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No contexto celular, quando necessrio

replicar o DNA?

Replicao do DNA Antes de cada evento de diviso celular (Mitose);

Para alguns procariotos, como E. coli (4.6Mb), essa

Wendell J. Pereira diviso pode ocorrer a cada 20 30 min;

O que essa taxa de reproduo significa?

Vejamos um exemplo (vdeo 1).

Propagar-se nessa velocidade exige da Contexto histrico Replicao do DNA

replicao:
Responsvel pela propagao da informao gentica.
Grande velocidade na incorporao de bases:
Complementariedade sugeriu possvel mecanismo de
De fato, DNA Polimerase incorpora mais de 1000 bases/seg.
cpia.
Taxa de erro extremamente reduzida:
Considerando apenas a replicao, 1 erro a cada 1010.

Para tanto, uma complexa maquinaria proteica evoluiu,

especializando-se nessas funes.

Ns a entenderemos a partir de agora!

Molecular Structure of Nucleic Acids. A Structure for Deoxyribose Francis Crick e James Whatson. Google imagens.
Nucleic Acid. Nature 171, 737 - 738 (25 April 1953).

1
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Contexto histrico Replicao do DNA O elegante experimento de Meselson e Stahl.

Hipteses que explicariam a replicao do DNA:

Cada fita seria um molde (template) para a criao de uma

nova fita companheira, com sequncia exatamente igual;
O que faz as fitas se desenrolarem e se separarem?
Quais so os papeis das protenas durante a replicao?

Trs possveis mecanismos para a replicao do DNA. Biologia Molecular do Gene.

Experimental Figure 4.29 The Meselson-Stahl experiment.

O elegante experimento de Meselson e Stahl.

Baseia-se em dois conceitos:

O DNA sintetizado a partir de dNTPs contendo 15N ser mais

pesado do que o DNA contendo 14N.

A diferena ser suficiente para separao por centrifugao

com gradiente de densidade.

A partir dos perfis de separao pode-se inferir sobre a hiptese

correta.

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A sntese de DNA requer desoxinucleosdeos

O Processo de replicao
trifosfatados e uma juno iniciador:molde

Juno iniciador:molde
As bases qumicas da sntese de DNA
A sntese depende:
Presena dos desoxinucleosdeos trifosfatados (dNTPs);
Monmeros de DNA.

DNA de fita simples (single-strand DNA ssDNA) como molde.

Primer (ou iniciador) anelado, normalmente 5 a 10 nucleotdeos;

Fornece a 3`-OH necessria para a sntese.

O DNA sintetizado pela extenso da As DNA-polimerases utilizam um nico stio

extremidade 3 do iniciador ativo para catalisar a sntese de DNA

Orienta qual dNTP ser

Explora a geometria formada pelo par de bases
adicionado. complementares;

Somente com o par de bases correto o grupo 3-OH do

primer e o grupo -fosfato estaro na posio tima para
catlise:
Velocidade de incorporao muito maior para a base correta!

Gera ganho de energia que torna a

reao favorvel.
Tambm ocorre a discriminao das bases de rNTPs das
dNTPs.

3

As DNA-Polimerases assemelham-se a uma
mo que segura a juno iniciador:molde
A estrutura tridimensional da DNA-polimerase lembra uma mo direita.
A palma estabelece vrias ligaes hidrognio com a fenda menor
do DNA:
Checagem do pareamento correto das bases recm sintetizadas.
As DNA-Polimerases assemelham-se a uma
mo que segura a juno iniciador:molde
O polegar interage com o DNA recm sintetizado:
Mantm a posio correta do primer e do stio ativo.
Aumenta a interao da DNA Polimerase com o substrato.
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As DNA-Polimerases assemelham-se a uma
mo que segura a juno iniciador:molde
Os dedos interagem com o molde, causando uma toro no esqueleto
fosfodister e expondo apenas a primeira base para o stio ativo.
Interagem tambm com o dNTP, modificando sua conformao se o
pareamento for correto.
As DNA-polimerases utilizam um nico stio
ativo para catalisar a sntese de DNA
Bases corretamente pareadas so necessrios para a adio de nucleotdeos catalisada pela DNA-polimerase.
4
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As DNA-polimerases utilizam um nico stio A DNA Polimerase processiva

ativo para catalisar a sntese de DNA

Grau de processividade: nmero mdio de bases adicionadas por evento de

Ilustrao esquemtica das restries estricas que previnem o uso de precursores rNTP pela DNA-polimerase. ligao.

A processividade da DNA-Polimerase Grampos deslizante de DNA

aumentada pelos Grampos Deslizantes de DNA

Mltiplas subunidades idnticas em E .coli

formato de anel.

Deslizam sobre o DNA sem dissociar-

se;
Fago T4

Possu forte interao com a DNA

Polimerase.

Montados na juno iniciador:molde

Eucarioto
(dsDNA)

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Exonucleases realizam reviso de leitura no Exonucleases realizam reviso de

DNA recm-sintetizado leitura no DNA-recm sintetizado

Somente a restrio pela geometria do pareamento no Atuao das exonucleases de reviso

explica a baixa taxa de erros; de leitura;

Ocorrem falhas nesse mecanismo, levando a adio de Presentes no mesmo polipeptdeo da

bases mal pareadas; DNA Polimerase;

Taxa de erros de 1 em cada 105 bases; Atuam sobre a extremidade 3 do DNA

recm sintetizado;
Parece pouco, mas considere a E. coli:
Genoma de 4.6.106 bases, logo: 46 erros por replicao. O pareamento incorreto desestabiliza a
1 replicao a cada 30 min. juno iniciador:molde.
O que aconteceria com a espcie?

De onde vem o controle adicional? As exonucleases de reviso de leitura removem

as bases malpareadas da extremidade 3 do DNA.

Incio da Replicao do DNA

O Processo de replicao

Etapa da Replicao do DNA

bastante controlada pela clula.

Uma vez desencadeada, no

pode ser interrompida.

A iniciao Inicia-se nas origens de

replicao.

Cada cromossomo bacteriano

(circular) possu apenas uma
origem de replicao.

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Origens de replicao

Regies de DNA com duas caractersticas:

Sequencias ricas em AT que facilitam a abertura da dupla fita.

Stios de ligao para protenas iniciadoras.

Stio de ligao de
Seq. ricas em AT protenas iniciadoras

Plasmdeos se replicam de forma Eucariotos possuem mltiplas origens de

semelhante aos cromossomos circulares replicao
Favorecem a replicao dos longos cromossomos lineares.
Possuem origem de replicao. Reduzem consideravelmente o tempo de replicao.
Contudo, nem todas so ativadas ao mesmo tempo.
Utilizam a mesma maquinaria
para replicao do seu DNA.

Tambm se replicam a cada ciclo

As origens de replicao do cromossomo 3 de S. cerevisiae.
celular, distribuindo-se nas
clulas filhas:

Vantagem para aplicaes

biotecnolgicas.

Desvantagem no controle de
bactrias patognicas devido
a transferncia de genes.

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DNA-helicases
Replicao do DNA

O Papel das protenas

Complexo proteico responsvel pela abertura da dupla fita.

Seu deslocamento dependente do consumo de ATP

DNA-helicases Protenas de ligao ao DNA de fita simples

estabilizam o ssDNA antes da replicao
Em geral, hexamrica e em forma de anel.
SSBs (ssDNA-binging proteins) ligam-se rapidamente ao
Ligam-se ao ssDNA e deslocam-se em sentido ssDNA, estabilizando-o.
nico.
Possuem atividade cooperativa.
Possui alta processividade.

De que forma ela se movimenta? (vdeo 2)

8

Protenas de ligao ao DNA de fita simples
estabilizam o ssDNA antes da replicao
SSBs (ssDNA-binging proteins) interagem com o
esqueleto acar-fosfato;
As bases nitrogenadas permanecem acessveis.
Primer de RNA sintetizado
pela primase
Forquilha de replicao
A replicao ocorre nas duas fitas simultaneamente.
Duas forquilhas de replicao so criadas e se movem
em sentido contrrio.
Como a forquilha se movimenta?
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A iniciao de uma nova fita de DNA requer
um iniciador de RNA
Sempre a polimerizao deve comear a partir de uma
extremidade 3OH livre de um oligonucleotdeo pr-
existente (iniciador ou primer)
Surpreendentemente, o iniciador uma fita de RNA
sintetizada por uma enzima denominada Primase
A Primase uma RNA polimerase
Sntese apenas com o ssDNA como molde;
Alta afinidade com a DNA-helicase;
Natureza antiparalela e a replicao
simultnea
5 3
3 5
A replicao sempre ocorrer no sentido 5`-> 3`:
Necessidade da extremidade 3`-OH livre, fornecida pelos primers.
Como a maquinaria de replicao poderia contornar este problema?
9
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Natureza antiparalela e a replicao Natureza antiparalela e a replicao

simultnea simultnea

Sntese de vrios primers para replicao da fita tardia! A Primase a responsvel pela
sntese dos vrios primers
Consequentemente, a nova molcula ser sintetizada necessrios.
em fragmentos, os fragmentos de Okazaki.
De tempos em tempos, primase
interage com a Helicase e gera
um novo primer.

Produo dos fragmentos de

Okazaki:
1000 a 2000 nucleotdeos em
procariotos
100 a 400 nucleotdeos em
eucariotos
Tsuneko and Reiji Okazaki

Principais protenas atuando na forquilha de Os iniciadores de RNA devem ser removidos

replicao:
RNAse H (hbrido):
Clamp loader
Remove o primer, exceto a ltima base no
sentido 5-3.

DNA-helicase 5 Exonuclease:
SSBs (ssDNA-binging Remove o rNTP deixado pela RNAse H.
proteins)
A lacuna gerada ideal para a DNA
Primase Polimerase:
DNA-Polimerase Utiliza a juno iniciador:molde e completa
Grampo deslizante de DNA a lacuna

Contudo, a ltima ligao fosfodister no

restabelecida:
DNA-ligase refaz essa ligao

Vejamos como atuam em conjunto (vdeo 3).

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As DNA-polimerases so especializadas em
As DNA polimerases diferentes funes na clula

Diferentes funes so executadas por diferentes

DNA-polimerases.

Eucariotos possuem mais de 10 DNA Polimerases,

enquanto E. coli possu 5 tipos:
Existem diversos tipos!

As DNA-polimerases so especializadas em Sntese de DNA na forquilha de replicao

diferentes funes na clula
DNA-polimerase III (DNA Pol III):
Principal enzima envolvida na replicao do
cromossomo.

Encontrada principalmente sobre a forma de uma

holoenzima (E. coli):
Holoenzima DNA Pol III

O complexo Holoenzima DNA Pol III

intensifica a processividade.

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As interaes entre as protenas da forquilha As interaes entre as protenas da forquilha

de replicao formam o replissomo de E. coli de replicao formam o replissomo de E. coli
O replissomo funciona como um conjunto proteico que favorece a Interao entre a DNA-helicase e a Holoenzima aumenta a atividade da
atividade dos componentes individuais. The Replication of DNA 285 Helicase em 10x.
Interao entre Helicase e Primase aumenta a atividade da Primase em
d
1000x.
a The Replication of DNA 287
5' 5'
3' a b
leading-strand
3' DNA polymerase 5' 5'

sliding clamp 3'

3' 3' - DNA helicase 3'

loader protein 3' - OH 3' associates with
OH 3' -
OH DNA polymerase III 3' -
OH
3'
5' holoenzyme
5' 5'
sliding 3'
DNA helicase
clamp not associated 5'
DNA helicase 5' enhanced with DNA
H polymerase
3' -OH reduced DNA
DNA helicase ' -O
unengaged DNA 5' 3' -OH 3'
3' activity
5' 3
helicase activity
5' 3'
polymerase 3' -O
H 3'
3' -OH 5' -O

3' 5' 5' 3' 5' H

-O
SSB bound H
5' to DNA 5'
lagging-strand
DNA polymerase The second lagging-strand
DNA polymerase
binds the sliding clamp
Okazaki fragment 5' at the primer:template
junction and begins to FIGURE 9-24 Binding of the DNA helicase to DNA Pol III holoenzyme stimulates the rate
b synthesize a new of DNA strand separation. The t subunit of the sliding clamp loader interacts with both the DNA
5' Okazaki fragment Vejamos um esquema que nos ajudar a compreender.
helicase and the DNA polymerase at the replication fork. (a) When this interaction occurs, the DNA
helicase unwinds the DNA at approximately the same rate as the DNA polymerases replicate the
DNA. (b) If the DNA helicase is not associated with DNA Pol III holoenzyme, DNA unwinding
slows by 10-fold. Under these conditions, the DNA polymerases can replicate faster than the
3' DNA helicase can separate the strands of unreplicated DNA. This allows the DNA Pol III holoenzyme
to catch up to the DNA helicase and re-form the replisome.
3' - 3'
OH
5' DNA helicase slows down if it becomes separated from the DNA polymerase
(see Fig. 9-24). The coupling of helicase activity to the presence of DNA Pol
III prevents the helicase from running away from the DNA Pol III holoen-
RNA primer e zyme and thus serves to coordinate these two key replication fork enzymes.
A second important proteinprotein interaction occurs between the DNA
5' 5' helicase and primase. Unlike most proteins that act at the E. coli replication
3' -OH fork, primase is not tightly associated with the fork. Instead, at an interval of
3' 3'
primase about once per second, primase associates with the helicase and SSB-coated
RNA primer is ssDNA and synthesizes a new RNA primer. Although the interaction between
5' lagging-strand Pol synthesized on the 3' -
the DNA helicase and primase is relatively weak, this interaction strongly
continues Okazaki OH 3' stimulates primase function (about 1000-fold). After an RNA primer is synthe-
lagging strand sized, the primase is released from the DNA helicase into solution.
fragment synthesis 5' 5' The relatively weak interaction between the E. coli primase and DNA
helicase is important for regulating the length of Okazaki fragments. A
tighter association would result in more frequent primer synthesis on the
lagging strand and therefore shorter Okazaki fragments. Similarly, a weaker
interaction would result in longer Okazaki fragments.
3' -OH The combination of all of the proteins that function at the replication fork is
c referred to as the replisome. Together, these proteins form a finely tuned fac-
5'
tory for DNA synthesis that contains multiple interacting machines. Individ-
3' ually, these machines perform important specific functions. When brought
3'
5' together, their activities are coordinated by the interactions between them.
sliding clamp is loaded Although these interactions are particularly well-understood in E. coli cells,
onto the newly primed 3' - 5' studies of bacteriophage and eukaryotic DNA replication machinery show
OH The first lagging-strand that a similar coordination between multiple machines is involved in DNA
lagging strand replication in these organisms. Indeed, there are clear parallels between the
DNA polymerase is
3' -OH released from DNA
and the sliding clamp
after completion of
5' an Okazaki fragment
primase
3' -OH is released

DNA-Polimerases em Eucariotos
Finalizando
279
The Replication of DNA
a replicao
3' 5'

Conjunto de DNA-polimerases em eucariotos 5' 3'

FIGURE 9-18 DNA polymerase switch-
ing during eukaryotic DNA replication.

maior e mais diversificado. DNA Pol /

The order of eukaryotic DNA polymerase
function is illustrated. The length of the
RNA primer
primase DNA synthesized is shorter than in reali-
synthesis by primase
ty for illustrative purposes. Typically, the

Assim como em procariotos, muitas DNA- combined DNA Pol a/primase product is
between 50 and 100 bp, and the further ex-
3' 5'

polimerases no atuam diretamente na

F I G U R E 9-23 (See facing page for legend.) 5' 5' 3'
tension by Pol 1 or Pol d is between 100 and
10,000 nucleotides. Although both DNA

replicao. DNA synthesis

by Pol
Pol d and 1 can substitute for DNA Pol a/
primase, recent studies indicate that DNA
Pol 1 substitutes on the leading-strand tem-
plate and DNA Pol d substitutes on the
3' 5'

Principais DNA-polimerases na replicao em 5' 5' 3'

lagging-strand template.

eucariotos so:
DNA Pol or
Problemas torsionais
sliding
clamp
DNA Pol /primase:
Iniciao de novas fitas de
DNA. 3' 5'

5' 5' 3'

DNA Pol :
Sntese da fita tardia
3' 5'

5' 5' 3'

DNA Pol :
Sntese da fita-lder.
before releasing from the template. How is the processivity of these enzymes
increased so dramatically at the replication fork?
One key to the high processivity of the DNA polymerases that act at repli-
cation forks is their association with proteins called sliding DNA clamps.
These proteins are composed of multiple identical subunits that assemble
in the shape of a doughnut. The hole in the center of the clamp is large
enough to encircle the DNA double helix and leave room for a layer of one
or two water molecules between the DNA and the protein (Fig. 9-19a) (see
Structural Tutorial 9-2). These properties allow the clamp proteins to slide
along the DNAwithout dissociating from it. Importantly, sliding DNA clamps
also bind tightly to DNA polymerases bound to primer:template junctions
(Fig. 9-19b). The resulting complex between the polymerase and the sliding
clamp moves efficiently along the DNA template during DNA synthesis.
How does the association with the sliding clamp change the processivity
of the DNA polymerase? In the absence of the sliding clamp, a DNA poly-
merase dissociates and diffuses away from the template DNA on average
once every 20 100 bp synthesized. In the presence of the sliding clamp,
the DNA polymerase still disengages its active site from the 30 -OH end
of the DNA frequently, but the association with the sliding clamp prevents
the polymerase from diffusing away from the DNA (Fig. 9-20). By keeping
the DNA polymerase in close proximity to the DNA, the sliding clamp

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As topoisomerases removem as superhlices As topoisomerases removem as superhlices

produzidas pelo desenrolamento do DNA. produzidas pelo desenrolamento do DNA.

Conforme a DNA-helicase avana, ocorre a formao

de superhlices no DNA dupla fita. Topoisomerases II

As topoisomerases I e II atuam na remoo das Removem as superhlices

superhlices. formadas pelo
desenovelamento.

Abrem a dupla fita atravs do

gasto de ATP.

Topoisomerases desempenham papel

fundamental no trmino da Replicao Finalizando a replicao
The Replication of DNA 303

Type II Topoisomerases Are Required to Separate

Daughter DNA Molecules

Topoisomerase tipo II
After replication of a circular chromosome is complete, the resulting daugh-
ter DNA molecules remain linked together as catenanes (Fig. 9-35; Chapter 4,
separa as molculas de
Fig. 4-23). Catenane is the general term for two circles that are linked (similar
to links in a chain). To segregate these chromosomes into separate daughter
DNA filhas geradas pela
cells, the two circular DNA molecules must be disengaged from each other or
decatenated. This separation is accomplished by the action of type II topo-
replicao.
isomerases. As discussed in Chapter 4, these enzymes have the ability to
break a dsDNA molecule and pass a second dsDNA molecule through this
break. This reaction can easily decatenate the two circular daughter chromo-
somes by breaking one DNA circle and passing the second through the break,
Cromossomos circulares e
allowing their segregation into separate cells. Problemas com os telmeros
Although the importance of this activity for the separation of circular
plasmdeos so separados
chromosomes is most clear, the activity of type II topoisomerases is also crit-
ical to the segregation of large linear molecules. Although there is no inher-
pela ao dessa enzima.
ent topological linkage after the replication of a linear molecule, the large
size of eukaryotic chromosomes necessitates the intricate folding of the
DNA into loops attached to a protein scaffold (see Chapter 8, Fig. 8-32b).
topoisomerase II
These attachments lead to many of the same problems that circular chromo-
somes have after replication when the two daughter linear chromosomes
must be separated. As in the case of circular chromosomes, type II topoiso-
merases allow these linked DNAs to be separated.

Lagging-Strand Synthesis Is Unable to Copy the Extreme Ends

of Linear Chromosomes FIGURE 9-35 Topoisomerase II cata-
lyzes the decatenation of replication pro-
The requirement for an RNA primer to initiate all new DNA synthesis creates
ducts. After a circular DNA molecule is
a dilemma for the replication of the ends of linear chromosomes, called replicated, the resulting complete daughter
the end replication problem (Fig. 9-36). This difficulty is not observed during DNA molecules remain linked to each other.
the duplication of the leading-strand template. In that case, a single internal Type II DNA topoisomerases can efficiently
RNA primer can direct the initiation of a DNA strand that can be extended to separate (or decatenate) these DNA circles.
the extreme 50 terminus of its template. In contrast, the requirement for multi-
ple primers to complete lagging-strand synthesis means that a complete copy
of its template cannot be made. Even if the end of the last RNA primer for Oka-
zaki fragment synthesis anneals to the final base of the lagging-strand tem-
plate, once this RNA molecule is removed, there will remain a short region
(the size of the RNA primer) of unreplicated ssDNA at the end of the chromo-
some. Although this shortening would only occur on one of the two strands of
the daughter molecule, after the next round of replication occurs both strands
of the daughter molecule would be shorter. This means that each round of
DNA replication would result in the shortening of one of the two daughter
DNA molecules. Obviously, this scenario would disrupt the complete prop-
agation of the genetic material from generation to generation. Slowly, but
surely, genes at the end of the chromosomes would be lost.
Organisms solve the end replication problem in a variety of ways. One so-
lution is to use a protein instead of an RNA as the primer for the last Okazaki
fragment at each end of the chromosome (Fig. 9-37). In this situation, the

13
priming protein binds to the lagging-strand template and uses an amino
acid to provide an OH (typically a tyrosine) that replaces the 30 -OH normally
provided by an RNA primer. By priming the last lagging strand, the priming
protein becomes covalently linked to the 50 end of the chromosome. Termi-
nally attached replication proteins of this kind are found at the end of the lin-
ear chromosomes of certain species of bacteria (most bacteria have circular
 9/13/16

A replicao da fita tardia no as

extremidades do cromossomos lineares

Replicao do DNA
Wendell J. Pereira

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