Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
Fleming found the lytic action of human nasal mucus and tear on Micrococcus
cells in 1922 and he reported the similar lytic action of egg white constituent on
Gram-positive bacteria. He proposed the name lysozyme for the enzyme and
Micrococcus lysodeikticus for the organism serving as the substrate (1).
Lysozyme cleaves the -(1,4)-glycoside linkages between N-acetylglucosamine
and muramic acid in bacterial cell wall and chitin or other oligomers. In addition
to glycosidase activity, this enzyme has transglycosylation activity (2) and
esterase activity (3). Thus, numerous names have been proposed for this enzyme.
The Commission on Enzyme Nomenclature in 1964 recommended ‘‘E.C.
3.2.1.17. Systematic name: mucopeptide N-acetylmuramyl hydrolase; trivial
name: mucopeptide glucohydrolase, lysozyme.’’ Lysozyme is easily crystallized
from chicken egg white, and a large amount of the enzyme can be obtained.
Therefore, lysozyme has been one of the most intensively investigated and
characterized enzymes.
Lysozyme exists abundantly in chicken egg white and constitutes 3.5% of the
total egg white proteins when calculated on the basis of lytic activity. Since
lysozyme interacts with ovomucin gel in egg white, the content may be > 3:5%.
The lysozyme activity in hen egg white decreases during storage of egg dependent
on the temperature, as shown in Figure 1. The activity is retained > 80% during
storage at low temperature for 1 week, while it is decreased < 60% during storage
at room temperature for 1 week (4). The loss of lysozyme activity results from the
increases in pH during storage of egg. The pH increases up to 9.3 within several
days’ storage at room temperature. On the other hand, lysozyme is stable in acidic
pH in the presence of CO2 gas, as shown in Figure 1. Lysozyme interacts with
ovomucin in thick egg white. It is well known that the interaction is responsible
for the gel structure of thick egg white (5). The ovomucin-lysozyme interaction
decreases with egg white thinning.
PROPERTIES AS PROTEIN
Lysozyme consists of 129 amino acids and the molecular weight is 14,307
daltons. The protein contains many more basic amino acids (11 arginines and six
lysines) than acidic amino acids (six aspartic acids and two glutamic acids), and
the isoelectric point is 11.2. The amino acid and nucleotide sequences of
prelysozyme are shown in Figure 3. The sequence 1 to 18 is the signal peptide,
and the N-terminus of mature lysozyme is the position 1 (lysine). Lysozyme has
four disulfide bonds: Cys6–127, Cys30–115, Cys64–80, and Cys76– 94. Human
lysozyme, which consists of 130 amino acids, is very similar to hen egg white
lysozyme in its primary and tertiary structures and the positions of disulfide
bonds. -Lactalbumin, which consists of 123 amino acids, is also homologous to
lysozyme in its primary and tertiary structure and in the position of disulfide
bonds. The x-ray analysis of hen egg white lysozyme was carried out by Blake et
al. in 1965 as the first enzyme to have its tertiary structure determined by x-ray
crystallography (8). The ribbon drawing model is shown in Figure 4. As shown in
Figure 4, it divides the molecule into two parts—a predominantly helical core, and
an irregular -strand core. The helical core consists of four -helices (5–15, 25–35,
88–99, and 108–115), and the -strand core consists of three strand regions (38–
46, 50–54, and 57–60). The two structural domains ( and ) of lysozyme appears to
be formed prior to docking of the domains to generate the native closed-packed
structure (9). The domain forms persistent structure during folding more rapidly
than the domain. In addition to a -helical domain, lysozyme contains two 310
helices (79–84 and 119–124).
V. PROPERTIES AS ENZYME
The most striking feature of the molecule is the crevice running across the waist
of the egg-shaped molecule. The crevice is the active site of lysozyme which
has the binding area for the substrate of hexasaccharide (N-acetylglucosamine/N-
acetylmuramic acid)3. The space-filling CPK model of lysozyme (left) and
its interaction with substrate are shown in Figure 5 (10). The substrate is
compactly bound to the crevice of the lysozyme molecule. A schematic view of
the substrate hexamer, NAG-NAM-NAG-NAM-NAGNAM, and its interactions
with the enzyme are shown in Figure 6 (10). The view is nearly straight
into the crevice, with the heavy edges of the sugar rings on the exterior. The site
of catalysis was identified to be between D and E rings. When a search was
made in the vicinity of the D/E ring for possible alytic groups, two candidates
came to light: Asp52, in a polar environment where it will be ionized, and Glu35,
in largely hydrophobic surroundings where it might easily remain protonated. The
mechanism of cleavage of the polysaccharide bond in lysozyme is suggested as
shown in Figure 7 (10). The proton of Glu35 first attacks the linkage oxygen and
weakens the C1-O bond (a). If the bond is cleaved, ring D forms a carbonium ion.
The nearby charged Asp52 helps to stabilize the carbonium ion (b). The Glu35
proton is replaced by another from an ionizing water molecule, and the resultant
hydroxyl ion then attacks the carbonium ion and completes the reaction (c).
This proposal of Phillips and coworkers (11–13) has been supported by a number
of chemical and kinetic experiments. The enzyme activity of lysozyme can be
easily measured by the lytic action on M. lysodeikticus (M. luteus). However, the
change in the turbidity of M. luteus does not necessarily reflect the real enzyme
activity, because the lysis is a rupture of the bacterial cell wall and is not equal to
the cleavage of glycosidic bonds. Nevertheless, the lytic action is generally used
for the measurement of lysozyme activity because of the ease of the assay. The
decrease in the turbidity of the suspension of M. luteus cell wall is followed by
the absorbance at OD450 and the enzyme activity can be represented as the initial
rate. In order to get a linear curve for the decrease, a small amount of lysozyme (4
g) should be added into the cell suspension (OD450 ¼ 0:7). When the enzyme
reaction is done at room temperature for 1 min, a linear decrease curve is
obtained and used to determine the initial rate. The optimal pH is 7:0 using lytic
activity. On the other hand, when the activity is measured using synthetic
substrates, p-nitrophenyl N-acetylglucosamine oligomer (14) and glycol chitin
(15), the optimal pH is 5 and 5.3, respectively. Therefore, the optimal pH of
lytic activity is different from that of the glycosidic activity. The glycosidic
activity is determined by measuring the reducing power produced by the
glycolysis of ethylene glycol chitin (15). One milliliter of 0.5% ethylene glycol
chitin is added to 0.5 mL lysozyme solution in sodium acetate buffer (pH 4.5).
The mixture is incubated at 40 C for 30 min. After the reaction, 2 mL of the color
reagent (prepared by dissolving 0.5 g potassium ferricyanide in 1 L of 0.5
M sodium carbonate) is added and the mixture is immediately boiled for 15 min to
estimate the reducing power resulting from the hydrolysis of ethylene glycol
chitin.
VI. PURIFICATION OF LYSOZYME
Lysozyme is easily crystallized from fresh chicken egg white. A 5% sodium
chloride (w/w) is added to the homogenized egg white adjusted to pH 9.5–9.8.
The egg white is stirred for 48 h at 4 C. The resulting crystals are collected and
solubilized in a half-volume of acetate buffer (pH 4.5). The solution is
recrystallized at least five times. Thus, the purified lysozyme is obtained
and the purity is 100%. On the other hand, lysozyme can be purified by cation
exchange chromatography, because the enzyme is a basic protein. For example,
when the recombinant lysozyme is expressed in S. cerevisiae, the yeast medium is
applied to CM-toyopearl equilibrated with a buffer of low ionic strength, and
the adsorbed basic proteins are eluted in a gradient manner.
VII. RECENT BREAKTHROUGH STUDIES ON LYSOZYME
الليزوزيم
ليزوزيم هو إنزيم يفكك جدار البكتيريا اكتشف انزيم الليزوزيم في عام 1921على يد العالم
االسكتلندي الكسندر فلمينج ليزوزيم هو المادة االولى التي تم اكتشافها كمضاد حيوي ضد
البكتيريامن مصدر بيولوجي يتواجد الليزوزيم في إفرازات مختلفة للثديات
مثل الدموع ،العرق ،اللعاب ،وايضا في خاليا الدم البيضاء التي تشكل جهاز المناعة لجسم
الكائن الحي.كذلك يتواجد هذا االنزيم في انسجة اخرى مثل بروتين البيض وفي الحليب.هذا
اإلنزيم يتسبب لتحلل خاليا البكتيريا وبذلك يساعد في حماية الحيوانات والكائنات من هذه
البكتيريا .يتواجد هذا االنزيم ايضا في انواع معينة من النبات مثل (بابايا و فيكوس) ،وايضا
في البكتيريوفاج (فيروسات التي تهاجم بكتيريا) .انزيم الليزوزيم يساعد القيروس
على اختراق .جدار خلية البكتيريا سمي هذا االنزيم بليزوزيم النه يتسبب لتحلل البكتيريا،حيث
تنفجر خلية البكتيريا بسبب دخول الماء اليها بعد تفكيك جدارها بفعل اإلنزيم ،نتيجة لذلك تنتفخ
خلية البكتيريا ثم نتفجر،وهذا ما يسمى" بليزيس" وتعني تحلل او تفكك ،ومن هنا جاء االسم
ليزوزيم.
جدار البكتيريا
لمعظم الخاليا البكتيرية يوجد جدار الذي يحيط بالغشاء،الجدار يحافظ ويحدد شكل خلية
البكتيريا ،وبذلك يساعدها في التواجد والعيش في بيئة ذات تراكيز مخففة مثل المياه
العذبة.جدار الخلية يتركب من مادة خاصة تسمى بيبتيدوجليكان .البيبتيدوجليكان عبارة عن
بوليمير صلب الذي يكون مبنى شبكي يتميز بقوة ميكانيكية عالية .كال الوحدتين من المبنى
األساسي للبيبتيدوجليكان هما وحدتين من السكر الخاص بالبكتيريا NAMو NAGوحدات
السكر مربوطة ببعضها البعض بشكل متتالي وتكون معا شبكة من السالسل الطويلة المربوطة
فيما بينها بواسطة سالسل عرضية قصيرة من الحوامض االمينية .هذه الشبكة هي المسؤولة
عن إعطاء المبنى الصلب للبيبتيدوجليكان.
مبنى االنزيم
URLloadcancel استعمال تقنيات حيود األشعة السينية ساعد في التعرف على مبنى انزيم
الليزوزيم ،تم التعرف على المبنى الفراغي لإلنزيم عام 1965على يد
Export Animated العالم "دافيد فيلفيس" وشركائه .إنزيم الليزوزيم من أصل بيض الطيور
Image يسمى ليزوزيم سي وهو إنزيم صغير نسبيا ،يتركب من سلسلة ببتيدية
واحدة والتي تتركب من 129حامضا امينياوزنه الجزيئي 14500
دالتون تسلسل الحوامض االمينية في االنزيم يشكل المبنى االولي اما
المبنى الثانوي النزيم الليزوزيم يتألف من التفاف السالسل الببتيدية على
بعضها البعض بشكل .حلزونات الفا باللون الخمري وصفائح بيتا .
باللون االصفر المبنى الفراغي لإلنزيم هو المبنى الثالثي للسلسلة
الببتيدية ويكون على شكل دائري والذي يحتوي على 4اربطة
كبريتية (دي سولفيدية) بين الحوامض األمينية سيستئين باللون االصفر
،تعتبر األربطة الكبريتية عامل مهم لتشكيل وتثبيت المبنى الفراغي
لإلنزيم وعند تفكيكها يحدث تغير في المبنى الفراغي وبذلك تتغير فعالية
اإلنزيم وقد تتوقف نهائيا ً .وعند مقارنة مبنى البروتين بين أنواع مختلفة
من الكائنات الحية تبين وجود تشابه ،حيث تتواجد مناطق في
البروتينات التي حفظت بينها،نجد مثل هذا التشابه في منطقة الموقع
الفعال .
فعالية االنزيم
يقوم إنزيم الليزوزيم بفك الرباط بين وحدتي NAGو NAMحيث
ترتبط وحدتي السكر للبببتيدوجليكان في الموقع فعال لإلنزيم ،وفيه
تحدث عملية هيدروليزا .عملية كهذه تسبب لكسور في جدار البكتيريا
وبذلك يفقد الجدار القوة الميكانيكية لتماسكه.وبما أن البكتيريا تعيش عامة
في بيئة مخففة التراكيز(هيبوتيني) عندها ونتيجة لفعالية الليزوزيم
ستحدث اسموزا ويدخل الماء لداخل البكتيريا فتنتفخ وتنفجر .