UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL DE HUAMANGA

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y METALURGIA

ESCUELA DE FORMACIÓN PROFESIONAL DE INGENIERÍA EN
INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

PRÁCTICA N° 04

“BARRIDO ESPECTRAL UV-VIS DE COLORANTES”

ASIGNATURA : TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS II

PROFESOR : Ing° PANIAGUA SEGOVIA, Jesús J.

ALUMNA : FLORES HUACRE, Carmen Rosa

GRUPO : Miércoles de 10 am-1 pm

AYACUCHO – PERÚ

2017
I. OBJETIVO
 Conocer manejar de un Espectrofotómetro UV – VIS, en la caracterización de
producto alimentario.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

2.1. Espectrofotómetro
Utiliza las propiedades de la luz y su interacción con otras sustancias, para determinar la
naturaleza de las mismas. En general, la luz de una lámpara de características especiales es
guiada a través de un dispositivo que selecciona y separa luz de una determinada longitud de
onda y la hace pasar por una muestra. La intensidad de la luz que sale de la muestra es captada
y comparada con la intensidad de la luz que incidió en la muestra y a partir de esto se calcula
la transmitancia de la muestra, que depende de factores como la concentración de la
sustancia. (JHON ELMER BUSTAMANTE BOTERO y LUIS MAURICIO
CARRASCAL, 2010).

2.2. Espectroscopía UV-VIS

La espectroscopia UV – Vis utiliza la radiación del espectro electromagnético, cuya longitud
de onda está comprendida entre los 100 y los 800 nm (energia comprendida entre las 286 y
36 kcal/mol), y su efecto sobre la materia es producir transiciones electrónicas entre los
orbitales atómicos y/o moleculares de la sustancia. En la espectrofotometría UV – Vis, una
especie química (en general una molécula, aunque pueda tratarse de una especie
monoatómica, un ion o un complejo) absorben UV – Vis, y la energia adquirida por el sistema
causa la transición de un electrón de un estado basal o fundamental (EF) a uno excitado (EE).

Las técnicas espectroscópicas se basan en la interacción de la radiación electromagnética con

la materia. A través de esta interacción las moléculas pueden pasar de un estado energético,
m, a otro estado energético distinto, l, absorbiendo una cantidad de energía radiante igual a
la diferencia energética existente entre los dos niveles: El – Em, Para conseguir esto, las
moléculas absorben un fotón de una radiación tal que:

Figura 01: transición electrónica entre el nivel de energia Em y El

Estos tránsitos energéticos son los que dan origen a los espectros que, en definitiva, no son
más que el registro de las distintas longitudes de onda a las que se producen estos tránsitos
energéticos. Debido a la existencia de diferentes tipos de energía: de los electrones entre sí,
de los movimientos vibracionales de las moléculas, de la rotación de las mismas, entre otros;
las moléculas pueden interaccionar con radiaciones electromagnéticas de un rango muy
amplio de longitudes de onda, dando lugar a distintos tipos de espectroscopias según las
diferentes regiones. (Pérez, M.F., Prieto, G.F., Barrado E.E., 2002).

La espectroscopia UV-Visible (espectros electrónicos), se debe a la transición de los

electrones más externos de los átomos de las moléculas, desde niveles fundamentales a
niveles más altos de energía. Esta técnica es complementaria de la espectrometría de
fluorescencia, que trata con transiciones desde el estado excitado al estado basal. Para el
análisis cuantitativo se basa en la Ley de Beer-Lambert
𝑨 = 𝜺𝒍𝒄
Donde es la “absortividad molar” (una medida de la radiación absorbida), que es un valor
constante para cada sustancia a cada longitud de onda, y en unas condiciones experimentales
determinadas; también se denomina “coeficiente de extinción molar” si, como es frecuente,
la concentración se expresa en moles por litro. Si se opera, por tanto, a una longitud de onda
dada y con una cubeta de un determinado espesor, l, la absorbancia A, medible directamente,
es proporcional a la concentración molar de la muestra, c, lo que constituye el fundamento
del análisis espectrofotométrico cuantitativo.
Existen, sin embargo, distintos factores que afectan al cumplimiento de la ley de Lambert-
Beer, especialmente a concentraciones elevadas. Por ello antes de proceder al análisis de una
muestra es preciso comprobar experimentalmente el rango de concentraciones en que dicha
ley se cumple, obteniendo la curva de calibrado que relaciona las absorbancias con las
concentraciones.
Un espectrofotómetro puede ser único o de doble haz. En un instrumento de un solo haz, toda
la luz pasa a través de la célula muestra. La Io debe medirse retirando la muestra. Este fue el
primer diseño, y todavía está en uso en la enseñanza y laboratorios industriales.
En un instrumento de doble haz, la luz se divide en dos haces antes de llegar a la muestra.
Un haz se utiliza como referencia, y el otro haz de luz pasa a través de la muestra. Algunos
instrumentos de doble haz tienen dos detectores (fotodiodos), y el haz de referencia y el de
la muestra se miden al mismo tiempo. En otros instrumentos, los dos haces pasan a través de
un bloqueador que impide el paso de un haz. El detector alterna entre la medida del haz de
muestra y la del haz de referencia.
Las muestras para espectrofotometría UV-Vis suelen ser líquidas, aunque la absorbancia de
los gases e incluso de los sólidos también puede medirse. Las muestras son colocadas en una
célula transparente, conocida como cubeta. Estas suelen ser rectangulares, con una anchura
interior de 1 cm. Esta anchura se convierte en la longitud de ruta, L, en la Ley de Beer-
Lambert. También se pueden usar tubos de ensayo como cubetas en algunos instrumentos.
Las mejores cubetas están hechas con cuarzo de alta calidad, aunque son comunes las de
vidrio o plástico. El cristal y la mayoría de los plásticos absorben en el UV, lo que limita su
utilidad para longitudes de onda visible. (Pérez, M.F., Prieto, G.F., Barrado E.E., 2002).

2.3. Obtención de un espectro de absorción

El espectro de absorción es una representación gráfica que indica cantidad de luz absorbida
(ξ) a diferentes valores de longitudes de onda (λ). A partir de una solución diluida de un
compuesto, cuya absorbancia máxima entra dentro del rango de medida del
espectrofotómetro, se verá el valor de absorbancia a diferentes longitudes de onda frente a
un blanco que contenga el disolvente de la solución de la muestra a caracterizar. A partir del
espectro de absorción se obtendrá el valor de λ al que el compuesto presenta mayor
absorbancia (λmax). Dicho λ se utilizará a la hora de hacer determinaciones cualitativas y
cuantitativas del compuesto. El espectro de absorción de un cromóforo depende,
fundamentalmente, de la estructura química de la molécula; no obstante, hay una gran
cantidad de factores que originan variaciones en los valores de λmax y ξM, entre los que se
incluye el pH, la polaridad del solvente o moléculas vecinas y la orientación de los
cromóforos vecinos; y cada uno afecta de forma particular. Las longitudes de onda de los
picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlace en una determinada
molécula, y son valiosos para determinar los grupos funcionales dentro de la molécula. La
naturaleza del disolvente, el pH de la solución, la temperatura, la concentración de
electrolitos, y la presencia de sustancias interferentes pueden influir en los espectros de
absorción de los compuestos, así como las variaciones en la anchura de la hendidura (ancho
de banda efectivo) en el espectrofotómetro. (Pérez, M.F., Prieto, G.F., Barrado E.E.,
2002).

Figura 02: Espectros de absorción de tres pigmentos fotosintéticos. (Observar que un

compuesto pueda tener más de un pico de absorción).
2.4. Determinación de la actividad antioxidante mediante el uso de espectrofotometría
UV-VIS.
Existes diversos métodos para determinar la actividad antioxidante in vitro de antocianinas
y otros polifenoles en una muestra. Su estructura particular, deficiente en electrones hace que
estos compuestos sean muy reactivos ante las especies reactivas de oxigeno (ROS) y de
nitrógeno (RONS). En general, los antioxidantes son sustancias que se encuentran en
pequeñas concentraciones en comparación con un sustrato oxidable y que retrasan o inhiben
significativamente la oxidación de dicho sustrato. También estabilizan las ROS mediante la
cesión de un H+ y las convierten en compuestos no radicalarios. Es necesario utilizar varios
métodos de medida de actividad antioxidante para obtener un valor representativo de
capacidad antioxidante de la muestra, debido a que los antioxidantes pueden ser hidropífilcos
o lipofílicos, la medición de los antioxidantes individuales por separado no permite conocer
con certeza la capacidad antioxidante total de un fluido biológico por los efectos sinérgicos
y cooperativos que puedan establecerse entre los antioxidantes presentes en él. Esto indica
que la capacidad antioxidante se debe a la acción conjunta de antioxidantes de muy variada
reactividad presentes en un extracto y de los cuales no todos son solubles en agua
(hidrofílicos) (Liliana Andrea Santacruz Cifuentes, 2011).

2.5. Análisis de antocianinas por espectrofotometría UV-Vis.

Debido a su estructura, las antocianinas presentan máximos de absorción tanto en la región
visible como en la ultravioleta lo que resulta muy importante para la caracterización
estructural de dichos compuestos. Sus espectros de absorción se caracterizan por tener dos
bandas separadas una en la región visible entre 465 y 550 nm y otra más pequeña en el UV
alrededor de 275nm (Figura 3). Es así como se pueden identificar las antocianinas por su
absorción en la región visible.

La glicosidación conlleva a un desplazamiento hipsocrómico de los máximos de absorción

en el visible. Así por ejemplo, entre (λmax 520nm) de la pelargonidina y de la pelargonidina-
3-glucósido (505nm), ocurre un desplazamiento de Δ λ de 15/nm; entre cianidina (λmax
535nm) y cianidina-3-glucósido (λmax 523nm) un Δ λ de 12/nm, entre delfinidina (λmax
544) y delfinidina-3-glucósido (λmax. 534nm) un Δ λ de 10/nm.

Los derivados acilados no muestran diferencia con respecto a los correspondientes no

acilados en la zona del visible, sin embargo, en la región del ultravioleta suelen presentar un
máximo adicional en el intervalo de λ 310-335 nm, correspondiente a la absorción del grupo
acilo; la esterificación con ácido p-cumárico aumenta la absorción en torno a 308-313 nm y
con ácido caféico en λ326-329 nm. Este hombro no se presenta cuando el ácido sustituyente
es el ácido acético. (Liliana Andrea Santacruz Cifuentes, 2011).
Figura 3: Espectros UV – Vis de las antocianinas aciladas y 3,5-glucosiladas (línea
continuo); no aciladas y 3-glucosiladas (línea discontinua).

Las antocianinas separadas son detectadas y cuantificadas a 525 nm y la identificación de

antocianinas está basada en los tiempos de retención correspondientes y espectros
ultravioleta-visibles (UV-Vis) comparado con la de los estándares auténticos puros tales
como delfinidina-3-glucósido, delfinidina-3-rutinósido, cianidina-3-glucósido, cianidina-
3galactósido, cianidina-3-rutinósido, peonidina-3-glucósido, petunidina-3-glucósido,
pelargonidina -3-glucósido y cloruro de cianidina que están comercialmente disponibles.
El contenido total de antocianinas es calculado en ug/g usando una curva estándar para
cianidina-3-glucósido o delfinidina-3-glucósido (las antocianinas más comunes en granos)
(Abdel-Aal y Hucl, 2003) citado por (Miguel Aguilera Ortiz, 2011).

Los espectros de absorción UV-Vis de una antocianina puede proveer información sobre la
naturaleza de la antocianidina, modelo de glicosilación y posiblemente de acilación (Costa
et al., 2000) citado por (Miguel Aguilera Ortiz, 2011). Las antocianinas tienen un rango de
absorción amplio al final del azul del espectro visible con una absorción máxima observada
en las regiones de 500-535 nm (Abdel-Aal et al., 2006) citado por (Miguel Aguilera Ortiz,
2011).

La búsqueda preliminar de los componentes en los extractos de Zea mays se realizaron

usando marchas fotoquímicas, cromatogramas de capa fina, y espectros UV – Vis.
Obtuvo un concentrado del extracto alcohólico proveniente tanto de coronta como de grano.
Espectro UV- Vis de maíz morado. El maíz fresco preparado en solución etanólica dio un
pico a 204 nm y otro a 280 nm y 340 nm. (Robles Román, Margarita - 2008).
Figura 04: Espectro UV – Vis del maíz morado.

2.6. Análisis espectrofotometría UV – Vis en colorante de Bixina

La bixina y los isómeros se determinaron espectrofotométricamente, al igual que los
pigmentos amarillos (orellina) en un espectrofotómetro Spectronic 20, Genesys 2PC. Para
determinar la longitud de onda a la cual el colorante tiene la máxima absorbancia, se toma 1
gramo de muestra del colorante y se toma 1 ml de solución anterior y se lleva a un segundo
balón de 100 ml y se afora con solución al 5% de KOH. Mediante el espectrofotómetro se
hace un barrido de absorbancias entre 300 nm y 600 nm.

La grafica de absorbancia VS la longitud de onda, figura 01, deja ver claramente que la
máxima absorbancia se encuentra en un rango de 450 nm a 500 nm de longitud de onda. Lo
anterior se corrobora con lo encontrado en la literatura (Mosquera, 1989; Jaramillo, 1992;
Kalsec, 2001) citado por (Jorge Enrique Devia Pineda y Liliana Saldarriaga Calderón,
2003), que a 480 nm se presenta la mayor absorbancia para el colorante del achiote.
Figura 05: Grafica de absorbancia VS longitud de onda.

III. MATERIALES Y METODOS

3.1. Materiales 3.3. Equipos
 Pipetas  Espectrofotómetro UV –
 Vasos VIS
 Fiola
3.4. Reactivos
3.2. Muestras  NaOH 0,2N
 Colorante de Bixina y  HCl
Norbixina  Etanol CHA3-OH
 Colorante de Antocianina

3.5. Procedimiento
 Registrar las muestras en evaluación

IV. RESULTADOS

Bixina y norbixina
 Barrido espectral
Se preparó una solución de colorante de bixina y norbixina de concentración media, de
acuoso y acida siguiendo el procedimiento establecido en el numeral 0,02a y 0,02b; el barrido
espectral se realizó en un espectrofotómetro UV-VIS. Se logró observar que el máximo de
absorción se presentaba a 250 nm - 450 nm (Figura 06).
Se hizo con el solvente o disolvente de línea base La extracción con etanol.

10 ml alcohol
0,02ml Bixina 10 m alcohol

0,02a 0,02b Blanco

Figura 05: Muestra de bixina

Figura 06: Barrido espectral de bixina y norbixina.
 Excel

Grafica01:
Grafica 01:Longitud
Longituddedeonda
ondaVSVSAbsorbancia
Absorbancia
3.53.5

33

2.52.5
Absorbancia
Absorbancia

22

1.51.5 0,02b
0,02b
0,02a
0,02a
11

0.50.5

00
00 100
100 200
200 300
300 400
400 500
500 600
600 700
700 800
800

Longituddedeonda
Longitud onda(nm)
(nm)

Tabla 01: Absorbancias y longitud de onda determinadas en cada muestra de bixina.

Concentración Longitud de Absorbancia
onda (nm)
0,02a 250 3.229

0,02b 450 2.978

BETALAINA
 Barrido espectral
Se preparó una solución de colorante de Betalaina de concentración media, siguiendo el
procedimiento establecido en el numeral 0,02a y 0,02b; el barrido espectral se realizó en un
espectrofotómetro UV-VIS. Se logró observar que el máximo de absorción se presentaba a
250 nm - 540 nm (Figura 06).
Se hizo con el solvente o disolvente de línea base La extracción con H2O.
Figura 07: Barrido espectral de betalaina

ANTOCIANINA
 Barrido espectral
Se preparó una solución de colorante de antocianina de concentración ácido con tiempo de
extracción 30 y 20 minutos siguiendo el procedimiento establecido en el numeral 0,1a; 0,5a;
0,1b y 0,5b el barrido espectral se realizó en un espectrofotómetro UV-VIS. Se logró observar
que el máximo de absorción se presentaba a 530 nm (Figura 08).
Se extrae con ácido y alcohol y sale con un solo pico.
0,1 y 0,5 ml de antocianina
3 gotas de ácido clorhídrico 10 ml alcohol
10ml alcohol 3 gotas de HCl

0,1a 0,5a 0,1b 0,5b Blanco

Figura 08: Muestra de antocianina

Figura 08: Barrido espectral

Excel:

Grafica 02:Absorbancia VS Longitud de onda (nm)

4.5

3.5
Absorbancia

2.5 05b
2 05a
1.5 01a
1 01b
0.5

0
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

Longitud de onda (nm)

Tabla 02: Absorbancias y longitud de onda determinadas en cada muestra de antocianinas.
Concentración Longitud de Absorbancia
onda (nm)
0,1a 538 1.389

V. DISCUSIÓN
 Según (Pérez, M.F., Prieto, G.F., Barrado E.E., 2002), La espectroscopia UV – Vis
utiliza la radiación del espectro electromagnético, cuya longitud de onda está
comprendida entre los 100 y los 800 nm y su efecto sobre la materia es producir
transiciones electrónicas entre los orbitales atómicos y/o moleculares de la sustancia.
Por lo general el equipo que utilizamos en el laboratorio de barrido espectral UV- Vis
de colorantes de bixina y antocianina, la longitud de onda es de 190 a 1000 nm, por
lo tanto coincidimos con la afirmación del autor.

 Según (Liliana Andrea Santacruz Cifuentes, 2011), debido a su estructura, las

antocianinas presentan máximos de absorción tanto en la región visible como en la
ultravioleta lo que resulta muy importante para la caracterización estructural de
dichos compuestos. Sus espectros de absorción se caracterizan por tener dos bandas
separadas una en la región visible entre 465 y 550 nm y otra más pequeña en el UV
alrededor de 275nm, es así como se pueden identificar las antocianinas por su
absorción en la región visible. Como podemos observar en la tabla 2 que las
diferencias de longitud de onda son diferentes de cada muestra con distintos
concentraciones, esto se debe al tiempo y tipo de extracción que se obtuvo el colorante
y está dentro del rango.

 amplio al final del azul del espectro visible con una absorción máxima observada en
las regiones de 500-530 nm. Según el grafica obtenido por el Excel el punto máximo
de longitud de onda es de 540nm.

 Según (Jorge Enrique Devia Pineda y Liliana Saldarriaga Calderón, 2003), la bixina
y se determina espectrofotométricamente UV - Vis, mediante el espectrofotómetro se
hace un barrido de absorbancias entre 300 nm y 600 nm. Pero la máxima absorbancia
se encuentra en un rango de 450 nm a 500 nm de longitud de onda. Para lo cual se
determinó el grafico en el Excel, que se ve claramente la máxima longitud de onda
es 418 nm, lo cual coincide con el autor mencionado.

VI. CONCLUSIÓN
 Se logró conocer manejar de un Espectrofotómetro UV – VIS, en la caracterización
de producto alimentario.
VII. BIBLIOGRAFIA

Tesis:
1. SANTACRUZ CIFUENTES, Liliana Andrea. 2011. “ANÁLISIS QUÍMICO DE
ANTOCIANINAS EN FRUTOS SILVESTRES”. Tesis
F.C. UNC. Bogotá – Colombia.

2. AGUILERA ORTIZ, Miguel. 2011. “PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS

ANTOCIANINAS”. Tesis F.C. Q. UJED. México.

3. BUSTAMANTE BOTERO, John Elmer y MAURICIO CARRASCAL, Luis. 2010.

“ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA
ESPECTROFOTOMÉTRICA (UV-VIS) PARA LA
CUANTIFICACIÓN DE ANTRAQUINONAS
PRESENTES EN PRODUCTOS A BASE DE (Aloe
vera)”.TRABAJO DE GRADO. F. T., UTP. Lima –
Perú.

Revista científica:
4. Pérez, M.F., Prieto, G.F., Barrado E.E., 2002. “Optimización del método de determinación
de arsénico en agua potable por espectrofotometría UV-
Vis”. Revista de la sociedad química de Mexico.

5. Jorge Enrique Devia Pineda y Liliana Saldarriaga Calderón, 2003. “PLANTA PILOTO
PARA OBTENCION COLORANTE DE LA
SEMILLA DEL ACHIOTE (Bixa Orellana). Revista
Universital EAFIT. Colombia.

ANEXO
ANEXO N°01
ANEXO N°02