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MARCADORES CITOGENÉTICOS EMPREGADOS NA PISCICULTURA

NACIONAL: REGIÃO ORGANIZADORA DE NUCLÉOLO, CMA3, DNAr 5S


E 18S NO HÍBRIDO INTERESPECÍFICO “CACHAPIRA”.
CITOGENETIC MARKERS EMPLOYED IN NATIONAL AQUACULTURE:
NUCLEOLAR ORGANIZER REGION, CMA3, 5S AND 18S rDNA IN THE
INTERSPECIFIC HYBRID “CACHAPIRA”.
Caroline Araújo de Souza, Fábio Porto-Foresti, Fernanda Dotti do Prado, Jehud Bortolozzi e Fausto
Foresti – campus de Bauru – Faculdade de Ciências – Ciências Biológicas – ca_souza85@hotmail.com – FAPESP.
Palavras chaves: marcadores citogenéticos; híbrido interespecífico; piscicultura.

Keywords: citogenetic markers; interespecific hybrid; aquaculture.

1. INTRODUÇÃO
A tecnologia da hibridação interespecífica, dentre as metodologias clássicas de manipulação
genética, é a que tem sido mais utilizada na aquicultura devido à suas facilidades de manejo e
execução prática. Esta aplicabilidade permite o atendimento da demanda de mercado para
produtos diferenciados, seja para consumo alimentar, pesca esportiva ou a criação de peixes
ornamentais. Entretanto, o produto híbrido pode representar um risco ao meio ambiente se
houver escape acidental de tanques de cultivo para a natureza. Os híbridos interespecíficos
podem competir pelos recursos com as espécies parentais, favorecidos pelo “vigor híbrido”, ou
caso sejam férteis, causar impacto sobre a integridade genética das populações selvagens,
devido ao potencial risco de retrocruzamento, com consequente introgressão de genes.
Devido aos problemas ecológicos e práticos que podem advir da técnica de hibridação
interespecífica, tornam-se necessários programas de monitoramento genético, para
identificação, caracterização e posterior controle destes híbridos produzidos nas estações de
reprodução de peixes. A ampliação do entendimento dos processos que envolvem o fenômeno
da hibridação pode auxiliar em programas de conservação dos recursos pesqueiros, assim como
em projetos a serem desenvolvidos em pisciculturas.

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA E OBJETIVOS


2.1 Fundamentação teórica
Segundo Toledo-Filho et al. (1998) é preciso cautela na utilização da técnica de hibridação
devido aos riscos potenciais que estes híbridos podem representar ao meio ambiente. Entretanto,
com o perfil genético destes animais conhecido, aliado às práticas corretas de manejo, os
possíveis problemas decorrentes do uso de animais geneticamente manipulados podem ser
evitados.
2.2 Objetivos
• Identificar citogeneticamente as regiões organizadoras de nucléolo, utilizando marcadores
citogenéticos como NOR, Cromomicina (CMA3) e hibridação in situ com sonda fluorescente
com genes ribossômicos (18S e 5S DNAr).
• Estabelecer marcadores cromossômicos que permitam a identificação das populações
parentais e do híbrido interespecífico.

3. COLETA DE DADOS E METODOLOGIA


3.1 Coleta de dados
Representantes das linhagens parentais das espécies Cachara (Pseudoplatystoma reticulatum)
(fig.1a) e Pirarara (Phractocephalus hemeliopterus) (fig. 1b), e o híbrido “Cachapira” (fig. 1c),
foram coletados de um estoque de cultivo provenientes do Projeto Pacu, uma empresa privada,
especializada na reprodução de peixes nativos, localizada na cidade de Terenos, MS.

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3.2 Metodologia
As espécies parentais e o híbrido apresentam a mesma estrutura cariotípica conservada de
2n=56, e quando isso ocorre é necessário o emprego de técnicas de colorações diferenciadas tais
como NOR (Regiões Organizadoras de Nucléolo), CMA3, e Hibridação in situ utilizando sondas
cromossômicas específicas, na tentativa de encontrar um marcador que os diferencie.
A metodologia abordada baseia-se no emprego destes marcadores citogenéticos, que tem
como objetivo principal a caracterização e diferenciação das espécies parentais e das linhagens
de híbridos interespecíficos.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Através da coloração pela impregnação de nitrato de Prata, nos exemplares de preparação
cromossômica provenientes dos parentais e do produto híbrido, observou-se a presença de
apenas um par de cromossomos portador de cístrons ribossômicos para as três espécies. A NOR
(Região Organizadora de Nucléolo) está localizada similarmente em um par de cromossomos
submetacêntricos aparecendo na região terminal do braço curto. Pelo fato da NOR ser análoga
entre as espécies parentais, estando localizada na mesma região cromossômica, e pela
ocorrência de polimorfismos torna-se difícil identificar a origem destes cromossomos no
híbrido. Após a coloração com fluorocromo CMA3, permitiu-se identificar as regiões ricas em
pares de base GC exclusivamente nos locais marcados pela Prata em todos os indivíduos
analisados.

a a1

a2

b b1

b2

c c1

c2

Figura 1. Os parentais: fêmea do Cachara (Pseudoplatystoma reticulatum) (a), macho da Pirarara


(Phractocephalus hemeliopterus) (b) e o híbrido interespecífico “Cachapira” (c). Ao lado, quadros
correspondentes a cada espécie. Pode-se observar apenas um par cromossômico portador da NOR na
posição terminal do braço curto para as três espécies (a1), (b1) e (c1). Posição confirmada através da
coloração com fluorocromo CMA3 (a2), (b2) e (c2).

A utilização da hibridação in situ com sondas de DNAr 18S, permitiu detectar sinais
fluorescentes na mesma região terminal dos cromossomos submetacêntricos de parentais e
híbridos (fig. 2), apresentando polimorfismos de tamanho, possivelmente resultado de
diferentes atividades da NOR e dos diferentes graus de condensação cromossômica

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(Foresti et al. 1981). Os resultados obtidos tanto pela NOR e pela Cromomicina (CMA3) e
pela hibridação in situ fluorescente com sondas de DNAr 18S confirmam a existência de
dois cromossomos portadores de genes ribossomais na região terminal dos cromossomos
marcados, tanto nas espécies parentais quanto no híbrido.

a b c

Figura 2. Metáfases submetidas á técnica de FISH ( Fluorescent in situ Hibridization) com sonda de
detecção ribossômica para os sítios de DNAr 18S. As setas indicam as regiões fluorescentes na mesma
região terminal de cromossomos submetacêntricos para Cachara (a), Pirarara (b) e “Cachapira” (c).

A utilização de sondas de detecção ribossômica revelou os sítios de DNAr 5S em


cromossomos diferentes dos portadores da NOR, com sinais pericentroméricos em dois
cromossomos subtelocêntricos em P.reticulatum e P. hemeliopterus, assim como no
produto híbrido “Cachapira”. A localização de sítios de DNAr 5S nas regiões
pericentroméricas poderia estar relacionada a um maior grau de proteção destas sequências,
que correm menor risco de sofrer eventos de transposição ou de permuta (crossing-over)
mais frequentes nas áreas terminais, ou seja, esta característica pode representar uma
organização genômica favorável nestes animais (Ferro et al. 2001).

a b c

Figura 3. Metáfases submetidas à técnica de FISH (Hibridação in situ Fluorescente) com sonda de detecção
ribossômica. As setas indicam os sítios de DNAr 5S nas regiões pericentroméricas de cromossomos
subtelocêntricos similares em P. reticulatum (a), em P. hemeliopterus (b) e no híbrido interespecífico
“Cachapira” (c).

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5. CONCLUSÕES
As análises de material cromossômico do híbrido interespecífico “cachapira” demonstraram
que este apresenta fórmula cariotípica diplóide simples, o que significa que provavelmente
tenha recebido metade dos cromossomos de cada um dos parentais. O fato observado que
possui duas NORs ativas, assim como dois lócus para os genes 18S e 5S, pode estar relacionado
à viabilidade deste híbrido, que em ambientes de cultivo, possui boa taxa de sobrevivência e
crescimento, ou seja, são viáveis, e podem atingir a idade adulta.
Os resultados obtidos até o momento para as marcações de NOR, CMA3, FISH 18S e 5S são
similares entre as espécies, e a presença de polimorfismos nestas regiões impossibilitam o uso
destes marcadores citogenéticos convencionais como diagnóstico. Entretanto, estes dados são
úteis na caracterização destes animais, ainda não descritos na literatura. O estudo possibilita a
ampliação do entendimento dos processos que envolvem o fenômeno da hibridação, e podem
auxiliar em programas de conservação dos recursos pesqueiros, assim como em projetos a serem
desenvolvidos em pisciculturas ou na orientação de programas de conservação biológica.

6. BIBLIOGRAFIA
CHEVASSUS, B. Hybridization in fish. Aquaculture, v. 3, p. 254-262, 1983.
FERRO, D.A.M.; NEO, D.M.; MOREIRA-FILHO, O. e BERTOLLO, L.A.C. Nucleolar
organizing regions, 18S and 5S rDNA in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): pop-
ulations distribution and functional diversity. Genetica, v.110, p. 55-62, 2001.
FORESTI, F.; ALMEIDA-TOLEDO, L.F. e TOLEDO-FILHO, S.A. Polymorfic nature of
nucleous organizer regions in fishes. Cytogenet Cell Genet, v. 31, p. 137-144, 1981.
MARTINS, C. e GALLETTI JÚNIOR, P.M. Two 5S rDNA arrays in Neotropical fish species:
is it a general rule for fishes? Genetica, v.111, p. 439–446, 2001.
PORTO-FORESTI, F.; OLIVEIRA, C.; TABATA, Y.A.; RIGOLINO, M.G.; FORESTI, F.
NORs inheritance analysis in crossings including individuals from two stocks of rainbow trout
(Oncorrhynchus mykiss) Hereditas, v.136, p. 227-230, 2002.
TOLEDO-FILHO, S.A.; ALMEIDA-TOLEDO, L.F.; FORESTI, F. & CALCAGNOTTO, D.;
SANTOS, S.B.A.F.; BERNARDINO, G. (1998) Programas genéticos de seleção, hibridação e
endocruzamento aplicados à piscicultura. Cadernos de Ictiogenética 4, CCS/USP, São Paulo.

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