin. El anlisis se realiz utilizando una columna
Aminex HPX 87C, una temperatura de 85 C, agua destilada como fase mvil y un flujo de 0,6
mL/min.

4.3.1.4 Slidos solubles expresados como grados Brix

Se emple un refractmetro manual, marca Atago, modelo 8678, con rango de medicin
de 0-90 Brix, basado en el mtodo AOAC 932.12 (1990). Se utiliz la modificacin propuesta
por Thompson (2004) en la que se centrifugaron aproximadamente 30 g de pur durante 30
minutos a 3000 rpm, para que las dos fases se separaran fcilmente por decantacin.
Posteriormente se coloc una gota del lquido supernatante en el visor del refractmetro.

4.3.1.5 Slidos solubles por gravimetra

Se utiliz una modificacin del mtodo de humedad citado en 3.3.1.1, pero aplicado a una
alcuota del lquido supernatante proveniente de la centrifugacin del pur de banano fresco,
el cual corresponde al mtodo 930.35 de la AOAC (1990), aplicado en vinagres para la
determinacin del residuo seco.
 49

4.3.1.6 pH
Para la determinacin de pH se hizo uso de un pH-metro previamente calibrado. Se
sumergi el electrodo en el pur de banano hasta obtener una lectura estable del valor de pH,
de acuerdo con el procedimiento aprobado en el Laboratorio de Qumica del CITA (2009c), por
el Ente de Acreditacin Costarricense (ECA), segn la norma INTE-ISO/IEC 17 025.

4.3.1.7 Acidez titulable

Para la determinacin de acidez titulable se utiliz el mtodo 942.15 de la AOAC, en el
que se valor el cido de la muestra utilizando NaOH patrn y fenolftalena como indicador.
Adems para la preparacin de la muestra de pur se utiliz el mtodo 921.25, igualmente de
la AOAC.

4.3.1.8 Material insoluble en alcohol (MIA)

Se bas en el mtodo propuesto por Milln (2001); con las modificaciones detalladas en el
Anexo A de acuerdo con el sustrato en cuestin.

4.3.1.9 Material insoluble en agua y alcohol (MIAA)

Se sigui el procedimiento utilizado por Cozzano (2007), el cual est basado en el mtodo
de Brillouet et al (1988); con las respectivas adecuaciones para el pur de banano que se
detallan en el Anexo A.

4.3.1.10 Determinacin de lignina extrada del MIAA

Para la determinacin de lignina en el material insoluble en agua y alcohol se utiliz el
procedimiento descrito por Effland (1977), efectuando algunos ajustes al tratarse de pulpa de
banano que se muestran en el Anexo A.

4.3.1.11 Celulosa y hemicelulosa extrada del MIAA

La cuantificacin de celulosa y hemicelulosa en el material insoluble en agua y alcohol se
realiz segn la metodologa descrita por Van Soest et al. (1981). De igual manera que en los
casos anteriores, el procedimiento detallado se encuentra en el Anexo A con los respectivos
cambios para la pulpa de banano en cuestin.
 50

4.3.2 Caracterizacin fsica y qumica del jugo de banano A y B

La Figura 6 esquematiza las pruebas de caracterizacin que se efectuaron al jugo de

banano para ser utilizado como sustrato en la fermentacin alcohlica con Saccharomyces
cerevisiae. Estas pruebas se realizaron tanto para el jugo extrado a partir del pur de banano
Jugo A-, como para el jugo B.

Humedad

pH Cenizas

Azcares
Acidez totales

Slidos
solubles

Figura 6. Pruebas de caracterizacin fsica y qumica del jugo de banano previo a la

fermentacin

De igual manera que para la caracterizacin del residuo de pur de banano, para el jugo
cada parmetro citado se determin por triplicado, de modo que se reporta el dato con su
respectivo intervalo de confianza al 95 % obtenido a partir de las rplicas realizadas.
Seguidamente en el Cuadro VII se resumen los mtodos utilizados para la caracterizacin
fsica y qumica del pur de banano.
 51

Cuadro VII. Sntesis de los principales mtodos utilizados para la caracterizacin fsica y
qumica del pur
Determinacin Abreviatura Mtodo Materiales Unidad Referencia

Medicin de la prdida de AOAC (2005)

Estufa de vaco a
Humedad masa por evaporacin de % CITA a
70 C
agua en estufa al vaco (2009)

Cuantificacin del residuo

AOAC (2005)
inorgnico resultante de la
Cenizas Mufla % CITA b
incineracin de la muestra a
(2009)
550 C
Cromatgrafo
Hitachi, detector
Glucosa, Identificacin y cuantificacin
de ndice de
fructosa y por cromatografa lquida de g/L Arce, 2004
refraccin,
sacarosa alta resolucin (HPLC)
columna Aminex
HPX 87C
Refractmetro
Slidos solubles Brix Refractometra Brix AOAC (1990)
manual
Determinacin gravimtrica
Slidos solubles de los slidos solubles en el
Estufa % AOAC (1990)
por gravimetra lquido supernatante de pur
de banano centrifugado
Deteccin de la acidez del
CITA c
pH pH medio con un electrodo de pH-metro
(2009)
vidrio
Cuantificacin de la acidez,
Bomba de vaco, g
expresada como cido ctrico,
Acidez Acidez bureta, base c.ctrico/ AOAC (2005)
mediante la valoracin con
patrn 100 mL
NaOH
Material Lavado del pur con etanol
Filtro Bchner, Milln
insoluble en MIA anhidro/ etanol 80%/ %
bomba de vaco (2001)
alcohol acetona y secado con ter
Cozzano
Material (2007)
Lavado con agua destilada a Filtro Bchner,
insoluble en MIAA % Brillouet et
4 C bomba de vaco
alcohol y agua al
(1988)
Remocin de glicsidos del
Effland
Lignina en MIAA MIAA con H2SO4 recuperando Autoclave %
(1977)
la lignina insoluble
Celulosa y Tratamiento de MIAA con Van Soest et
%
hemicelulosa detergente neutro y cido al. (1981)
 52

4.3.3 Pretratamiento de la materia prima (residuo de pur de banano y jugo concentrado de

banano)

4.3.3.1 Residuo de pur de banano

Todo el residuo de pur a utilizar se homogeneiz mediante mezclado manual antes de
efectuar las pruebas correspondientes. Posterior a ello se congel en bolsas pequeas
individuales, de modo que se descongelaron paulatinamente las porciones requeridas durante
el transcurso de la parte experimental.
Asimismo, segn lo obtenido por Thompson (2004), se efectu la esterilizacin antes del
proceso de enzimacin y fermentacin. As, el residuo de pulpa de banano se esteriliz a 121
C por 30 minutos en autoclave.
Dado la consistencia compleja del pur de banano al ser un fluido no newtoniano, para el
manejo y anlisis del MIA, MIAA, pectina soluble, celulosa y hemicelulosa as como lignina, fue
necesario llevar a cabo un paso previo de liofilizacin del pur, pues de este modo el
resultante es un polvo cuya manipulacin se simplifica considerablemente. Este procedimiento
se llev a cabo en el liofilizador Labconco FreeZone 12, disponible en el CIPRONA.
Adems se realizaron varias operaciones unitarias, como centrifugacin, prensado y
clarificacin centrfuga, para la extraccin del jarabe azucarado a partir del pur de banano,
jugo que se emple posteriormente como medio para la fermentacin alcohlica utilizando S.
cerevisiae. Las condiciones de operacin para la extraccin del jugo, se detallan
posteriormente.

4.3.3.2 Jugo de banano B

El jugo de banano B se congel hasta el momento de su uso, en baldes de
aproximadamente 20 L. Esta materia prima se encontraba concentrada a 70-72 Brix, de
manera que para el momento de su uso se diluy hasta alcanzar cerca de 17 Brix y se
pasteuriz a 72 C por 15 minutos, en una marmita, marca Groen, modelo TA-10-SP.
 53

4.3.4 Establecimiento de las condiciones para la mxima liberacin de azcares fermentables

de la pulpa de banano

La liberacin de los azcares fermentables se llev a cabo por va enzimtica con la

utilizacin de los preparados enzimticos 1, 2 y 3.

4.3.4.1 Produccin de dextrinas y oligosacridos a partir del almidn presente en el pur de

banano
Esta etapa se llev a cabo por tratamiento enzimtico del pur con la enzima 1. Esta es
una enzima de tipo -amilasa que cataliza la degradacin del almidn presente en la pulpa de
banano, hasta convertirse en dextrinas y otros oligosacridos menores, lo que produce un
aumento en los slidos solubles y azcares fermentables, pues paralelamente se liberan
algunas unidades de glucosa terminales.
Para establecer estas condiciones de utilizacin se efectuaron ensayos por triplicado en
los que se coloc la concentracin de enzima especificada en el Cuadro VIII en Erlenmeyers
plsticos de Nalgene de 250 mL, provistos con tapa de rosca, con un contenido cercano a 75,0
g de pur de banano fresco descongelado y estril. La enzima se diluy en 5,00 mL de CaCl2 al
1%. Luego de colocar la enzima, se incub segn el tiempo especificado en el diseo
experimental y se mantuvo a temperatura y agitacin constante por oscilacin en bao de
glicerina, provisto con controles para regular la temperatura y la velocidad de agitacin.
Una vez finalizado el tiempo de tratamiento, los Erlenmeyers se sumergieron en agua con
hielo con el fin de suspender el efecto de la enzima. Esto resulta de particular importancia
dado que una de las variables que se est considerando es el tiempo de incubacin, de manera
que no suspenderla podra introducir errores en los resultados y por ende, en la escogencia del
tratamiento.
El diseo experimental, que se detalla en el Cuadro VIII, consiste en un modelo 22, donde
los factores considerados fueron el tiempo de incubacin y la concentracin del preparado
enzimtico, pero a la vez, los resultados obtenidos se compararon contra el pur de banano
inicial, sin el tratamiento con la enzima 1, por lo que finalmente, se evaluaron cinco
tratamientos. Por otra parte, la temperatura se mantuvo constante en 95 C y el pH natural del
pur de banano.
 54

Los niveles de los factores se eligieron segn resultados de trabajos previos de

investigacin en el CIPRONA y en la ficha tcnica del producto (Novozymes, 2004a; Hernndez,
2010).

Cuadro VIII. Diseo experimental para establecer las condiciones de tratamiento del pur de
banano con la enzima 1
Concentracin de Parmetros fijos
Tratamiento Tiempo (min)
enzima (mg/kg)
1 300 30 Temperatura: 95 C
2 300 90 pH: Natural del pur de banano
3 360 30 Agitacin: 200 rpm
4 360 90
Pur de banano inicial,
5 0 0 esterilizado, sin maceracin
enzimtica

Las variables respuesta del diseo factorial consideradas fueron la concentracin de

azcares fermentables (glucosa, fructosa y sacarosa expresados como azcares totales),
slidos solubles (expresados tanto gravimtricamente como en grados Brix). Los resultados
obtenidos a partir del diseo experimental propuesto se analizaron a travs de un ANDEVA
utilizando para ello el programa JMP versin 5.1 de SAS, en los casos en que la probabilidad de
cometer error tipo 1 fue menor de 0,05 se consideraron las diferencias entre tratamientos
como significativas y se procedi a realizar una prueba de Tukey con un 95 % de confianza para
determinar especficamente qu tratamientos eran diferentes.
De tal manera se seleccionaron las condiciones de tiempo y concentracin de enzima, que
brindaron la mayor concentracin de azcares fermentables para aumentar la productividad
de etanol durante la fermentacin.

4.3.4.2 Produccin de azcares fermentables a partir de dextrinas del pur de banano

Esta etapa es conocida como sacarificacin y se llev a cabo por tratamiento enzimtico
con la enzima 2, una vez que se seleccion el tratamiento con la enzima 1. La enzima 2
presenta actividad del tipo glucoamilasa que libera unidades de dextrosa o glucosa a partir de
 55

dextrinas u oligosacridos menores, los cuales provienen de la actividad previa de la enzima 1.

Con ello, aumenta los azcares fermentables totales presentes en el pur de banano.
La metodologa que se emple se detalla en el apartado 4.3.4.1., pero consisti en
adicionar la enzima 1 en la concentracin y tiempo seleccionados, en Erlenmeyers plsticos de
Nalgene de 1 L, provistos con tapa de rosca, con un contenido cercano a 750 g de pur de
banano fresco, descongelado, estril e inoculado con la enzima. Esta se dej actuar por el
tiempo seleccionado, durante el cual se mantuvo el control de temperatura y agitacin.
Al trmino del tratamiento con la enzima 1, los Erlenmeyers se sumergieron en agua con
hielo para suspender la accin de la enzima. Luego, el pur de banano se mezcl manualmente
y se subdividi en porciones que se inocularon con la concentracin correspondiente para el
diseo experimental con la enzima 2: 560 y 840 mg/kg.
De igual manera, las porciones de pur de aproximadamente 75 g se incubaron en
Erlenmeyers de Nalgeno de 250 mL y la enzima se dej actuar durante los tiempos descritos
en el Cuadro IX, en un agitador orbital con control de temperatura y agitacin. Luego de
concluido el tratamiento, la enzima se inactiv esta vez con un aumento de la temperatura a
75 C por 15 min.
El diseo experimental se muestra en el Cuadro IX, y contempla dos factores con dos
niveles cada uno (22), donde los factores son el tiempo de incubacin y la concentracin de la
enzima, sin embargo, los resultados obtenidos se compararon con los del pur sin tratamiento
con la enzima 2 (pur nicamente tratado con la enzima 1), por lo que finalmente se
compararon cinco tratamientos. La temperatura se mantuvo constante en 50 C y el pH
natural del pur de banano.
De igual manera que en el apartado anterior, los niveles de los factores se eligieron segn
resultados de trabajos previos de investigacin en el CIPRONA y en la ficha tcnica dada por el
fabricante para el uso adecuado del producto (Novozymes, 2005; Hernndez, 2010).
 56

Cuadro IX. Diseo experimental para establecer las condiciones de tratamiento del pur de
banano con la enzima 2
Concentracin de Parmetros fijos
Tratamiento Tiempo (horas)
enzima (mg/kg)
1 560 24 Temperatura: 52 C
2 560 48 pH: Natural del pur
3 840 24 de banano
Agitacin: 160 rpm
4 840 48
Pur tratado con
5 0 0 enzima 1, 300 mg/kg,
30 minutos

Las variables respuesta fueron la concentracin de azcares fermentables (glucosa,

fructosa y sacarosa expresados como azcares totales), slidos solubles medidos tanto
gravimtricamente as como expresados como grados Brix. Los resultados se analizaron a
travs de un ANDEVA con el programa JMP versin 5.1 de SAS, en los casos en que la
probabilidad de cometer error tipo 1 fue menor de 0,05 se consideraron las diferencias entre
tratamientos como significativas y se procedi a realizar una prueba de Tukey con un 95 % de
confianza para determinar especficamente qu tratamientos eran diferentes.

4.3.4.3 Degradacin de pectinas y celulosa presentes en el pur de banano

Como se mencion con anterioridad, el coctel de la Enzima 3 consiste de un preparado
de pectinasas y celulasas, de modo que degradan las pectinas y la celulosa hasta liberar cido
D-galacturnico y D-glucosa. Por consiguiente, su efecto se resume en un aumento en la
concentracin de azcares fermentables y una consecuente disminucin de la viscosidad.
Para establecer estas condiciones de utilizacin se efectuaron ensayos por triplicado
como se describe en el apartado 4.3.4.1. Luego de colocar la enzima se incub segn el tiempo
especificado en el diseo experimental (que se detalla en el Cuadro X) y se mantuvo a
temperatura y agitacin constante en bao de glicerina, provisto con controles para regular la
temperatura y la velocidad de agitacin. Luego de finalizado el tiempo de tratamiento, los
matraces Erlenmeyers se sumergieron en agua con hielo con el fin de suspender el efecto de la
enzima.
 57

Se aplic un diseo factorial 2x2, donde los factores considerados fueron el tiempo de
tratamiento y la concentracin del preparado enzimtico y a la vez, los resultados obtenidos
tras el tratamiento enzimtico con la enzima 3 se compararon con los datos reportados para el
pur sin esta enzima, por lo que finalmente se compararon cinco tratamientos. En tanto que la
temperatura fue constante de 52 C y el pH natural del pur de banano. Los niveles de los
factores se eligieron segn los valores recomendados en la ficha tcnica (Novozymes, 2002).
Para el caso de concentracin del preparado enzimtico los dos niveles fueron 240 y 360
mg/kg, mientras que para el tiempo de tratamiento los dos niveles correspondieron a 60 y 120
minutos.

Cuadro X. Diseo experimental para establecer las condiciones de tratamiento del pur de
banano con la enzima 3
Concentracin de Parmetros fijos
Tratamiento Tiempo (min)
enzima (mg/kg)
1 240 60 Temperatura: 52 C
2 240 120 pH: Natural del pur
3 360 60 de banano
Agitacin: 160 rpm
4 360 120
Pur tratado con
5 0 0 enzima 2, 560 mg/kg,
24 horas

Las variables respuesta del diseo factorial consideradas fueron la concentracin de

azcares fermentables (glucosa, fructosa y sacarosa expresados como azcares totales),
slidos solubles (expresados tanto gravimtricamente como en grados Brix). Los resultados
obtenidos a partir del diseo experimental propuesto se analizaron a travs de un ANDEVA
utilizando para ello el programa JMP versin 5.1 de SAS, en los casos en que la probabilidad de
cometer error tipo 1 fue menor de 0,05 se consideraron las diferencias entre tratamientos
como significativas y se procedi a realizar una prueba de Tukey con un 95 % de confianza para
determinar especficamente qu tratamientos eran diferentes.
Asimismo, dado que se aplic el preparado enzimtico Enzima 3, que posee
propiedades pectinolticas y celulsicas, fue necesario efectuar nuevamente la caracterizacin
 58

de MIA, MIAA, pectinas solubles, lignina, celulosa y hemicelulosa. Para todos los anlisis se
siguieron los mtodos citados en el apartado 4.3.1.
Con los datos obtenidos por triplicado del pur previo al tratamiento enzimtico y del
pur posterior a este, se efectu una comparacin pareada con la prueba t de Student con un
nivel de confianza de 95 % (en JMP matched pairs), sobre cada parmetro de anlisis qumico,
de manera que se pudo detectar si existen diferencias significativas en cuanto a la composicin
qumica del jarabe con respecto al pur de banano inicial debidas a la accin de las enzimas.
Para ello se emple el programa JMP versin 5.1 de SAS.
Adems, debido a que se reporta que este tipo de enzima posee un efecto importante
sobre la viscosidad de la pulpa, se realiz la medicin de viscosidad, por triplicado, antes y
despus del tratamiento enzimtico, medida a 22 C, utilizando un viscosmetro de rotacin,
Cole Parmer modelo 98936, con el husillo R7, a una velocidad de 10 rpm y luego de 30 s de
iniciada la rotacin

4.3.4.4 Escalamiento del tratamiento enzimtico del pur de banano

Se realiz una prueba del tratamiento enzimtico en marmita, para simular el
escalamiento del proceso y a la vez, para tratar un lote completo de pur, que sirvi para
extraer todo el jugo A que se requera para la etapa de fermentacin, que se describir ms
adelante.
Para este tratamiento enzimtico, se procesaron 75 kg de residuo de pur de banano, que
se recibi congelado en bolsas de polietileno de alta densidad, separado en cajas de 25 kg cada
una, y se mantuvo as hasta el momento de su uso. Un da antes, previo al tratamiento se puso
a descongelar a temperatura ambiental.
Por da se procesaron 25 kg de pur de banano, de manera que para completar el
procesamiento de la materia prima, se requirieron tres das completos. Se trabaj en una
marmita Groen, provista de agitacin y tapa, con un puerto para termmetro de espiga. Se
introdujeron los 25 kg de pur de banano. Para el escalamiento, no se realiz la operacin de
esterilizacin ya que la mxima temperatura alcanzada por el residuo de pur de banano en
marmita fue de 95 C, sin embargo, cuando se alcanz esta temperatura mxima, se realiz el
tratamiento enzimtico con la enzima 1, as que la temperatura se mantuvo elevada por un
 59

tiempo prolongado, de 30 minutos, de manera que este tratamiento si bien es cierto no es una
esterilizacin, fungi como una pasteurizacin y contribuy con la disminucin de la carga
microbiana.
Cuando se alcanz una temperatura de 95 C se adicion la cantidad apropiada de enzima
1, para alcanzar una concentracin de este preparado de 300 mg/kg de pur y se mantuvo con
agitacin constante durante 30 minutos, esto con el fin de dextrinizar el almidn presente en
la matriz de residuo de pur de banano. Una vez concluido el tiempo, la temperatura se redujo
a 55 C, rociando la chaqueta de la marmita con agua fra y se agreg la cantidad apropiada de
enzima 2 para alcanzar una concentracin de 560 mg/kg de pur, esto para liberar unidades de
glucosa y fructosa a partir de las dextrinas producidas con la enzima 1, en este caso la
temperatura y la agitacin se mantuvieron por 6,5 horas. Pero adems, cuando haban
transcurrido 5,5 horas, se aadi la enzima 3, para reducir la viscosidad del residuo de pur de
banano, en una concentracin de 240 mg/ kg de pur, y este preparado se mantuvo activo,
junto con la enzima 2, hasta las 6,5 horas.
Debe recalcarse que para el escalamiento del tratamiento enzimtico, se redujo el tiempo
de aplicacin de la enzima 2, debido a que el tratamiento tuvo que ajustarse a una jornada de
8 horas, pues no se poda mantener la marmita en funcionamiento en horas extra de trabajo
pues se requera la supervisin de personal autorizado que controlara el manejo tanto de la
marmita como de la caldera.
Una vez culminado este tiempo, el pur de banano se retir de la marmita y se guard en
baldes en congelacin a una temperatura de -18 C, hasta el momento en que se trat para la
extraccin de jugo, proceso que se realiz cuando se tena la totalidad del residuo de pur
macerado. Con esta prueba se obtuvieron los resultados del tratamiento enzimtico, ajustados
a un da con una jornada laboral de 8 horas, con el fin de ajustar al proceso a uno ms factible
desde el punto de vista industrial.

4.3.5 Produccin de bioetanol a partir de Saccharomyces cerevisiae

Se evalu la productividad y rendimiento de la fermentacin alcohlica empleando la

levadura Saccharomyces cerevisiae, comparando dos medios de cultivo, el primero un jugo de
banano obtenido a partir del tratamiento fsico y enzimtico de residuo agroindustrial de pur
 60

de banano que contena residuos de slidos insolubles y el segundo, un jugo de banano

comercial totalmente clarificado, libre de slidos insolubles. Por ser la parte primordial del
estudio, la metodologa se divide en cinco grandes secciones: flujo de proceso,
especificaciones de flujo de proceso, mtodos de anlisis (fsicos, qumicos y microbiolgicos),
diseo experimental y finalmente variables y curvas respuesta. Cada una se detalla
seguidamente.

4.3.5.1 Flujo de proceso propuesto

A continuacin se detallan las etapas para el proceso completo, desde el recibo del
residuo de pur de banano hasta la fermentacin, haciendo especial detalle en las operaciones
de extraccin del jugo de banano, que se utiliza posteriormente como medio para la
fermentacin.
El proceso esquematizado se encuentra en la Figura 7.

RECIBO: se coordin con la empresa proveedora correspondiente el envo de la materia

prima, especificando cantidad de materia prima, forma de empaque (bolsas individuales o
caja) y fecha de recibo. Esta materia prima se dej en las cmaras de congelacin del CITA a
una temperatura de -18 C hasta el momento de su uso.
LIOFILIZACIN: previo a la caracterizacin proximal del pur de banano, la pulpa se
congel con hielo seco directamente en el frasco del liofilizador, formando una capa delgada.
Una vez congelada, las muestras se liofilizaron utilizando un sistema FreeZone de Labconco,
hasta su completa sequedad. Cuando se retiraron del liofilizador, las muestras secas de pur
de banano, se empacaron en bolsas de polietileno de alta densidad, totalmente selladas, hasta
el momento del anlisis qumico. Una vez que el pur se encontr seco, se realiz la
caracterizacin proximal del mismo como se detall en la seccin 4.3.1.
ESTERILIZACIN: cuando se trabaj con muestras pequeas de pur de banano, la
esterilizacin se efectu en la autoclave horizontal del CIPRONA, bajo las condiciones de
tiempo y temperatura se describieron en el apartado 4.3.3.1. Para los lotes completos
utilizados, no se realiz una esterilizacin propiamente, sino que se efectu un tratamiento
 61

enzimtico a 95 C por 30 minutos, que de paso fungi como una pasteurizacin para reducir
la carga microbiana del residuo de pur de banano.
TRATAMIENTOS ENZIMTICOS: los tratamientos enzimticos para muestras pequeas se
realizaron tal y como se describi en el apartado 4.3.4.1, sin embargo, para los lotes completos
analizados, el tratamiento enzimtico se realiz en una marmita Groen, provista de tapa,
agitacin y control de temperatura, como se detalla en la seccin 4.3.4.4.
PRENSADO: esta operacin se realiz en la prensa hidrulica del CITA, marca OTC, modelo
A, serie Y-125, utilizando tandas de aproximadamente 5 kg de pur, con doble bolsa de manta,
a una presin de 4000 psi y por un tiempo de 15 minutos.
CLARIFICACIN CENTRFUGA: esta operacin se realiz en una clarificadora centrfuga
Westfalia modelo D-LG205-1, tambin en el CITA, y se realiz 3 veces consecutivas para
remover la mayor cantidad de slidos insolubles suspendidos.
PASTEURIZACIN: la pasteurizacin del jugo de banano se realiz en la planta piloto del
CITA, en una marmita, a 72 C durante 15 minutos, tiempo durante el cual el jugo se agit
manualmente con una paleta de acero. Luego de pasteurizado, el jugo se recibi en ollas de
acero, previamente desinfectadas con alcohol al 70 %m/m, en las cuales se transport al
Laboratorio de Microbiologa del CITA. Luego, en una cmara de flujo laminar utilizando la
tcnica asptica, el jugo se envas en carboys de 10 L, que se almacenaron en la cmara de
refrigeracin del CITA hasta su uso.
Las etapas anteriormente descritas, se muestran de manera sintetizada en la Figura 7, que
resume el flujo de proceso propuesto para la fermentacin alcohlica de jugo de banano A,
utilizando como materia prima inicialmente, residuo de pur de banano.
 62

Figura 7. Flujo de proceso propuesto para la obtencin de bioetanol a partir de pulpa de

banano va fermentacin

Adicionalmente, en este proyecto se estudi tambin la fermentacin alcohlica

utilizando como medio el jugo de banano B, pues era de inters comparar el proceso
fermentativo con un jugo extrado a partir de residuo de pur de banano con un jugo
producido industrialmente. Sin embargo, el tratamiento de esta materia prima difiere del que
se present en la Figura 7, debido a que en este caso se parte de jugo de banano concentrado.
Por tanto, seguidamente se detallan las etapas del proceso con el jugo B.
 63

RECIBO: se coordin con la empresa proveedora correspondiente el envo de la materia

prima, jugo de banano clarificado y concentrado en baldes plsticos. Esta materia prima se
dej en las cmaras de congelacin del CITA a -18 C, hasta el momento de su uso.
DILUCIN: el jugo concentrado se dej descongelar un da antes de su uso en la cmara
de refrigeracin del CITA, luego de esto se le midi el contenido de slidos solubles, expresado
como Brix, pues este dato brinda una estimacin o aproximacin del contenido de azcares
totales del jugo. De acuerdo con este resultado, se aadi la cantidad necesaria de agua para
disminuir los azcares a 17,5-18,0 Brix. Las mediciones se realizaron con un refractmetro
digital y la dilucin se realiz en marmita. Este jugo diluido se caracteriz siguiendo los
procedimientos descritos en la seccin 4.3.1.
PASTEURIZACIN: la pasteurizacin del jugo de banano se realiz en una marmita, a 72 C
durante 15 minutos, tiempo durante el cual el jugo se agit manualmente con una paleta de
acero.
A la vez, para sintetizar lo anteriormente expuesto, el flujo de proceso utilizando esta
materia prima se presenta en la Figura 8 a continuacin.

Figura 8. Flujo de proceso para la obtencin de bioetanol a partir de jugo de banano B va

fermentacin
 64

4.3.5.2 Especificaciones de flujo de proceso de la etapa fermentativa

En este estudio, se evalu el efecto de la suplementacin del medio de fermentacin
sobre el rendimiento y la productividad del bioetanol. El enriquecimiento se realiz segn lo
recomendado por Thompson (2004), pero, en este caso no se utiliz el preparado complejo
Fermaid, en el Cuadro XI se puede ver dicha composicin.

Cuadro XI. Medio de cultivo a utilizar para la fermentacin alcohlica de jugo de banano con
Saccharomyces cerevisiae
Nutriente* Cantidad (g/kg)
Nutriente 1 5,00
Nutriente 2 1,00
Nutriente 3 1,00
Nutriente 4 0,50
Hasta completar 5 L** del volumen del
Jugo de banano
bioreactor
* Las sales utilizadas como fuente de cada uno de los nutrientes especificados no se
indican por motivos de confidencialidad del proyecto
**El volumen total final fue ligeramente superior a 5 L, dado que el inculo se aadi
disuelto en 75 mL de agua peptonada

En todos los casos se emplearon bioreactores Applikon, ubicados en el CENIBiot, con

capacidad de 7 L y volumen mximo de trabajo de 5 L. Antes de agregar los nutrientes del
medio, en los casos en los que corresponda, estos se esterilizaron a 121 C por 15 minutos.
Dichos nutrientes se disolvieron en una porcin de jugo de jugo de banano de volumen entre
250 y 500 mL y se alimentaron al bioreactor haciendo uso de una bomba peristltica. Luego de
agregados estos nutrientes en los casos que se tratase de medio suplementado-, se aadi el
resto de jugo de banano hasta alcanzar los 5 L de volumen total, de igual forma que con los
nutrientes, este jugo se aliment a travs de una bomba peristltica.
Simultneo al llenado de los bioreactores, se realiz la activacin de la levadura S.
cerevisiae, que se rehidrat en una proporcin 1:10 (levadura: medio) en caldo peptonado
estril al 1 %, a 38 C y se incub en un bao a esta misma temperatura por 20 minutos, en
Erlenmeyers de 150 mL.
 65

Una vez transcurrido el tiempo de activacin, la levadura se inocul. Para ello, se abri
uno de los puertos de la tapa del bioreactor, se roci con alcohol al 70 %m/m y se verti el
caldo de levadura activa. Luego de eso, la agitacin se aument a 250 rpm por 2 minutos para
asegurar la distribucin homognea de la levadura en todo el bioreactor y posteriormente se
fij en 75 rpm para toda la fermentacin, excepto para el muestreo, cuyo procedimiento se
detalla en el anexo A, en el apartado 9. Durante la fermentacin el pH se mantuvo controlado
en 4,5, la temperatura se fij en 30 C, no se realiz aireacin ni tampoco se removi el aire
del espacio de cabeza.
Simultneamente a la inoculacin, se empez la toma de datos en tiempo real de cada
bioreactor mediante el software BioXpert, tambin de Applikon. As se documentaron los
datos de pH, temperatura y oxgeno disuelto (en los casos en que se instal y calibr el
sensor). Durante todo el tiempo de fermentacin, se tomaron muestras y se trataron como se
detalla tambin en el anexo A, punto 9.
Al final de las 67 horas de fermentacin, se detuvo el programa BioXpert, se detuvo la
agitacin, se desconectaron los bioreactores, se desconectaron las chaquetas del sistema de
calentamiento/enfriamiento, se retiraron los sensores de temperatura y pH y se drenaron los
caldos de cada bioreactor. Para drenar los bioreactores, el caldo se agit vigorosamente (600
rpm) y el lquido se deposit en botellas para centrfuga de aproximadamente 2 L de
capacidad, utilizando una bomba peristltica en direccin opuesta, para el drenado. Este caldo
homogneo, se centrifug en dos pasos, de 10 minutos cada etapa, a 3500 rpm y a 4 C, una
vez finalizadas las dos etapas, el lquido supernatante se separ de la levadura depositada
mediante decantacin simple. Esto porque, para etapas posteriores del proyecto es de inters
caracterizar la levadura y adems, trabajar en las etapas de purificacin del caldo para la
recuperacin del etanol, este caldo se almacen en las instalaciones del CENIBiot en
refrigeracin a 4 C.

4.3.5.3 Mtodos de anlisis para la fermentacin

Durante todo el tiempo de fermentacin, se tomaron muestras del medio, con el fin de
obtener la cintica o comportamiento de todo el proceso, estas muestras se tomaron con ms
frecuencia al inicio de la fermentacin, y ms distancia hacia el final del tiempo de
 66

fermentacin. Las muestras se recolectaron en tubos de centrfuga de plstico y en tubos de

ensayo de vidrio, se extrajeron mediante succin con una jeringa de 50 mL. Las horas de
muestreo se detallan seguidamente en el Cuadro XII.

Cuadro XII. Frecuencia de toma de muestras en la fermentacin alcohlica de jugo de banano

con Saccharomyces cerevisiae
Muestreo Tiempo (horas)
1 0
2 2
3 12
4 14
5 17
6 20
7 23
8 25
9 36
10 38
11 40
12 42
13 44
14 46
15 49
16 62
17 65
18 67

Todas las muestras se centrifugaron a 3500 rpm por 15 minutos y se separ el lquido
supernatante por decantacin, descartando el slido correspondiente mayoritariamente a la
levadura. Posteriormente, el lquido se utiliz para la medicin de slidos solubles expresados
como Brix y luego de esto se filtr con un filtro desechable de 0,45 m de dimetro de poro y
se diluy para ser inyectado en el cromatgrafo (El detalle se encuentra en el Anexo A, seccin
9).
En la Figura 9 se muestran los anlisis fsicos y qumicos realizados para seguir el curso de
la fermentacin.
 67

Slidos Poblacin
solubles microbiana

Concentracin de Concentracin de
glucosa y fructosa etanol y glicerol

Anlisis durante la
fermentacin

Figura 9. Anlisis para la evaluacin de la fermentacin de pulpa de banano para la

produccin de bioetanol

Concentracin de glucosa, fructosa, glicerol y etanol: se determin la concentracin de

estos azcares y alcoholes en cada muestreo durante el transcurso total de la
fermentacin, por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC). Todos estos anlisis se
realizaron en el CENIBiot, utilizando la columna Rezex ROA-cidos orgnicos de la casa
comercial Phenomenex, a una temperatura de 65 C, con cido sulfrico 0,0025 M como
fase mvil y un flujo de 0,6 mL/min.
Poblacin microbiana: La poblacin de S. cerevisiae se determin por densidad ptica,
medida en un espectrofotmetro Perkin Elmer Lambda 25 UV/VIS. Previamente a las
fermentaciones y a la toma de muestra, se construy una curva de calibracin que
correlaciona la absorbancia con la poblacin de la cepa, que se determin por conteo al
microscopio con una cmara de Neaubauer, con la metodologa propuesta por University
of Paisley (2002).
Slidos solubles: se realiz la medicin de los slidos solubles expresados como Brix con
un refractmetro manual digital marca Atago, modelo 3840 pal-, cuyo rango de
medicin va de 0 a 99 Brix.

4.3.5.4 Diseo Experimental

Pruebas preliminares

Previo a definir las condiciones que se estudiaran en el diseo experimental, se realizaron

varias pruebas preliminares que se describen a continuacin. En primera instancia, se realiz
 68

una prueba para definir el volumen total de operacin de los bioreactores, pues si bien es
cierto, el volumen propuesto por el fabricante es de 5 L, cuando se utilizan sales para
suplementar el medio y dependiendo de la materia prima que se trate, se genera mucha
espuma. En esta prueba los bioreactores se llenaron hasta el volumen mximo y la
fermentacin se dej transcurrir durante el tiempo definido, 67 horas.
Adems se realizaron dos corridas, una con medio suplementado y otra con medio sin
suplementar, a modo de prueba preliminar para corroborar que la levadura pudiese crecer en
un medio sin suplementar, esto se realiz utilizando nicamente un bioreactor para cada
fermentacin: con medio suplementado y sin suplementar. De este modo, si la levadura
lograba sobrevivir, convena llevar a cabo las fermentaciones por triplicado para tener la
robustez estadstica para definir el efecto de la suplementacin del medio.
A la vez, se realiz otra prueba preliminar, tambin en bioreactor de 5 L, donde se evalu
la concentracin inicial del inculo de levadura. Se utilizaron dos concentraciones iniciales:
1,50 g/L y 0,75 g/L, con base en el estudio realizado por Thompson (2004) y en
recomendaciones aportadas por el seor Max Reynes, Director de la Unidad Comn de
Investigacin del CIRAD, Francia, quien brind asesora durante el transcurso del proyecto
(Reynes, 2011).
Cabe sealar que todas estas prueba descritas, al ser preliminares, se realizaron
nicamente una vez, con un bioreactor por prueba, de manera que pese a que no poseen
robustez estadstica, ayudaron a definir las variables de estudio del diseo experimental en s.

Diseo Experimental

El diseo experimental final utilizado fue un diseo factorial 2x2, dos factores con dos
niveles cada uno, realizando a la vez, tres rplicas para cada tratamiento, esto con el fin de
hallar el comportamiento tpico de la curva de produccin de etanol. Los factores
correspondieron al jugo de banano utilizado y la suplementacin o no del medio de cultivo.
Mientras que, otros parmetros como la temperatura, agitacin, aireacin y concentracin
inicial del inculo se mantuvieron constantes. Se tomaron muestras espaciadas en el tiempo
hasta que culmin la fermentacin, es decir, hasta que la concentracin de etanol permaneci
estable por un tiempo prolongado.
 69

Se compar el rendimiento con respecto al contenido de azcares en el sustrato inicial,

productividad total, productividad al trmino de los azcares y productividad mxima en la
produccin de bioetanol para todos los casos. Asimismo, cabe resaltar que las condiciones
propuestas para el manejo del microorganismo se derivan del estudio realizado por Thompson
(2004), quien obtuvo mejores resultados en cuanto a productividad de bioetanol y
rendimiento sobre el sustrato inicial cuando se utiliz una concentracin de 1,5 g/L.
Seguidamente en el Cuadro XIII se muestra el diseo experimental detallado.

Cuadro XIII. Diseo experimental para la evaluacin de la produccin de bioetanol a partir de

jugo de banano utilizando Saccharomyces cerevisiae

Suplementacin del
Tratamiento Jugo de banano Parmetros fijos
medio
1
1 B S Temperatura: 30 C,
1
Concentracin inculo: 1,5
2 B No g/L
2
Agitacin: 75 rpm y se
3 A S aument a 200 rpm 2
minutos antes del
4 A No muestreo, sin aireacin

1
Parmetros fijos para Saccharomyces cerevisiae propuestos por Thompson, 2004.
2
Parmetros fijos establecidos para este estudio: agitacin mnima para mantener la levadura
en suspensin, no se aire para favorecer la ruta anaerbica de fermentacin alcohlica

Con el fin de efectuar comparaciones vlidas entre tratamientos, se calcul la

productividad mxima, que corresponde a la pendiente de la curva de produccin de etanol en
el tiempo en la fase exponencial, esto es en la fraccin en que la curva es una lnea recta. As,
una vez obtenidas las productividades mximas de cada tratamiento, se realiz una prueba de
Tukey entre pendientes con el fin de evaluar si existen diferencias entre tratamientos. El nivel
de confianza requerido en el experimento es del 95 % y se efectu la prueba haciendo uso del
programa JMP versin 5.1 de SAS.
Por otra parte, el rendimiento de etanol con respecto a la cantidad inicial de azcares en
el pur de banano se compar mediante un ANDEVA al 95 % de confianza empleando para ello
 70

tambin el programa estadstico JMP versin 5.1 de SAS. Nuevamente, al presentarse

diferencias entre tratamientos, se realiz una prueba de comparacin de medias de Tukey con
un 95 % de confianza, en el programa estadstico JMP. A la vez, tambin se compararon los
rendimientos obtenidos con respecto al mximo esperado, con base en lo reportado en la
literatura.
Adicionalmente, se analizaron las curvas de la cintica de crecimiento as como las curvas
de consumo de azcares (medidos como azcares totales (g/L) y como Brix) y las de
produccin de alcoholes. Tambin se obtuvo la velocidad de crecimiento, el porcentaje de
azcares consumidos y la concentracin mxima obtenida de glicerol y etanol. Estas variables
respuesta se detallan en el siguiente apartado.

4.3.5.5 Variables y curvas respuesta

En la Figura 10 se muestran las variables respuesta y curvas que se graficaron con el fin de
analizar los tratamientos aplicados en la fermentacin de la pulpa de banano.

Tiempo de
fermentacin Productividad mxima,
Rendimiento de etanol total y al trmino de los
respecto al sustrato inicial y azcares
respecto al terico

Consumo de Velocidad
azcares y slidos especfica de
solubles vs tiempo crecimiento

Produccin de
etanol y glicerol Concentracin
vs tiempo final de glicerol y
etanol

Variables y
Azcares
Cintica de crecimiento curvas
consumidos
respuesta

Figura 10. Variables y curvas respuesta para el anlisis de la fermentacin de pulpa de banano
para la obtencin de bioetanol
 71

Rendimiento de etanol respecto al sustrato inicial

(Ecuacin 3)

Es decir, indica el rendimiento en la produccin de etanol con respecto a la

concentracin inicial de azcares del residuo de pur de banano colocada en el bioreactor.

Rendimiento respecto al mximo terico

(Ecuacin 4)

Esto considerando que el mximo rendimiento terico de acuerdo con la

estequiometra de la reaccin es de 51 %m/m (Crueger & Crueger, 1993).

Productividad mxima

Pendiente de la curva de cintica de produccin de alcohol, que se obtiene al graficar

la concentracin de etanol (g alcohol/L mosto) en funcin del tiempo de reaccin (horas).
La pendiente se calcula en la seccin lineal de la curva.

Productividad total

Se obtiene como la concentracin de etanol en el tiempo total en que se dej la

fermentacin, esto es 67 horas, en g/(L .

Productividad al trmino de los azcares

Se obtiene como la concentracin de etanol dividida entre el tiempo en que los

azcares llegaron a un nivel de 0 g/L, este tiempo vari dependiendo del tratamiento en
cuestin.

Velocidad especfica de crecimiento ()

(Ecuacin 5)
 72

t
td
g (Ecuacin 6)
log x f log x0
g
log 2 (Ecuacin 7)

Donde es la velocidad especfica de crecimiento (h-1), t es cada tiempo que dura la

fase log o de crecimiento exponencial, td es el tiempo de duplicacin que se calcula con la
Ecuacin 6 que se muestra, xf es la concentracin de levaduras mxima alcanzada en la
fase logartmica, x0 es la concentracin inicial de levaduras y g es el nmero de
generaciones que se calcula mediante la Ecuacin 7 que tambin se muestra (Recalde,
2010).

Porcentaje de azcares consumidos

Cn azcares iniciales Cn azcares remanentes

% Azcares consumidos 100
Cn azcares iniciales
(Ecuacin 8)

Tiempo de fermentacin

Es el tiempo a partir del cual la concentracin de etanol se mantiene constante, es

decir, cuando ya no se produce ms etanol y los azcares se han consumido en su
totalidad. En este caso el tiempo no se pudo determinar experimentalmente a partir de la
cintica de produccin de etanol, debido a que hubo espacios de muchas horas entre
muestreos, por lo que la estabilizacin de azcares y etanol en muchos casos corresponda
a tiempos probablemente mayores de los reales, de manera que la estimacin no hubiese
sido adecuada.
Por tanto, para estimar los tiempos de fermentacin se obtuvieron las ecuaciones
polinomiales que describen la curva de produccin de etanol en el tiempo, se evaluaron
las ecuaciones correspondientes a modelos polinomiales de diferentes rdenes.
Posteriormente se eligi el polinomio con el mejor ajuste o correlaciones entre el tiempo
 73

de fermentacin y la concentracin de etanol (mayor coeficiente de correlacin o r). Las

ecuaciones finales elegidas se muestran en el Anexo C.
Con esta ecuacin, se calcul el tiempo en el que la concentracin de etanol alcanz
un mximo, esto es la derivada de la curva de produccin de etanol en el tiempo. Este
tiempo se tom como el tiempo de fermentacin.
Se tiene como parmetro de comparacin que el tiempo de fermentacin propuesto
por Thompson (2004) fue de 50 horas, utilizando tambin S. cerevisiae y pur de banano.
 74

5. Resultados y discusin

5.1 Caracterizacin de la materia prima

En el Cuadro XIV se muestran los resultados de la caracterizacin proximal del residuo de

pur de banano inicial, as como de los jugos de banano tanto A como el B.

Cuadro XIV. Caracterizacin fsica y qumica del residuo de pur de banano previo al
tratamiento enzimtico y de los jugos de banano utilizados como medio de fermentacin para
la produccin de bioetanol
Residuo de pur
Jugo de Jugo de
Anlisis de banano
banano A** banano B**
inicial*
Humedad (g/100g) 74,5 0,2 82,68 0,09 81,4 0,2
Cenizas (g/100g) 0,54 0,01 0,62 0,04 0,63 0,02
Slidos solubles (Brix) 12 1 16,0 0,2 18,0 0,2
Azcares totales (g/L) 104 3 182 3 190 3
pH 5,15 0,04 4,84 0,05 4,64 0,02
Acidez (g c.ctrico/100 mL) 0,40 0,03 0,80 0,03 0,68 0,01
Material insoluble en alcohol MIA (g/100 g
48 1 NA NA
banano en base seca)
Material insoluble en alcohol y agua MIAA
26,2 0,7 NA NA
(g/100 g banano en base seca)
Lignina (g/100 g banano en base seca) 26 2 NA NA
Hemicelulosa (g/100 g banano en base seca) 4,0 0,8 NA NA
Celulosa (g/100 g de banano en base seca) 72 NA NA
NA: No aplica, este anlisis no es de inters para esta materia prima
* El resultado que se muestra corresponde al promedio de dos lotes analizados, con tres
rplicas para cada uno, y su respectivo intervalo con un 95 % de confianza
** El resultado que se muestra corresponde al promedio de tres lotes analizados, con tres
rplicas para cada uno, y su respectivo intervalo con un 95 % de confianza
 75

En primer lugar, conviene resaltar la composicin del residuo de pur de banano inicial,
pues esta materia prima se somete a diversos tratamientos fsicos y enzimticos con el fin de
obtener un jugo que funcione como medio base para la fermentacin. En cuanto a su
humedad, se puede notar que es bastante alta, cercana a tres cuartas partes de la pulpa total,
que es lo normal para esta fruta. As, este dato concuerda con la humedad de la pulpa
reportada por Velsquez et al. (2010), quienes indican que la pulpa de banano posee hasta un
74,6 %m/m de humedad. Adems segn la escala de maduracin reportada por Chacn et al.
(1987), el pur posee un contenido de agua similar al encontrado en pur de banano amarillo.
Sin embargo, vale hacer la aclaracin de que este sustrato se est comparando con un pur de
banano, pero realmente es un residuo de pur de banano, que proviene del finisher en que se
remueven las semillas a la fruta, de ah que su composicin vara con respecto al pur
reportado en la literatura.
Las cenizas constituyen tan slo un 0,54 %m/m de la materia prima fresca, lo que
corresponde a un 2,12 %m/m en base seca (considerando 74,5 %m/m como el porcentaje de
humedad), este dato se acerca mucho al reportado por Clarke et al., (2008), que es de un 2,25
% b.s. para desechos agroindustriales de banano. El contenido de cenizas es importante dado
que estn constituidas por minerales que finalmente favorecen y permiten el crecimiento del
microorganismo utilizado en la fermentacin, algunos de los nutrientes que contienen estas
cenizas son calcio, -caroteno, hierro y fsforo.
En cuanto a los azcares totales y slidos solubles del residuo de pur de banano inicial,
estos son (104 3) g/L y (12 1) Brix, respectivamente. En este caso, debido a que no se
trabaj propiamente con pur de banano sino con un residuo agroindustrial, no es posible
comparar el contenido de azcares con el de la fruta como tal, sin embargo, se nota que esta
concentracin es baja con respecto al contenido mximo presente en pur de banano entero,
lo que se puede atribuir a que debido a la naturaleza del residuo, este posee un alto contenido
de fibra, pues se obtiene de la remocin de las semillas de la fruta, durante la elaboracin de
pur de banano a nivel industrial.
De acuerdo con los datos reportados por la FAO (1990), la pulpa de banano contiene un
25,5 % m/m de carbohidratos, y segn lo reportado por Chacn et al. (1987), de estos
carbohidratos un 19,71 %m/m son azcares totales, cuando el banano est en su nivel de
maduracin mximo, esto es cuando fsicamente se observa totalmente amarillo con pecas. En
 76

este caso, el contenido de azcares de 104 g/L, equivale a un 10 %m/m de azcares, as que
nuevamente se evidencia que el contenido de azcares de este residuo es mucho menor del
contenido de azcares en el pur de la fruta como tal. Sin embargo, an cuando no es tan rico
como la fruta, esta concentracin de azcares representa una ventaja para el uso del pur
como materia prima para la fermentacin, dado que los azcares simples son la principal
fuente de carbono de la levadura.
Seguidamente, para el pH, se obtuvo un dato que concuerda con lo reportado por Ciro et
al. (2005), quienes reportan que el pH de la fruta vara entre 5 y 5,6, adems segn la
clasificacin propuesta por Chacn et al. (1987), como el pH es ligeramente ms bsico, se
puede relacionar con la fruta en un estado verde. Tambin se determin la acidez de la
muestra, este dato corresponde a 0,40 %, expresado como cido ctrico, que corresponde con
el rango reportado en la literatura que va desde 0,24 hasta 0,60 % (Ciro et al., 2005).
Tras los anlisis discutidos anteriormente, se puede aseverar que la pulpa de banano se
presenta como un sustrato apto para su uso en fermentacin, debido a que contiene
mayoritariamente agua, lo que permite la obtencin de una buena cantidad de jugo, y
adems, contiene un porcentaje interesante de azcares, como glucosa, fructosa y sacarosa,
que sirven como fuente de carbono para la levadura. Esto se afirma, al comparar el contenido
de azcares de la materia prima con otras fuentes como sorgo (15 %), papaya (10-20 %), pia
(10-15 %) e incluso con lo reportado en banano por otros autores (16-20 Brix, 100 g/L), todas
estas fuentes con las que se han encontrado buenos resultados producto de la fermentacin
alcohlica (Kordylas, 1992; Cabrera et al., 2001; Zapata & Pelez, 2010).
Adems, el contenido de azcares es comparable con el de las materias primas que se han
utilizado en otros estudios, por ejemplo, Galindo et al., (1993) partieron de melazas con un
contenido de 165 g/L, Choi et al., (2008) utilizaron pur de yuca con un contenido de azcares
totales de 183,50 g/L y Nikolic et al., (2008) emplearon como sustrato harina de maz
hidrolizada cuyo contenido de azcares fue de 176 g/L.
Adicional a la caracterizacin proximal tradicional, que se realiza a purs de frutas, se
realiz una caracterizacin ms especfica para conocer el contenido de fibra en el pur, que
resulta de particular inters ya que posteriormente se trabaj con enzimas para degradar
parte de estos carbohidratos parietales que conforman la fibra. Es importante sealar que,
para realizar esta caracterizacin de fibra, el pur se liofiliz, proceso que permite remover el
 77

disolvente, agua en este caso, mediante la congelacin seguida de sublimacin. Este

mecanismo de secado tiene aplicaciones en anlisis qumico donde es conveniente trabajar
con la muestra seca, pues los componentes de la muestra permanecen estables sin alterar su
composicin qumica, en este caso particular, las muestras se secaron pues el pur era ms
manejable de esta forma y adems los procesos de filtracin tomaron menos tiempo
(Labconco, s.f.).
Primeramente se cuantific el material insoluble en alcohol (MIA), que corresponde a 48
g/100 g de banano en base seca, que es mucho mayor al reportado por Franquin (2002) quien
obtuvo un 13,5 g/100 g de banano en base seca. El contenido de MIA hallado en este caso es
mayor que el reportado debido a que en el estudio de Franquin se utiliza banano en estado de
maduracin 7, y que por tanto contiene ms azcares simples y menos almidn y polisacridos
complejos, en contraparte, en este caso se trabaj con un residuo de pur de banano, que es
rico en semillas. Esta cuantificacin es importante, porque es el material base para la
extraccin posterior de lignina, celulosa y hemicelulosa.
La siguiente cuantificacin que se realiz para el pur fue el material insoluble en alcohol y
agua (MIAA), donde se obtuvo un 26,2 g de MIAA por cada 100 g de banano seco, en
contraparte con el 22 % que reporta Franquin (2002) para banano. Este contenido mayor al
reportado, puede atribuirse la presencia de las semillas en el pur, y esto implica un aumento
en el contenido de fibra o material insoluble.
Para la extraccin del MIAA, se realizaron lavados con agua destilada a 4 C, pues a esta
temperatura se favorece la selectividad, principalmente se remueve la amilopectina, que
gracias a su estructura ms ramificada, no establece fuerzas intermoleculares tan intensas
como las de la amilosa.
Los lavados con agua se detuvieron hasta eliminar todo el almidn, y la forma de verificar
que ya no quedasen remanentes de almidn fue indirectamente, a travs de la prueba de
antrona (Herrera et al., 2003).
Al hacer la prueba de antrona a las aguas de lavado del MIAA, se corrobor que el material
insoluble en alcohol y agua estaba libre de azcares y almidn. De esta manera, los lavados se
pueden detener hasta que la prueba d negativa, que se evidencia porque se mantiene la
coloracin amarilla del reactivo de antrona.
 78

El reactivo utilizado consiste en antrona disuelta en cido sulfrico. El grupo carbonilo

proveniente del furfural o hidroximetilfurfural se condensa con el compuesto fenlico,
antrona, y genera un compuesto coloreado, que absorbe a una longitud de onda de 620 nm, y
es por ende, de color verde azulado (Herrera et al., 2003).
En la Figura 11 se evidencia ms fcilmente lo que sucede en esta reaccin. El almidn en
medio cido se hidroliza a su unidad estructural ms simple, la glucosa, misma que se oxida a
hidroximetilfurfural, quien finalmente se condensa con la antrona, originando as, un
compuesto con alta conjugacin, motivo por el que absorbe en la regin visible del espectro
electromagntico. A la vez, es muy estable debido a su resonancia.

Antrona

Figura 11. Hidrlisis y oxidacin del almidn en la prueba de antrona realizada a las
aguas de lavado del material insoluble en alcohol y agua.

Segn lo reportan Kunerth & Youngs (1984), con el mtodo de antrona se obtienen
resultados reproducibles para la cuantificacin de glucosa, el inconveniente radica en que la
prueba da positiva para otras sustancias dentro de las que citan a xilosa, arabinosa, galactosa y
cido galacturnico. Sin embargo, en este caso la prueba se utiliz exclusivamente de manera
cualitativa.
A partir del material insoluble en alcohol y agua se realiz la extraccin de lignina, celulosa
y hemicelulosa. Para el primer parmetro se encontr un contenido de 26 g de lignina por cada
100 g de banano en base seca, porcentaje mucho mayor al que algunos autores como
Velsquez et al. (2012) reportan, que es de apenas 14,0 %b.s. para cscaras y de un 4,2 %b.s.
para la fruta. Este resultado mayor al esperado se puede atribuir a que el mtodo no logr ser
efectivo para aislar la lignina, especficamente en esta matriz tan compleja.
 79

Finalmente, el contenido de celulosa y hemicelulosa hallado en la pulpa de banano fue de

7 y 4,0 g/100 g de pulpa de banano seca. Velzquez et al., (2010) reportan un contenido de 4,0
%b.s. y 4,4 %b.s. para celulosa y hemicelulosa en pulpa de banano, de manera tal que el
resultado hallado se acerca bastante.
Estas determinaciones se basan en que, los detergentes cidos y neutros solubilizan los
polisacridos no celulsicos, adems de protenas y cidos nucleicos, pero no la celulosa ni
hemicelulosa, de modo que el slido remanente se puede cuantificar.
Los resultados de la caracterizacin del residuo de pur de banano, muestran que es un
sustrato con un contenido de fibra muy superior al de otras frutas, como la pia. Por ejemplo,
el contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina es mucho ms alto que el reportado por
Gutirrez (2012). Es conveniente comparar estos dos sustratos, ya que se posicionan como los
dos primeros productos agrcolas de exportacin y por ende, los que generan mayor cantidad
de residuos o subproductos, en este caso, segn los objetivos de este estudio, la pia es un
sustrato de ms fcil manejo debido a que contiene menos fibra y por tanto, no requiere
tratamientos previos para degradar estos polisacridos y aumentar los azcares libres.
En general, una de las desventajas del residuo de pur de banano como sustrato para la
fermentacin, es que contiene gran cantidad de carbohidratos complejos, como almidn,
pectinas y celulosa, de ah la necesidad de realizarle tratamientos enzimticos previos para
aumentar la cantidad de azcares fermentables y tratar de reducir un poco la viscosidad del
pur. Este tipo de tratamientos tambin son comunes con sustratos como el bagazo de yuca o
los residuos de pulpa de manzana, mas no se ha reportado su uso con pia como sustrato
(Hofvendahl & Hahn, 2000; Gulln et al., 2007; Araya, 2010).
Otra desventaja que sealan Hammond et al. (1996) es que cuando la materia prima es
muy variable, se recomienda madurar post cosecha el fruto hasta alcanzar su estado mximo
de maduracin, sin embargo, como en este caso se trabaj con un desecho agroindustrial, el
residuo de la elaboracin de pur como tal y no el fruto, esto result imposible. Al mismo
tiempo, por tratarse de un desecho, la desviacin estndar en los anlisis fue relativamente
alta, ya que este desecho no est estandarizado (especficamente, en el caso de los azcares la
desviacin estndar fue mayor, de 3 g/L, lo que en algunos casos signific hasta un 2,8 % de
coeficiente de variacin).
 80

Las otras materias primas de inters que se caracterizaron, fueron los jugos de banano,
provenientes de ambas fuentes, tanto el B (que es un jugo concentrado y comercial de
banano) como el jugo A que se obtuvo a partir del residuo de pur de banano.
Lo primero acerca de estos jugos es que su humedad es muy alta, naturalmente como es
de esperar para un jugo, especficamente un 82,68 %m/m y 81,4 %m/m para los productos A y
el B, respectivamente. El siguiente componente de gran importancia lo constituyen los
azcares simples, expresados como la suma de glucosa, fructosa y sacarosa, que ascienden a
182 y 190 g/L, lo que se aproxima a 16-18 Brix, en el orden citado con anterioridad.
Particularmente, este dato es de gran inters puesto que estos azcares son la fuente directa
de energa para las levaduras alcohlicas y adems, es similar al dato reportado por Zapata &
Pelez (2010) en su estudio de produccin de etanol igualmente con jugo de banano con 15,5
Brix. Por otra parte, en el estudio efectuado por Thompson (2004), se utiliz jugo de banano
con 22-23 Brix iniciales, obtenido a partir de bananos procesados en su nivel mximo de
maduracin, por lo que el contenido de azcares resulta mayor al del jugo analizado.
En estudios anteriores, Chan et al. (2003) alcanzaron una concentracin de hasta 20
%m/m de azcares fermentables en un jugo de banano. Sin embargo, su alta viscosidad y la
cantidad de slidos insolubles, imposibilitaba su uso directo, de manera tal que se tuvo que
diluir para su fermentacin, as que finalmente, consista en un jugo con menor cantidad de
slidos. Adems, en el estudio reportado por Araya (2010), se utiliz jugo de pia de desechos
industriales, para fermentacin lctica y su contenido de glucosa, fructosa y sacarosa, en total
fue de un 9 %m/m. Con lo anterior, sendos jugos de banano utilizados, se presentan como
materias primas promisorias para la fermentacin, debido a su perfil de azcares
fermentables.
Por su parte, el contenido de cenizas es comparable con el que se encuentra en medios
como el suero lcteo (0,8 %m/m). Estos minerales son deseables puesto que pueden funcionar
como nutrientes para el crecimiento y desarrollo correcto de la levadura en la fermentacin
(Araya, 2010).
Finalmente, otra particularidad que se debe destacar del jugo es el valor de su acidez y pH,
ya que al observar los datos del Cuadro XIV, sobresale que el pH natural de ambos jugos es
cercano a 4,5, que resulta ser el pH ptimo para la fermentacin alcohlica a travs de
Saccharomyces cerevisiae, de manera que nuevamente, el jugo de banano se perfila como un
 81

sustrato adecuado para el crecimiento de la levadura, este pH es ligeramente inferior al del

jugo caracterizado por Zapata & Pelez (2010).
Asimismo, se observa que la caracterizacin para ambos productos es similar, los dos
tienen un alto contenido de azcares, ligeramente inferior para el jugo A, lo que tambin se
refleja en menores slidos solubles, la humedad es muy similar en ambos, as como el pH y la
acidez. As que en cuanto a esta caracterizacin proximal ambas materias primas parecen
coincidir bastante. Sin embargo, es posible que existan diferencias a nivel de minerales,
vitaminas y otros nutrientes que no se cuantificaron en el presente trabajo.

5.2 Pre-tratamiento enzimtico de la materia prima para la fermentacin

En este caso, al observar el contenido de MIA (48 g/100 g) en el pur de banano, se

evidencia la necesidad de aplicar un tratamiento enzimtico previo a la fermentacin, por
cuanto el residuo contiene un elevado porcentaje de fibra y un bajo contenido de azcares
(104 g/L) con respecto al pur de la fruta entera (Chacn et al., 1987). Esto con el fin de
obtener un mayor rendimiento de etanol, al aumentar el contenido de azcares del sustrato
inicial, tal y como lo reportan en su estudio Hammond et al. (1996), pues al utilizar enzimas en
banano verde, el rendimiento aument en un 65 %, en tanto el efecto fue menos marcado en
banano sobre madurado, pero de igual manera se aument el rendimiento en un 13 %.
Tambin, en estudios previos se han hallado resultados igualmente satisfactorios en
produccin de bioetanol con pulpa tratada enzimticamente como con pulpa de banano que
se lleva a su nivel mximo de maduracin y se esteriliza. Inclusive se ha encontrado que ya solo
la operacin de esterilizacin aumenta la produccin de bioetanol, especficamente para
banano verde el rendimiento aument en 0,01 L/kg peso fresco, en tanto que, para banano
sobre madurado el rendimiento aument en 0,06 L/kg peso fresco, con respecto a pulpa de
banano que tampoco se trat enzimticamente pero que no se esteriliz. A su vez, este
tratamiento trmico es necesario pues de lo contrario, el rendimiento de etanol disminuye
considerablemente debido a los microorganismos de deterioro (Hammond et al., 1996).
Adems, Thompson (2004) por su parte encontr que el tratamiento trmico de
esterilizacin de la pulpa permite que el tratamiento enzimtico sea ms eficiente. Esto
porque, con la aplicacin de calor se da una degradacin de las estructuras celulares,
 82

desnaturalizacin de las protenas y solubilizacin del almidn presente. Con ello

probablemente se da una liberacin de polisacridos como las pectinas que quedan ms
expuestas para la accin enzimtica. Tambin la esterilizacin inactiva o degrada ciertos
compuestos que pueden afectar la actividad de enzimtica como lo son las proteasas y taninos
presentes en la pulpa. Con base en tales fundamentos, es que en este caso se realiz una
esterilizacin del pur previa a los tratamientos enzimticos secuenciales aplicados. Ms an,
Blanchard & Katz (2006), reportaron que es conveniente aumentar la temperatura hasta 145-
150 C previo a la aplicacin de enzimas, para asegurar la correcta dispersin del almidn.
Una vez que el almidn se ha gelatinizado mediante un tratamiento trmico (T=74-81 C),
puede ser hidrolizado por la accin de un cido, enzimas o una combinacin de ambos. Los
grandes retos del proceso consisten en minimizar los productos de cadena larga que se
pueden reasociar como parte del proceso de retrogradacin y lograr uniformidad en el
tratamiento, situacin que se dificulta debido a la alta viscosidad del almidn que impide una
transferencia de calor uniforme. De ah que es necesaria una agitacin efectiva del pur, no
solo para asegurar la homogeneizacin del sustrato con la enzima, sino tambin para remover
las burbujas de aire que quedan atrapadas en el pur formando una especie de espuma
(Thompson, 2004; Blanchard & Katz, 2006).
La hidrlisis por va enzimtica ha cobrado mayor importancia que la cida debido a la
tendencia de realizar reacciones limpias, que tratan de minimizar la formacin de productos
secundarios indeseables como el hidroximetil furfural, furfuraldehdo y compuestos anhidros
de glucosa. Adems los compuestos resultantes tienden menos a retrogradar y presentan
menor viscosidad (Kilara & Desai, 2001; Blanchard & Katz, 2006). Debido a esto, el mercado de
las carbohidrasas para el ao 2010 se reportaba de hasta 550-650 millones de dlares (Bertsch
et al., 2010).
En este caso, el proceso que se realiz consisti bsicamente en la gelatinizacin del
almidn, seguido por la licuefaccin que implica la hidrlisis parcial del almidn y finalmente,
la sacarificacin que consiste en la produccin de glucosa y maltosa por una hidrlisis total
(Kilara & Desai, 2001; Mera et al., 2003).
 83

5.2.1 Produccin de dextrinas y oligosacridos a partir del almidn presente en el residuo de

pur de banano

En el Cuadro XV se muestran los resultados del tratamiento del pur de banano con la
enzima 1, cuyo efecto se evalu en los slidos solubles y azcares totales.

Cuadro XV. Efecto de la concentracin y el tiempo de aplicacin de la enzima 1 sobre los

azcares totales y slidos solubles (determinados gravimtricamente y como grados Brix) de la
pulpa de banano
Concentracin Tiempo de Azcares Slidos Slidos
Tratamiento enzima tratamiento totales* solubles solubles
(mg/kg) (min) g/L (n-1) % (n-1) Brix (n-1)
1 300 30 138,2(5,0)a 17,5(0,3)a 16,0(0,0)a
2 300 90 146,2(7)a 17,7(0,5)a 16,2(0,3)a
3 360 30 139,7(15)a 17,1(0,3)a 16,0(0,0)a
4 360 90 147,8(10)a 16,5(0,6)a 15,3(0,6)a
5 (inicial) 0 0 104,3(3)b 12,4(0,9)b 11,5(1,0)b
* Expresados como la suma de glucosa, fructosa y sacarosa
En una misma columna, valores no conectados por la misma letra presentan diferencias
significativas con un 95 % de confianza

En el Cuadro XV se muestran las variables respuesta analizadas, azcares totales, slidos

solubles medidos como Brix y por gravimetra, para los tratamientos enzimticos evaluados
con la enzima 1, en los que se vari la concentracin del preparado enzimtico y el tiempo de
tratamiento. En todos los casos, las tres variables aumentaron en una magnitud
significativamente diferente del pur inicial, que no recibi tratamiento enzimtico. Esto
significa que la cantidad de azcares de los purs tratados con la enzima 1 fue
significativamente mayor que el pur inicial.
Segn el anlisis estadstico, para el caso de los azcares totales, la probabilidad de
cometer error tipo I hallada fue de 0,0008; mientras que para los slidos solubles medidos
gravimtricamente y como Brix esta probabilidad fue menor a 0,0001. Por tanto, hay
 84

evidencia suficiente para descartar la hiptesis de igualdad de medias de azcares totales y

slidos solubles entre tratamientos, as que se concluye que el contenido de azcares,
expresados como azcares totales y slidos solubles, es mayor para los purs que recibieron
tratamiento enzimtico que para el pur inicial, con ms de un 99% de confianza.
Pese a las diferencias halladas con respecto al inicial, se observa tambin que entre
tratamientos no hubo diferencia significativa, y por esto, conviene elegir el tratamiento en el
que se utiliza la menor concentracin de enzima y que se realiza en el menor tiempo, pues es
el tratamiento ms viable desde el punto de vista de factibilidad econmica, ms an al
considerar el alto costo de los preparados enzimticos comerciales, y al conocer que la
aplicacin de esta enzima se realiza a 95 C, lo que conlleva un incremento importante en los
costos de operacin del tratamiento. As que en este caso se seleccion un tiempo de reaccin
de 30 minutos con una concentracin de enzima de 300 mg/kg.
La enzima 1 posee actividad de tipo -amilasa, y es obtenida del microorganismo Bacillus
licheniformis. La accin de estas enzimas radica en la ruptura o hidrlisis de las cadenas de
amilosa y amilopectina del almidn, hasta productos como la maltosa y dextrinas. Adems se
trata de una enzima bacteriana termorresistente que acta a 95 C (Kilara & Desai, 2001;
Blanchard & Katz, 2006).
La ruptura que efectan estas enzimas sucede de manera aleatoria, es decir, puede darse
a nivel interno de la cadena del almidn o bien, en el extremo de la cadena. Esto ocasiona no
slo una disminucin de la viscosidad sino tambin, la liberacin de oligosacridos de bajo
peso molecular y una pequea proporcin de dextrosa (Ravi-Kumar & Umesh-Kumar, 2005;
Snchez et al., 2005; Blanchard & Katz, 2006). Por esto, se observa un incremento en todas las
variables respuesta analizadas en este caso, es decir, en los azcares totales y slidos solubles,
ya que la hidrlisis azarosa genera unidades libres de glucosa, que incrementan los azcares
totales y Brix, y la liberacin de dextrinas o cadenas pequeas de almidn, contribuye con un
aumento en la porcin soluble en agua.
Dado que en este caso, el tiempo de reaccin era una variable a evaluar, una vez
transcurrido el tiempo de reaccin, se termin la reaccin desnaturalizando la enzima, en este
caso con un bao de agua-hielo, debido a que la enzima acta a altas temperaturas. Esto debe
hacerse lo ms pronto posible y puede favorecerse con el uso de cido, pero como en este
 85

caso el pur se someta a otro tratamiento enzimtico posterior, no convena acidificar el

medio (Blanchard & Katz, 2006).
Cabe resaltar que para mantener la estabilidad de la enzima a altas temperaturas es
necesaria la presencia de iones de calcio para mantener la configuracin proteica a altas
temperaturas (Ravi-Kumar & Umesh-Kumar, 2005). Por ello, la enzima se disolvi previamente
en un baln aforado de 5,00 mL con CaCl2 al 1 %, as, adems de proveer la estabilidad
necesaria a la enzima, se favoreca la adecuada distribucin y homogeneizacin de la enzima
en el pur, pues al tratarse de cantidades tan pequeas, del orden de 50 L, era difcil el
proceso de aplicacin de la enzima.
Otro factor que afecta la actividad de las enzimas comerciales es la presencia de
polifenoles, que pueden secuestrar la enzima y por tanto, dejarla inactiva. Este efecto se evita
al poner en contacto el pur con el aire, pues en presencia de oxgeno las polifenol-oxidasas
endgenas oxidan los polifenoles presentes en la pulpa que polimerizan para dar compuestos
de alto peso molecular que no son capaces de inhibir la actividad de las enzimas agregadas
(Pilnik & Voragen, 1993). En este caso, la materia prima se recibe molida, y es posible que
durante la molienda se d dicha oxidacin, pero tambin la pulpa entra en contacto con el aire
durante el descongelamiento y la homogeneizacin.
Los resultados obtenidos concuerdan con los obtenidos por Thompson (2004), quien
encontr un aumento significativo en glucosa libre al utilizar un preparado enzimtico con
actividad -amilasa y amiloglucosidasa en pulpa de banano, pese a que en este caso,
Thompson utiliz banano totalmente maduro, de modo que el contenido de almidn que
degradar, era menor, as que el aumento en los niveles de glucosa tambin es muy moderado
(de 5,22 a 5,86 %).
Debe notarse adems que, el contenido mximo de azcares en pulpa de banano
totalmente maduro es cercano a 225 g/L, y en este caso se aument de 104 g/L a 138,2 g/L.
Esto significa que aunque se increment el contenido de azcares en un 32 %, an hace falta
aplicar ms enzimas para la completa degradacin del almidn en el pur de banano.
 86

5.2.2 Produccin de azcares fermentables a partir de dextrinas del pur de banano

Seguidamente, en el Cuadro XVI se muestran los resultados del tratamiento enzimtico

con el preparado comercial Enzima 2, sobre la pulpa ya tratada con la enzima 1.

Cuadro XVI. Efecto de la concentracin y el tiempo de aplicacin del preparado enzimtico

Enzima 2 sobre los azcares totales y slidos solubles (determinados gravimtricamente y
como grados Brix) de la pulpa de banano
Concentracin Tiempo de Azcares Slidos Slidos
Tratamiento enzima tratamiento totales* solubles solubles
(mg/kg) (horas) g/L (n-1) % (n-1) Brix (n-1)
1 560 24 169,2(2)a 20,3(0,2)a 17,7(0,3)a
2 560 48 166,6(4)a 20,95(0,03)a 17,2(0,3)a
3 840 24 163,4(5)a 20,6(0,5)a 17,4(0,6)a
4 840 48 173,4(11)a 21,4(0,4)a 16,7(0,6)a
5
(Luego de
300 30 minutos 141,4(2)b 17,9(0,4)b 16,3(0,6)b
tratado con
la enzima 1)
* Expresados como la suma de glucosa, fructosa y sacarosa
En una misma columna, valores no conectados por la misma letra presentan diferencias
significativas con un 95 % de confianza

Al igual que en el caso anterior, para este preparado enzimtico se vari la concentracin
de enzima y el tiempo de aplicacin del tratamiento, y las variables respuesta contempladas
fueron los azcares totales medidos por HPLC y los slidos solubles. En todos los casos, se
observa que hay diferencias significativas con respecto al pur tratado solo con la enzima 1,
pues las tres variables incrementaron significativamente al aplicar el preparado enzimtico
Enzima 2.
En este caso, para los azcares reductores el valor-p o la probabilidad de cometer error
tipo I fue de 0,0006, para los slidos solubles medidos gravimtricamente fue de 0,0012 y
 87

finalmente, para los slidos solubles expresados como Brix fue de 0,0014. Con esto, para
todas las variables respuesta, se puede afirmar que hay evidencia suficiente para descartar la
hiptesis nula de igualdad de medias entre todos los tratamientos. Luego, al aplicar la prueba
de Tukey, se hall que la diferencia radica respecto al pur inicial, que nicamente se ha
tratado con la enzima 1. Por consiguiente, se puede afirmar que la aplicacin de la enzima
produce un aumento significativo en la concentracin de azcares totales y por ende, en los
slidos solubles medidos tanto por gravimetra as como a travs de los grados Brix, con un
nivel de confianza de entre 98 y 99 %.
Cabe recalcar, que de igual forma que para el tratamiento anterior con la enzima 1, para
esta enzima tampoco se hallaron diferencias significativas entre los cuatro tratamiento
aplicados con distinta concentracin de enzima y diferente tiempo de tratamiento, as que se
eligi el tratamiento que significa menor gasto econmico, esto es, una concentracin de 560
mg/kg y un tiempo de 24 horas.
Los oligosacridos que se obtuvieron de la hidrlisis parcial en la licuefaccin deben
tratarse con enzimas para producir azcares libres que puedan ser utilizados como alimento
para las levaduras en la fermentacin, este proceso se conoce como sacarificacin, y consiste
en la ruptura de los enlaces -1,4 y -1,6 de la cadena de dextrina (Kumar et al., 2005; Snchez
et al., 2005; Blanchard & Katz, 2006).
Esto se hace con una enzima amiloglucosidasa, en este caso la que est presente en el
preparado utilizado proviene del hongo Aspergillus niger y acta removiendo unidades
individuales desde el extremo no reductor de la molcula. Por ello, como se presenta en el
Cuadro XVI, la actividad de esta enzima conlleva a un aumento en los azcares totales, Brix y
slidos solubles, por la liberacin de las unidades libres de glucosa, de ah que en todos los
casos, el pur de banano al que se le aplic la enzima present mayor concentracin de
azcares que el pur inicial, que solo se trat con la enzima 1. (Kilara & Desai, 2001; Ravi-
Kumar & Umesh-Kumar, 2005; Blanchard & Katz, 2006).
Bajo condiciones ptimas, la glucoamilasa es capaz de transformar al menos un 95 % de las
dextrinas en glucosa, la cual puede ser fcilmente fermentada por las levaduras durante la
produccin de alcohol. Las condiciones de operacin que se recomiendan son temperaturas de
alrededor 50-60 C, pH de 4,0-5,0 y un tiempo de reaccin de 1-4 das. Con esto se evidencia
que siempre el tiempo de reaccin necesario para esta enzima es prolongado, y se observa
 88

que las condiciones ptimas que se reportan en la literatura en cuanto a temperatura y pH se

acercan mucho a las que se utilizaron en estos ensayos (Kilara & Desai, 2001; Mera et al.,
2003; Kumar et al., 2005).
Uno de los factores que influye en este tiempo prolongado de reaccin es que, la velocidad
de la hidrlisis enzimtica se ve afectada por el tamao del sustrato, por la estructura y por los
enlaces en la secuencia de la cadena. Por ejemplo, la amiloglucosidasa de A. niger , hidroliza
maltosa 100 veces ms rpido que la isomaltosa, en tanto que la panosa la degrada en tan solo
un 45 % de la velocidad de la maltosa, es decir, que los enlaces 1,6 que estn cerca de enlaces
1,4 son atacados ms rpidamente que cuando se encuentran enlaces 1,6 solos (Snchez et al.,
2005). Esta es una de las razones por las cuales, el tiempo de tratamiento con la enzima 2
asciende al orden de das, dado que se trata de sustratos complejos, como dextrinas u otros
oligosacridos, sobre los que la reaccin no se da con tanta facilidad.
Sin embargo, tambin debe definirse con cuidado el tiempo de reaccin con la
amiloglucosidasa, ya que tiempos excesivos tienen un efecto contraproducente, ya que la
enzima tambin cataliza la reaccin inversa, esto es, polimerizar unidades de glucosa
individuales para generar oligosacridos. La reaccin es relativamente lenta y por ello, siempre
se observa un mximo de glucosa pronunciado antes de que empiece a decaer, pero, debe
tenerse el cuidado de inactivar la enzima en el punto correcto para evitar este decaimiento
(Blanchard & Katz, 2006). En este caso, la enzima se inactiv en un bao de glicerina tras un
aumento en la temperatura.
Pese a que en este caso se realiz el tratamiento enzimtico previo a la fermentacin, es
importante mencionar que actualmente, los estudios donde se realiza la sacarificacin
simultneamente a la fermentacin han cobrado gran importancia (Kumar et al., 2005; Araya,
2010).
Adems, un punto importante que se debe rescatar, es que en cierta manera, el diseo
experimental con la enzima 2, fungi como prueba confirmatoria de los resultados del diseo
experimental con la enzima 1, pues como se puede observar, con el tratamiento 1, que es el
de menor tiempo y concentracin de enzima, se obtuvieron 138,2 g/L de azcares totales.
Luego, para realizar el tratamiento con la enzima 2, se trat el pur con la concentracin y
tiempo seleccionados en el paso 1, y se obtuvo una concentracin final de 141,4 g/L, valor muy
 89

cercano al encontrado con el primer diseo. Esto permite concluir que los datos del
tratamiento enzimtico con la enzima 1, son reproducibles.
Nuevamente, igual que con el caso pasado, se nota que la concentracin de azcares
mxima alcanzada ronda los 160 g/L, en contraparte con la mxima que se reporta para el
banano en su estadio de maduracin total, que puede ascender hasta a 225 g/L. Esto se debe a
que en este caso, no se trata de pur simple de banano, sino que es un pur de banano con un
alto contenido de fibra, de manera que an luego del extensivo tratamiento enzimtico que se
aplic, no se logra el contenido mximo de azcares que s se podra alcanzar en pur de
banano. Adicionalmente, otro factor que pudo impedir que se alcanzase una mayor
concentracin de enzima es a la actividad de la enzima, la condicin del almidn que por
ejemplo pudiese ser almidn nativo- entre otros factores como temperatura, pH, agitacin,
que impidieron que las reaccin de liberacin de los azcares fermentables se completara.
En la ficha tcnica del producto, se recomiendan concentraciones de entre 480 y 840
mg/kg, con un pH entre 4 y 5 y a una temperatura de maceracin de 61 C. La concentracin
que se eligi est dentro del rango recomendando por el proveedor, el pH del pur es muy
cercano al recomendado por el proveedor (pH=5,5) y la temperatura que se eligi es
ligeramente menor, ya que se utiliz la misma a la que se aplica la enzima 3 con el fin de hacer
el proceso ms viable y sencillo a nivel industrial, al mantener una misma temperatura de
tratamiento.
A la vez, esta misma ficha tcnica indica que bajo estas condiciones la conversin es de
hasta 96%, sin embargo, en este caso an quedaron remanentes de almidn debido a que no
se alcanz la concentracin mxima de azcares para banano maduro. Esto puede deberse a
que la matriz de almidn de banano es muy compleja, puede contener almidn nativo adems
de inhibidores de las enzimas y adems, para tiempos de sacarificacin menores de 40 horas,
los proveedores recomiendan una temperatura de maceracin superior, de 64 C.

5.2.3 Degradacin de pectinas y celulosa presentes en el pur de banano

En el Cuadro XVII se muestran los resultados de la ltima etapa del tratamiento

enzimtico, esta vez utilizando el coctel Enzima 3, aplicado al pur tratado tanto con la
enzima 1 como con la 2.
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Cuadro XVII. Efecto de la concentracin y el tiempo de aplicacin de la enzima 3 sobre los

azcares totales y slidos solubles (determinados gravimtricamente y como grados Brix) de la
pulpa de banano
Concentracin Tiempo de Azcares Slidos Slidos
Tratamiento enzima tratamiento totales* solubles solubles
(mg/kg) (minutos) g/L (n-1) % (n-1) Brix (n-1)
1 240 60 166,02 (4,73)a 16,2 (0,3)a 20,07 (0,07)a
2 240 120 167,83 (3,21)a 17,0 (0,3)a 20,12 (0,08)a
3 360 60 157,17 (1,23)ab 17,0 (0,5)a 20,07 (0,05)a
4 360 120 160,88 (8,20)ab 17,0 (0,5)a 20,08 (0,04)a
5
(Luego de
560 24 horas 153,37 (0,92)b 16,8 (0,3)a 20,06 (0,01)a
tratado con la
enzima 2)
En una misma columna, valores no conectados por la misma letra presentan diferencias
significativas con un 95 % de confianza
* Expresados como la suma de glucosa, fructosa y sacarosa

Para este preparado se evaluaron cuatro tratamientos que se compararon con respecto al
pur inicial, antes de ser tratado con la enzima 3. En dichos tratamientos se vari, al igual que
en los otros casos, la concentracin del complejo enzimtico y el tiempo de reaccin. Segn los
resultados obtenidos, no se presentaron diferencias significativas en slidos solubles en
ninguno de los casos, es decir ni entre tratamientos ni con respecto al pur inicial, que no se
trat con la enzima 3.
Con respecto a azcares, se present una diferencia significativa, tal y como se muestra en
el Cuadro XVII, pero la tendencia no es clara, esto por cuanto, no hay una diferencia marcada
entre tratamientos ni con respecto al pur inicial que no se trat con la enzima 3. Para esta
prueba, la probabilidad de cometer error tipo I fue de 0,0148, con esto se afirma que hay
diferencias significativas entre tratamiento. Al aplicar la prueba de comparacin de medias de
Tukey, se observa que los tratamientos 3 y 4 no son diferentes del tratamiento inicial, en tanto
que los tratamientos 1 y 2 s son significativamente diferentes del inicial, lo cual no concuerda
 91

con lo esperado pues se trata de los tratamientos en que se utiliz menor concentracin de
enzima.
Para el caso de los Brix el valor-p o la probabilidad de cometer error tipo I fue de 0,0692,
por lo tanto, no hay evidencia suficiente para rechazar la hiptesis nula as que se concluye
que no hay diferencias significativas entre los distintos tratamientos con enzima ni con
respecto al pur que no se trat con la enzima 3. Por otro lado, con respecto a los slidos
solubles, la probabilidad asociada fue de 0,8079, as que de igual manera, en cuanto a esta
variable se puede concluir que no hay diferencia significativa entre los purs tratados con
enzima con respecto al pur que no se trat con este preparado enzimtico.
Tal y como se mencion a priori, el sistema enzimtico 3 consta de un juego de enzimas
con actividad combinada y accin sinergstica de celulasas y pectinasas, ambos carbohidratos
parietales encargados de proporcionar rigidez, soporte y turgencia de la clula (Kyamuhangire
et al., 2002). Conociendo esto y segn la caracterizacin del pur inicial que se estudi en el
apartado anterior, conviene la aplicacin de este tipo de enzimas para degradar parte de la
fibra que est presente en el pur de banano.
Estas enzimas provienen de microorganismos como Trichoderma reesei y Aspergillus niger.
Particularmente las celulasas producidas por A. niger se caracterizan por la efectividad que
tienen en la degradacin de la celulosa nativa y cristalina, pues produce y secreta un complejo
celuloltico con tres actividades necesarias para la hidrlisis, endo--1,4-glucanasa, exo--1,4-
glucanasa y -1,4-glucosidasa (Ghose, 1987; Ovando & Waliszewski, 2005). As que el fin de
aplicar esta enzima al residuo de pur de banano es, disminuir el contenido inicial de celulosa
(g/100 g), para consecuentemente aumentar la concentracin de azcares fermentables.
Para este tratamiento era de esperarse, un aumento en los azcares reductores, puesto
que la hidrlisis de la celulosa ocurre en tres pasos. Primero actan las enzimas -1,4-
glucanasa que degrada las cadenas amorfas de celulosa a oligosacridos. En la segunda fase, la
exo-1,4-glucanasa permite la liberacin de unidades de celobiosa y glucosa. Y finalmente, la
hidrlisis contina pero esta vez en las zonas cristalinas gracias al efecto sinrgico de las exo y
endo glucanasa (Ovando & Waliszewski, 2005). Sin embargo, el proceso descrito no se logr
evidenciar, debido a que tras la aplicacin de la enzima no se obtuvo un aumento en la
concentracin de azcares totales, resultados que se presentan en el Cuadro XVII. Una de las
razones que pudo entorpecer este proceso es la presencia de la lignina que impide el
 92

desempeo de las enzimas durante la hidrlisis, pues las enzimas crean enlaces con esta que
no son funcionales. Por ello, se han reportado estudios donde previo al tratamiento
enzimtico se lleva a cabo la deslignificacin parcial del material, y con ello, los tratamientos
enzimticos posteriores dan como resultado un mayor rendimiento de azcares (Kovacs et al.,
2009).
Asimismo, la asociacin de la lignina con la hemicelulosa y celulosa, hace ms difcil la
degradacin comercial de la celulosa tanto como si fuese nativa, que es sumamente resistente
a la hidrlisis. Los materiales asociados deben ser removidos y la estructura cristalina debe
destruirse si se desea mejorar la hidrlisis enzimtica. Tratamientos con lcali, cido, vapor y
molienda pueden ser utilizados para preparar el material celulsico para la hidrlisis
enzimtica (Kilara & Desai, 2001; Eveleigh et al., 2009).
Otra razn que afecta el rendimiento de la hidrlisis es el tratamiento trmico. Por
ejemplo Kovacs et al., (2009) reportan que las materias primas que se trataron con
tratamientos trmicos muy severos, reportaron menores rendimientos en azcares,
probablemente debido a que con un tratamiento tan severo se generan altas concentraciones
de productos inhibitorios. Entonces, por una parte es deseable aplicar tratamientos con calor o
vapor para degradar la lignina, pero este tratamiento, si es a muy alta temperatura, puede
originar compuestos que inhiben la enzima. Esto pudo haber sucedido en este caso, ya que la
pulpa de banano se esteriliz a muy alta temperatura, 121 C.
Es importante notar que, el pur inicial que se utiliz para el tratamiento con la enzima 3,
fue el que se trat previamente con la enzima 2, y cuyo contenido de azcares luego del
tratamiento ascendi a 153 g/L. Sin embargo, este contenido de azcares es significativamente
distinto del contenido de azcares obtenido luego del tratamiento 2 cuando se realiz el
diseo, que fue de 169,2 g/L (azcares totales alcanzados con el tratamiento 1, Cuadro XVI).
Esto quiere decir, que el tratamiento con la enzima 2 no es del todo reproducible, ya que para
el diseo experimental se trabaj en Erlenmeyers de 250 mL, en tanto que para tratar pur
para iniciar el tratamiento con la enzima 3, se trabaj en Erlenmeyers de 1 L, de manera que
este escalamiento produjo diferencias en los resultados obtenidos con el tratamiento
enzimtico, que posiblemente se atribuye a que la distribucin de calor en el Erlenmeyer de
mayor tamao no fue tan homognea como s lo fue en el Erlenmeyer pequeo, adems tal y
 93

como lo expresa Galindo (1993), al escalar un proceso biotecnolgico , se presentan problemas

de mezclado.
Pese a que los resultados del Cuadro XVII no representan beneficio alguno, dado que no se
evidencia un incremento en azcares fermentables, el tratamiento con el complejo de
pectinasa y celulasa no se descart, puesto que numerosos autores reportan mltiples
ventajas con su uso. Por ejemplo, la aplicacin de enzimas celulasas y pectinasas en purs de
frutas resulta en una disminucin de la viscosidad, un aumento de los slidos solubles y del
rendimiento de jugo y adems, favorece operaciones posteriores de centrifugacin y
ultrafiltracin, esto debido a que, al degradar los polisacridos parietales, se forman poros que
mejoran la difusin del solvente a travs del tejido de la fruta o el vegetal, facilitando la
extraccin de los componentes (Silva et al., 2004; Ovando & Waliszewski, 2005; Valley
Research Inc, s.f.).
Adems, el uso de las pectinasas en la industria de alimentos ha venido incrementando
debido a que aumentan tanto la velocidad de filtracin como el porcentaje de extraccin de
jugo de fruta y aceites esenciales y comestibles, y a la vez, reducen la turbidez y mejoran la
clarificacin, el sabor y otros atributos sensoriales en jugos con fines comestibles. Las enzimas
pcticas reducen la turbidez del jugo de uva en la produccin de vino, adems permiten un
aejamiento ms veloz del vino (Kilara & Desai, 2001; Ovando & Waliszewski, 2005).
Por lo anterior, se efectu el tratamiento enzimtico de la pulpa utilizando el menor
tiempo y la menor concentracin, con el fin de determinar si efectivamente el uso de estas
enzimas ejerca un efecto sobre la viscosidad del pur. Los resultados se muestran
seguidamente en el Cuadro XVIII.

Cuadro XVIII. Efecto del tratamiento enzimtico con la enzima 3 sobre la viscosidad de la pulpa
de banano, medido con un viscosmetro de rotacin tipo Brookfield

Pur de banano Viscosidad (cP) a 25 C*

Enzima 3 (240 mg/kg; 60 min) (196 2) x 103 a

Sin Enzima 3 (221 4) x 103 b

* Promedio de tres rplicas con su respectivo intervalo de confianza (=0,05); en una
misma columna datos no seguidos por la misma letra presentan diferencias significativas
 94

Como se observa en el Cuadro XVIII, se midi la viscosidad del pur antes y despus de la
aplicacin de la enzima 3, en este caso s existe una diferencia significativa en la viscosidad del
pur luego de que se aplica el preparado de enzimas. El valor-p o la probabilidad de cometer
error tipo I fue de 0,0006 y esto indica que, existe evidencia suficiente para rechazar la
hiptesis nula y por tanto, la aplicacin de la enzima conlleva a una disminucin importante en
la viscosidad del pur.
Con los datos del Cuadro XVIII, se puede derivar que la viscosidad disminuy en un 11 %
luego de que el pur se trat con la enzima 3, esta disminucin es muy baja con respecto a lo
reportado por otros autores como Stoll et al. (2003), quienes consiguieron reducir la
viscosidad en ms de un 60 % en orujo de zanahoria a los 60 minutos, esto utilizando una
preparacin combinada de la enzima 3 en una concentracin de 500 mg/kg y otra enzima con
actividad celuloltica en la misma concentracin. Con lo anterior, se recomienda evaluar el
efecto de la utilizacin de dos enzimas conjuntamente para degradar los carbohidratos
parietales, pues su accin sinrgica podra generar mejores resultados en cuanto a la
disminucin de la viscosidad del pur.
De acuerdo con lo reportado por Ovando & Waliszewski (2005), con la aplicacin de este
tipo de enzimas se da una reduccin en la viscosidad y en los slidos insolubles suspendidos,
pues las enzimas actan sobre los polisacridos parietales, celulosa y pectina. La liberacin
aleatoria de los exo-azcares o azcares terminales de la cadena de celulosa, genera un
aumento en los slidos solubles, medidos como Brix. Sin embargo, como est sujeto a la
hidrlisis azarosa de estos extremos, el incremento es ms sutil que el observado con los otros
concentrados enzimticos.
Lo anterior explica, por qu en este caso no se obtuvo un incremento significativo en los
azcares totales del pur tratado con enzima. Sin embargo, el tratamiento con esta enzima es
conveniente debido a la disminucin de la viscosidad de la pulpa, lo que concuerda con lo que
se ha reportado en otros estudios. Esto ocurre gracias a que, tras la degradacin de los
compuestos macromoleculares parietales, se liberan los sustratos contenidos en la clula hacia
el medio acuoso, esto finalmente desemboca en una disminucin de la viscosidad (Gazania,
2003).
Una posibilidad de mejorar el tratamiento est en que, algunos autores han utilizado una
mezcla de los preparados Celluclast y Ultrazym y se han obtenido mejores resultados, pues al
 95

parecer, la combinacin tiene un efecto sinrgico. Asimismo, en este estudio se concluy que
la efectividad de las enzimas depende de la naturaleza qumica del sustrato, as como tambin,
una pre-digestin enzimtica del material, favorece la liberacin de los compuestos de inters,
como aceites esenciales y azcares (Ovando & Waliszewski, 2005).
Una vez realizados los tratamientos enzimticos con los tres preparados comerciales, se
definieron las condiciones de aplicacin de los mismos, de manera secuencial con el fin de
obtener un pur con mayor contenido de azcares y menor viscosidad, lo que se traduce en
mayor extraccin de jugo. Con esto, en la Figura 12 se esquematiza el procedimiento
completo, partiendo desde pur de banano hasta la fermentacin. Debe notarse que en todos
los casos el tratamiento se utiliz en los niveles ms bajos de concentracin y de tiempo, lo
que desde el punto de vista econmico, es muy favorecedor, ms considerando que las
enzimas puras tienen elevados costos y que las condiciones operativas del tratamiento
(agitacin constante y control de temperatura), son bastante desfavorables desde el punto de
vista econmico.
 96

a)
 97

b)

Figura 12. Flujo de proceso propuesto para la obtencin de bioetanol a partir de pulpa de
banano va fermentacin
a) Condiciones de tratamiento enzimtico definidas
b) Condiciones de tratamiento utilizadas en planta piloto
 98

Seguidamente, en el Cuadro XIX se muestran los resultados de la caracterizacin del pur

de banano inicial, as como el del pur de banano final, luego del tratamiento secuencial con
los tres preparados enzimticos, con el fin de concluir sobre los efectos de las enzimas sobre la
composicin del pur utilizado.

Cuadro XIX. Comparacin de las caractersticas fsicas y qumicas del residuo de pur de
banano antes y despus de macerar con tres cocteles enzimticos1
Residuo de pur Residuo de pur
Anlisis de banano de banano
inicial** macerado**
Humedad (g/100g) 74,5 0,2 a 77 1b
Cenizas (g/100g) 0,54 0,01 a 0,59 0,01a
Slidos solubles (Brix) 11,3 0,5 a 20,0 0 ,3 b
Azcares totales (g/L)* 101,9 0,3 a 168 01 b
pH 5,15 0,04 a 5,13 0,04 a
Acidez (g c.ctrico/100 mL) 40 3 a 34 4 b
Material insoluble en alcohol MIA (g/100 g
48 1 a 38 3 b
banano en base seca)
Material insoluble en alcohol y agua MIAA
26,2 0,7 a 19,1 0,8 b
(g/100 g banano en base seca)
Lignina (g/100 g banano en base seca) 26 2 a 39 1 b
Hemicelulosa (g/100 g banano en base
4,0 0,8 a 2,0 0,4 b
seca)
Celulosa (g/100 g de banano en base seca) 7 2a N.C. b
1
Tratamiento enzimtico utilizado: Enzima 1: 300 mg/kg y 30 min; Enzima 2: 560 mg/kg y 24
horas; Enzima 3: 240 mg/kg y 60 min.
** En una misma fila, valores no conectados por la misma letra presentan diferencias
significativas con un 95 % de confianza
N.C.: No cuantificable
 99

En el cuadro anterior se presentan los resultados de la caracterizacin del pur antes y

despus del tratamiento enzimtico secuencial seleccionado, adems se indica si la diferencia
es o no significativa para cada variable. De acuerdo con la prueba estadstica utilizada, en este
caso la comparacin pareada, se observa que hay diferencias significativas en la humedad,
slidos solubles expresados como grados Brix, azcares, MIA, MIAA, lignina, hemicelulosa y
celulosa al aplicar el tratamiento secuencial de enzimas sobre el pur de banano.
En el caso de la humedad, esta aumenta luego de los tratamientos debido a que para
distribuir la enzima en el pur y asegurarse de que el esparcimiento haya sido homogneo, la
enzima se pre-disuelve en una pequea porcin de agua (5,00 mL para cada enzima), de ah
que la humedad del pur final haya sido ligeramente mayor. Los azcares aumentan
significativamente y por consiguiente, los grados Brix tambin son significativamente mayores,
esto se puede justificar pues, como se discuti con anterioridad, las enzimas amilasa y
amiloglucosidasa liberan unidades de azcares reductores libres a partir de la cadena de
almidn, por tanto los azcares son considerablemente mayores en el pur luego de tratado.
Por esta degradacin enzimtica del almidn, disminuye significativamente el contenido
de material insoluble en alcohol y el material insoluble en alcohol y agua, ya que el almidn
insoluble se convierte en azcares simples. Adems la accin de las enzimas celulasa y
hemicelulasa sobre la celulosa y hemicelulosa respectivamente, conlleva a la degradacin de
estos polmeros y esto se refleja en una disminucin significativa de estos parmetros en el
pur luego de tratado.
En cuanto a la lignina, se observa que tras el tratamiento enzimtico esta aumenta
significativamente, pero esto probablemente se atribuye a algn error con el mtodo. Cabe
sealar que la metodologa empleada no parece ser la indicada para este sustrato en
particular, que es bastante rico en fibra, y especialmente, con el mtodo de lignina se
presentaron mltiples problemas ya que el papel de fibra de vidrio empleado se degrad
durante la calcinacin de la lignina, por tanto, es posible que tal situacin introdujera una
importante fuente de error que se vislumbra en este resultado incongruente.
Ahora bien, evaluando el proceso o panorama general del tratamiento enzimtico, se
observa que, a pesar de que se eligieron las condiciones ms favorecedoras, este toma mucho
tiempo e implica adems mucho gasto, por las condiciones de agitacin y control de
temperatura constante que se han de tener. Sin embargo, estas consideraciones debern
 100

someterse a un anlisis financiero detallado, puesto que grandes esfuerzos se han dirigido a la
degradacin de los polisacridos lignocelulsicos en monmeros que puedan ser empleados
para convertirlos en etanol combustible. En un plan econmico viable, ambas partes, la
celulsica y la hemicelulsica, deben ser utilizadas para el proceso. La hidrlisis completa de la
celulosa y hemicelulosa requiere un plan bien diseado que incluya un coctel enzimtico con
preparados de endoglucanasas, celobiohidrolasas y enzimas que acten en las cadenas
laterales de xilanos y mananos (Kovacs et al., 2009).
A nivel industrial probablemente el proceso enzimtico no sea muy viable y quizs haya
que evaluar opciones ms prcticas para el escalamiento, tales como el enriquecimiento con
azcar comercial, esto permitira obtener un rendimiento de etanol similar al obtenido en este
caso que se discutir ms adelante-, sin tener que incurrir en tratamiento enzimtico, que
finalmente puede resultar ms costoso.
Adems, en el apartado 4.3.4.4, se coment que para el tratamiento del lote completo de
pur, el proceso se realiz en marmita, pues a partir de este pur se extrajo todo el jugo
necesario para las fermentaciones alcohlicas con el jugo de tipo A. En esta prueba, debido a
limitaciones con el horario y el uso de la caldera, el tratamiento enzimtico se tuvo que reducir
al tiempo de una jornada laboral ordinaria, aproximadamente 8 horas, por tanto, el tiempo en
que se dej actuar la enzima 2 fue de tan solo 6,5 horas. Sin embargo, pese a esta disminucin
del tiempo de tratamiento, la concentracin de azcares totales del pur luego de tratado por
un tiempo reducido fue similar a la obtenida cuando se trat por 24 horas con la enzima 2. De
esto se puede inferir que, los tiempos de tratamiento propuestos en el diseo experimental
estn sobredimensionados, pues de igual forma se obtuvieron los resultados deseados con un
tiempo de tratamiento considerablemente menor a los evaluados.
Este resultado es de particular importancia debido a que permitira agilizar en gran medida
el tratamiento previo necesario para utilizar el residuo de pulpa de banano como sustrato para
la fermentacin. Sin embargo, estos resultados deben estudiarse cuidadosamente y es
recomendable que el tratamiento se realice por triplicado y ms an, evaluarlo en marmitas
de distintas capacidades y condiciones, para comprobar si realmente esta metodologa es
escalable.
 101

5. 3 Pre-tratamiento fsico de la materia prima para la fermentacin

En el apartado anterior se discuti la necesidad de aplicar un tratamiento enzimtico

seriado para aumentar los azcares fermentables de la materia prima, ahora, se discutirn las
operaciones unitarias realizadas para la obtencin de jugo, estas son el prensado y la
clarificacin. El rendimiento de estas operaciones se presenta en el Cuadro XX.

Cuadro XX. Rendimiento de las operaciones unitarias de prensado y clarificacin centrfuga

utilizadas para la extraccin de jugo de banano a partir de pulpa de banano macerada
Operacin Rendimiento (%)*
Prensado 51 2
Clarificacin 98,9 0,6
* El resultado que se expresa es el promedio de tres rplicas con su respectivo intervalo de
confianza (=0,05)

Una vez que el pur fue tratado con las tres enzimas, prosigue la etapa de separacin del
jugo, que es un sustrato mucho ms manejable para la fermentacin que el pur, permite una
mejor transferencia de calor, favorece la agitacin y a la vez, facilita el contacto entre el
sustrato y el microorganismo, al tratarse de un medio lquido.
Por esta razn, se procedi a extraer el jugo del pur, mediante una etapa de prensado o
estrujamiento, que consiste en la ruptura de las clulas de frutas, semillas y hortalizas para la
liberacin de compuestos de inters, ejemplos de ello lo son la extraccin de aceites vegetales
y de jugos de frutas que pueden ser consumidos directamente o bien, utilizarse para
tratamientos posteriores como la fermentacin (Brennan et al., 1998; Fellows, 2000). En este
caso se utiliz la operacin de prensado para extraer el jugo de banano, material que se utiliz
como medio en la fermentacin.
La operacin de prensado puede realizarse en un solo paso o bien, en dos pasos,
reduciendo antes el tamao de la materia prima, pero por lo general, en un proceso en una
sola etapa, la operacin es ms econmica, permite rendimientos ms altos y tiene menores
costos capitales y operativos (Fellows, 2000). En este caso, la materia prima vena ya molida,
as que nicamente se someti a una operacin de prensado. El rendimiento de la operacin
fue de 51 %, esto significa que 100 kg de pur, se obtienen nicamente 50 kg de jugo de
 102

banano que puede ser utilizado como sustrato para la fermentacin. Este dato es algo bajo,
pues sera deseable obtener mayor cantidad de jugo, pero esta operacin est condicionada a
las mximas condiciones de carga y presin que se podan emplear en la prensa piloto que se
utiliz.
Adems, es deseable obtener la mxima cantidad de jugo con la menor cantidad de slidos
y compuestos fenlicos. Esto se logra utilizando bajas presiones y la menor cantidad de
prensados, adems es necesario aumentar la presin lentamente para evitar la formacin de
una torta muy densa e impenetrable (Fellows, 2000). Por estos motivos, el prensado de la
pulpa se realiz aumentando la presin poco a poco hasta alcanzar la mxima recomendada,
adems el uso de doble bolsa de manta permite que quede menor cantidad de slidos
insolubles suspendidos en el jugo final. Luego de obtener este jugo de banano, producto del
prensado, se someti a una clarificacin centrfuga para la remocin de los slidos insolubles
suspendidos remanentes.
Para esta operacin el rendimiento (98,9 %m/m), es muy alto debido a que el jugo
contiene una cantidad mnima de slidos luego del prensado, ms an debido a que se prens
utilizando doble manta. Cabe sealar que esta operacin de clarificacin se realiz porque en
este caso era de inters tener un jugo totalmente clarificado para poder llevar un control de la
poblacin microbiana, que se realiz por densidad ptica. Por esto, se tena que remover el
slido para que no introdujera un error en la lectura de la poblacin de levadura, pero, para
fines industriales, esta operacin se puede obviar. Sin embargo, valga hacer la aclaracin de
que, an cuando se pas el jugo tres veces consecutivas por la clarificadora centrfuga,
siempre se evidenci a simple vista una diferencia en el nivel de translucidez de este jugo, es
decir, el jugo de banano A se observ ms opaco o turbio que el jugo B, que era totalmente
translcido. Esta diferencia fsica se asocia con un diferente contenido de slidos insolubles
suspendidos, sin embargo, esta cuantificacin no se llev a cabo.
El procedimiento aplicado para la obtencin de este jugo parece ser bastante sencillo,
pero para cantidades industriales tendran que utilizarse otros equipos. El equipo empleado
fue una prensa hidrulica que consiste en un cilindro con perforaciones en el cual se coloca la
pulpa en mantas y al ser comprimida por un mbolo, permite la lixiviacin del jugo. Por ello, en
este tipo de equipo, la carga, compresin, apertura y limpieza de estas unidades requiere
mucha mano de obra y para lograr una extraccin mxima a menor costo se deberan buscar
 103

prensas continuas capaces de ejercer presiones crecientes en diferentes sectores (Brennan et

al., 1998).

5.4 Fermentacin alcohlica de jugo de banano va Saccharomyces cerevisiae

Las tendencias actuales miran hacia el incremento de la produccin de combustibles no

derivados del petrleo, de ah que se ha puesto ms nfasis en producir combustibles
competitivos como el etanol (Roche, 2009). En la siguiente seccin, se muestran y analizan los
resultados obtenidos en los estudios realizados para la produccin de bioetanol a partir de
jugo de banano utilizando Saccharomyces cerevisiae para la fermentacin alcohlica.

5.4.1 Pruebas preliminares

Previo al diseo estadstico como tal, se realizaron pruebas preliminares en bioreactor,

para elegir parte de las variables en estudio. En primer lugar, se montaron dos bioreactores de
7 L totales, con 5 L de volumen de trabajo, con jugo de banano B y una concentracin de
levadura de 1,5 g/L, variando nicamente la suplementacin o no del medio. Esta prueba se
realiz con dos objetivos, evaluar si no haba problemas al utilizar el mximo volumen de
trabajo y tambin, evaluar los resultados de crecimiento microbiano y produccin de etanol en
un medio no enriquecido.
En cuanto al primer aspecto, se observ que an en el medio enriquecido, con sales
minerales, no se tuvieron problemas de presencia de espuma ni de presurizacin del
bioreactor cuando se utiliz el equipo lleno con jugo de banano hasta su capacidad mxima, ni
tampoco cuando se utiliz jugo de banano sin suplementar. Sin embargo, para prevenir la
formacin de espuma en la superficie, se observ que era suficiente con agregar 2 mL de
aceite mineral estril, como antiespumante, al inicio de la fermentacin, con esto, no se form
espuma excesiva durante el transcurso del proceso.
Una vez que se comprob que a nivel prctico no hubo problemas con llenar los
bioreactores a 5 L, se mont un bioreactor ms, esta vez con el volumen mximo jugo de
banano B, sin suplementacin, pero esta vez con la mitad del inculo inicial, esto es 0,75 g/L.
Los resultados de esta prueba, junto con la prueba preliminar anterior, se muestran en las
Figuras 13, 14 y 15.
 104

9,00
Suplementado 1,5 g/kg
8,80
Sin suplementar 1,5 g/kg
Poblacin de levaduras (lev/ml)

8,60
8,40 Sin suplementar 0,75 g/kg

8,20
8,00
7,80
7,60
7,40
7,20
7,00
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo de fermentacin (horas)

Figura 13. Variacin de la poblacin de levaduras en funcin del tiempo, para la

fermentacin alcohlica de jugo de banano con S.cerevisiae, con y sin suplementar y con dos
concentraciones de levadura

20,0

18,0 Suplementado 1,5 g/kg

16,0 Sin suplementar 1,5g/kg

Slidos solubles (Brix)

14,0 Sin suplementar 0,75 g/kg

12,0

10,0

8,0

6,0
0 20 40 60 80
Tiempo de fermentacin (horas)
Figura 14. Variacin de los slidos solubles (expresados como Brix) en funcin del tiempo,
para la fermentacin alcohlica de jugo de banano con S.cerevisiae, con y sin suplementar y
con dos concentraciones de levadura
 105

180,00
Azcares suplementado 1,5 g/kg
160,00 Etanol suplementado 1,5 g/kg
Azcares sin suplementar 1,5 g/kg
140,00
Etanol sin suplementar 1,5 g/kg
120,00
Concentracin (g/L)

Azcares sin suplementar 0,75 g/kg

100,00 Etanol sin suplementar 0,75 g/kg

80,00

60,00

40,00

20,00

0,00
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo de fermentacin (horas)

Figura 15. Variacin de la concentracin de azcares y etanol en funcin del tiempo, para la
fermentacin alcohlica de jugo de banano con S.cerevisiae, con y sin suplemento nutricional y
con dos concentraciones iniciales de levadura

Al analizar el comportamiento de la poblacin microbiana (Figura 13), se observa que

todas presentan la misma forma tpica, que posteriormente se detallar. A la vez, las pruebas
en las que se utiliz la misma concentracin de levadura, parten del mismo punto y tambin,
alcanzan la misma concentracin al final de la fermentacin, en tanto que, para la prueba en la
que se utiliz la mitad de la levadura, la poblacin inicial es menor e incrementa con menor
velocidad que las otras dos corridas, en las que se utiliz mayor cantidad de inculo. Adems,
se observa que la fermentacin con menor cantidad de inculo, acab tambin con menor
poblacin de levaduras, es decir, la diferencia se mantuvo en el transcurso de toda la
fermentacin.
En la Figura 14 se puede ver el comportamiento de los slidos solubles, medidos como
grados Brix. Al respecto se observa que, en la fermentacin en la que se utiliz jugo de banano
 106

suplementado y la mayor concentracin de levadura inicial, los grados Brix descendieron ms

que con los otros tratamientos, y la fermentacin se estabiliz o culmin cerca de las 44 horas
del proceso. Algo similar ocurri con la fermentacin en que se us la mayor concentracin de
levadura, pues tambin a las 44 horas luego de inocular, los slidos solubles se estabilizaron y
llegaron al mnimo. Sin embargo, en este caso, los grados Brix mnimos alcanzados fueron de 8,
en tanto que en el primer caso el proceso se estabiliz en 7 Brix.
Adems, en la fermentacin en que se utiliz la mitad de levadura, se observa que, a las 60
horas se alcanz la misma concentracin mnima de slidos solubles (expresados como grados
Brix), que se alcanz cuando se emple la mxima concentracin de levadura en medio sin
suplementar. Esto ocurre con 16 horas de diferencia, de manera que basados en estas pruebas
preliminares, parece que la disminucin en la concentracin inicial del inculo desemboca en
un mayor tiempo de proceso.
Este mismo comportamiento se puede evidenciar en la Figura 15, pues en ambas
fermentaciones con la mayor concentracin de levadura, los azcares se agotan totalmente a
las 44 horas de proceso, en tanto que, para la fermentacin con la menor cantidad de
levadura, los azcares no se han consumido totalmente an a las 60 horas de proceso. Lo
mismo sucede con la concentracin de etanol, en las fermentaciones con la mayor
concentracin de levadura, se alcanza la mayor concentracin de etanol a las 44 horas, pero,
para la corrida con la mitad del inculo inicial, la concentracin mxima de etanol se logra
hasta las 60 horas de proceso.
Con estos resultados se confirm lo que se establece en la literatura, esto es que se
requieren mayores tiempos de fermentacin cuanto menor sea la concentracin del inculo
inicial, ya que conforme mayor sea la poblacin inicial, los azcares se consumen con mayor
velocidad, lo que finalmente significa en una reduccin de los costos capitales y de produccin
del etanol (Roche, 2009; Recalde, 2010). Por tal motivo, se eligi la mayor concentracin de
levadura para las pruebas del diseo experimental que se discuti previamente, ms an al
considerar que la levadura es de uso industrial y su precio es bastante accesible. A la vez, esta
levadura liofilizada se activ previamente a la inoculacin en caldo peptonado con el fin de
pre-disolverla, lo que facilita la distribucin y favorece la reduccin de la fase de acople al
nuevo medio o fase lag (Snchez, 2005).
 107

Adicionalmente, los resultados de esta prueba parecen mostrar que no hay diferencias
entre la fermentacin con el medio suplementado o no. Este resultado cobra validez
considerando el alto costo de las sales minerales que se utilizan como suplementos. Por ello,
para obtener datos con veracidad y respaldo estadstico, se decidi incluir esta variable como
parte del diseo experimental.

5.4.2 Pruebas definitivas de fermentacin alcohlica de jugo de banano con S. cerevisiae

En primer lugar, en la Figura 16 se muestran las curvas de evolucin de la poblacin

microbiana durante el progreso de la fermentacin en el tiempo.

8,5

8,4

8,3
Log poblacin celular (levadura/mL)

8,2

8,1

8,0
B suplementado =0,0088/h
7,9
B sin suplementar =0,078/h
7,8
A sin suplementar =0,083/h
7,7 A suplementado =0,086/h
7,6

7,5

7,4

7,3
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo de fermentacin(h)

Figura 16. Variacin de la poblacin microbiana en funcin del tiempo de fermentacin con
Saccharomyces cerevisiae en jugo de banano A y B, suplementado y sin suplementar

El seguimiento de la poblacin se realiz a travs de la cuantificacin de la densidad ptica

en un espectrofotmetro, pues esta medida se correlaciona con el conteo poblacional a travs
 108

de una curva de calibracin, en la que se emplea una cmara de Neubauer. Esta cmara
permite el conteo de clulas sin embargo, lo recomendable es realizar una tincin con azul de
metileno pues las clulas vivas reducen este colorante a su forma incolora en tanto que, las no
viables permanecen azules, en este caso debe recalcarse que esta coloracin no se realiz y
por tanto, las curvas representadas muestran tanto la poblacin viable como la no viable
(Rusell, 2003).

La Figura 16 presenta los resultados de la poblacin microbiana en funcin del tiempo de

fermentacin y muestra el comportamiento esperado o tpico para una curva de crecimiento
microbiano, pues adopta una tendencia logartmica y estacionaria hacia el final del tiempo.
Como se mencion en el marco terico, la primera etapa de la curva consiste en una etapa de
adaptacin al medio donde no se observa un aumento pronunciado en crecimiento, ni en el
consumo de azcares y la produccin de etanol, puesto que apenas la levadura est
generando el paquete enzimtico necesario para utilizar el sustrato del que dispone en el
nuevo medio y activar su metabolismo (Shuler & Kargi, 1992; Rusell, 2003; Araya, 2010).

En este caso no se observ la fase de latencia, puesto que desde el segundo muestreo, dos
horas despus de haber realizado la inoculacin, se observ un aumento en la masa celular, y
ms an, en el tercer punto, doce horas luego de haber inoculado. Una posibilidad es que no
se haya observado esta primera etapa debido a que no se realizaron muestreos ms seguidos
al inicio de la fermentacin, pero tambin, puede ser que el inculo se encontrara en muy
buen estado y que la activacin previa en caldo peptonado le haya servido para que al realizar
la inoculacin la fermentacin empezara prcticamente de inmediato. A la vez, el medio no
parece contener algn factor que retarde o impida el crecimiento, ms an cuando la fuente
principal de carbono lo son, los azcares simples.

Lo anterior concuerda con lo que expone Rusell (2003), quien indica que cuando se utiliza
levadura seca activa, la duracin de la fase lag es muy corta, y por ende en este caso se
justifica que no se haya podido observar, ms porque la siguiente muestra se tom a las 12
horas de inoculacin.

En otros estudios en los que se ha utilizado S. cerevisiae tampoco se ha observado fase lag
(Galindo et al., 1993; Hoyer, 2008). Sin embargo, en el estudio realizado por Thompson (2004)
en que se utiliz tambin S. cerevisiae, jugo de banano maduro y el mismo nivel de
 109

inoculacin, la fase lag dur entre 4-5 horas, este mismo tiempo de fase lag lo reportan Zapata
& Pelez (2010) al utilizar tambin jugo de banano.

La etapa que se vio en este caso muy marcada, es la de crecimiento logartmico, pues
puede notarse que desde las 0 horas hasta aproximadamente las 23 horas en todos los casos,
se presenta una tendencia exponencial de crecimiento microbiano, porque ya las clulas se
han adaptado a su nuevo ambiente y se multiplican exponencialmente a velocidad constante,
de ah que el consumo de azcares y la produccin de etanol se da a velocidad mxima y
tambin uniforme (Rusell, 2003). Desde el punto de vista industrial, esta fase es la que cobra
mayor importancia pues es donde se generan los productos de inters.

Posteriormente, luego de las 23-25 horas de fermentacin y hasta el final de la curvas a y

b, hacia las 67 horas, se observa que la poblacin se mantuvo bastante constante o que las
diferencias son mnimas al tratarse de una escala logartmica. Esto ocurre porque los
nutrientes se van haciendo limitantes o se acumulan productos txicos, debe recalcarse que la
levadura tiene la capacidad de sobrevivir an sin la adicin de nutrientes por un largo perodo,
de ms de 40 horas (Shuler & Kargi, 1992; Russell, 2003).

Pero adems, es muy importante sealar que la poblacin que se midi, no distingue entre
viable o no viable, as que en este perodo que se evidencia como constante, existe la
posibilidad de que ya estuviese decayendo. La fase de muerte ocurre porque no hay
suficientes nutrientes para que el microorganismo se pueda reproducir o por la formacin de
inhibidores o sustancias txicas producto del metabolismo de la clula, que al alcanzar
concentraciones muy altas, impiden la multiplicacin de las clulas (Hernndez, 2003).

Como se mencion anteriormente, debido al mtodo empleado para la curva de

calibracin, en este caso no es posible determinar a partir de qu hora se comienza a dar la
muerte de la levadura, as que como una oportunidad de mejora se recomienda utilizar azul de
metileno o algn otro colorante de tipo redox para poder diferenciar la poblacin viable de la
no viable.

Es importante tambin de esta figura, que no hay diferencias significativas en la pendiente

de crecimiento de la fase logartmica entre las curvas de los cuatro tratamientos. Esto quiere
decir que sin importar la suplementacin del medio o el contenido de slidos insolubles
 110

suspendidos, la levadura aumenta con la misma tasa de reproduccin, cuando se encuentra en

la fase logartmica de su ciclo.

Otro aspecto interesante que se evidencia en la Figura 16, es que no se presenta el

comportamiento diaxico, esto es que la curva de crecimiento presenta una nica etapa
logartmica y exponencial. Este tipo de curvas frecuentemente se asocian con que los azcares
simples -glucosa, fructosa y sacarosa-, se consumieron al mismo tiempo y que no hay otra
fuente importante de energa. Esto porque, en medios complejos con varios azcares se da un
consumo secuencial de diferentes fuentes de energa, empezando por los simples hasta que
recurre a los ms complejos. Por ello, en estos casos la curva de crecimiento presenta dos
fases de latencia o adaptacin, seguidas por sus respectivas fases logartmicas. Esto no se
present en este caso, as que las levaduras no emplearon otro tipo de azcares de mayor
complejidad (Shuler & Kargi, 1992).

Valga hacer la aclaracin de que, con el mtodo empleado para realizar la cuantificacin
de azcares por HPLC, se utiliz cido diluido como fase mvil, de manera que es imposible la
cuantificacin de la sacarosa como tal, debido a que se hidroliza y se cuantifica como glucosa y
fructosa. Sin embargo, an cuando el mtodo empleado no permiti la cuantificacin de la
sacarosa, Rusell (2003) reporta que la sacarosa no se observa en el perfil de azcares del
mosto debido a que su hidrlisis ocurre a gran velocidad, y luego los azcares simples ingresan
por difusin pasiva en la clula donde siguen la ruta metablica regular.

En el caso de la sacarosa, pese a tratarse de un disacrido, no se consume despus debido

a que la hidrlisis en sus azcares simples constituyentes, glucosa y fructosa, ocurre a una alta
velocidad catalizado por la enzima invertasa. Luego por difusin pasiva estos azcares ingresan
a la clula donde ocurre la fermentacin, de ah que la sacarosa no se observa en el perfil de
azcares del mosto (Rusell, 2003). Adicionalmente con el mtodo empleado para realizar la
cuantificacin por HPLC no se cuantifica la sacarosa como tal, sino los monosacridos simples
que la componen y que resultan de la hidrlisis con el cido sulfrico presente en la fase mvil.

Adems, se aprecia que en todos los casos el aumento total en la poblacin microbiana es
de aproximadamente una unidad en escala logartmica, pues pasa de 7,40 a 8,40 como
mximo. Este aumento no es muy importante, lo que es de esperar considerando que el medio
no se aire, sino que todo el oxgeno disponible fue el del espacio de cabeza. Bajo condiciones
 111

de oxgeno limitado, la levadura toma la ruta metablica de fermentacin antes que la de

reproduccin celular y produccin de biomasa, esto solo lo hace mientras se consume el
oxgeno disponible en el espacio de cabeza que no se desplaz (Scragg, 1996).

En su estudio utilizando jugo de banano con la misma cepa de S.cerevisiae, Thompson

(2004) observ un incremento de 5x107 a 4x108 lev/mL para la poblacin microbiana, en este
caso la poblacin microbiana pasa de 2,5x107 a 1,7x108 lev/mL, es decir, es ligeramente menor
que la reportada, pues los datos varan dentro del mismo ciclo logartmico, lo que hace que la
diferencia no sea importante. Esto se puede deber a que en las pruebas realizadas no se aire
el medio, sino que todo el oxgeno consumido fue el que qued en el espacio de cabeza, en
tanto que, en el estudio de Thompson, el medio se aire durante las primeras 18 horas para
estimular este crecimiento microbiano, de ah que la poblacin alcanzada sea mayor.

En el estudio realizado por Galindo et al., (1993) con melazas y bajo condiciones
totalmente anaerbicas (desplazamiento del oxgeno con nitrgeno y llenado del bioreactor al
95 % de su volumen nominal), la concentracin de levadura pas 2 g/L a 3,5 g/L, esto significa
que el crecimiento microbiano fue mayor en estos ensayos, pues la concentracin inicial fue
de 1,5 g/L pero increment hasta a 6 g/L (concentracin que equivale a 1,87 x108 lev/mL). Esto
es de esperar pues como se mencion, las condiciones de esta fermentacin no fueron
anaerobias, como s lo son en el estudio de Galindo y colaboradores.

Tambin Zapata & Pelez (2010) reportan un cambio en la concentracin de levadura de 1

a 5 g/L, sin embargo, en este reporte no se mencionan las condiciones de aireacin del medio.
Con estos resultados, se comprueba que el crecimiento que se present en este estudio es
normal al tratarse de un medio sin aireacin y sin desplazamiento del espacio de cabeza.

En las curvas de la Figura 16 no se muestra una diferencia marcada en cuanto a las

variaciones de la poblacin debido al tipo de jugo o a la suplementacin. La curva de la
fermentacin con el jugo A y en medio suplementado muestra valores ms elevados de
poblacin, luego se ubican las curvas del jugo B suplementado y sin suplementar, y la curva
inferior es la del jugo A en medio no suplementado. En las Figuras, las curvas con medios
suplementados son ligeramente mayores que sus contrapartes con medio no suplementado,
pero sin embargo, estas diferencias no son significativas al observar los datos de velocidad
especfica de crecimiento que se muestran.
 112

A continuacin, en la Figura 17 se muestra la variacin de los azcares totales y etanol,

para jugo de banano B.

180,00
Azcares B suplementado
160,00
Azcares B sin suplementar
140,00
Etanol B suplementado
120,00
Concentracin (g/L)

100,00 Etanol B sin suplementar

80,00

60,00

40,00

20,00

0,00
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo de fermentacin (h)

Figura 17. Variacin de la concentracin de azcares totales y etanol en funcin del tiempo de
fermentacin con Saccharomyces cerevisiae en jugo de banano B, suplementado y sin
suplementar, a una temperatura de fermentacin de 30 C y con una concentracin de inculo
inicial de 1,5 g/L

A la vez, en la Figura 18 se muestra la variacin de los azcares totales y etanol, para el

jugo de banano A.
 113

180,00
Azcares A sin suplementar
160,00
Azcares A suplementado
140,00

120,00 Etanol A suplementado

Concentracin (g/L)

100,00 Etanol A sin suplementar

80,00

60,00

40,00

20,00

0,00
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo de fermentacin (h)

Figura 18. Variacin de la concentracin de azcares totales y etanol en funcin del tiempo de
fermentacin con Saccharomyces cerevisiae en jugo de banano A, suplementado y sin
suplementar, a una temperatura de fermentacin de 30 C y con una concentracin de inculo
inicial de 1,5 g/L

Primeramente se observa que la concentracin inicial de azcares se encuentra en un

intervalo entre 150 y 170 g/L. Esta alta concentracin de azcares favoreci el denominado
efecto Crabtree, lo que significa que la levadura toma la va anaerbica para la obtencin de
energa, consumiendo los azcares fermentables del medio y produciendo etanol (Gottschalk,
1986), an en presencia de oxgeno en el medio, debido al remanente que quedaba en el
espacio de cabeza.
Al inicio de la fermentacin, como hay oxgeno remanente en el espacio de cabeza por el
aire que no se desplaz, parte de los azcares fermentables se consumen en la va aerbica de
respiracin celular (Figura 3), y por esto durante las primeras 20-23 horas de la fermentacin
se observ un aumento en la poblacin (Figura 16). A la vez debido al punto expuesto con
anterioridad, se presenta la ruta fermentativa (Figura 4), en la que se consumen azcares
hasta que se acaban o llegan a un punto donde la concentracin remanente no se consume,
 114

que es lo que se evidencia en la Figuras 17 y 18, es en esta segunda etapa en la que se generan
productos o metabolitos de inters industrial, como lo es en este caso el etanol, que es un
metabolito primario pues se produce al mismo tiempo que se consumen los azcares (Scragg,
1996).
Al comparar las curvas de los cuatro tratamientos evaluados, se observan diferencias
importantes. Al utilizar el jugo de banano A, el consumo de azcares se da ms rpido, en
menor tiempo que con el jugo de banano B, sustrato con el que se requiere ms tiempo para
que se agoten todos los azcares, y estas diferencias se reflejan en la productividad mxima de
los tratamientos, datos que se muestran en el Cuadro XXI y que se discutir ms adelante. A la
vez, con un mismo sustrato tambin se presentan diferencias en funcin de la suplementacin,
pues para el jugo A, el azcar se consume en su totalidad ms rpido cuando el medio est
suplementado que cuando est sin suplementar (31 horas contra 36 horas). Lo mismo sucedi
en las fermentaciones con jugo de banano B, donde los azcares se agotaron a las 34 y 48
horas para el medio suplementado y sin suplementar respectivamente.
Otro aspecto importante de notar es que, pese a alta concentracin inicial de azcares, en
casi todos los casos, excepto para el jugo de A sin suplementar, los azcares se consumieron
en su totalidad, lo que significa que no se dio una inhibicin por sustrato, pues la levadura se
mantuvo viable an a altas presiones osmticas, para metabolizar estos azcares (Araya,
2010). Esto se sustenta a la vez, con los resultados del Cuadro XXI, donde no existen
diferencias significativas para el porcentaje de azcares consumidos a las 67 horas de proceso.
Adicionalmente, en las Figuras 17 y 18 se puede observar tambin la concentracin de
etanol producido en el transcurso de la fermentacin. El etanol es un metabolito primario,
esto significa que se forma durante el metabolismo primario de la clula. Por ello, su velocidad
de formacin est estrechamente relacionada con el crecimiento celular, de ah la congruencia
o similitud en la forma de estas curvas y las mostradas en la Figura 16. En estos tipos de
fermentacin inclusive es usual emplear la curva del producto como indicador del
comportamiento poblacional, ms an cuando se utilizan bacterias de tamao muy pequeo
que no se pueden cuantificar tan fcilmente por mtodos de conteo directo (Shuler & Kargi,
1992; Araya, 2010).
Para todos los tratamientos es preciso notar que la concentracin inicial de etanol es de 0
g/L, pues no se adicion nada de esta sustancia en el medio al comenzar el proceso y empieza
 115

a aumentar gradualmente hasta llegar a un mximo. La curva de produccin de etanol es, en

este sentido, lo opuesto a las curvas de consumo de azcares, ya que en el perodo de tiempo
en que estos se consumen, se da el aumento en la concentracin de etanol, producto principal
de las rutas metablicas de fermentacin alcohlica.
En todos los casos, llega un tiempo a partir del cual no se da un aumento significativo en la
concentracin de etanol producida y a la vez, existen diferencias entre las concentraciones
finales alcanzadas y el tiempo en que se alcanzan entre los distintos tratamientos evaluados.
As, las fermentaciones en las que se utiliz jugo de banano B alcanzaron una concentracin
final de etanol significativamente mayor, cercana a los 70 g/L, en tanto que en las que se
utiliz como materia prima el jugo de banano tipo A, la concentracin final de etanol alcanzada
fue de aproximadamente 60 g/L. Esta diferencia, adems de ser estadsticamente significativa
como lo muestra el Cuadro XXI, cobra importancia cuando se consideran los costos de
purificacin, pues es beneficioso tener caldos con mayor contenido alcohlico para abaratar
los costos de destilacin. Pero, debe tomarse en cuenta, que la concentracin inicial de
azcares en el jugo A fue menor (aproximadamente 10 g/L) que la concentracin de azcares
en el jugo de B, esto hace que la concentracin mxima posible de etanol producido tambin
sea menor.

Adems de la diferencia en concentracin debida al tipo de jugo, se presentaron

diferencias debidas a la suplementacin del medio. En ambos casos, las fermentaciones con
jugo de banano suplementado alcanzaron la concentracin mxima de etanol en menor
tiempo, 31 y 34 horas respectivamente para el jugo de banano A y B respectivamente,
mientras que cuando no se utiliz suplementacin, la concentracin mxima cuantificada de
etanol se alcanz hasta las 36 y 48 horas en ese mismo orden. Cabe hacer la aclaracin de que
en ningn caso se puede aseverar que el tiempo final reportado coincida con el tiempo
experimental, pues el que se reporta se calcul con el modelo, sin embargo en todos los casos
la correlacin entre dicha curva y la ecuacin fue muy alta, lo que indica que es un buen
mtodo para predecir el tiempo final de la fermentacin.

Estas diferencias en cuanto al tiempo de produccin del etanol y la concentracin final de

este metabolito, se reflejan ms claramente en la productividad, que se muestra en el Cuadro
XXI y que se discutir ms a fondo posteriormente, pero a grandes rasgos, la productividad
 116

total de los tratamientos con el jugo B es significativamente mayor que en los que se utiliz el
jugo A, pues la concentracin de etanol en los primeros tratamientos es mayor. A la vez, la
productividad mxima, que es la pendiente de la curva de produccin de etanol, es
significativamente mayor cuando se utiliz jugo suplementado, puesto que los azcares se
consumen con mayor velocidad, estos resultados, expresados con un 95 % de confianza.

Luego de la estabilizacin, se observa que la curva de produccin de etanol empieza a

decaer, porque los microorganismos desarrollan un paquete enzimtico para metabolizar el
etanol como fuente de obtencin de energa, y esto a su vez coincide con el inicio de la fase de
muerte de la levadura por la acumulacin de productos txicos o limitacin de nutrientes
(Shuler & Kargi, 1992). En este caso, nuevamente se puede evidenciar la congruencia de la
curva de etanol con la del crecimiento microbiano mostrada en la Figura 16, sin embargo no es
posible observar este decaimiento en ninguno de los dos casos, debido a que no se diferenci
la poblacin viable de la no viable y tambin a que la fermentacin se detuvo antes de ver el
descenso del etanol.

A la vez, es de importancia recalcar que se observa congruencia entre las curvas de

azcares y las de etanol para cada medio, pues ocurre que en el tiempo en que se agotan los
azcares la concentracin de etanol se estabiliza hasta el final de la fermentacin. Tambin
ambas presentan la misma tendencia, esto es que la fermentacin ocurre significativamente
ms rpido con el jugo de banano A y que la suplementacin del medio tambin acelera la
velocidad de la fermentacin.
Los resultados mostrados concuerdan con lo esperado y reportado en la literatura. Sin
embargo, el seguimiento de la fermentacin a travs de los azcares totales cuantificados por
HPLC, presenta el inconveniente de que los resultados se conocen varios das luego, ya que la
muestra lleva un tratamiento especial para poder analizarse y el equipo debe prepararse
previamente para la cuantificacin. De ah que es conveniente, realizar otra lectura rpida que
se relacione directamente con los azcares para conocer el curso de la fermentacin en
determinado momento. Para tal fin, en estas pruebas se midieron los slidos solubles en cada
muestra, y el comportamiento de esta medida en el tiempo se presenta en la siguiente figura.
 117

20,0

B suplementado

17,5 B sin suplementar

A sin suplementar
15,0
A suplementado
Slidos solubles (Brix)

12,5

10,0

7,5

5,0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (h)

Figura 19. Variacin de los slidos solubles (expresados como grados Brix) en funcin del
tiempo de fermentacin con Saccharomyces cerevisiae en jugo de banano suplementado y sin
suplementar para jugo de banano A y B

En la Figura 19 se observa el comportamiento de los slidos solubles cuantificados como

grados Brix a travs del tiempo de fermentacin, en general, la tendencia es la misma que para
los azcares. Inicialmente, el contenido de grados Brix en todos los casos estuvo en un rango
de 16,7-19,0 Brix aproximadamente, dependiendo del sustrato y de la presencia o no de las
sales minerales que se utilizaron como suplemento, y que con el paso del tiempo disminuye
aceleradamente, hasta llegar a una constante que se mantiene hacia el final de la
fermentacin, en un valor entre 6,5 y 7,5 Brix. En este punto, cuando los grados Brix se
estabilizan, los azcares descienden a 0 g/L, es decir, la fermentacin culmina porque no hay
ms sustrato para continuar.
 118

En estas curvas s se observan diferencias en los tiempos de estabilizacin entre

tratamientos. En las fermentaciones con el jugo A la curva se estabiliza en menor tiempo que
las fermentaciones con jugo B, es decir, el consumo total de azcares se da ms rpido con el
jugo A. Por su parte, la suplementacin parece ayudar a que la fermentacin concluya ms
rpido, ya que en ambos casos con los medios suplementados la curva se estabiliza en menos
horas, 31 y 34 horas respectivamente para los jugos A y B, mientras que para sus contrapartes
sin suplementar la curva se observa estable hasta las 36 y 48 horas, en el orden citado. Acerca
de la suplementacin se discutir ms adelante, pero, ciertamente estas diferencias en el
tiempo de fermentacin se evidencian y sustentan de manera estadstica, tal y como se
muestra en los resultados del Cuadro XXI, donde se evala el tiempo de fermentacin como
una variable respuesta.

En todos los casos, los grados Brix remanentes corresponden a otros slidos que estn
disueltos en el medio, como las sales que se agregan en los medios suplementados o las que
estn per se en el jugo, adems de cidos y aminocidos o cadenas cortas de pptidos, de ah
que al final de la fermentacin, pese a que no quedan azcares remanentes, los grados Brix no
son cero.

Este comportamiento es el mismo que se observ y detall en las Figuras 17 y 18 para los
azcares, dado que los grados Brix guardan una relacin muy estrecha con la medida de los
sacridos del mosto, pues se trata de todos los slidos solubles que hay en el medio
(Thompson, 2004). Por ende, se puede relacionar esta medicin con los azcares solubles que
haya en cada momento de la fermentacin, as esta medicin de grados Brix que es sencilla,
requiere poca preparacin de la muestra y brinda un resultado casi inmediato, puede utilizarse
como parmetro rpido de control y seguimiento del curso de la fermentacin.

Desde las primeras horas de fermentacin se observa un descenso de los grados Brix
debido al consumo de azcares por parte de la levadura para el crecimiento y reproduccin
celular, ms tarde, el descenso contina con ocasin del metabolismo anaerobio en que se
consumen los azcares remanentes para la produccin de energa y etanol, hasta que
finalmente se estabiliza.

La comparacin de los grados Brix con los azcares, que se muestra seguidamente en la
Figura 20.
 119

20,0 200,00

Grados Brix B Suplementado 180,00

17,5
Azcares B suplementado 160,00
Slidos solubles (Brix)

140,00

Azcares totales (g/L)

15,0
120,00

12,5 100,00

80,00
10,0
60,00

40,00
7,5
20,00

5,0 0,00
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (h)

Figura 20. Comparacin de las curvas de azcares totales medidos por HPLC y expresados
como grados Brix para la fermentacin alcohlica de jugo de banano B suplementado

Al comparar ambas curvas de la Figura 20, se observa que existen grandes coincidencias,
que se presenta la misma tendencia y que a partir de la de grados Brix se puede deducir el
comportamiento de los azcares totales, aunque se desconozca su concentracin exacta.

Finalmente se estudia la produccin de glicerol en las fermentaciones realizadas. Despus

del etanol y el dixido de carbono, el glicerol es el producto ms notable de la fermentacin
alcohlica. Este metabolito cumple con dos funciones: acta como regulador de oxidacin-
reduccin en los procesos celulares y funge como regulador del estrs osmtico (Rusell, 2003;
Zhang & Xun, 2008). En cuanto al primer punto sealado, el glicerol aparece durante la
fermentacin porque en condiciones anaerobias las levaduras oxidan el exceso de NADH y
generan glicerol (Solana, 2011), en tanto que como osmoprotector, acta como un eficiente
osmolito a nivel intracelular, lo cual ayuda a evitar que la clula sufra lisis (Zhang & Xun, 2008).
 120

En la Figura 21 a continuacin se muestra la relacin de concentracin de glicerol vs

tiempo de fermentacin.

12,00

10,00

8,00
Concentracin de glicerol (g/L)

6,00

4,00 B suplementado

B sin
suplementar
2,00 A sin
suplementar

0,00
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (h)

Figura 21. Variacin de la concentracin de glicerol en funcin del tiempo de fermentacin con
Saccharomyces cerevisiae en jugo de banano suplementado y sin suplementar, proveniente de
dos empresas productoras

En una fermentacin alcohlica se espera que la concentracin de glicerol ronde entre 1 y

15 g/L con un promedio de 7 g/L, pero la cantidad final que se genere depende de mltiples
condiciones ambientales. Por ejemplo, en condiciones anaerobias, de alto estrs osmtico,
baja acidez y con cambios bruscos de temperatura, se generan mayores cantidades de glicerol,
pues le permite a las clulas sobrevivir antes los efectos del estrs ambiental (Scanes et al.,
1998; Rusell, 2003; Solana, 2011).
 121

En este caso, es de importancia cuantificar el glicerol pues este est relacionado de

manera inversa con el etanol, esto significa que cuanto mayor glicerol se forma, menor ser el
rendimiento para etanol, as que contrario al efecto positivo del glicerol en vinos en este caso
es deseable que se genere la menor cantidad posible de glicerol. El comportamiento de este
triol se observa en la Figura 19 y tiene una forma similar a la descrita para etanol.

En todos los casos se observa que se parte de 0 g/L al inicio de la fermentacin, pero la
concentracin va aumentando gradualmente hasta llegar a las 25 horas donde el proceso se
estaciona y la concentracin se mantiene ms o menos constante hasta el trmino de la
fermentacin. Nuevamente en este caso, se observa que con los jugos suplementados se
alcanza ms rpido la mayor concentracin, adems, para todos los casos la concentracin de
glicerol mxima fue de 6-7 g/L, exceptuando el tratamiento con jugo B suplementado donde la
mxima concentracin, al final de las horas fue de ms de 10 g/L. De manera que, la
concentracin final de glicerol es significativamente mayor con el jugo de banano B
suplementado, luego est el tratamiento con el jugo B no suplementado y finalmente, los
tratamientos en los que se produjo la menor concentracin de glicerol fueron los del jugo A
tanto suplementado como sin suplementar, todos con un 95 % de confianza.

Ahora bien, en todas las curvas que resumen el comportamiento de las fermentaciones
evaluadas, se han observado diferencias debidas al tipo de jugo utilizado y a la
suplementacin, por lo que conviene adentrarse en estos aspectos.

En la seccin 5.1 se habl sobre la caracterizacin de ambos jugos, y a groso modo no

existen diferencias en los componentes analizados para ambos jugos. Sin embargo, es
probable que existan diferencias que no se pudieron detectar con esa caracterizacin pues fue
muy general. Los resultados indican que hay diferencias entre estas materias primas, puesto
que con el jugo A la fermentacin es ms rpida, ya que en menor tiempo se consumen todos
los azcares y se produce la mxima concentracin de etanol.

Una posible diferencia entre estos jugos fue que el jugo de banano A, luego de prensado,
contena muchas partculas finas insolubles an, por lo que se clarific tres veces. Sin embargo
an despus de estas etapas mltiples, qued un remanente de slidos suspendidos, que se
observaron antes de empezar la agitacin del caldo en el bioreactor y al dejar en reposo el
jugo sin ninguna agitacin. Segn lo reportado por Ackland (2004), el banano contiene una
 122

fraccin importante de fibra insoluble (tal y como se observ en la caracterizacin de la pulpa),

que puede actuar como agente osmoprotector, lo que permite un mayor desarrollo y
viabilidad de la levadura. Adems, las partculas insolubles ayudan a que las levaduras
permanezcan en suspensin y sirven de soporte para la actividad fermentadora, lo que podra
ser la causa por la cual los resultados con el jugo de banano A present mejores resultados
desde el punto de vista de velocidad de produccin de etanol o de productividad.

El otro factor que gener diferencias entre tratamientos fue la suplementacin del medio,
que en este caso se realiz para aportar protenas, vitaminas, fsforo, nitrgeno y magnesio al
microorganismo durante el proceso. El efecto de la suplementacin es la disminucin del
tiempo de fermentacin, puesto que tal y como se observ, en los medios suplementados los
azcares se consumieron ms rpido y se obtuvo la mayor concentracin de etanol en menor
tiempo.

Esto se debe a que en general, al encontrarse ms nutrientes en el medio las levaduras

toleran ms el efecto del estrs osmtico, de temperatura e inclusive de la inhibicin por
producto. Uno de los nutrientes agregados es fuente de minerales, nitrgeno y factores de
crecimiento como vitaminas del complejo B (cido flico, piridoxina, niacina, cido pantotnico
y riboflavina), que son esenciales para el desarrollo de la masa celular (Stanbury & Whitaker,
1984; Araya, 2010).

Por otra parte, la fuente de nitrgeno que se utiliz es un compuesto orgnico, de bajo
peso molecular, fcilmente asimilable y contribuye con el crecimiento del microorganismo as
como en la produccin del etanol, y favorece ms que las fuentes de nitrgeno inorgnicas
(Stanbury & Whitaker, 1984; Buescher et al., 2001). El fsforo por su parte, est relacionado
con la adquisicin de energa mediante los enlaces exergnicos de fosfatos en la molcula de
ATP, cuando el nivel de fosfatos es mayor, aumenta la velocidad de formacin del producto
final, de ah que tambin se suplement con fsforo inorgnico (Amrane, 2000).

En tanto que, el in magnesio acta como activador de las enzimas involucradas en la va

glicoltica, estimula la sntesis de cidos grasos, regula las enzimas ATPasas de las membranas y
ejerce un efecto protector de los cultivos microbianos que sufren condiciones de estrs por
temperatura o presin osmtica (Russell, 2003; Buitrago & Tenjo, 2007).
 123

Todo lo anterior justifica el por qu la fermentacin con medios suplementados es ms

rpida, ya que los minerales, vitaminas y nitrgeno adicionados ayudan a que la clula
microbiana se mantenga estable an bajo condiciones adversas del medio para efectuar la
fermentacin ms pronto. Sin embargo, una desventaja de suplementar el medio es que, para
la asimilacin de las fuentes nitrogenadas se genera NADH, lo que aumenta el estrs redox
dentro de la clula y desemboca en una mayor concentracin de glicerol generado, esto se
evidenci ya que con el medio de B suplementado la concentracin de glicerol super los 10
g/L, mayor que en los otros casos (Scanes et al., 1998).

Pese a que la fermentacin se ve favorecida con la suplementacin, es claro que

igualmente se obtienen resultados satisfactorios con los jugos no suplementados, pues
finalmente la fermentacin culmina con las mismas cantidades de etanol y de consumo total
de azcares, solo que en mayor tiempo. Esto se debe a que, per se, el jugo de banano contiene
gran parte de los nutrientes que se utilizan en la suplementacin, que si bien es cierto no se
cuantificaron en este ensayo, en la literatura es reportada por varios autores. Por ejemplo, se
ha reportado que el sustrato de banano es una buena fuente de nitrgeno libre en forma de
aminocidos libres como triptfano, treonina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, cistena,
fenilalanina, tirosina, valina, arginina, histidina, alanina, cido asprtico, cido glutmico,
glicina, prolina, serina, lo que en la composicin general representa una concentracin de
nitrgeno de 1710 mg/L (Hammond et al., 1996; Robinson, 1999; Happi et al., 2007; USDA,
2011).

En cuanto a minerales, los cuatro que se encuentran en mayor concentracin son potasio
(2810 mg/L), sodio (425 mg/L), magnesio (200 mg/L) y fsforo (165 mg/L), pero adems se
encuentran otros como calcio, cinc, hierro, manganeso y cobre en cantidades menores a 100
mg/L (Hammond et al., 1996; Rusell, 2003; Mohapatra et al., 2010). Tambin se reporta que el
banano contiene vitaminas A y C, tiamina, rivoflavina y niacina, de modo que todos estos
nutrientes aunados favorecen la actividad metablica y de crecimiento de la levadura
(Nakasone & Paull, 1998).

A nivel de laboratorio es sencillo y accesible suplementar el medio con compuestos puros,

pues son pocas las cantidades requeridas, mas a la hora de escalar el proceso a nivel industrial
o con fines comerciales, el proceso se hace insostenible, pues los reactivos tienen un alto costo
 124

y adems, un nivel alto de suplementacin puede provocar problemas ulteriores para la

purificacin del caldo (Stanbury & Whitaker, 1984; Amrane, 2000). Por lo tanto, los datos
obtenidos en este estudio son bastante promisorios, pues revelan resultados igualmente
satisfactorios an con el jugo de banano sin suplementar.

El Cuadro XXI muestra comparativamente las variables respuesta de las fermentaciones

evaluando cuatro tratamientos en los que se vari el sustrato de fermentacin y la
suplementacin.
 125

Cuadro XXI. Resultados de las pruebas de fermentacin alcohlica utilizando Saccharomyces

cerevisiae a partir de jugo de banano proveniente de dos empresas productoras
Fermentacin (*)

Variable respuesta Jugo A Jugo A no Jugo B Jugo B no

suplementado suplementado suplementado suplementado

Velocidad especfica de
-1
0,086 0,003a 0,083 0a 0,088 0,001a 0,078 0,004a
crecimiento (h )
Rendimiento con respecto a
azcares a las 67 horas 45,6 0,3b 46 1b 42 1a 43 2a
(%m/m)
Rendimiento con respecto al
89,3 0,5b 91 3b 83 2a 83 3a
esperado (%m/m)

Productividad total 0,91 0,03b 0,94 0,02b 1,10 0,02a 1,08 0,02a

Productividad mxima 2,56 0,07b 1,8 0,3a 2,01 0,03a 1,48 0,03c

Productividad al trmino de
2,51 0,09b 1,74 0,03a 1,87 0,09a 1,16 0,02c
los azcares

Concentracin final de
61 2b 63 1b 74 1a 72 1a
etanol (g/L)
Concentracin final de
6,8 0,4c 6,52 0,05c 10,7 0,2a 7,6 0,2b
glicerol (g/L)
Porcentaje de azcares
consumidos a las 67 horas 100 0a 100 0a 99,96 0,08a 100 0a
(%m/m)
Tiempo de fermentacin
31 1b 36 0d 34 1a 48 0c
(horas)

* Para una misma fila, valores no conectados por una misma letra presentan diferencias
significativas con al menos un 95 % de confianza
 126

En primer lugar, la velocidad especfica de crecimiento indica con qu facilidad se

reproduce el microorganismo en determinado medio de cultivo, y esto depender de la
afinidad que tenga por el mismo y de la presencia de nutrientes y factores de crecimiento
(Recalde, 2010). En este caso todas las velocidades de crecimiento son bajas, esto por cuanto
el medio no se aire y adems la concentracin de azcares iniciales era muy elevada (similar a
las concentraciones de 165 g/L o 176 g/L para melaza y maz, respectivamente). Por estas dos
condiciones se favorece el metabolismo anaerobio de produccin de etanol en lugar de la
produccin de biomasa o crecimiento poblacional. Al mismo tiempo, se observa que no hay
diferencias significativas entre ninguno de los tratamientos, lo que significa que en ningn caso
se ve favorecida la reproduccin celular (Galindo et al., 1993; Nikolic et al., 2008).

Estos valores son similares al reportado por Rankovik et al., (2009) utilizando remolacha
azucarera, pues en las primeras 12 horas de la fermentacin, la velocidad mxima de
crecimiento estuvo en el rango de 0,0712 a 0,0754 h-1 para diferentes cepas de S.cerevisiae.
Cabe resaltar que en el estudio de Rankovik y colaboradores, durante el transcurso de estas
primeras 12 horas el medio se aire, en contraparte con las fermentaciones que se realizaron
en este estudio. Sin embargo, los resultados son bastante similares debido a que aunque no se
aire el medio, tampoco se desplaz el espacio de cabeza, y este provee oxgeno que favorece
el crecimiento celular.

En relacin con el rendimiento respecto a los azcares, es decir, la masa de etanol

generada dividida entre la masa de azcares fermentables disponibles, se observa que existe
diferencia significativa entre los rendimientos obtenidos para ambos jugos. Los rendimientos
obtenidos utilizando el jugo B son significativamente mayores que los rendimientos obtenidos
con el jugo A, pero esta diferencia se puede deber a que tal y como se mencion
anteriormente, el jugo A contena hasta 10 g/L menos de azcares totales que el jugo B.

Los datos de rendimiento obtenidos varan en el rango de 42-46 %m/m, cuando el mximo
esperado es de 51 %m/m, adems se considera que para materias primas de grado industrial
el mximo que se puede obtener es de 48 %m/m (Buitrago & Tenjo, 2007; Goh et al., 2010).
Con lo anterior, se observa que el rendimiento obtenido es muy satisfactorio pues se acerca
bastante el mximo esperado, ms an al tomar en cuenta que el sustrato es un desecho
 127

agroindustrial que no posee la pureza de un medio sinttico. No obstante, debe considerarse

que en el medio existen otros componentes que la levadura puede metabolizar para producir
etanol, y en este clculo se consideran nicamente los azcares fermentables glucosa, fructosa
y sacarosa, pero la levadura podra incluso degradar restos de almidn presente para liberar
azcares fermentables que metabolice rpidamente (Araya, 2010).

Adems el rendimiento obtenido es mayor al que obtuvieron Pereira et al. (2010) quienes
evaluaron diferentes suplementaciones en un medio sinttico utilizando glucosa como fuente
de carbono, y el mayor rendimiento obtenido fue de 43,8 %.

Con respecto a otras materias primas, el rendimiento es muy parecido al encontrado por
Galindo et al., (1993) para melaza utilizando S. cerevisiae en un tanque provisto de agitacin,
pues el rendimiento fue de 44 %m/m o al reportado por Rankovic et al. (2009), y de igual
forma, es cercano al rendimiento reportado por Zapata & Pelez con banano de rechazo y con
el mismo microorganismo (48 %m/m). Sin embargo, el rendimiento con jugo de banano, es
menor al que se reporta por Nikolic et al. (2008) para maz como sustrato, pues con este el
rendimiento ascendi a 59 %m/m.

Con microorganismos como Pichia stipitis se han alcanzado rendimientos similares a los
que se reportan en este estudio con S.cerevisiae, pues utilizando arroz como sustrato, el
rendimiento mximo alcanzado fue de 42 %m/m (Kumar et al., 2009).

Muy relacionado con la variable anterior, est el rendimiento respecto al terico, que
indica qu tan cercano fue el rendimiento experimental respecto al mximo que se puede
obtener de acuerdo con la estequiometra de la reaccin, que es de 51 %m/m. En este
aspecto, nuevamente se hallaron diferencias significativas debidas al tipo de jugo, donde el
rendimiento es significativamente mayor utilizando el jugo A.

Nuevamente, este dato es promisorio y mayor al alcanzado por Thompson (2004) quien
obtuvo rendimientos entre 73 y 82,9 %m/m, pero menor al rendimiento reportado por
Hammond et al. (1996) quienes lograron rendimientos de hasta 91 %m/m, los anteriores
utilizando banano como sustrato. El rendimiento alcanzado es similar al obtenido por Choi
(2008) utilizando pur de yuca como sustrato y alcanz un 83 %m/m con S. cerevisiae.
 128

En cuanto a las productividades, se calcul primeramente la productividad total, que es la

concentracin de etanol en el total del tiempo que se realiz la fermentacin. Tal y como se
observa en el Cuadro XXI, en este caso tambin hay diferencias significativas debidas a la
fuente o materia prima, pero se aventaja el jugo de banano B, con el cual la productividad
total de la fermentacin es significativamente mayor que la obtenida con el jugo de banano A.

Por su parte, la productividad mxima es la pendiente o velocidad mxima que se obtiene

en la fase logartmica de la curva de etanol contra el tiempo. Para esta variable, se
encontraron diferencias significativas interesantes, puesto que la menor productividad
mxima se obtuvo en el tratamiento con jugo de banano B sin suplementar, en tanto que, para
los tratamientos en que se utiliz jugo B suplementado y jugo A no suplementado, se
obtuvieron productividades mximas significativamente mayores que para el B sin
suplementar y finalmente, la mayor productividad mxima se obtuvo para el tratamiento con
jugo de A y medio suplementado, que fue significativamente mayor que para todos los otros
tratamientos en estudio.

Con respecto a otros sustratos como yuca y maz, utilizando S. cerevisiae la productividad
es similar, pues se reportan 2,15 g/(L h) y 2,26 g/(L h) respectivamente. Al mismo tiempo, la
productividad mxima con los jugos de banano B fue mejor que la reportada con melaza, que
alcanz los 1,8 g/(L h) (Choi et al., 2008; Nikolic et al., 2008; Rankovic et al., 2009).

Otra variable respuesta que se evalu, fue la productividad al agotamiento de los azcares,
esto es la concentracin de etanol obtenida en el tiempo en que se consumen totalmente los
azcares. Este dato es de importancia ya que en la productividad total no se considera que en
los diferentes tratamientos se dan diferencias en la velocidad con que se consumen los
azcares, debido a que se considera el tiempo total, en tanto que, con este dato s se toman
en cuenta estas diferencias. El comportamiento observado es el mismo que para la
productividad mxima, el tratamiento con menor productividad fue el B no suplementado,
mientras que la productividad fue significativamente mayor con los jugos B suplementado y A
no suplementado, y finalmente, la productividad ms alta se obtuvo para el jugo A
suplementado.
 129

Estos resultados de productividad concuerdan con los encontrados por Zapata & Pelez
(2010) quienes obtuvieron datos de entre 1,96 y 2,41 g/(L h), y son superiores a la
productividad obtenida en algunos estudios utilizando glucosa como sustrato. Sin embargo
estos autores sealan que esta productividad obtenida en procesos tipo batch es costosa y no
resulta rentable para la produccin de biocombustible, pero se puede duplicar el dato de
productividad en procesos en continuo.

Otra variable que se debe tomar en cuenta a la hora de evaluar la factibilidad de una
fermentacin es la concentracin final o total de etanol producido. En este aspecto, se
encontraron diferencias importantes entre ambos medios. As pues, la concentracin de
etanol producida con el jugo B fue significativamente mayor que la que se produjo con el jugo
A, tanto para el medio suplementado como para el no suplementado. La diferencia entre
ambos fue de aproximadamente 10 g/L.

Esta concentracin final es menor a la reportada por Thompson (2004) quien alcanz
concentraciones finales de etanol en el mbito de 76-79 g EtOH/kg mosto a partir de jugo de
banano, y mucho menor a la concentracin hallada en este mismo estudio con sacarosa
comercial como sustrato, donde la concentracin final fue de 104-106 g EtOH/kg mosto.

Una mayor concentracin de etanol es deseable, sobre todo en procesos industriales, pues
el producto requiere un proceso de concentracin menor, lo que disminuye los costos de
purificacin ulterior (Hujanen et al., 2001).

En otros estudios donde se utiliz melaza y pur de yuca con un alto contenido de
azcares, se obtuvieron concentraciones superiores de etanol al final de la fermentacin, de
75 g/L y 85,03 g/L, respectivamente (Galindo et al., 1993; Choi et al., 2008). Por otra parte, en
estudios donde se empez con sustratos diluidos en azcares, se obtuvieron mostos con tan
solo 10,0 g/L, 30 g/L y 12,47 g/L de etanol en sustratos como glucosa, banano y salvado de
arroz hidrolizado, respectivamente (Dombek & Ingram, 1987; Kumar et al., 2009; Zapata &
Pelez, 2010).

Tambin se evalu la concentracin total producida de glicerol, dado que es un metabolito

indeseable y disminuye el rendimiento en la produccin de etanol. En este caso, los dos
 130

tratamientos con jugo de banano A produjeron la menor concentracin de glicerol, a su vez, el

tratamiento con jugo B sin suplementacin produjo una concentracin significativamente
mayor de glicerol y en ltima instancia, el tratamiento en que se utiliz jugo de banano B con
suplementacin, favoreci la mayor produccin de glicerol.

Otra de las variables respuesta estudiadas fue el porcentaje de azcares consumidos. En

este caso no hay diferencias significativas entre tratamientos debido a que en todos los casos
estudiados se consumi la totalidad de los azcares presentes, lo que nuevamente indica que
no se present inhibicin por sustrato, ya que la levadura logr metabolizar todo el sustrato
del que dispona.

Finalmente, la otra variable de inters fue el tiempo de fermentacin. Cabe reiterar, que
este tiempo se estim a travs de una ecuacin pues el tiempo exacto al que la fermentacin
se estabiliz no se puede conocer con exactitud debido a que se tienen espacios de tiempo de
ms de 12 horas en los que no se muestre, debido a que corresponda a perodos no hbiles
en el laboratorio, as que este tiempo es tan solo un estimado y en muchos casos es probable
que sea menor, pero slo se puede determinar si se realizan muestreos sucesivos y menos
espaciados. En este caso, todos los tratamientos fueron significativamente diferentes entre s,
el menor tiempo de fermentacin fue en el que se utiliz jugo de banano A suplementado,
seguido del jugo B tambin suplementado, posteriormente se ubica el tratamiento con jugo A
y no suplementado y finalmente, el tratamiento que tard ms tiempo fue en el que se
emple jugo B como sustrato y no se suplement con sales minerales.

Este tiempo de fermentacin exceptuando el tratamiento con jugo B sin suplementar- es

similar al que se requiri en otros estudios utilizando jugo de banano como sustrato, donde el
tiempo necesario para obtener la mxima concentracin de etanol fue de aproximadamente
30 horas y a la vez, menor al que se requiere en medios sintticos con sacarosa, que puede
ascender hasta a 48-50 horas (Dombek & Ingram, 1987; Thompson, 2004).

Adems, en otros estudios en los que se utilizaron sustratos con un contenido similar de
azcares iniciales, la fermentacin tom entre 40-42 horas, utilizando sustratos como melazas
y pur de yuca (Galindo et al., 1993; Choi et al., 2008). Mas en cambio, cuando el sustrato
 131

tiene un contenido de azcares iniciales mucho menor, como para el jugo de banano utilizado
por Zapata & Pelez (2010), que tena una concentracin inicial de 100 g/L, la fermentacin
tom 16 horas.

Valga hacer la aclaracin que para estas fermentaciones nicamente se vari el grado de
purificacin del jugo (A o B) y la suplementacin o no del medio, pero se mantuvieron
constantes los parmetros de temperatura, agitacin y concentracin inicial del inculo. La
temperatura se defini con base en la recomendacin dada por el proveedor de la levadura, la
agitacin se defini al momento de realizar el montaje de las fermentaciones y se defini
como la mnima necesaria para mantener las levaduras suspendidas, en tanto que, la
concentracin inicial del inculo se defini a travs de una pequea prueba preliminar en la
que se evaluaron dos concentraciones iniciales, 1,5 g/L y 0,75 g/L.

Para el anlisis general del proceso, debe considerarse que en una fermentacin, es
deseable obtener el mayor rendimiento y la mayor concentracin de producto posible, que la
tasa de produccin del producto principal sea la ms alta, que se produzca la menor
concentracin de productos minoritarios o indeseables y que sea barato y sus componentes
accesibles (Stanbury & Whitaker, 1984).

A manera de cierre, en las fermentaciones analizadas se obtuvieron resultados

satisfactorios y promisorios a nivel de rendimiento, productividad y concentracin de
bioetanol para los cuatro tratamientos en estudio. En general, con el jugo B la ventaja radica
en que se obtienen mayores concentraciones finales de etanol y esto facilita las etapas
posteriores de purificacin y extraccin del biocombustible, mientras que con el jugo A se
presenta la ventaja de que la productividad es mayor, as que la fermentacin culmina en
menor tiempo, lo que tambin disminuye los costos de produccin. Por tanto, para poder
concluir qu jugo es ms recomendable, deber efectuarse un estudio econmico comparativo
ms profundo, donde se consideren los gastos econmicos asociados con mantener la etapa
de fermentacin durante ms horas y adems, los costos asociados con la purificacin del
alcohol.
 132

En cuanto a la suplementacin, en general se observ que en ambos medios conlleva a

una disminucin en el tiempo de fermentacin, por cuanto aumenta la productividad de la
fermentacin. Nuevamente, tendra que considerarse qu es ms factible o ms rentable, si
mantener la fermentacin durante ms horas o bien, adicionar los nutrientes al medio.

Con lo anterior es indudable que el proceso de produccin de bioetanol debe evaluarse

globalmente y debe existir un balance entre la prdida de energa con el aporte de energa en
las distintas etapas del proceso. Adems deben considerarse aspectos tan diversos como el
tiempo de produccin, el tiempo requerido para la limpieza del equipo, el tiempo de la fase de
latencia, costos de operacin, de mano de obra, gastos en personal, capacidad del sistema,
entre muchos otros (Crueger & Crueger, 1993).

Esto pone en evidencia la necesidad de optimizar al mximo todas las etapas del proceso,
pues debido a que el margen de provecho es tan bajo, la optimizacin econmica es ms
valiosa para la produccin de una fuente de energa que lo que podra ser para la obtencin de
un producto fino o un antibitico (Crueger & Crueger, 1993).

Sin embargo, el panorama general es prometedor pues en algunos pases ya se ha

implementado la produccin industrial de combustibles de segunda generacin, como el caso
de la planta en Colombia en que se producen 5000 L/da de etanol al 95 % a partir de banano
de rechazo con una cepa tambin de Saccharomyces cerevisiae (Zapata & Pelez, 2010).
 133

6. Conclusiones

1. Debido a su elevado contenido de azcares fermentables (104 g/L) y su pH

naturalmente cido (4,5-5,0) el residuo de pur de banano se perfila como un sustrato apto
para la fermentacin.
2. La pulpa de banano contiene una elevada cantidad de material insoluble en alcohol, en
alcohol y agua y de material lignocelulsico, de ah la necesidad de desdoblar estos
carbohidratos complejos en azcares simples fermentables.
3. Los jugos de banano de A y B poseen un contenido de azcares entre 182-190 g/L y el
pH natural de ambos es cercano a 4,5, siendo por ello sustratos idneos para la fermentacin
alcohlica a travs de Saccharomyces cerevisiae.
4. El contenido de azcares totales, de grados Brix y de slidos solubles de la pulpa de
banano aument significativamente luego de aplicar el preparado enzimtico Enzima 1 an
con el tratamiento menos intenso, esto es 30 minutos y 300 mg/kg.
5. Con la enzima comercial Enzima 2 tambin se obtuvo un aumento considerable en los
grados Brix, slidos solubles y azcares totales fermentables de la pulpa de banano, a partir
del tratamiento con menor tiempo y concentracin de enzima (24 horas y 560 mg/kg).
6. Al utilizar el coctel enzimtico 3 no se obtuvieron diferencias significativas en los
azcares fermentables, slidos solubles ni grados Brix. Sin embargo s se da una reduccin
significativa en la viscosidad de la pulpa de banano al ser tratada con esta mezcla de enzimas.
7. La curva de crecimiento microbiano presenta una etapa logartmica marcada durante
aproximadamente las primeras 20 horas luego de la inoculacin, seguida por una fase en la
que la poblacin se mantiene estable.
8. La cintica de consumo de azcares fermentables muestra que estos se consumen
rpidamente durante las primeras horas hasta alcanzar niveles mnimos y en la mayor parte de
los casos de 0 g/L, lo que indica que la levadura no sufre de inhibicin por sustrato utilizando
como medio el jugo de banano.
9. La curva de los grados Brix en el tiempo muestra el mismo comportamiento descrito
para los azcares fermentables, de modo que se puede utilizar esta medicin como parmetro
de seguimiento del curso de la fermentacin, pues es una medida prcticamente inmediata.
 134

10. La cintica de produccin de etanol presenta un aumento logartmico durante las

primeras horas luego de la inoculacin del microorganismo, pero cuando alcanza un nivel
mximo la concentracin permanece constante en el tiempo, y su comportamiento es opuesto
al de los azcares fermentables.
11. En todos los casos se produjo glicerol, pues es un metabolito secundario de la
fermentacin que la clula genera para protegerse a s misma de las condiciones desfavorables
o de estrs osmtico del medio.
12. Con el jugo de banano A la fermentacin culmina en menor tiempo y la productividad
o velocidad de generacin del etanol es mayor, posiblemente debido al efecto protector que
ejercen los slidos insolubles suspendidos para mantener la viabilidad de la levadura.
13. La suplementacin del jugo de banano con nutrientes y sales minerales favorece la
velocidad de obtencin del etanol y por ende, disminuye el tiempo de fermentacin, porque
los nutrientes favorecen el metabolismo de las clulas y protegen la levadura de condiciones
ambientales adversas.
14. A pesar de que la fermentacin se ve favorecida con la suplementacin del medio, se
alcanz la misma concentracin final de etanol y se consumieron totalmente los azcares en el
medio no suplementado, pero tom ms tiempo, lo que indica que el jugo de banano tambin
tiene los nutrientes necesarios para el desarrollo de la levadura.
15. En todos los casos la velocidad de duplicacin fue baja, por las condiciones de oxgeno
limitado del medio y de la alta concentracin de azcares iniciales, a su vez no se presentaron
diferencias significativas entre los distintos medios evaluados, en ninguno se ve ms
favorecida la reproduccin celular.
16. El rendimiento y la productividad fueron mayores con el jugo de banano A, y para este
mismo sustrato, el jugo suplementado alcanz la mayor productividad mxima, de 2,56 .

17. El rendimiento de etanol respecto a la concentracin inicial de azcares estuvo entre

42-43 % para el jugo B y entre 45-46 % con el jugo A, esto implica entre un 83 y un 91 % de
rendimiento respecto al mximo terico que se puede esperar para produccin de etanol a
partir de azcar.
18. Con el jugo de banano B se obtuvieron concentraciones finales de etanol en el orden
de 72-74 g/L, concentraciones superiores en ms de 10 g/L a los resultados con el jugo A.
 135

19. El tiempo de fermentacin fue significativamente distinto para todos los tratamientos,
el menor se obtuvo con el jugo de A suplementado, seguido por el jugo B suplementado
tambin; luego se tiene el jugo A no suplementado y finalmente, el tratamiento que tard
ms, hasta 48 horas, fue en el que se utiliz jugo B sin suplementar.
 136

7. Recomendaciones

1. Utilizar otros mtodos para la cuantificacin de la fibra del pur de banano (MIA,
MIAA, celulosa, hemicelulosa y lignina), ms adecuados para esta matriz compleja y con alto
contenido de material insoluble.
2. Realizar una caracterizacin qumica ms detallada del jugo de banano para justificar
con datos cuantitativos, el porqu no es necesaria la suplementacin del jugo y a la vez, esta
caracterizacin permitira ahondar ms en las diferencias entre ambos jugos.
3. Omitir la etapa de clarificacin centrfuga del jugo de banano, debido a que nivel
industrial no es necesaria e implica una reduccin de costos y recursos en el proceso de
fermentacin global.
4. Evaluar desde el punto de vista financiero, si a nivel industrial el uso de enzimas es
factible para el incremento de los azcares fermentables del medio o bien, si se podra
enriquecer con azcar comercial o jugo de algn otro desecho de la agroindustria nacional.
5. Optimizar las condiciones de uso y aplicacin de las enzimas mediante una superficie
de respuesta, que indique exactamente cul concentracin y tiempo son los ptimos para ese
preparado enzimtico.
6. Disear el procedimiento y evaluar el uso de un medio a partir del jugo de banano
como medio de activacin, cultivo y mantenimiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae,
previo a las fermentaciones, con el fin de reducir el perodo de adaptacin o fase lag.
7. Evaluar la produccin de bioetanol utilizando otros microorganismos tales como
Zymomonas mobilis utilizando el jugo de banano como medio de cultivo.
8. Utilizar como medio de cultivo el jugo de banano A sin clarificar para comprobar si
efectivamente los slidos insolubles favorecen el mantenimiento y estabilidad de las
levaduras.
9. Realizar fermentaciones en continuo o tipo fed-batch para evaluar la productividad y
rendimiento con respecto a las obtenidas en este proceso tipo batch.
10. Evaluar otros parmetros de operacin en la fermentacin, como la agitacin y
configuracin de los impulsores para mantener homogeneidad dentro del bioreactor.
11. Efectuar pruebas preliminares donde se desplace el oxgeno del espacio de cabeza
para crear condiciones de anaerobiosis.
 137

12. Utilizar la levadura producida para generar productos de mayor valor agregado, como
concentrado proteico o extracto de levadura.
13. Este estudio evala la factibilidad tcnica de produccin de bioetanol a partir de
Saccharomyces cerevisiae, no obstante, para poder implementar un proceso tan complejo
debe realizarse antes un detallado plan de negocios, con especial nfasis a la parte financiera
para determinar si realmente la produccin e implementacin es viable.
14. Utilizar un modelo matemtico biolgico para estimar el tiempo final de la
fermentacin, en lugar de un modelo polinomial, para obtener resultados ms confiables.
 138

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 151

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 152

9. Anexos

Anexo A: Mtodos fsicos y qumicos para caracterizacin y tratamiento del pur de banano

A1) Humedad
1. Se pesan muestras por triplicado, de aproximadamente 5,00 g de pur de banano y se
colocarn en Placas Petri.
2. Se secan las muestras a 70 C en estufa de vaco por un perodo no menor a 5 horas y se
trasladan a un desecador.
3. Se pesan nuevamente cuando se hayan enfriado.
El contenido de humedad se determina por diferencia de masas, a partir de la
ecuacin dada:
masa pulpa fresca masa pulpa deshidratada
% Humedad 100
masa pulpa fresca

A2) Cenizas
1. Se calcinan por triplicado, crisoles de porcelana rotulados con grafito, a una temperatura
de 550-600 C hasta obtener masa constante, se colocan los crisoles en un desecador y se
mide su masa.
2. Se pesan en los crisoles y con balanza analtica muestras por triplicado de 5,0000 g
aproximadamente de pur de banano.
3. Se calcinan hasta masa constante a una temperatura de 550-600 C.
4. Se pesan los crisoles con las cenizas remanentes.
El contenido de cenizas se determina por diferencia de masas, a partir de la siguiente
ecuacin:
(masa residuo cenizas crisol calcinado ) (masa crisol calcinado )
%Cenizas 100
(masa pulpa fresca crisol calcinado ) (masa crisol calcinado )
 153

A3) Slidos insolubles suspendidos

1. Se mide la masa de la muestra seleccionada, que debe ser cercana a 30 g definida de
acuerdo con la capacidad de los tubos de centrfuga.
2. Se centrifuga por 30 minutos a una velocidad de 3400 rpm.
3. Se separa por decantacin el lquido supernatante del slido depositado y se mide la
masa de este residuo.
As, el porcentaje de slidos insolubles viene dado por la ecuacin:
Masa residuo slido
%SIS 100
Masa muestra completa

A4) Slidos solubles por gravimetra

1. Se pesa una placa Petri, que previamente se ha secado por una hora.
2. Se coloca en la placa Petri una alcuota de 1,00 mL de la sustancia de inters.
3. Se pesa nuevamente la placa Petri con la muestra.
4. Se seca durante 5 horas a 70 C en estufa de vaco.
5. Se coloca en un desecador y se deja enfriar por aproximadamente 20 minutos.
6. Se pesa nuevamente la placa con los slidos solubles resultantes.

A5) Material insoluble en alcohol (MIA)

1. Se pesan 15 g de pur de banano liofilizado y se colocan en un Erlenmeyer de 1 L.
2. Se adicionan 80 mL de etanol al 95 %v/v y se hierve durante 30 minutos, manteniendo la
mezcla con vigorosa agitacin magntica, evitando la ebullicin violenta.
3. Se filtra con papel Whatman #41 sobre un embudo Bchner conectado a una bomba de
vaco.
4. Se lava el precipitado con 45 mL de etanol al 80% sin encender el vaco, revolviendo con
una cuchara para promover que el solvente est en contacto con el precipitado.
5. Se enciende el vaco y se deja que el disolvente escurra.
6. Se lava con 45 mL de etanol al 95 %v/v de la misma manera que en los pasos 4 y 5.
 154

7. Se lava con 45 mL de acetona de la misma manera que se realiza con etanol.

8. Se adicionan 15 mL de ter etlico y se seca el precipitado depositado en el papel filtro.
9. Se seca el precipitado en cajas Petri (previamente secadas y taradas) a una temperatura
de 70 C en estufa de vaco por 5 horas.
10. Se sacan las muestras y se colocan en un desecador por aproximadamente 30 minutos.
11. Se pesa el residuo y se expresa el contenido de MIA como g de MIA/ 100 g de pulpa de
banano seco.

A6) Material insoluble en agua y alcohol (MIAA)

1. Se pesa el material insoluble en alcohol (MIA).
2. Se coloca sobre papel de filtro Whatman #4 en un embudo Bchner.
3. Se lava el precipitado de MIA con agua destilada a 4 C sin encender el vaco.
4. Se enciende el vaco y se deja correr el disolvente.
5. Se realiza la prueba de antrona sobre el agua de escurrido posterior a cada lavado, se
prosiguen los lavados hasta que la prueba sea negativa.
6. Cuando la prueba es negativa se recupera la MIAA que queda sobre el papel de filtro y se
coloca en una placa Petri previamente secada y tarada.
7. Se llevan las muestras a una estufa a temperatura de 60 C durante toda la noche hasta
desecacin completa.
8. Se pesa el material insoluble en alcohol y agua y se expresa como g de MIAA por cada 100
g de pulpa de banano seco.

Prueba cualitativa de antrona

Reactivo de antrona: Disolver 200 mg de antrona en 100 mL de cido sulfrico
concentrado. La disolucin se realiza agitando con pastilla magntica con sumo cuidado. La
preparacin se efecta al momento mismo de utilizarla y debe protegerse de la luz pues es
altamente sensible a esta.
 155

Prueba colorimtrica
Se toman 100 L de una alcuota del agua de lavado de la MIA.
Se coloca en un tubo de ensayo que contiene 1,15 mL de agua destilada.
Se agregan 2,5 mL de reactivo de antrona en un bao de hielo pues la reaccin es
altamente exotrmica.
Se preparan dos blancos que contienen una alcuota de 100 L de agua destilada en lugar
del volumen de la muestra.
Se comparan los tubos de las muestras con los blancos, estos deben tener la misma
coloracin, sino se deben continuar los lavados de la MIA hasta que los tubos tengan el
mismo color que los blancos.

A7) Determinacin de lignina en material insoluble en alcohol y agua (MIAA)

El principio de esta determinacin consiste en solubilizar todo el material glicosdico
en cido sulfrico al 72 %, pues de este modo slo queda la lignina bruta. Para preparar el
cido sulfrico 72 %v/v se disuelven 720 mL en 1000 mL en un baln aforado.
1. Se pesan 200 mg de MIA en un Erlenmeyer de 250 mL, por triplicado.
2. Se agrega a cada Erlenmeyer 4 mL de H2SO4 al 72% v/v.
3. Se coloca en bao Mara a 30 C durante una hora con agitacin continua.
4. Se lava con 56 mL de H2O destilada y se coloca en una botella de vidrio. Esto sin botar o
filtrar el agua del lavado.
5. Se autoclava a 121 C y una presin de 1,1 bar por una hora.
6. Se filtra con papel Whatman de GF/F, previamente identificado y pesado.
7. Se lava con 300 mL de agua destilada para eliminar la solucin cida.
8. Se coloca el papel de filtro en un crisol y se deja a 100 C durante 5 horas en estufa (el
crisol debe estar previamente calcinado).
9. Se colocan los crisoles en un desecador y se pesan (P1)
10. Se llevan los crisoles hasta incineracin a 550 C por 4 horas y se dejan en un desecador
hasta alcanzar temperatura ambiente.
11. Se pesan hasta alcanzar masa constante (P2). As el contenido de lignina viene dado por la
expresin:
 156

Donde P1 es el peso despus de secar a 100 C, P2 es el peso despus de incinerar en

mufla y PM es el peso inicial del material insoluble en alcohol y agua (MIAA).

A8) Determinacin de celulosa y hemicelulosa en material insoluble en alcohol y agua

(MIAA)
En este caso para la cuantificacin del material insoluble se hace uso del mtodo
tradicional de Van Soest. Se requiere un detergente neutro NDS para la extraccin de celulosa,
hemicelulosa y lignina y tambin se requiere un detergente cido ADS para hidrolizar o digerir
la hemicelulosa, la precipitacin de la celulosa y lignina.

Cuadro AI. Composicin del detergente neutro y el detergente cido para la determinacin de
celulosa y hemicelulosa en material insoluble en alcohol y agua
Detergente neutro Detergente cido
Cantidad Reactivo Cantidad Reactivo
30 g Lauryl sulfato de sodio
Bromuro hexadecil
18,61 g EDTA deshidratado 20 g
trimetil amonio
6,81 g Tetraborato de sodio
Disodio
4,56 g hidrogenofosfato
anhidro 1000 mL cido sulfrico
10 mL Etilenlgicol
1000 mL Agua destilada

1. Se pesan 0,5 g de MIAA en un baln para calentar a reflujo (Debe ser de al menos 250 mL
por el burbujeo intenso).
2. Se aaden 25 mL de NDS, se lleva a ebullicin por 30 minutos a reflujo y se activa el
cronmetro al iniciar el burbujeo. Se enfra hasta temperatura ambiente.
3. Se aaden, nuevamente, 25 mL de NDS y se pone a ebullicin durante 1 hora. El tiempo se
cuenta desde que inicia el burbujeo.
4. Se filtra con dracn, los residuos se recuperan en un papel de filtro y se colocan en un
crisol previamente pesado.
 157

5. Se coloca en estufa de vaco a 70 C toda la noche.

6. Se enfra en un desecador y se pesa.
7. Se recupera la fraccin slida en un Erlenmeyer de 250 mL y se aaden 25 mL de ADS,
tratando de recuperar al mximo las porciones de las paredes del crisol.
8. Se coloca en bao Mara a 100 C por una hora y se filtra sobre tela de dracn, el residuo
se coloca en crisoles previamente tarados a 100 C por una hora.
9. Se pone dicho residuo a secar en una estufa de vaco a 70 C durante toda la noche y se
deja enfriar hasta temperatura ambiente. El contenido de hemicelulosa y celulosa se
obtiene de:

Donde P1 es el peso de los residuos recuperados del papel de filtro luego de secarse
durante 8 horas a 100 C, P2 es el residuo seco obtenido al final de la determinacin y PE es el
peso del MIAA.

A9) Metodologa para la toma de muestra de las fermentaciones efectuadas en bioreactor

(CENIBiot)

A9.1) Muestreo con jeringa

1. Se aumenta la agitacin a 250 rpm por dos minutos cronometrados.

2. Se retiran las prensas de seguridad en las mangueras de la toma de muestra.
3. Luego de que transcurran los dos minutos, se inyecta aire con la jeringa con el fin de
devolver los restos de muestra que pudieran haber quedado en esta de la toma anterior.
4. Se succiona muestra con la jeringa, hasta que el tubo de centrfuga contenga
aproximadamente 20 mL.
5. Se colocan nuevamente las prensas de seguridad en las mangueras.
6. Bajo condiciones estriles, utilizando una lmpara de alcohol, se retira el tubo de ensayo
que contiene la muestra y se coloca un tubo de ensayo estril vaco.
7. Al momento de hacer el cambio se flamean las tapas y bocas de los tubos de centrfuga.
 158

8. Se baja la agitacin a 75 rpm nuevamente.

NOTA: Para realizar el muestreo, las manos deben desinfectarse previamente con abundante
alcohol al 70 %v/v y no se debe conversar durante el cambio de tubos para evitar posibles
fuentes de contaminacin.

A9.2) Muestreo con bomba peristltica

1. Se aumenta la agitacin a 250 rpm por dos minutos cronometrados.

2. Se retiran las prensas de seguridad en las mangueras de la toma de muestra.
3. Se coloca la manguera en la bomba peristltica y se enciende. Inicialmente el flujo va
direccionado hacia el bioreactor, para devolver los restos de caldo que quedaron en la
manguera de la toma anterior.
4. Luego se pone en reversa el flujo, de tal manera que el caldo se deposite en el tubo de
centrfuga, hasta completar 20 mL.
5. Se colocan nuevamente las prensas de seguridad en las mangueras.
6. Se retira la manguera de la bomba peristltica.
7. Bajo condiciones estriles, utilizando una lmpara de alcohol, se retira el tubo de ensayo
que contiene la muestra y se coloca un tubo de ensayo estril vaco.
8. Al momento de hacer el cambio se flamean las tapas y bocas de los tubos de centrfuga.
9. Se baja la agitacin a 75 rpm nuevamente.
NOTA: Para realizar el muestreo, las manos deben desinfectarse previamente con abundante
alcohol al 70 %v/v y no se debe conversar durante el cambio de tubos para evitar posibles
fuentes de contaminacin.

A9.3) Tratamiento de la muestra post muestreo

Determinacin de poblacin microbiana

1. Se agita vigorosamente en vortex, el tubo de centrfuga en el que se tom la muestra.
2. Se toma una alcuota* con micropipeta de 200 L y se coloca en la cubeta de plstico del
espectrofotmetro.
 159

3. Se agrega una alcuota* de agua, con pipeta automtica de 10 mL, en la misma cubeta de
plstico.
4. Se seca la punta de la micropipeta y con esta se agita la mezcla de la cubeta.
5. Se mide la absorbancia a 620 nm, utilizando agua filtrada con milipore como blanco.

* Nota: el volumen exacto de las alcuotas no se puede establecer previamente y no es fijo, ya

que depende del progreso de la fermentacin. El factor de dilucin que se utiliza permite
obtener una absorbancia menor a 0,5, mbito donde el equipo funciona de manera lineal.

Determinacin de grados Brix, azcares totales y etanol por cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC)
1. De la muestra recolectada en el tubo de centrfuga, se toma una alcuota de 5 mL con
pipeta de vidrio y pipeteador automtico, bajo condiciones estriles con lmpara de
alcohol y en cmara de flujo laminar.
2. Esta alcuota se coloca en los tubos de vidrio de la centrfuga.
3. Se colocan las muestras en la centrfuga a 3500 rpm y por 15 minutos. Si transcurrido el
tiempo la muestra an se observa turbia, se repite la centrifugacin.
4. Se decanta la muestra, separando el lquido supernatante de la levadura depositada en el
fondo.
5. El lquido supernatante se coloca en un vial estril, y se toman unas gotas para medir
grados Brix con un refractmetro digital, previamente calibrado con agua de smosis.
6. El lquido restante se congela de inmediato y debe permaneces as hasta el momento del
anlisis.
7. Cuando se vaya a efectuar el anlisis de azcares y etanol por HPLC, la muestra se
descongela y se diluye, para que se pueda interpolar con la curva de calibracin efectuada
previamente para azcares y etanol.
 160

Anexo B: Datos experimentales

Cuadro BI. Caracterizacin proximal de pur de banano A para dos lotes analizados por
triplicado
Lote 2 Lote 3
Anlisis Rplica Pur de Pur de banano Pur de Pur de banano
banano inicial macerado banano inicial macerado
1 74,46 75,08 75,08 78,24
Humedad
2 74,25 76,78 74,72 77,74
(g/100 g b.h.)
3 74,40 76,22 74,29 78,03
1 0,54 0,59 0,55 0,60
Cenizas (g/100 g
2 0,53 0,59 0,57 0,57
b.h.)
3 0,54 0,59 0,52 0,59
1 11,6 20,6 11,2 20,4
Slidos Solubles
2 11,0 20,2 11,0 19,8
(Brix)
3 12,2 21,2 10,8 19,0
Azcares totales 1 100,9 175,6 107,5 179,8
(g/L) 2 98,6 162,0 102,5 165,4
(Glc+Sac+Fru) 3 97,5 161,1 104,4 167,9
1 5,10 5,08 5,20 5,19
pH 2 5,08 5,08 5,20 5,16
3 5,10 5,11 5,19 5,17
1 36,02 38,42 38,42 28,82
Acidez (g cido
2 48,03 38,42 40,35 28,82
ctrico/100 g b.h.)
3 38,42 38,42 38,42 28,82
1 48,87 33,58 47,12 41,88
MIA (g/100 g b.s.) 2 47,67 34,86 48,05 40,23
3 51,14 38,16 47,40 41,53
1 24,97 19,03 26,60 20,41
MIAA (g/100 g
2 25,16 18,50 26,64 17,74
b.s.)
3 26,85 20,14 27,15 19,08
 161

Continuacin Cuadro BI. Resultados de la caracterizacin proximal de pur de banano para los
dos lotes analizados por triplicado
Lote 2 Lote 3
Pur de Pur de Pur de Pur de
Anlisis Rplica
banano banano banano banano
inicial macerado inicial macerado
Lignina (g/100 g de 1 22,91 40,42 26,25 38,04
banano en base 2 28,98 38,65 25,37 38,07
seca) 3 25,48 39,38 29,48 41,89
Hemicelulosa 1 5,20 1,45 4,21 2,10
(g/100 g de banano 2 4,77 1,66 3,41 2,54
en base seca) 3 4,20 1,67 2,23 2,46
Celulosa (g/100 g de 1 10,31 N.D. 5,08 N.D.
banano en base 2 9,58 N.D. 7,48 N.D.
seca) 3 3,79 N.D. 3,37 N.D.

Cuadro BII. Resultados de la caracterizacin proximal de jugo de banano B

Lote
Anlisis Rplica
1 2 3
1 81,40 82,09 81,01
Humedad
2 81,49 81,41 80,83
(g/100 g de jugo)
3 81,44 81,60 80,94
1 0,60 0,63 0,67
Cenizas (g/100 g de
2 0,62 0,62 0,67
jugo)
3 0,62 0,61 0,62
1 18,0 18,0 17,4
Slidos Solubles
2 18,0 17,8 18,2
(Brix)
3 18,0 18,0 18,2
 162

Continuacin Cuadro BII. Resultados de la caracterizacin proximal de jugo de banano B

Lote
Anlisis Rplica
1 2 3
Azcares totales 1 190,18 185,29 191,64
(g/L) 2 191,17 185,96 191,85
(Glu+Sac+Fru) 3 185,39 198,01 192,39
1 4,59 4,63 4,67
pH 2 4,60 4,64 4,68
3 4,62 4,66 4,68
Acidez (g cido 1
67,24 67,24 71,09
ctrico/100 mL de 2
67,24 69,16 69,16
jugo) 3
71,09 65,32 67,24

Cuadro BIII. Resultados de la caracterizacin proximal de jugo de banano proveniente de pur

de banano, luego de ser macerado, prensado y clarificado
Lote
Anlisis Rplica
1 2 3
1 82,92 82,49 82,73
Humedad
2 82,77 82,61 82,60
(g/100 g de jugo)
3 82,78 82,64 82,54
1 0,70 0,65 0,62
Cenizas (g/100 g
2 0,60 0,57 0,62
jugo)
3 0,61 0,59 0,62
1 16,4 15,6 16,0
Slidos Solubles
2 16,4 15,8 16,2
(Brix)
3 16,2 15,6 16,0
Azcares totales 1 183,75 186,31 176,13
(g/L) 2 183,55 186,11 175,73
(Glu+Sac+Fru) 3 183,95 185,91 175,93
 163

Continuacin Cuadro BIII. Resultados de la caracterizacin proximal de jugo de banano

proveniente de pur de banano, luego de ser macerado, prensado y clarificado
Lote
Anlisis Rplica
1 2 3
1 4,91 4,88 4,74
pH 2 4,90 4,86 4,75
3 4,90 4,85 4,74
Acidez (g cido 1 78,77 78,77 82,61
ctrico/100 mL de 2 74,93 80,69 86,46
jugo) 3 73,01 80,69 82,61

Cuadro BIV. Resultados del diseo experimental con el preparado enzimtico Enzima 1
aplicado al pur de banano
Slidos Solubles Slidos solubles Azcares totales
Tratamiento Rplica
( Brix) (g/100 g pulpa) (g/L)
1 16,0 17,81 133,13
300 mg/kg; 30
2 16,0 17,33 143,21
minutos
3 16,0 17,37 138,22
1 16,5 18,34 149,38
300 mg/kg; 90
2 16,0 17,37 138,65
minutos
3 16,0 17,50 150,68
1 16,0 17,01 156,68
360 mg/kg; 30
2 16,0 17,41 132,32
minutos
3 16,0 16,78 130,05
1 16,0 17,18 136,89
360 mg/kg; 90
2 15,0 15,94 149,71
minutos
3 15,0 16,40 156,69
1 10,5 11,39 107,59
Inicial 2 12,5 13,15 102,14
3 11,5 12,73 103,10
 164

Cuadro BV. Resultados del diseo experimental con el preparado enzimtico Enzima 2
aplicado al pur de banano
Slidos Solubles Slidos solubles Azcares totales
Tratamiento Rplica
( Brix) (g/100 g pulpa) (g/L)
1 18,0 19,64 168,60
560 mg/kg; 24
2 17,5 18,39 171,90
horas
3 17,5 19,29 167,20
1 17,4 18,36 167,09
560 mg/kg; 48
2 17,0 19,34 161,98
horas
3 17,5 18,47 170,61
1 18,0 18,81 164,13
840 mg/kg; 24
2 17,4 18,63 157,76
horas
3 16,8 17,53 168,28
1 17,2 18,49 170,18
840 mg/kg; 48
2 17,0 18,58 185,96
horas
3 16,0 18,73 164,11
Inicial (300 1 16,0 17,01 143,15
mg/kg; 30 2 15,0 16,33 139,57
minutos con la
3 15,0 16,41 141,64
enzima 1)
 165

Cuadro BVI. Resultados del diseo experimental con el preparado Enzima 3 aplicado a pur
de banano
Slidos Solubles Slidos solubles Azcares totales
Tratamiento Rplica
( Brix) (g/100 g pulpa) (g/L)
1 16,0 20,04 161,29
240 mg/kg; 60
2 16,5 20,02 166,02
minutos
3 16,0 20,16 170,76
1 17,0 20,10 167,83
240 mg/kg; 120
2 17,0 20,05 171,03
minutos
3 17,5 20,20 164,62
1 16,5 20,03 157,17
360 mg/kg; 60
2 17,5 20,07 158,40
minutos
3 17,0 20,12 155,94
1 17,0 20,04 170,32
360 mg/kg; 120
2 16,5 20,11 156,85
minutos
3 17,5 20,10 155,48
Inicial (560 1 17,0 20,07 153,37
mg/kg; 24 horas 2 17,0 20,06 152,45
con la enzima 2) 3 16,5 20,07 154,29

Cuadro BVII. Resultados de viscosidad (a 22 C) para el pur de banano antes y despus del
tratamiento enzimtico con la enzima 3
Tratamiento
Antes de aplicar la enzima 3
Despus de aplicar la enzima 3 (240 mg/kg; 60
minutos)
Rplica Viscosidad (cP)*
1 221 700
2 224 100
3 216 700
1 194 200
2 197 600
3 198 100
 166

Cuadro BVIII. Resultados de las operaciones unitarias de prensado y clarificacin centrfuga

para la obtencin de jugo de banano clarificado a partir de pur de banano tratado
enzimticamente
Operacin Rplica Rendimiento
1 53,47
Prensado* 2 49,59
3 49,72
1 97,26
Clarificacin 2 98,18
3 98,18
* El prensado se realiz en tandas de aproximadamente 8 kg, con una presin de 4000 psi y
durante 15 minutos
 167

Cuadro BIX. Resultados de la fermentacin alcohlica de jugo de banano utilizando

Saccharomyces cerevisiae

Hora de inoculacin: 6:00 pm Volumen total: 5 L pH: 4,5 Temperatura: 30 C

Concentracin de microorganismo: 1,5 g/L jugo Aireacin: No Agitacin: 75 rpm
Sustrato: Jugo de banano B Suplementacin: S Rplica: 1

Tiempo de Slidos Poblacin Azcares

Glicerol Etanol
Muestra fermentacin Solubles (log totales
(g/L) (g/L)
(horas) (Brix) lev/mL) (g/L)
1 0 19,5 7,42 161,88 0,90 0,10
2 2 19,3 7,45 173,07 0,54 0,77
3 12 17,0 7,95 131,48 3,27 16,72
4 14 15,7 8,06 120,62 4,77 25,35
5 17 14,6 8,10 94,85 6,86 29,53
6 20 13,1 8,15 73,82 8,38 37,18
7 23 12,2 8,20 58,49 9,34 44,47
8 25 11,3 8,18 46,78 9,73 49,39
9 36 8,5 8,19 1,90 10,32 69,39
10 38 8,3 8,11 1,00 10,45 71,36
11 40 8,1 8,19 0,16 10,47 71,45
12 42 8,2 8,16 0,14 10,50 72,45
13 44 8,1 8,20 0,07 9,66 66,31
14 46 8,1 8,19 0,00 10,58 70,54
15 49 8,1 8,23 0,00 10,69 72,90
16 62 8,2 8,23 0,00 10,57 71,70
17 65 8,2 8,24 0,00 10,50 71,47
18 67 8,2 8,24 0,00 10,51 72,34
 168

Cuadro BX. Resultados de la fermentacin alcohlica de jugo de banano utilizando

Saccharomyces cerevisiae

Hora de inoculacin: 6:00 pm Volumen total: 5 L pH: 4,5 Temperatura: 30 C

Concentracin de microorganismo: 1,5 g/L jugo Aireacin: No Agitacin: 75 rpm
Sustrato: Jugo de banano B Suplementacin: S Rplica: 2

Tiempo de Slidos Poblacin Azcares

Glicerol Etanol
Muestra fermentacin Solubles (log totales
(g/L) (g/L)
(horas) (Brix) lev/mL) (g/L)
1 0 19,5 7,43 170,17 1,34 0,42
2 2 19,5 7,48 172,20 1,49 0,79
3 12 17,2 7,95 133,74 3,18 15,93
4 14 15,9 8,06 115,39 5,25 23,17
5 17 14,8 8,13 99,61 6,45 29,68
6 20 13,1 8,16 77,03 8,20 38,36
7 23 12,2 8,25 60,03 9,27 45,58
8 25 11,3 8,23 47,16 9,59 49,57
9 36 8,5 8,25 1,85 10,52 70,44
10 38 8,3 8,30 0,85 10,35 70,63
11 40 8,1 8,23 0,17 10,22 70,67
12 42 8,1 8,19 0,08 10,17 70,86
13 44 8,1 8,22 0,00 10,38 71,34
14 46 8,0 8,26 0,00 10,46 72,28
15 49 8,0 8,27 0,05 10,38 72,16
16 62 8,1 8,29 0,12 10,51 70,01
17 65 8,2 8,28 0,19 10,52 72,38
18 67 8,1 8,25 0,22 10,71 74,65
 169

Cuadro BXI. Resultados de la fermentacin alcohlica de jugo de banano utilizando

Saccharomyces cerevisiae

Hora de inoculacin: 6:00 pm Volumen total: 5 L pH: 4,5 Temperatura: 30 C

Concentracin de microorganismo: 1,5 g/L jugo Aireacin: No Agitacin: 75 rpm
Sustrato: Jugo de banano B Suplementacin: S Rplica: 3

Tiempo de Slidos Poblacin Azcares

Glicerol Etanol
Muestra fermentacin Solubles (log totales
(g/L) (g/L)
(horas) (Brix) lev/mL) (g/L)
1 0 19,5 7,44 170,96 3,96 0,36
2 2 19,5 7,47 176,29 1,39 0,80
3 12 17,3 7,94 133,92 3,93 15,03
4 14 16,3 8,05 118,90 4,96 21,19
5 17 15,1 8,08 105,24 6,48 27,91
6 20 13,7 8,16 80,56 7,96 35,36
7 23 12,5 8,19 65,15 9,28 42,95
8 25 11,7 8,19 52,38 9,61 47,25
9 36 8,7 8,21 4,21 10,69 70,10
10 38 8,5 8,31 2,40 10,53 70,48
11 40 8,2 8,22 0,64 10,91 72,83
12 42 8,2 8,17 0,18 10,42 71,10
13 44 8,2 8,21 0,05 10,62 71,95
14 46 8,1 8,22 0,04 10,49 71,14
15 49 8,2 8,25 0,00 10,51 71,08
16 62 8,2 8,25 0,00 10,77 70,86
17 65 8,3 8,26 0,00 10,80 72,96
18 67 8,3 8,25 0,00 10,82 73,70
 170

Cuadro BXII. Resultados de la fermentacin alcohlica de jugo de banano utilizando

Saccharomyces cerevisiae

Hora de inoculacin: 6:00 pm Volumen total: 5 L pH: 4,5 Temperatura: 30 C

Concentracin de microorganismo: 1,5 g/L jugo Aireacin: No Agitacin: 75 rpm
Sustrato: Jugo de banano B Suplementacin: No Rplica: 1

Tiempo de Slidos Poblacin Azcares

Glicerol Etanol
Muestra fermentacin Solubles (log totales
(g/L) (g/L)
(horas) (Brix) lev/mL) (g/L)
1 0 18,1 7,40 156,19 0,48 0,00
2 2 18,7 7,48 166,92 1,14 0,11
3 12 16,0 7,89 132,70 3,76 15,99
4 14 15,3 7,97 118,69 4,15 17,75
5 17 14,2 8,07 103,55 5,26 24,81
6 20 13,2 8,07 88,94 5,90 31,07
7 23 12,4 8,14 76,61 6,29 35,20
8 25 11,7 8,12 67,86 6,58 40,58
9 36 9,3 8,17 31,46 7,49 56,54
10 38 9,0 8,09 26,96 7,34 59,31
11 40 8,7 8,17 22,77 7,46 61,05
12 42 8,4 8,15 18,33 7,55 62,46
13 44 8,1 8,17 14,50 7,57 64,71
14 46 7,9 8,11 9,94 7,29 67,49
15 49 7,8 8,14 5,43 7,36 69,44
16 62 7,3 8,18 0,00 7,69 71,70
17 65 7,2 8,19 0,00 7,68 71,64
18 67 7,1 8,13 0,00 7,77 72,40
 171

Cuadro BXIII. Resultados de la fermentacin alcohlica de jugo de banano utilizando

Saccharomyces cerevisiae

Hora de inoculacin: 6:00 pm Volumen total: 5 L pH: 4,5 Temperatura: 30 C

Concentracin de microorganismo: 1,5 g/L jugo Aireacin: No Agitacin: 75 rpm
Sustrato: Jugo de banano B Suplementacin: No Rplica: 2

Tiempo de Slidos Poblacin Azcares

Glicerol Etanol
Muestra fermentacin Solubles (log totales
(g/L) (g/L)
(horas) (Brix) lev/mL) (g/L)
1 0 18,1 7,40 164,45 0,54 0,00
2 2 18,3 7,45 173,12 1,06 0,00
3 12 15,9 7,91 130,28 3,58 14,86
4 14 15,4 7,92 123,68 4,01 17,13
5 17 14,3 8,06 106,63 4,96 23,45
6 20 13,3 8,09 91,95 4,69 29,76
7 23 12,6 8,20 80,26 5,27 35,48
8 25 11,9 8,20 70,88 5,59 37,98
9 36 9,4 8,21 33,86 6,75 55,15
10 38 9,1 8,18 29,43 6,86 57,08
11 40 8,8 8,16 25,35 6,89 58,69
12 42 8,5 8,12 20,64 7,02 60,69
13 44 8,3 8,21 17,15 7,09 63,28
14 46 8,0 8,10 12,47 7,11 64,18
15 49 7,6 8,30 7,79 7,21 66,31
16 62 7,1 8,20 0,00 7,41 71,29
17 65 7,1 8,23 0,00 7,43 71,38
18 67 7,1 8,02 0,00 7,39 70,84
 172

Cuadro BXIV. Resultados de la fermentacin alcohlica de jugo de banano utilizando

Saccharomyces cerevisiae

Hora de inoculacin: 6:00 pm Volumen total: 5 L pH: 4,5 Temperatura: 30 C

Concentracin de microorganismo: 1,5 g/L jugo Aireacin: No Agitacin: 75 rpm
Sustrato: Jugo de banano B Suplementacin: No Rplica: 3

Tiempo de Slidos Poblacin Azcares

Glicerol Etanol
Muestra fermentacin Solubles (log totales
(g/L) (g/L)
(horas) (Brix) lev/mL) (g/L)
1 0 18,3 7,41 165,51 0,69 0,00
2 2 18,4 7,47 168,66 0,74 0,00
3 12 15,5 7,93 124,43 3,93 17,46
4 14 15,3 7,95 130,71 3,44 14,96
5 17 14,4 8,08 107,46 5,04 24,04
6 20 13,3 8,06 92,11 5,80 30,36
7 23 12,7 8,11 81,42 6,27 36,00
8 25 12,2 8,19 73,13 6,48 37,55
9 36 9,5 8,14 35,46 7,31 54,30
10 38 9,4 8,22 31,33 7,25 56,74
11 40 9,2 8,08 27,17 7,37 58,53
12 42 8,7 8,10 22,91 7,45 61,34
13 44 8,5 8,10 19,32 7,48 62,51
14 46 8,2 8,16 14,31 7,61 65,04
15 49 7,5 8,13 9,45 7,53 67,05
16 62 7,2 8,11 0,00 7,87 72,72
17 65 7,2 8,17 0,00 7,66 72,33
18 67 7,1 8,12 0,00 7,72 73,28
 173

Cuadro BXV. Resultados de la fermentacin alcohlica de jugo de banano utilizando

Saccharomyces cerevisiae

Hora de inoculacin: 6:00 pm Volumen total: 5 L pH: 4,5 Temperatura: 30 C

Concentracin de microorganismo: 1,5 g/L jugo Aireacin: No Agitacin: 75 rpm
Sustrato: Jugo de banano A Suplementacin: S Rplica: 1

Tiempo de Slidos Poblacin Azcares

Glicerol Etanol
Muestra fermentacin Solubles (log totales
(g/L) (g/L)
(horas) (Brix) lev/mL) (g/L)
1 0 18,0 7,67 183,75 0,26 0,00
2 2 16,5 7,69 130,64 0,24 0,68
3 12 14,0 8,09 84,80 2,91 20,99
4 14 12,7 8,15 68,01 3,76 27,97
5 17 10,7 8,24 42,70 4,97 38,07
6 20 8,3 8,35 14,09 6,29 50,42
7 23 7,3 8,33 0,21 6,89 58,42
8 25 7,2 8,34 0,38 6,86 57,66
9 36 7,3 8,37 0,46 7,24 62,31
10 38 7,2 8,34 0,23 6,81 58,51
11 40 7,3 8,33 0,34 6,51 56,29
12 42 7,4 8,28 0,07 6,46 56,17
13 44 7,2 8,33 0,30 6,38 56,35
14 46 7,3 8,34 0,15 6,75 58,84
15 49 7,3 8,31 0,02 6,70 58,99
16 62 7,5 8,36 0,31 6,72 58,77
17 65 7,5 8,26 0,27 6,88 59,73
18 67 7,5 8,27 0,00 6,65 58,90
 174

Cuadro BXVI. Resultados de la fermentacin alcohlica de jugo de banano utilizando

Saccharomyces cerevisiae

Hora de inoculacin: 6:00 pm Volumen total: 5 L pH: 4,5 Temperatura: 30 C

Concentracin de microorganismo: 1,5 g/L jugo Aireacin: No Agitacin: 75 rpm
Sustrato: Jugo de banano A Suplementacin: S Rplica: 2

Tiempo de Slidos Poblacin Azcares

Glicerol Etanol
Muestra fermentacin Solubles (log totales
(g/L) (g/L)
(horas) (Brix) lev/mL) (g/L)
1 0 18,4 7,54 132,68 0,26 0,00
2 2 16,7 7,64 134,40 0,24 0,82
3 12 14,4 8,02 92,42 2,52 17,95
4 14 13,5 8,08 77,82 3,11 23,45
5 17 11,6 8,21 55,09 4,25 32,86
6 20 9,2 8,29 27,52 6,16 49,69
7 23 7,6 8,32 5,06 6,53 56,20
8 25 7,5 8,35 0,41 7,41 59,75
9 36 7,3 8,31 0,34 6,79 60,02
10 38 7,2 8,33 0,15 6,85 61,21
11 40 7,2 8,36 0,30 6,37 57,01
12 42 7,2 8,31 0,30 6,41 57,27
13 44 7,0 8,31 0,25 6,62 60,03
14 46 7,3 8,35 0,29 6,69 60,16
15 49 7,3 8,30 0,09 6,68 59,57
16 62 7,4 8,36 0,32 7,15 63,94
17 65 7,5 8,27 0,26 6,68 59,87
18 67 7,5 8,35 0,00 6,59 60,96
 175

Cuadro BXVII. Resultados de la fermentacin alcohlica de jugo de banano utilizando

Saccharomyces cerevisiae

Hora de inoculacin: 6:00 pm Volumen total: 5 L pH: 4,5 Temperatura: 30 C

Concentracin de microorganismo: 1,5 g/L jugo Aireacin: No Agitacin: 75 rpm
Sustrato: Jugo de banano A Suplementacin: S Rplica: 3

Tiempo de Slidos Poblacin Azcares

Glicerol Etanol
Muestra fermentacin Solubles (log totales
(g/L) (g/L)
(horas) (Brix) lev/mL) (g/L)
1 0 17,8 7,55 136,85 0,24 0,56
2 2 16,9 7,62 136,90 0,32 0,83
3 12 13,2 8,14 73,64 4,05 27,78
4 14 11,6 8,20 52,52 4,94 35,12
5 17 9,4 8,28 25,45 6,56 46,96
6 20 7,3 8,32 3,27 7,31 57,78
7 23 7,1 8,29 0,44 7,33 59,85
8 25 7,2 8,35 0,23 6,65 57,96
9 36 7,2 8,33 0,34 7,22 58,87
10 38 7,4 8,34 0,32 7,14 58,16
11 40 7,3 8,35 0,32 6,97 57,12
12 42 7,2 8,32 0,32 6,98 56,75
13 44 7,1 8,28 0,29 7,11 58,43
14 46 7,2 8,39 0,29 7,22 59,48
15 49 7,3 8,29 0,27 7,46 59,70
16 62 7,5 8,31 0,39 7,52 59,65
17 65 7,5 8,28 0,07 7,58 59,77
18 67 7,4 8,30 0,00 7,28 62,68
 176

Cuadro BXVIII. Resultados de la fermentacin alcohlica de jugo de banano utilizando

Saccharomyces cerevisiae

Hora de inoculacin: 6:00 pm Volumen total: 5 L pH: 4,5 Temperatura: 30 C

Concentracin de microorganismo: 1,5 g/L jugo Aireacin: No Agitacin: 75 rpm
Sustrato: Jugo de banano A Suplementacin: No Rplica: 1

Tiempo de Slidos Poblacin Azcares

Glicerol Etanol
Muestra fermentacin Solubles (log totales
(g/L) (g/L)
(horas) (Brix) lev/mL) (g/L)
1 0 16,6 7,51 137,17 0,19 0,00
2 2 15,9 7,53 135,95 0,24 0,80
3 12 13,2 8,05 88,59 3,45 20,80
4 14 12,7 8,09 78,12 4,41 27,12
5 17 10,8 8,13 57,98 4,60 31,74
6 20 9,5 8,18 40,47 5,42 40,28
7 23 8,4 8,23 27,94 6,20 47,62
8 25 7,9 8,17 19,09 6,45 54,54
9 36 6,5 8,23 0,33 7,00 61,55
10 38 6,6 8,20 0,23 6,82 62,11
11 40 6,4 8,21 0,21 6,60 60,55
12 42 6,5 8,18 0,17 6,34 58,77
13 44 6,3 8,18 0,14 6,20 57,54
14 46 6,5 8,22 0,15 6,46 60,58
15 49 6,5 8,21 0,14 6,47 60,86
16 62 6,6 8,25 0,15 6,67 61,61
17 65 6,7 8,19 0,28 7,32 68,78
18 67 6,6 8,23 0,00 6,50 62,20
 177

Cuadro BXIX. Resultados de la fermentacin alcohlica de jugo de banano utilizando

Saccharomyces cerevisiae

Hora de inoculacin: 6:00 pm Volumen total: 5 L pH: 4,5 Temperatura: 30 C

Concentracin de microorganismo: 1,5 g/L jugo Aireacin: No Agitacin: 75 rpm
Sustrato: Jugo de banano A Suplementacin: No Rplica: 2

Tiempo de Slidos Poblacin Azcares

Glicerol Etanol
Muestra fermentacin Solubles (log totales
(g/L) (g/L)
(horas) (Brix) lev/mL) (g/L)
1 0 16,7 7,54 186,11 0,00 0,59
2 2 16,0 7,55 135,64 0,30 0,88
3 12 13,7 7,87 94,24 3,08 18,27
4 14 13,0 7,91 88,09 3,79 24,96
5 17 11,8 7,95 73,31 4,18 30,56
6 20 11,0 7,98 59,25 4,47 34,17
7 23 10,4 8,01 50,34 4,78 38,64
8 25 10,0 7,92 47,34 4,95 40,39
9 36 9,1 7,98 36,36 5,95 47,75
10 38 9,4 7,93 35,95 5,77 46,98
11 40 9,0 7,89 33,89 5,66 46,41
12 42 9,0 7,86 32,11 5,56 46,08
13 44 8,9 7,90 33,87 5,98 49,83
14 46 8,9 7,96 32,40 5,80 48,53
15 49 8,8 7,92 31,17 5,73 49,16
16 62 8,9 7,85 30,14 5,87 48,68
17 65 9,0 7,88 32,94 6,31 53,07
18 67 8,7 7,86 30,48 5,85 50,64
 178

Cuadro BXX. Resultados de la fermentacin alcohlica de jugo de banano utilizando

Saccharomyces cerevisiae

Hora de inoculacin: 6:00 pm Volumen total: 5 L pH: 4,5 Temperatura: 30 C

Concentracin de microorganismo: 1,5 g/L jugo Aireacin: No Agitacin: 75 rpm
Sustrato: Jugo de banano A Suplementacin: No Rplica: 3

Tiempo de Slidos Poblacin Azcares

Glicerol Etanol
Muestra fermentacin Solubles (log totales
(g/L) (g/L)
(horas) (Brix) lev/mL) (g/L)
1 0 16,9 7,46 175,93 0,54 0,55
2 2 16,0 7,51 134,61 0,25 0,88
3 12 13,5 8,01 91,73 2,88 19,61
4 14 12,4 8,07 81,13 3,58 24,26
5 17 11,4 8,17 66,08 4,27 30,40
6 20 10,0 8,16 47,96 5,07 38,89
7 23 9,1 8,21 32,43 5,98 49,01
8 25 8,3 8,20 24,32 5,89 50,15
9 36 6,6 8,27 0,22 6,66 63,61
10 38 6,6 8,26 0,28 6,69 64,19
11 40 6,5 8,22 0,19 6,36 60,58
12 42 6,5 8,27 0,16 6,10 58,59
13 44 6,6 8,25 0,17 6,33 61,25
14 46 6,6 8,25 0,16 6,58 64,34
15 49 6,5 8,22 0,15 6,62 63,23
16 62 6,8 8,20 0,15 6,50 63,42
17 65 6,8 8,19 0,12 6,73 65,77
18 67 6,7 8,20 0,00 6,55 63,38
 179

Anexo C: Modelos para la estimacin del tiempo final de fermentacin

Cuadro CI. Modelos matemticos para la estimacin del tiempo final de fermentacin con su
respectivo coeficiente de correlacin
Medio Ecuacin r
Jugo A
y=-2x10-6x5+0,0004x4-0,0225x3+0,5405x2-1,9378x+1,0339 0,9951
Suplementado
Jugo B
y=-1x10-7x5+5x10-5x4-0,0059x3+0,2135x2-0,4888x+0,6198 0,9992
Suplementado
Jugo A Sin
y=-9x10-7x5+0,0002x4-0,0113x3+0,2878x2-0,5342x+0,6074 0,9981
suplementar
Jugo B Sin
y=-2x10-7x5+4x10-5x4-0,0034x3+0,1121x2+0,3346x-0,4258 0,9996
suplementar

Donde y es la concentracin de etanol obtenida a lo largo del tiempo (g/L), x es el

tiempo de fermentacin transcurrido (horas) y r es el coeficiente de correlacin que indica el
ajuste entre las variables x y y.