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CENTRO DE FORMACIN TCNICA

TCNICO EN ANLISIS QUMICO (131)


SANTO TOMS SEDE ARICA

Gua N6: Pruebas de diferenciacin bioqumica

Objetivos
1 Que el alumno demuestre los tipos de metabolismo bacteriano utilizando las pruebas
bioqumicas.
2 Observar la capacidad de utilizacin de diferentes sustratos y condiciones de oxgeno por las
bacterias, de importancia para su caracterizacin bioqumica.

Introduccin

El metabolismo es el conjunto de reacciones que ocurren en los seres vivos, que incluye
procesos de obtencin de energa, tales como, descomposicin de molculas orgnicas en los
quimitrofos (catabolismo) o la captacin de luz para el caso de los fottrofos. Asimismo, se encuentran
las de sntesis de material celular a partir de nutrientes esenciales (anabolismo).
Todas las reacciones metablicas son catalizadas por enzimas que en su mayora son
intracelulares aunque hay tambin extracelulares, sobre todo hidrolticas, que son liberadas por la
clula para catalizar reacciones fuera de esta.
Es posible conocer las caractersticas metablicas de los microorganismos por su inoculacin en
medios de cultivo con diversos sustratos que puedan ser utilizados como fuentes de energa, carbono,
donadores de electrones, as como de otros nutrientes esenciales necesarios para su crecimiento.
Existen numerosas pruebas bioqumicas con medios de cultivo adicionados de indicadores de pH para
detectar la produccin de cido o lcali, con inhibidores selectivos como bilis, cianuro o con colorantes,
sulfuros, etc. que facilitan la determinacin de diferentes actividades metablicas. Las actividades que
se evalan con mayor frecuencia son: capacidad para fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa,
sacarosa), para catabolizar aminocidos y urea, la produccin de enzimas hidrolticas especficas de tipo
endo o exo como oxidasas, reductasas, amilasas, lipasas, etc.
Por la importancia que tienen estas pruebas bioqumicas para la identificacin de especies
bacterianas en reas de alimentos, clnica y ambiental, se han desarrollado sistemas bioqumicos
miniaturizados (Api), Micro ID, Microgen que se realizan en forma ms rpida y segura pero que
mantienen los criterios de evaluacin de las pruebas bioqumicas convencionales.

Identificacin de cocos Grampositivos

Para la identificacin de Cocos Grampositivos, es indispensable, de inicio, saber si se trata de


cocos del gnero Staphylococcus (los cuales contienen la enzima Catalasa) o son de algn otro gnero
bacteriano como Streptococcus, Micrococcus, etc. Comenzaremos por distinguir si esos cocos son o no
Staphylococcus mediante la siguiente prueba:

Prueba de Catalasa Utiliza el perxido de hidrgeno el cual se produce como uno de los pro-ductos
finales del metabolismo oxidativo aerbico de carbohidratos. Si se deja acumular, el perxido de
hidrgeno es letal para las clulas bacterianas. La catalasa transforma al perxido de hidrgeno en agua
y oxgeno como lo demuestra la siguiente reaccin manifestndose por formacin de burbujas.

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Prueba de Coagulasa: Conocida como factor de coagulacin, est unida a la pared celular bacteriana y
no est presente en los filtrados de cultivos. Los hilos de fibrina formados entre las clulas bacterianas
suspendidas en plasma (fibringeno) provocan su aglutinacin, indicada por la presencia de agregados
visibles en el tubo de ensayo. Una vez que supimos que la cepa era efectivamente un estafilococo, la
prueba de Coagulasa nos llevar a averiguar si se trata de cepas patgenas productoras de Coagulasa
(Staphylococcus aureus). Las cepas Coagulasa Negativas no son clnicamente significativas.

Parte prctica

Todo manejo de cepas deber hacerse dentro del rea estril (15cm alrededor de la flama de
mechero; cuidar de no salirse de ah)

Prueba de Catalasa: Se utiliza un aplicador de madera para transferir un poco de colonia bacteriana (no
utilizar colonias aisladas en Agar Sangre, pues da resultados FALSOS POSITIVOS) al centro de un
portaobjetos en la que se aadieron unas gotas de perxido de hidrgeno. La formacin de burbujas
significa una prueba Positiva.

Prueba de Coagulasa: Colocar en un tubo de ensayo 0.5 ml de plasma humano tomado con
anticoagulante de EDTA y suspender en l 2 o 3 colonias que hayan dado positiva la prueba de
Coagulasa. Colocar en incubacin a 37C por 18 a 24 hrs. Observar en busca de la formacin de un
cogulo o de un precipitado granular. No exceder las 24 horas, pues si se trata de una cepa de
Staphylococcus aureus, ste contiene tambin otra enzima (fibrinolisina) capaz de deshacer el cogulo
formado, y reportaramos una cepa Coagulasa Negativa (FALSA NEGATIVA) cuando en realidad no lo era.

Identificacin de bacilos Gramnegativos

Principios De la Fermentacin: Los estudios de Pasteur de mediados del siglo XIX sobre la
accin de las levaduras en el vino proporcionaron la base de nuestro conocimiento actual de la
fermentacin de los hidratos de carbono. Pasteur observ que algunas bacterias contaminantes
producan una cada del pH del vino por la produccin de distintos cidos. Poco despus surgieron
descripciones completas de las vas fermentativas por las cuales se degrada un monosacrido como la
glucosa. Mediante una serie de escisiones glucolticas y transformaciones enzimticas, la molcula de
glucosa se divide en tres compuestos de carbono, el ms importante de los cuales es el cido pirvico.
La secuencia qumica mediante la cual la glucosa se convierte en cido pirvico se conoce como la Va
de Embden Meyerhoff. Muchas bacterias entre ellos todas las Enterobacterias fermentan la glucosa a
travs de esta va, sin embargo la forma cmo se origina el cido pirvico vara segn la especie
bacteriana. Los destinos alternativos del cido pirvico son el resultado de distintas vas de
fermentacin, que arrojan productos bastantes diferentes.
Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que metabolizan y por los tipos de y las
cantidades de cidos producidos. Estas diferencias en la actividad enzimtica son una de las principales
caractersticas por las cuales se reconocen las diversas especies.
El gas resultante de las fermentaciones bacterianas es fundamentalmente una mezcla de
hidrgeno, dixido de carbono que se forma a travs de la escisin del cido pirvico.

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La fermentacin bacteriana de la lactosa es ms compleja. La lactosa es un disacrido


compuesto por glucosa y galactosa, conectado por un enlace de oxgeno conocido como enlace
galactosdico. Con la hidrlisis este enlace se corta y libera glucosa y galactosa. Para que una bacteria
metabolice lactosa deben pre-sentarse dos enzimas 1) la -galactsido permeasa que permite el
transporte de un -galactsido como la lactosa a travs de la pared bacteriana , y 2) la Galacosidasa
necesaria para hidrolizar el enlace -galactsido una vez que el disacrido ha entrado a la clula. La
degradacin cida final es el resultado de la degradacin de la glucosa.
Un microorganismo no fermentador de lactosa es aquel que carece de una o ambas enzimas
necesarias para el metabolismo de la lactosa o que carece de la capacidad para atacar la glucosa.

Parte prctica

Se utilizaran los medios Triple sugar iron (TSI), Lisina iron agar (LIA), Movilidad indol ornitina (MIO) y
citrato de Simonns.
Revisar los fundamentos de cada uno de estos medios para la clase prctica

Bibliografa

Aquiahuatl M., Volke T., Prado L., Shirai K., Ramrez F., Salazar M. 2012. Manual de prcticas de
laboratorio, Microbiologa general. Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, Mxico.

Ayala I. 2013. Manual de Prcticas de Laboratorio de Microbiologa Mdica. Universidad Xochicalco

Laboratorio Linsan. 2012. Manual microdiagnstica, tercera parte, toma de muestras, medios de
transporte, Medios de cultivo, y pruebas diferenciales.

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