UNIVERSIDAD AUTNOMA DE SINALOA

MTODOS DE SEPARACIN
CROMATOGRFICOS

Dra. Nancy Yareli Salazar Salas

Octubre 2017
CROMATOGRAFA

Tcnica que permite separar los componentes de una muestra

debido a su diferente afinidad entre dos fases inmiscibles entre s,
una estacionaria y otra mvil

Elementos que participan

en una cromatografa

1. Fase estacionaria
2. Fase mvil
3. Muestra
INICIO DE LA CROMATOGRAFA
MIGUEL TSWEET (BOTANICO RUSO-1906)
REALIZ LA PRIMERA CROMATOGRAFA EN COLUMNA

Eter de Eter de
Eter de
petrleo petrleo
petrleo

Mezcla de
pigmentos
vegetales

CaCO3

Cromatografa
Chroma (Color) Escritura en color
Graphein (Escribir)
La caracterstica que distingue a la cromatografa de la mayora de
los mtodos fsicos y qumicos de separacin, es que se ponen en
contacto dos fases mutuamente inmiscibles:

La FE y la FM

La muestra en la FM es transportada por la

FE

Los analitos experimentan interacciones

repetidas (repartos) entre la FM y la FE.

En una FM y FE los analitos se separan

gradualmente en bandas en la FE.

Al final los componentes separados

emergen en orden creciente de interacin

El componente menos retardado emerge

primero, el retenido eluye al final.

El reparto entre las fases aprovecha

las diferencias entre las prop. fsicas
y/o qumicas de los componentes de
la muestra.
DESARROLLO DE LAS TCNICAS CROMATOGRFICAS

Tipo de
Autores Ao
cromatografa
Tswett 1906
Columna

Capa fina Izmailov 1938

Columna (particin) Martin y Synge 1941

En papel Consden 1944

Fase inversa Haward y Martin 1950

De gases James y Martin 1952

Elucin con gradiente Tiselius 1952

Fluidos supercrticos Klesper 1962

De geles Determan 1964

HPLC Horvath 1964

Valcarcel, Gomez; Tcnicas Analticas de separacin

 TERMINOLOGA Y PARMETROS CROMATOGRFICOS

ELUYENTE: As se denomina a la FM que entra por la columna.

ELUATO: Termino con que se define la salida del eluyente ya con
la muestra.
FLUJO: Mide la velocidad de la fase mvil, se expresa como gasto
de volumen (ml de disolvente/ minuto de recorrido)
TIEMPO DE RETENCIN tR : Tiempo que un soluto permanece
en la columna, se mide desde el momento de la inyeccin hasta la
elucin del pico correspondiente.
TIEMPO MUERTO t0: El tiempo requerido para eluir un soluto que
no se retiene en la fase estacionaria.
CROMATOGRAMA: Grfica de alguna funcin de concentracin
del soluto contra el tiempo o el volumen de elucin

SELECTIVIDAD, EFICIENCIA, NMERO DE PLATOS TERICOS,

FACTOR DE CAPACIDAD, RESOLUCIN, COEFICIENTE DE RETENCIN
 Tipos de Cromatografa

Mecanismos de retencin
-Adsorcin (normal, de fase reversa)
-Particin lquido-lquido
-Exclusin por tamao
-Intercambio inico
Cromatografa de adsorcin

La fase estacionaria es slida. La separacin se logra

por las diferencias en solubilidad (en fase mvil) y de
retencin por adsorcin (en fase estacionaria) de la
mezcla de solutos

Pueden ser sistemas lquido/slido y gas/slido

 La FE es un slido en el que los
componentes de la muestra son adsorbidos.

La FM puede ser un lquido (cromatografa

lquido-slido) o un gas (cromatografa gas-
slido); los componentes se distribuyen
entre dos fases a travs de la combinacin
de los procesos de adsorcin y desorcin.
Cromatografa de adsorcin

- Slica (90%) y almina (10%) son las fases estacionarias

ms comunes

- Tanto las molculas de solutos como de disolvente son

atradas hacia los lugares activos polares de la fase
estacionaria

- Unos solutos sern ms atrados que otros por la fase

estacionaria y as se lograr su migracin diferencial

- Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poder de

elucin y la selectividad adecuadas. Normalmente un
disolvente apolar (n-hexano) mezclado con otro de mayor
polaridad (acetona, cloruro de metilo, etc.).
Cromatografa de particin

La separacin se basa en el reparto o distribucin de los

solutos entre una fase mvil lquida y otra estacionaria
inmiscible, soportada sobre un slido inerte.
La discriminacin se produce por diferencias de solubilidad

El soluto est en equilibrio entre el lquido estacionario y la fase mvil

Particin lquido-lquido y Particin gas-lquido
 Cromatografa de Particin

La fase estacionaria de la cromatografa de

particin es un lquido soportado en un
slido inerte.

La fase mvil puede ser un lquido

(cromatografa de particin lquido-lquido)
o un gas
(cromatografa de particin gas-lquido,
GLC).

La cromatografa en papel es un tipo de

cromatografa de particin en la cual la
fase estacionaria es una capa de agua
adsorbida en una hoja de papel.
Cromatografa de particin

Existen dos modos bsicos de operacin:

-Fase normal. Cuando se trabaja con fase estacionaria polar

y fase mvil no polar

-Fase reversa. Cuando se emplea una fase estacionaria no

polar y fase mvil polar

- Inicialmente tuvo ms auge la fase normal pero en la actualidad

son ms comunes los mtodos cromatogrficos en fase reversa
dada la naturaleza hidroflica de las muestras de mayor inters
(clnico, contaminacin, alimentos)
Cromatografa de exclusin por tamao

La separacin se basa en el tamao molecular. Como

fase estacionaria se emplean sustancias de tamao de
poro determinado. Tambin se denomina cromatografa
de permeabilidad por gel (GPC).

Cromatografa de exclusin por tamao

- Como fase estacionaria se emplea un material poroso inerte

(gel) que permite la discriminacin entre los solutos segn su
tamao.

- Los analitos de mayor tamao no pueden penetrar en los

poros de la fase estacionaria y son excluidos, viajando con la
fase mvil en el frente de la misma.

- Se muestra especialmente til para determinar el rango

molecular de polmeros, protenas, etc.
Cromatografa de intercambio inico

La separacin depende de la adsorcin reversible de molculas de

soluto cargadas, a una resina con grupos inicos de carga opuesta

Fase mvil: Solucin Buffer

Fase estacionaria: Matriz slida insoluble a la cual se unen de
forma covalente grupos cargados
Intercambiadores
- Catinicos: Carboximetil, metilsulfonato
- Aninicos: Dietilaminoetil, amonio cuaternario
Cromatografa de intercambio inico

Permite la separacin de las molculas con base a su carga neta.

Las protenas cargadas pueden unirse a intercambiadores
aninicos o catinicos dependiendo de su carga neta.
Las protenas ms cargadas se unirn ms fuertemente al
intercambiador y sern ms difciles de eluir.
La afinidad con la que se une la protena al intercambiador inico
depende de la fuerza inica del medio determinada por el pH,
debido a la competencia de los grupos cargados de la protena y
los iones del medio.
Para eluir las protenas se debe aumentar la fuerza inica del
medio.
Cromatografa de intercambio inico
MTODOS CROMATOGRFICOS

MTODOS CROMATOGRFICOS

SIMPLES INSTRUMENTALES

PAPEL PLACA COLUMNA GASES LQUIDOS

Cromatografa en plano

- Cromatografa en papel
- Cromatografa en capa fina (TLC)

Tipo: Particin
Desarrollo:
-Radial
- Ascendente, descendente,
bidimensional
Cromatografa en plano

Cualitativa

x x x x x x

Identificacin Pureza Ausencia

Cuantitativa Preparativa

x x x x
Cromatografa en columna abierta

Columnas de vidrio rellenas de Almina

(Al2O3), Slica u xido de Magnesio.

Cromatografa de Particin
Fase estacionaria
FASE NORMAL: FE de Elevada polaridad
y FM disolventes relativamente apolares como
hexano o isopropanol.
FASE REVERSA: FE no polar frecuente-
mente un hidrocarburo y FM relativamente
polar como agua, metanol o acetonitrilo
Cromatografa

Fases mviles Polaridad de compuestos orgnicos

Alcanos (Hexano, ciclohexano,
Eter de petrleo) Alcanos

Aumento de la Polaridad
Aumento de la Polaridad

Tetracloruro de carbono Alquenos

Tolueno Dienos conjugados

Diclorometano Hidrocarburos Aromaticos

Cloroformo teres, hidrocarburos

Acetato de etilo Aldehdos, cetonas, steres
Isopropanol Aminas
Acetona Alcoholes
Metanol cidos carboxlicos
Agua
 CROMATOGRAFA DE LQUIDOS
DE ALTA RESOLUCIN: HPLC

- Cromatografa de ALTA PRESIN

Se aplica un flujo a presin ( entre
1500 y 2200 psi)
- Longitud de la columna: 5-25 cm
- Tamao de partcula: 3-10 micras
- Requiere equipo sofisticado

Anlisis de compuestos Termolbiles o de masa molecular muy grande:

Aminocido, protenas, antibiticos, vitaminas, farmcos, etc.
CROMATOGRAFA DE LQUIDOS
DE ALTA RESOLUCIN: HPLC

Tipos
Cromatografa de particin
En fase inversa
En fase normal
Cromatografa de adsorcin o
lquido-slido
Cromatografa de intercambio inico
Cromatografa de exclusin por
tamao o filtracin en gel

IDENTIFICACIN, CUANTIFICACIN y PURIFICACIN de mezclas

de compuestos.
 TLC vs HPLC FASE NORMAL Y FASE REVERSA

Normal Phase (SiO ) TLC

TLC fase normal
2
(SiO2) Normal Phase (SiO2)
fase normal (SiO2)

a b c

a Tiempo
Time
0
b

Reverse Phase (C18)

Fase reversa (C18)

x c b a

0 Tiempo
Time
ESQUEMA BSICO DE UN HPLC
ESQUEMA BSICO DE UN HPLC

Solventes

Bomba

Inyector

Columna

Detector
SEPARACIN Injector

Mixer

Pumps

Column

Detector

Waste
Solvents
 Injector Cromatograma

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Injector Cromatograma

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Injector Cromatograma

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Injector Cromatograma

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Injector Cromatograma

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Injector Cromatograma

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Injector Cromatograma

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Injector Cromatograma

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Injector Cromatograma

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Injector Cromatograma

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Injector Cromatograma

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Injector Cromatograma

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Injector Cromatograma

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Injector Cromatograma

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Injector Cromatograma

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Injector Cromatograma

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 EL CROMATOGRAMA

to Tiempo muerto- elucin del compuesto no retenido

tR- Tiempo de retencin Importante para identificar
tR

tR
mAU El rea o la altura es
proporcional a la
concentracin del analito
to

Inyeccin tiempo
El comportamiento cromatogrfico de un soluto puede describirse de
diversas formas. Considero ahora importante introducir las definiciones de
algunos trminos importantes para la cromatografa en columna como son:
Tiempo de retencin (tr). El tiempo que un soluto permanece en la
columna, se mide desde el momento de la inyeccin hasta la elusin del pico
mximo. Es caracterstico del soluto para condiciones de operacin
constantes. Auxiliar en la identificacin de los solutos.

Tiempo muerto (tm). El tiempo requerido para eluir un soluto que no se

retiene en la fase estacionaria. Tiempo que un soluto permanece en fase
mvil. Representa el espacio vaco de la columna.

Tiempo de retencin ajustado (tr). Mide el tiempo que el componente

permanece en fase estacionaria.
tr = tr tm

Ancho a la base (Wb). Es la porcin de la lnea base intersectada por las

tangentes al pico.
Ancho a la mitad de la altura (W). Una medida mas reproducible,
adecuada para evaluar manualmente la eficiencia del sistema (platos
tericos).

Nmero de platos tericos (N). Cada plato terico representa un equilibrio

terico de distribucin del soluto entre las fases. El nmero total de platos
tericos de una columna representa el poder de separacin de la columna.
Una buena columna tiene un nmero alto de platos tericos.

Se calcula con cualquiera de las ecuaciones:

1. La fase mvil tarda 3,0 min en atravesar una
columna, y un soluto tiene un tiempo de retencin
de 9,0 min. a) Calcular el factor de capacidad.
2.- Un soluto con un tiempo de retencin de 407 s tiene
una anchura en la base de 13 s para una columna de 12,2
m de longitud. Calcular la altura equivalente del plato
terico y el nmero de platos tericos

3.- Un pico con un tiempo de retencin de 407 s tiene una

anchura de base de 13 s, un pico prximo se eluye a 424 s
con una anchura de base de 16 s. Calcular la resolucin
de los dos compuestos
5.- Las sustancias A y B tienen tiempos de retencin de 16.40 y 17.63 min,
respectivamente, en una columna de 30 cm. Una especie no retenida pasa a
travs de la columna en 1.30 min. Las anchuras mximas (en la base) de A y B
son 1.11 y 1.21 min, respectivamente. Calcule:

a) la resolucin entre los compuestos A y B

b) el nmero medio de platos de la columna
c) la altura de plato
d) la longitud de la columna necesaria para lograr una resolucin de 1.5
e) el tiempo necesario para eluir la sustancia B en la columna que da un valor
de RS de 1.5
 FM: Desgasificada y libre de partculas en suspensin.
Reservorio de fase mvil Grado HPLC

Debe generar presiones por arriba de 6000 psi, flujo

Sistemas de bombeo libre de pulsaciones, caudales de 0.1 a 10 mL/min, de
acero inoxidable

Inyector: manual Pequeos volmenes de muestra de 5-500 ul y 0.5-100 ul,

o automtico diluida en un disolvente miscible con la fase mvil.

Tubos de acero inoxidable, vidrio, polietileno, debe ser

Columna qumicamente inerte y resistir altas presiones. En ella se
encuentre la FE.

Detector Genera una seal elctrica proporcional a la concentracin del

analito eluido

Sistema de registro y Proporciona el tiempo de retencin y el rea total del

componente medido
tratamiento de datos
SISTEMA DE SOLVENTES

-Recipientes de vidrio o acero inoxidable

volumen: 200-1000 ml
-Solventes grado HPLC
- Libres de polvo y partculas en suspensin
Filtrados a vaco a travs de filtro (millipore)
-Libres de burbujas (gases disueltos: O2 y N2)
Filtracin, bombeo por vaco, sonicacin,
burbujeo con helio
- Tratamiento diario.
SISTEMA DE BOMBEO

REQUISITOS:
1.- Generar presione s por encima de 6000 psi.
2.- Flujo libre de pulsaciones
3.- Intervalo de caudales de 0.1 a 10 ml/min
4.- Componentes resistentes a la corrosin
(juntas de acero inoxidable o tefln)

TIPOS DE BOMBAS:
- Bombas recprocas
- Bombas de desplazamiento
- Bombas neumticas
Problema general de la elucin

Skoog and Leary: Principals of Instrumental Analysis, 5 th ed. Suanders, 1998

Programacin del solvente

Dos mtodos de programacin de solvente

Isocrtico
Elucin en gradiente
- Obtener la mejor resolucin de los componentes
de la muestra en el menor tiempo posible
Pasos fundamentales:
1.- Determinar la concentracin inicial y final del solvente
2.- Ajustar el tiempo del gradiente
3.- Determinar la forma del gradiente (lineal o escalonado)
4.- Ajustar la velocidad de flujo para mejorar la resolucin
5.- Regresar a las condiciones iniciales la columna.
ELUCIN ISOCRTICA vs ELUCIN EN GRADIENTE

50% CH3CN

40% CH3CN
SISTEMA DE INYECCIN DE LA MUESTRA

Factor limitante en la precisin del anlisis:

REPRODUCIBILIDAD de la inyeccin

-Inyeccin manual o automtica

- Microjeringas
- Volumen de inyeccin: 1-500 l
- Muestras disueltas en la FM u otro
solvente miscible en ella
- Muestras filtradas con filtros < 0.5 m
COLUMNAS

PRECOLUMNAS: Aumentan la vida de la columna

analtica.

COLUMNAS ANALTICAS
-Tubo recto de acero inoxidable
- Longitud: 3-15 cm
- Dimetro interno promedio: 4.6 mm
- tamao de partcula: 3-10
- Flujo de la FM: 0.2-2mL/min
- Diversidad de fases estacionarias
Materia base: GEL DE SLICE
Tipos de columnas en HPLC

Stationary
Types of Compounds Mode Mobile Phase
Phase
Neutrals C18, C8, C4
Reversed Water/Organic
Weak Acids cyano, amino
Phase Modifiers
Weak Bases

Ion Water/Organic
Ionics, Bases, Acids C-18, C-8
Pair Ion-Pair Reagent

Compounds not Normal Silica, Amino,

Organics
soluble in water Phase Cyano, Diol

Anion or Catin
Ion Aqueous/Buffer
Ionics Inorganic Ions Exchange
Exchange Counter Ion
Resin
High Molecular Weight Gel Filtration-
Size Polystyrene Aqueous
Compounds
Exclusion Silica Gel Permeation-
Polymers
Organic

66
COLUMNAS
COLUMNAS COMERCIALES

Columna capilar: AGILENT ZORBAX Columna capilar: WATERS

Fase estacionaria: Eclipse XDB-C8 Fase estacionaria: Nova-Pak C18
Dimensiones: 15cm x 4.6mm x 5m Dimensiones: 250mm x 4.6mm x 4m
Aplicaciones: Compuestos cidos, Aplicaciones: Fase reversa.
bsicos o neutros.

Columna capilar: VARIAN Columna capilar: PHENOMENEX

Fase estacionaria: MicroPak 1C6020 Fase estacionaria: Sphereclone 5u ODS(2)
Dimensiones: 300mm x 6.5mm Dimensiones: 250mm x 4.6mm x 5m
Aplicaciones: Aminocidos Aplicaciones: Compuestos aromticos
DETECTORES

Caractersticas del detector Ideal:

1. Adecuada sensibilidad
2. Estabilidad y reproducibilidad
3. Respuesta lineal
4. Tiempo de respuesta corto
5. Alta fiabilidad
6. Volumen interno mnimo
7. No destructivo de la muestra

La seleccin de un detector est relacionada con

la naturaleza de las sustancias a determinar
DETECTORES DE ABSORBANCIA UV

FOTMETRO
- Fuente: Lmpara de mercurio, deuterio o wolframio
- Una sola longitud de onda: 254, 250,313,334 y 365 nm
- Aplicacin restringida.

MONOCROMADOR (Detector de arreglo de diodos)

- Espectrofotmetro de barrido con una red entre sus
componentes pticos
- Pueden abarcar radiacin ultravioleta y visible.
- Ventaja: Lectura a varias longitudes de onda.
Anlisis de analgsicos UV
Estandar de analgsicos
Gradient =
2.82 min 0 min: 100% EtOAC (+ 0.2% HOAc)
Acetaminophen
3 min: 100% EtOAC (+ 0.2% HOAc)
5 min: 15% MeOH, 85% % EtOAc
(+ 0.2% HOAc)
8 min: 15% MeOH, 85% % EtOAc
(+ 0.2% HOAc)
1.48 min. 10 min: 100% EtOAC (+ 0.2% HOAc)
Aspirin SiO2
Flow Rate = 1 mL/min
UV detector set at 240 nm

7.11 min.
Analgesic Retention
Caffeine Time
Acetaminophen 2.82
Aspirin 1.48
1.35 min. Caffeine 7.11
Ibuprofen
Ibuprofen 1.35
ANALGESICOS HPLC-UV

Excedrin ES
250 mg aspirin
250 mg acetaminophen
65 mg caffeine

rea %
Aspirina 19.5%
Acetaminofen 50.0%
Cafena 20.5%
HPLC: rea del pico vs deteccin UV UV Max
Aspirina 220, 296 nm
Acetaminofen 248 nm
Cafena 272 nm
Detector set at 240 rea %
nm Aspirin a 19.5%
Acetaminofen 50.0%
Cafena 20.5%

Detector set at 254 rea %

nm Aspirina 7.3%
Acetaminofen 81.9%
Cafena 10.8%

Detector
set rea %
at 280 nm Aspirina 24.8%
Acetaminofen 39.3%
Cafena 35.9%
DETECTORES DE FLUORESCENCIA

-Fuente de excitacin de mercurio

- Uno o ms filtros para aislar la
radiacin emitida.
-Alta sensibilidad
- Aplicacin: Especies fluorescentes
materiales de inters farmacutico,
clnico, productos naturales y del
petrleo, AMINOCIDOS

La fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoelctrico

colocado perpendicularmente respecto al haz de excitacin
DETECTOR DE NDICE DE REFRACCIN

-Detector universal:
Responde a casi todos los solutos
- Baja sensibilidad.
- Son fiables y no dependen del caudal
- Desventaja: Muy sensibles a los cambios
de temperatura.

ndice de refraccin: Determina la reduccin de la velocidad de la

Luz al propagarse a travs de un medio homogneo
DETECTOR DE MASAS

Limitante: entrada de la muestra al detector

-Termovaporizacin
- Nebulizacin trmica

- Proporciona espectros simples y

datos de la masa molecular del analito
-Ventaja: Identificacin de los compuestos
por sus masas moleculares.
APLICACIONES
Bioscience
Chemical proteins
peptides
polystyrenes nucleotides
dyes
phthalates

tetracyclines
Pharmaceuticals corticosteroids
antidepressants
Consumer Products
barbiturates
lipids
antioxidants
sugars
Environmental
polyaromatic hydrocarbons
Clinical
Inorganic ions amino acids
herbicides vitamins
homocysteine
ANLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO

Tiempos de retencin: Identificar

ESPECTROS DE
ABSORCIN

CURVA DE B-CAROTENO

7000

rea del pico: Cuantificar 6000

5000 y = 14295x - 161.54

R2 = 0.997

1. Curva de calibracin 4000

mUA
Serie1

2. Normalizacin de reas
3000
Lineal (Serie1)
2000

3. Estndar Interno 1000

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
-1000
mg/ml
 CROMATOGRAFA DE GASES: CG

TIPOS:
- Gas- Lquido
- Gas- Slido

HORNO Permite anlisis a TEMPERATURA PROGRAMADA

ESQUEMA DE UN CROMATGRAFO DE GASES
Principales componentes

Gas de acarreo
Controladores de flujo
Inyectores

Columnas

Detectores

Sistema de datos
Principales componentes
Horno
Temperatura ligeramente superior que T de
HORNO ebullicin de la muestra.
Anlisis Isotrmico o Temperatura
programada

Detector
DETECTOR Genera una seal elctrica proporcional a la
concentracin de analito en el gas portador
eluido en cualquier instante.

SISTEMA DE Sistema de registro y tratamiento de datos

REGISTRO DE DATOS Proporciona el tR y el rea total de cada
componente medido.
GAS PORTADOR

Caractersticas:

Qumicamente inerte, puro ( 99%), seco.

He, N2 y H2
La eleccin del gas esta determinada
por el tipo de detector que se utilizar
Grado cromatogrfico
INYECTORES

En el puerto de inyeccin se lleva a cabo la

introduccin de la muestra
Temperatura 50C arriba del punto de ebullicin
del componente menos voltil
 Con divisin-sin divisin

Split Splitless

Modo con divisin para analitos en concentraciones altas

Modo sin divisin para analitos en concentraciones traza
HORNO
ELUCIN ISOTRMICA vs
TEMPERATURA PROGRAMADA
COLUMNAS

Es donde ocurre la separacin y es el corazn

de un cromatgrafo.
Columnas empacadas de: cobre, aluminio, acero
inoxidable, vidrio tefln.
Columnas capilares de slice fundida recubiertas
con poliamida.
El empaque puede ser un slido, un lquido o un
slido recubierto por un lquido.
Empacadas o rellenas
Columnas empacadas
Tubo de vidrio, metal (acero inoxidable, cobre aluminio) o
de tefln.
Las dimensiones de una columna empacada oscilan entre:
- 2 y 4.6 mm de dimetro interno (DI)
- Longitud entre 2 a 3 m para las ms comnes.
Soporte slido, finamente dividido y homogeneo (10mm),
Fase estable trmica y qumicamente.
- Base: Tierra de diatomeas.
- Permita mayor superficie de contacto con la FM
Columnas capilares

-Capilar de slice fundida

- Flexibles
- Longitud: 10-100 m
- Diametro interno: 0.1-0.75 mm
- Ms eficaces y rpidas

Columna abierta de pared recubierta (WCOT)

- Mayor eficacia
Columna abierta con soporte recubierto (SCOT)
- Mayor capacidad de carga
Fases estacionarias

Propiedades deseables de la FE: FE polares:

1.- Baja volatilidad. - CN, -CO, -OH
2.- Estabilidad trmica FE no polares:
3.- Qumicamente inertes Tipo
hidrocarburo

La polaridad de la FE debe ser parecida a la de los

componentes de la muestra
Fases estacionarias

Polidimetilsiloxano
COLUMNAS PARA CG Y APLICACIONES

Nombre Temperatura
Fase estacionaria Comercial mxima Aplicaciones comunes
comn C

Polidimetilsiloxano OV-1, SE-30 350 Fase no polar de uso general;

Hidrocarburos; aromticos, drogas
Esteroides.

Poli(fenilmetildifenil) OV-3, SE-52 350 Esteres metlicos de cidos grasos;

Siloxano (10% fenil) alcaloides, drogas, compuestos
halogenados.

Poli(fenilmetil)siloxano OV-17 250 Drogas, esteroides, pesticidas, glicoles.

(50% fenil)
Aromticos clorados, nitroaromaticos,
Poli(trifluoropropildimetil) OV-210 200
bencenos alquilsustituidos.
Siloxano

Carbowax 20M cidos libres, alcoholes, eteres,

Polietilen glicol 250
aceites escenciales, glicoles.

Poli(dicianoalildimetil) OV-275 cidos grasos poliinsaturados, cidos

240
siloxano Libres, alcoholes.
FACTORES QUE AFECTAN LA EFICIENCIA
DE UNA COLUMNA

Longitud de la Columna
Dimetro de la Columna (1/4", 1/8", 1/16" de dimetro
externo)
Tamao de las partculas del empaque
Naturaleza de las fases
Grosor de fase estacionaria
Temperatura de la columna
Velocidad del gas portador
Cantidad de muestra inyectada
DETECTOR DE IONIZACIN DE FLAMA (FID)

Consiste de una llama de hidrgeno-aire y

una placa colectora.
El efluente de la columna pasa a travs de
la llama, que ioniza las molculas orgnicas.
Los iones se recogen en un electrodo de pola-
rizacin negativa y producen una seal elctrica.
El FID es extremadamente sensible y es el
detector ms ampliamente utilizado, su
desventaja es que destruye la muestra.
Gpos carbonilo, alcohol, halogeno y amina originan
pocos iones.
Empleado para Insensible a gases como H2O, CO2, SO2 Y NO2.
hidrocarburos,
(la mayora de los
compuestos
orgnicos)
DETECTOR DE CAPTURA DE ELECTRONES, ECD

Utiliza un emisor beta radioactivo

(electrones) para ionizar parte del gas
portador y para producir una corriente
entre un par de electrodos. Cuando las
molculas orgnicas que contienen
grupos funcionales electronegativos,
tales como halgenos, fsforo y grupos
nitro, pasan por el detector, capturan
algunos de los electrones y reducen la
corriente medida entre los electrodos.

Empleado frecuentemente para

compuestos halogenados
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD TRMICA TCD

- Se basa en los cambios en la conductividad trmica de la corriente de

gas ocasionados por la presencia de las molculas del analito.
- Utiliza H2 o He como gas portador
- Ventajas: Sencillo, Respuesta universal (orgnicas e inorgnicas),
no destructivo de la muestra
- Desventaja: Sensibilidad relativamente baja (columnas rellenas)
DETECTOR DE ESPECTRMETRA DE MASAS, MSD

*El espectrmetro de masas usa la

relacin masa-carga (m/z) de
molculas ionizadas.

*Es una tcnica muy poderosa que

permite cuantificar, identificar y da
informacin acerca de la
estructura de compuestos
desconocidos.
*Destructivo de la muestra
 APLICACIONES

En productos alimenticios:
- Control de los procesos de destilado de aguardientes a escala industrial:
grado alcohlico, acidez total, acetato de etilo, metanol, acetaldehido,
acetal y alcoholes superiores.
- Estudio de vinos monovarietales.
- Caracterizacin de avellanas por su composicin en cidos grasos.
- Identificacin de compuestos voltiles en granos de cacao.
- Determinacin del perfil del cido graso, acidez y valor del perxido en la
calidad del aceite de oliva contra el almacenaje.
- Determinacin cuali y cuantitativa de componentes voltiles en hierbas y
especias.
- Separacin de compuestos voltiles del queso.
- Anlisis de compuestos terpnicos de la uva de la variedad albario.
CROMATOGRAFA LQUIDA VS
CROMATOGRAFA DE GASES
 MUESTRAS

HPLC CG
Especies no voltiles y Especies voltiles y
Termolbiles Termoestables
Cantidad: ug/ml Cantidad: ug/ml
Ej; Aa, protenas, frmacos Ej: cidos grasos, pesticidas
Esteroides, antibiticos Muestras ambientales,esteroles
 COLUMNAS
HPLC
Acero inoxidable
Longitud: 10-30 cm
Dimetro interno: 3-10 mm
Tamao de partcula: 2-10 m
Relleno: Slice, almina, resinas
de intercambio inico
CG
Acero, vidrio, slice fundida
Longitud: 2-50 m
Dimetro interno: 200-250 um
Tamao de partcula: 5-10 m
Relleno: Slice fundida, tierra de
diatomeas
 DETECTORES
HPLC CG

Detectores de Absorbancia Detector de ionizacin de llama (FID)

- Detector de arreglo de Diodos Detector de conductividad trmica (TCD)

Detectores de Fluorescencia Detector de captura de electrones (ECD)

Detector de ndice de refraccin Detector Termoinico(TID )