Metabolic Engineering  

Wei‐Shou Hu 

Solving Metabolic Flux Analysis: Equations 
Solving a set of material balance equations for a biochemical reaction network: 
Example: The incomplete combustion of CH4 to CO2, CO and H2O is shown in the following set 
of chemical reactions: 

Input Output  

CH 4 + O2 → CO2 + CO + H 2 O  
Known reactions :
CH 4 + 2O2 ⎯⎯
→ CO2 + 2 H 2 O
2CH 4 + 3O2 ⎯⎯
→ 2CO + 4 H 2 O
 

If  all  the  inputs  and  outputs  (i.e.  amount  of  CH4,  O2  consumed  and  that  of  CO2,  CO,  H2O 
produced)  are  completely  balanced,  the  fraction  of  CH4  going  to  both  reactions  can  be 
determined. On the other hand, if the material balance is not closed, there will be uncertainty 
about  the  solution,  and  the  distribution  of  materials  can  only  be  estimated.  The  following 
outlines the steps need to be followed for Metabolic Flux Analysis: 

1. List all reactions and chemical species 
The chemical species for this problem are: CH4, O2, CO, CO2, H2O 

CH 4 + 2O2 ⎯⎯
J1
→ CO2 + 2 H 2O
 
2CH 4 + 3O2 ⎯⎯
J2
→ 2CO + 4 H 2O

The Stoichiometric coefficients are: 

CH 4 O2 CO CO2 H 2O
 J
1 −1 −2 0 2 2  
J2 −1 −3 2 0 4

2. Set up Material Balance Equations for every species: 
We will set up material balance equations for this chemical reaction network. The symbol q is 
used to represent external fluxes measured. Remember any flux out of the system is negative, 
while any flux into the system is taken as positive. 

 
 
 Metabolic Engineering  
Wei‐Shou Hu 

dCH 4  
= qCH 4 − J1 − 2 J 2 (1)
dt
dO2
= qO2 − 2 J1 − 3 J 2
dt
dCO
= − qCO + 2 J 2
dt
dCO2
= − qCO2 + 2 J1
dt
dH 2 O
= − q H 2O + 2 J 1 + 4 J 2
dt
 

If pseudo‐steady state is assumed, then all the left hand terms of the ODE’s will become zero 
and the system of equations can re‐written as: 

J1 + 2 J 2 = qCH 4 (2)  
2 J1 + 3J 2 = qO2
2 J 2 = qCO
2 J1 = qCO2
2 J 1 + 4 J 2 = q H 2O
 

The system of equations can be written in the matrix form as: 

⎡1 2⎤ ⎡ qCH 4 ⎤  
⎢2 ⎢ ⎥
3⎥ ⎢ qO2 ⎥
⎢ ⎥ ⎡J ⎤
⎢0 2 ⎥ ⎢ 1 ⎥ = ⎢ qCO ⎥ ⇒ AX = Q (3)
⎢ ⎥ J ⎢ ⎥
⎢2 0 ⎥ ⎣ 2 ⎦ ⎢ qCO2 ⎥
⎢⎣ 2 4 ⎥⎦ ⎢ ⎥
⎢⎣ qH 2O ⎥⎦
 

The matrix A of the left hand side of equation 3 is referred to as the stoichiometric matrix, the 
vector  X  on  the  left  hand  side  is  the  flux  vector,  the  vector  Q  on  the  right  hand  side  is  the 
external interaction matrix, as discussed later. If in given reaction network, a compound exists 
only internally, the element in the corresponding vector is zero. 

 
 
 Metabolic Engineering  
Wei‐Shou Hu 

3. Solving the system of equations: 
Let  us  consider  a  general  case.  Generally,  a  metabolic  network  contains  m  compounds  and  n 
reactions, all transient material balances can be represented by the following expression: 

dY
= AX (t ) − Q (t )  
dt

Where  

Y:  m  dimensional  vector  of  intracellular  concentrations  (denoted  as  ci  for  the  ith  species)  of 
intermediates, metabolites and nutrients 

X: n metabolic fluxes (denoted as Ji) 

A: Stoichiometric matrix m×n (denoted as aij) 

Q: vector of m specific substrate consumption or product formation (denoted as qi) or material 
flow in and out of the system being evaluated 

 
⎡ c1 ⎤ ⎡ J1 ⎤ ⎡ q1 ⎤
⎢c ⎥ ⎢J ⎥ ⎛ a11 K a1n ⎞ ⎢q ⎥  
Y = ⎢ 2⎥ X = ⎢ 2⎥ A = ⎜⎜ M O M ⎟⎟ Q = ⎢ 2⎥
⎢M ⎥ ⎢M ⎥ ⎜a ⎟ ⎢M ⎥  
⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎝ m1 L amn ⎠ ⎢ ⎥
⎣ cn ⎦ ⎣Jn ⎦ ⎣ qn ⎦  

In the equation, the dilution due to cell volume change caused by growth (due to cell division) is 
considered negligible. The specific rate refers to the metabolic rate based on per cell or per unit 
biomass. In general, we are interested in how materials flow in the metabolic system, so we are 
interested in how materials are distributed in each cell. For this purpose, the metabolic rates 
used in general can be converted to be on a per unit cell mass basis.  

The time constants characterizing the metabolic transients are typically very rapid compared to 
the time constants of cell growth and process dynamics, therefore, the mass balances can be 
simplified to only consider the steady‐state behavior. Eliminating the derivative yields: 

 
⎡ J1 ⎤ ⎡ q1 ⎤
⎛ a11 K a1n ⎞ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥
AX (t ) = Q(t ) or ⎜ M O M ⎟ ⎢ J 2 ⎥ = ⎢ q2 ⎥  
⎜ ⎟ ⎢M ⎥ ⎢M ⎥
⎜a ⎟
⎝ m1 L amn ⎠ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥
⎣ J n ⎦ ⎣ qn ⎦
 
 
 Metabolic Engineering  
Wei‐Shou Hu 

This form is similar to what was derived in previous example as shown in equation 3. Depending 
on  the  number  of  fluxes  q’s  are  measured,  there  may  be  different  number  of  unknowns  (in 
addition to J1 and J2). There are three possible cases: 

• Fully  specified  system:  The  system  has  same  number  of  equations  as  variables.  There 
exists only one solution. If m=n, where rank(A)=m is the number of linearly independent 
equations, then X has a unique solution. For example: if only two of the external fluxes 
are  known,  and  we  are  interested  in  estimating  J1  and  J2  only,  then  the  above  set  of 
equations becomes a fully‐specified 2×2 system. In the following we discuss the Gauss‐
Elimination method to solve such a system of equations. 
• Over‐specified  system:  This  occurs  when  m>n,  where  rank(A)=m  is  the  number  of 
linearly independent equation in the system of equations, the solution to the problem is 
unique and obtained via a Least‐square fitting scheme. In general, biological systems are 
over‐specified,  as  a  particular  metabolite  can  participate  in  numerous  pathways.  For 
example,  if  three  of  the  external  fluxes  for  say  CO2,  CO  and  O2  are  known,  then  the 
system becomes over specified. In the following we discuss the Least squares method to 
solve such a system of equations. 
• Under‐specified system: In this case there are more number of unknowns as compared 
to the number of equations. This occurs if rank(A)=m, where m<n. Biological systems are 
rarely  underspecified.  For  example,  if  only  qCO  is  known,  while  we  are  interested  to 
estimate J1 and J2, then the system becomes underspecified.  

Fully  specified  system  or  Unique  solution  case:  Simple  Gauss  Elimination 
method 
For a fully‐specified system where the number of equations equals the number of variables, the 
system  of  linear  equations  can  be  solved  using  the  Gauss‐Elimination  method.  The  following 
shows  the  steps  followed  for  solving  a  general  system  AX=Q  using  the  Gauss‐Elimination 
method. 

a11 J1 + a12 J 2 + L L + a1n J n = q1 (4)  

a21 J1 + a22 J 2 + L L + a2 n J n = q2  
M M M
 
an1 J1 + an 2 J 2 + L L + ann J n = qn
 

At the first step in the elimination process, we multiply the first equation by –ai1/a11  and add it 
to the ith equation for i=1,2,…n. The result is: 

 
 
 Metabolic Engineering  
Wei‐Shou Hu 

 
a11(1) J1 + a12 (1) J 2 + L L + a1n J n = q1(1) (5)
 
a22 (2) J 2 + L L + a2 n (2) J n = q2 (2)
M M M  
an 2(2) J 2 + L L + ann (2) J n = qn (2)  

As you may notice, that the coefficients in the first equation are unchanged and are denoted by 
aij(1)  to  distinguish  them  from  the  coefficients  in  equations  i=2,…n  which  have  transformed 
coefficients, given by: 

ai1(1) (1)
aij (2) = aij (1) − a1 j , i, j = 2,3,...., n (6)
a11  
(1)
a
bi (2) = bi (1) − i1
b1(1) , i = 2,3,...., n
a11

In the next step, the second equation is multiplied by –ai2(2)/a22(2) and the result is added to the 
ith  equation for i=3,4,…,n. This eliminates the J2 term in equations i=3,4,…,n and generates the 
following set of equations: 

a11(1) J1 + a12 (1) J 2 + L L + a1n J n = q1(1) (7)  

a22 (2) J 2 + L L + a2 n (2) J n = q2 (2)  
a33(3) J 3 + L L + a3n (3) J n = q3(3)  
M M M
 
an3(3) J 3 + L L + ann (3) J n = qn (3)
 

In a similar manner, continuation of this process transforms the set of linear equations into the 
upper triangular problem: 

 
a11(1) J1 + a12 (1) J 2 + L L + a1n J n = q1(1) (8)
 
a22 J 2 + L
(2)
L + a2 n J n = q2
(2) (2)

 
a33(3) J 3 + L L + a3n (3) J n = q3(3)
M M  

ann ( n ) J n = qn ( n )  

 
 
 Metabolic Engineering  
Wei‐Shou Hu 

Thus, in this method, the system of equations AX=Q is transformed to a form UX=b, such that U 
is a upper triangular matrix of the form shown in the following. 

 
u11 J1 + u12 J 2 + L L +u1n J n = b1 (9)
u22 J 2 + L L +u2 n J n = b2  

M M M  
un−1,n−1 J n−1 + un−1,n J n = bn−1
 
unn J n = bn
 

Symbolically,  these  equations  can  be  represented  in  the  following  figure,  where  the  triangle 
represents the matrix U and the vertical lines represent the vector X and b. 

 
The solution can be determined by back substitution, namely: 

bn
Jn = (10)
unn
bn−1 − un−1,n J n  
J n−1 =
un−1,n−1
M

In a similar way, the system of equations AX=Q can be transformed to LX=b, where L is a lower 
diagonal matrix, using the forward substitution method, namely: 

b1
Jn = (11)
l11
           b2 − u21 J1
J n−1 =
l22
M  

Lets solve the example we derived in equation 3. Lets suppose qCH4=3 mM/s and qO2=4 mM/s, 

⎡1 2 ⎤ ⎡ J1 ⎤ ⎡ qCH 4 ⎤ ⎡5 ⎤ ⎡1 2⎤ ⎡5 ⎤
=⎢ ⎥= ⇒ = = =
⎢2 3 ⎥⎦ ⎢⎣ J 2 ⎥⎦ ⎢⎣ qO2 ⎥⎦ ⎢ 4⎥ ⎢2 3 ⎥⎦ ⎢ 4 ⎥ (3a )
AX Q where A and Q
⎣ ⎣ ⎦ ⎣ ⎣ ⎦
 
 
 Metabolic Engineering  
Wei‐Shou Hu 

Then  the  system  of  equations  becomes  as  shown  in  equation  3a.  Now,  lets  apply  Gauss‐

Elimination method to this 2×2 system. 

J1 + 2 J 2 = 3
2 J1 + 3 J 2 = 4  

In the first step, we will multiply the first equation with  ‐a21/a11 =‐2, the result is: 

J1 + 2 J 2 = 3
− J 2 = −2  

Now using back substitution, we can obtain the fluxes J1 and J2. 

 
J 2 = 2mM / s
J1 = 5 − 2 J 2 = 5 − 4 = 1mM / s  
 

In this case, the values of flux obtained are positive, which implies that the direction of flux is 
same  as  was  assumed.  A  negative  flux  implies  the  direction  of  flux  is  opposite  to  what  was 
assumed.  

Over‐specified system 
For this case, the solution is obtained using a least‐square error fit method. Let us assume, the 
optimum solution is given by X=J1, J2,J3,…Jn. For the ith equation, let fi represent the following: 
n
fi = ai1 J1 + ai 2 J 2 + ... + ain J n = ∑ aij J j (12)  
j =1

Then the residual or error is given by: 

n
Ri = fi − bi = ∑a J
j =1
ij j − bi (13)  

The sum of the square of the residuals or error is given by: 

 
 
 Metabolic Engineering  
Wei‐Shou Hu 
2
m m m ⎛ n ⎞
S = ∑ Ri = ∑ ( bi − fi ) = ∑ ⎜ bi − ∑ aij J j ⎟ ,
2
2
where m > n (14)  
i =1 i =1 i =1 ⎝ j =1 ⎠

Which depends on the variables J1, J2, J3,…Jn. A necessary condition for S to be a minimum is: 

dS n ⎛ n ⎞
= −∑ 2 ⎜ bi − ∑ aij J j ⎟ ai1 =0 (15)
dJ1 i =1 ⎝ j =1 ⎠
dS n ⎛ n ⎞
= −∑ 2 ⎜ bi − ∑ aij J j ⎟ ai 2 =0  
dJ 2 i =1 ⎝ j =1 ⎠
M
dS n ⎛ n ⎞
= −∑ 2 ⎜ bi − ∑ aij J j ⎟ ain =0
dJ n i =1 ⎝ j =1 ⎠

This  is  a  n×n  system  of  linear  equations,  which  is  fully  specified  and  can  be  solved  using  the 
Gauss‐Elimination method discussed before. Lets again solve the previous example of methane 
combustion,  if  we  now  have  three  equations  and  2  unknowns.  Let  us  suppose  qCH4=3  mM/s, 
qO2=4 mM/s and qCO2=1 mM/s. The system of equations becomes: 

J1 + 2 J 2 = 3  
2 J1 + 3 J 2 = 4
 
2 J1 =1
Then the squared sum of residuals becomes: 

S = ( 3 − J1 − 2 J 2 ) + ( 4 − 2 J1 − 3 J 2 ) + (1 − 2 J1 )
2 2 2  

Minimizing S gives us two equations: 

dS  
= 0 ⇒ 9 J1 + 8 J 2 = 13
dJ1
 
dS
= 0 ⇒ 8 J1 + 13 J 2 = 18
dJ 2  

Now we can solve these two equations using Gauss‐Elimination method. Again, multiplying the 
first  equation  with  ‐9/8  and  adding  to  the  second  equation.  The  transformed  equations  are 
shown in the following. Now, using back substitution we obtain the best fit solution. 

J1 + 8 / 9 J 2 = 13/ 9 ⇒ J 2 = 58/ 53 = 1.094 mM / s  

53/ 9 J 2 = 58 / 9 J1 = 13/ 9 − 8 / 9 J 2 = 10 / 9 − 8/ 9 × 58/ 53 = 66 / 477 = 0.138 mM / s
 

 
 
 Metabolic Engineering  
Wei‐Shou Hu 

Example: Pentose phosphate pathway 
In  the  next  section,  we  discuss  the  example  of  a  metabolic  pathway  called  the  Pentose 
Phosphate pathway as shown in the following.  Let us suppose the influx of glyceraldehyde‐6‐
phosphate into the pentose phosphate pathway is 100 moles/s, the rate of outflux of Ribose‐5‐
Phosphate is 50 moles/s and that of CO2 is 12 moles/s. 

Figure 1 Pentose phosphate pathway 
A  simplified  figure  of  the  pentose  phosphate  pathway  is  shown  below,  which  would  be  used  for  the 
Metabolic  Flux  Analysis  (MFA).    Lets  write  down  the  mass  balance  for  each  species.  The  system  of 
equations in (16) shows the steady state mass balance equations. 

Figure 2 Simplified figure for MFA 

 
 
 Metabolic Engineering  
Wei‐Shou Hu 

1.G 6 P : J +J =q (16)
1 10 G6P
2.CO 2 : J =q
1 CO2
{also NADPH : 2 J1= q NADPH }

3.Ribu 5 P : J −J −J =q
1 4 5 Ribu 5 P
4.R 5 P : J −J =q
4 6 R5P
5. X 5 P : J −J −J =q
5 6 8 X 5P  
6. S 7 P : J −J =q
6 7 S 7P
7.G 3 P : J − J + J + 2J = q
6 7 8 9 G 3P
8. F 6 P : J +J −J +J =q
7 8 9 10 F 6P
9. E 4 P : J −J =q
7 8 E 4P

As you may  notice,  there are 9 equations and 8 variables, the system seems over‐specified. However, 

one of the equations is a linear combination of the others and thus is not independent. Note that the 
carbon balance gives: 

6qCO2 + qO2 + 5qribu 5 P + 5qR 5 P + 5q X 5 P + 7qS 7 P + 3qG 3 P + 6qF 6 P + 4qE 4 P = 0  

Hence, we eliminate one of the equations, specifically we eliminate the equation (eq 7) corresponding 
to G3P to obtain a set of linearly independent equations and solve for the following: 

⎡1 0 0 0 0 0 0 1 ⎤ ⎡ J1 ⎤ ⎡ qG 6 P ⎤ ⎡100 ⎤
⎢1 ⎢ ⎥ ⎢ ⎥
⎢ 0 0 0 0 0 0 0 ⎥⎥ ⎢ J 4 ⎥ ⎢ qCO2 ⎥ ⎢⎢12 ⎥⎥
⎢1 −1 −1 0 0 0 0 0 ⎥ ⎢ J 5 ⎥ ⎢ qribu 5 P ⎥ ⎢0 ⎥
⎢ ⎥⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥
⎢0 1 0 −1 0 0 0 0 ⎥ ⎢ J 6 ⎥ ⎢ qR 5 P ⎥ ⎢50 ⎥
= =
⎢0 0 1 −1 0 −1 0 0 ⎥ ⎢ J 7 ⎥ ⎢ q X 5 P ⎥ ⎢0 ⎥  
⎢ ⎥⎢ ⎥ ⎢ ⎥ ⎢ ⎥
⎢0 0 0 1 −1 0 0 0 ⎥ ⎢ J 8 ⎥ ⎢ qS 7 P ⎥ ⎢ 0 ⎥
⎢0 0 0 0 1 1 −1 1 ⎥ ⎢ J 9 ⎥ ⎢⎢ qF 6 P ⎥⎥ ⎢0 ⎥
⎢ ⎥⎢ ⎥ ⎢ ⎥
⎢⎣ 0 0 0 0 1 −1 0 0 ⎥⎦ ⎢⎣ J10 ⎥⎦ ⎣⎢ qE 4 P ⎥⎦ ⎢⎣0 ⎥⎦

This  equation  is  of  the  form  AX=Q.  Solving  the  set  of  equations  in  MATLAB,  the  flux  J1,…,J10  can  be 
estimated. The values of flux are: 

 J1=   12.0000 

 J4= 37.0000 

 
 
 Metabolic Engineering  
Wei‐Shou Hu 

 J5= ‐26.0000 

 J6= ‐13.0000 

 J7= ‐13.0000 

 J8= ‐13.0000 

 J9= 62.0000 

 J10= 88.0000