Análisis de composición y propiedades

antioxidantes del extracto de ajo negro

Xiaoming Lu 1, Ningyang Li 1, Xuguang Qiao *, Zhichang Qiu, Pengli

Liu

Ajo negro producido a partir de ajo fresco bajo control de alta temperatura y humedad tiene fuertes
propiedades antioxidantes. Para determinar estos compuestos, se separaron cinco fracciones (de F1 a F5) y se
purificaron por elución con cloroformo: metanol a diferentes proporciones (8: 1, 6: 1, 4: 1, 2: 1 y v / v). Se
analizó la actividad antioxidante de cada fracción. Los resultados mostraron que F3 y F4 tenían mayores
contenidos fenólicos y más fuerte 2,2-difenil-2-picrilhidrazil actividad de barrido que los otros. Siete
componentes individuales purificados se separaron adicionalmente utilizando cromatografía líquida de alta
resolución semipreparación de estas dos fracciones intensamente antioxidantes (F3 y F4), sus estructuras
fueron dilucidadas por cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a detección de diodos, ionización
por electrospray, espectrometría de masas, 1 H de resonancia magnética nuclear, y 13 C espectrometría de
resonancia magnética nuclear. Tres compuestos que incluyen adenosina, uridina, y 2-acetilpirrol se
identificaron por primera vez en ajo negro, a excepción de 5-hidroximetil-furfural, (1S, 3S) -1-metil-1,2,3,4-
tetrahidro- b carbolina-3- ácido carboxílico, y (1R, 3S) b ácidos carbolina-3-carboxílico -1-metil-1,2,3,4-
tetrahidro-. Las actividades antioxidantes celulares de los extractos de uridina, adenosina, carbolina, 5-
hidroximetilfurfural y acetato de etilo fueron consistentes con los resultados de las propiedades antioxidantes
experimentales in vitro. Los resultados proporcionan información útil para comprender los beneficios para la
salud de los productos de ajo negro.

Copyright © 2016, la Administración de Alimentos y Medicamentos, Taiwán. Publicado por Elsevier Taiwan
LLC. Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND licencia ( http: //
creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).

1 Introducción
El ajo (Allium sativum L.) es uno de los alimentos y especias más importantes durante siglos. Estudios
extensivos han demostrado que el ajo puede proporcionar efectos biológicos y farmacológicos
favorables.

efectos in vitro y en modelos animales in vivo, tales como actividades de Antimi microbianas y contra el
cáncer [1,2] , y también tiene efectos hypogly-CEMIC y antioxidantes [3] . Extractos de ajo también se
han demostrado tener una fuerte actividad de eliminación de radicales [1,1-difenil-2-picrilhidrazil
(DPPH)] [4] y la actividad superóxido dis-mutasa in vitro [5] . Varios estudios han

* Autor correspondiente. Facultad de Ciencias de los Alimentos e Ingeniería de la Universidad Agrícola de

Shandong, Número 61, Daizong Road, Tai 'an, provincia de Shandong, 271018, República Popular de China.
Dirección de correo electrónico: xgqiao@sdau.edu.cn (X. Qiao).

1
Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jfda.2016.05.011

1021-9498 / Copyright © 2016, la Administración de Alimentos y Medicamentos, Taiwán. Publicado por Elsevier
Taiwan LLC. Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND licencia (
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).

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ajo demostrado efectos medicinales 's tales como exhibiendo antifatiga efectos, la regulación de la
glucosa en sangre [6] y la presión arterial [3] , para ayudar en la digestión, y la mejora de apetito [7] .
Los experimentos con pequeñas ratas blancas informado que el ajo negro tenía funciones de antibiosis y
antitumorales, lo que podría inducir el cuerpo humano para producir respuesta inmunitaria intensa de
TH1 [8] . Ajo negro podría frenar el desarrollo de la ateroesclerosis, esclerosis limpiando el colesterol
para mejorar la hiperlipidemia [9] , y reducir el peso y los lípidos en la sangre [10,11] . Además, los
investigadores encontraron que el ajo negro tenía una fuerte actividad antioxidante tanto in vivo como in
vitro [12] .
La actividad antioxidante de ajo podría verse afectada por los métodos y condiciones de procesamiento
[4] . El ajo negro, dotado de actividad antioxidante, se produce a partir de ajo fresco bajo temperatura
controlada y humedad, eliminando su olor desagradable. Después del procesamiento, los productos de
ajo negros tienen un alto contenido de polisacáridos, de azúcar reductor, pro-tein, compuestos fenólicos,
compuestos de azufre orgánicos, y melanoidinas [4] . Como se muestra en nuestro estudio anterior, el
proceso de liofilización puede mantener significativamente un alto contenido de componentes bioactivos
funcionales en ajo negro [13] . Las propiedades antioxidantes de productos de ajo negro están
relacionados con polifenoles [14] . Los polifenoles son sensibles a algunos tratamientos térmicos, tales
como fritura, horneado, y la ebullición de algunos vege-mesas [15] . Los investigadores encontraron que
la capacidad antioxidante del ajo entero era muy similar a la de los dientes de ajo pelados durante el
proceso negro del ajo. La cantidad de polifenoles se triplicó en bulbos de ajo negro enteros y
aproximadamente seis veces en peladas dientes de ajo negro [16] . Además, polifenoles totales y el
contenido de flavonoides totales de ajo negro aumentaron significativamente durante el período de
envejecimiento [17] . Algunos re-buscadores también mencionó que algunos componentes, tales como
(1S, 3S) 3 carbolina-carboxílico b -1-metil-1,2,3,4-tetrahidro- y (1R, 3S) -1-metil ácido carbolina-3-
carboxílico b -1,2,3,4-tetrahidro-, estaban presentes en alta concentración en el ajo fresco y negro, y
tenía un fuerte H 2 O 2 capacidad de eliminación de [18,19] . El objetivo del presente estudio fue
determinar la característica de los componentes bioactivos y beneficios para la salud del ajo negro.

2 materiales y métodos

2.1. Materiales y reactivos

Ajo fresco fue comprado en el mercado local. Los reactivos tales como 2,2-difenil-1-picrilhidracilo
(DPPH) y 2,2 de ácido 0 -azino-bis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico se adquirieron de Sigma-Aldrich
Co. (St Louis, MO, EE.UU.). Todos los demás disolventes / productos químicos obtenidos de Tianjin
Yongda Reagente Químico Co, Ltd (Tianjin, China) eran de grado analítico o grado de cromatografía
líquida de alto rendimiento (HPLC) grado.

2.2. Preparación de extracto de ajo negro

El ajo negro se mezcló con una cantidad apropiada de agua y se homogeneizó, después se extrajo con
acetato de etilo. El extracto de acetato de etilo se coloca en la parte superior de una columna de vidrio
(100 5 cm 2 id) llena de gel de sílice (200 e 300 mallas) en cloroformo. La elución se realizó con
cloroformo y

metanol a diferentes proporciones de 8: 1, 6: 1, 4: 1, 2: 1 y 0: 1 (v / v) a un caudal de 2 ml / min. Los

efluentes se controlaron a 254 nm; se recogieron cinco fracciones que se designaron F1 (8: 1), F2 (6: 1),
F3 (4: 1), F4 (2: 1) y F5 (0: 1) y eventualmente desecado al vacío para antioxidante prueba de actividad
y análisis de HPLC. La polaridad de los cinco fracciones fue consistente con el de la eluyente, es decir,
F1 <F2 <F3 <F4 <F5; por lo tanto, la extracción en bruto se separó basándose en la polaridad del
componente en esta etapa.

Sus propiedades antioxidantes fueron determinadas por la actividad de eliminación del radical DPPH y
el contenido fenólico total. Además, las fracciones antioxidantes intensos obtenidos a partir de la elución
de cloroformo y metanol se analizaron por HPLC y HPLC semipreparation (semiprep-HPLC), y luego
sus estructuras dilucidadas por cromatográfico (HPLC) y spec-trometric [espectrometría de masas de
ionización por electrospray e (ESI e MS), 1 H de resonancia magnética nuclear, (1 H RMN), y 13 C de
resonancia magnética nuclear (RMN 13C)] técnicas.

2.3. Determinación del contenido total de fenoles

El contenido fenólico total se determinó de acuerdo con Zhu et al

[20] y Sharma et al [21] , con modificaciones menores. Una muestra de los extractos de ajo negro (200
m l), reactivo de Folin e Ciocalten (1 ml, diluido 10 veces), y carbonato de sodio (1 ml, 7,5%) se
mezclaron y se diluyeron con agua destilada para 5 ml. Posteriormente, las mezclas se incubaron en la
oscuridad durante 30 minutos. Después de la incubación, se registró la absorbancia a 760 nm. Se utilizó
ácido gálico como estándar para la curva de calibración. El contenido fenólico se informó como ácido
gálico

equivalentes (m g) usando la siguiente ecuación lineal a base de

la curva de calibración: A ¼ 0.0929C þ 0,0131, R 2 ¼ 0,9993, donde A es la absorbancia a 760 nm y C

es la concentración de equivalentes de ácido gálico (m g / ml).

2.4. Actividad de eliminación de radicales DPPH

La actividad de eliminación de radicales DPPH se determinó según Xu et al [22] y Yokozawa et al [23]

, con ligeras modificaciones. En resumen, se mezclaron 1 ml de solución de radical DPPH 0,2 mM
preparada en etanol con 1 ml de la muestra de ensayo disuelta en tampón Tris-HCl 100 mM (pH 7,4); las
mezclas se agitaron entonces enérgicamente durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
La absorbancia se midió a 517 nm. La actividad de eliminación de radicales DPPH se proporcionó como
porcentaje de eliminación de radicales DPPH y se calculó como sigue:

DPPH de eliminación de radicales d% Þ ¼ 1 A i A j Un

c 100% (1)

donde A i es la absorbancia de la mezcla de 1 ml de muestra y 1 ml de 0,2 mM DPPH, A j es la

absorbancia de la mezcla de 1 ml de muestra y 1 ml de etanol, y A c es la absorbancia de la mezcla de 1
ml 0,2 mM de DPPH y 1 ml de tampón Tris - HCl.

2.5. Análisis y purificación por HPLC mediante HPLC semiprep

El análisis por HPLC se realizó con un modelo 1100 de Agilent. Se separaron cinco fracciones mediante
HPLC de fase inversa en una columna Agilent Zorbax SB-C18 (4,6 mm 250 mm) ecuidadosamente en
disolvente A de agua pura y disolvente B de metanol.

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La elución se realizó con un gradiente lineal al aumentar la concentración de disolvente B, como seguido
por los extractos de acetato de etilo a partir de ajo negro: 0 e 30 minutos, 5 e 100%; 30 E 45 minutos,
100%; 45 E 55 minutos, 100 e 5%. F3 se detectó por HPLC con la solución de metanol: agua (1: 9, v /
v) durante 45 minutos; F4 se detectó por HPLC con la solución de metanol: agua (2: 8, v / v) durante 55
minutos. La temperatura de la columna se mantuvo a 25 C. El caudal fue de 0,8 ml / min, y la longitud
de onda se estableció en 254 nm para la detección de UV [24] .

La semiprep-HPLC se realizó con análisis / sistema semipreparativo circular del sistema SHIMADZU
LC-6AD en una columna Agilent Zorbax SB-C18 (9,4 mm 250 mm); F3 se detectó por HPLC semiprep
con la solución de metanol: agua (1: 9, v / v) durante 45 minutos. F4 se detectó mediante HPLC
semiprep con la solución de metanol: agua (2: 8, v / v) durante 55 minutos a una velocidad de flujo de 2
ml / min, y la longitud de onda se fijó a 254 nm para la detección de UV. Los compuestos que
purificamos a partir de F3 y F4 se detectaron por HPLC con la solución de metanol: agua (2: 8, v / v)
durante 55 minutos a una velocidad de flujo de 0,8 ml / min.

2.6. HPLC ae DAD e ESI e análisis MS y espectrometría de RMN

La cromatografía líquida se realizó en una HPLC Agilent serie 1200 (Agilent, Palo Alto, CA, EE.UU.)
equipada con un autoinyector y una bomba de HPLC cuaternaria. La cromatografía se realizó con un
mm de diámetro 4,6 mm 250, 5 m m Agilent plus C18 columna. El volumen de inyección fue de 20 m
de fase L. móvil A era agua y B era metanol. El procedimiento fue el siguiente: 0 E 30 minutos, B era 5
e 100%; 30 e 40 minutos, B fue del 100%; 40 E 50 minutos, B fue de 5% a un caudal de 0,8 ml / min.

La espectrometría de masas se realizó con Agilent 1100LC-MSD (Agilent). Las condiciones optimizadas
fueron las siguientes: los compuestos se analizaron en el modo de iones positivos. Las tensiones capilar
y de fragmentos fueron 3500 V y 175 V, respectivamente. El skimmer se ajustó a 65,0 V. El caudal del
gas de secado fue de 10,0 L / min, y el nebulizador se hizo funcionar a 40 psi. Se usó Ni-trogen como
gas de colisión. Espectros de masas se ac-quired en un análisis de barrido completo dentro de un
intervalo m / z de 100 e 1000 utilizando un rango dinámico extendido y una velocidad de barrido de 1,4
espectros / s, y mediante la variación de la energía de colisión con la masa. El software de operación de
la estación de datos fue la estación de trabajo Mass Hunter (versión B.04.00). Se usó una solución de
masa de referencia que contenía los iones de referencia 121.0508 y 922.0097 para mantener la precisión
de la masa durante el tiempo de funcionamiento.

Para los compuestos melanoidina, 1 H RMN y espectros 13 C RMN se registraron en un Varian INOVO-
600 (Varian, Palo Alto, EE.UU.) espectrómetro de trabajo a 400 MHz para 1H RMN y a 100 MHz para
13C-RMN.
Las muestras purificadas (8 E 15 mg) disuelto en 0,4 ml de sulfóxido de dimetilo se utilizan
como estándares internos.

2.7. Actividad antioxidante celular de los compuestos de ajo negro

El protocolo de ensayo celular actividad antioxidante (CAA) se describió previamente [25] . Células
HepG2 se sembraron a una densidad de 6 10 4 / pocillo en una microplaca de 96 pocillos en 100 m l de
medio de crecimiento / pocillo. Después de 24 horas de siembra, el medio de crecimiento

y se lavaron los pocillos con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los pocillos se trataron por
triplicado durante 1 hora con 100 m l de medio de tratamiento que contiene compuestos ensayados de
ajo negro más 25 m diacetato M dichlorofluorescin. Cuando se utilizó un lavado de PBS, los pocillos se
lavaron con 100 m L de PBS. Entonces 600 m m 2,2 0 azobis (2-amidinopropano) se aplicó a las
células en 100 m l de solución salina equilibrada de Hanks, y el microplacas de 96 pocillos se
colocaron en un lector de placas Fluoroskan Ascenso FL en 37 La emisión a 538 nm se midió con
excitación a 485 nm cada 5 minutos durante 1 hora.

2.8. Cuantificación de CAA

Después de la resta y restracción en blanco de los valores iniciales de fluorescencia, se integró el área
bajo la curva de fluorescencia frente al tiempo para calcular el valor de CAA en cada compuesto a partir
del ajo negro como sigue:

Z Z

Unidad CAA ¼ 1 SA California 100 (2)

donde! SA es el área integrada bajo la curva y de la muestra FLUORESCENTE-cencia en función del

tiempo! CA es el área integrada de la curva de control.

3 Resultados y discusión

3.1. Contenido fenólico total en extractos de ajo negro

El contenido fenólico total y diferentes fracciones de extractos de ajo negro se muestran en la Tabla 1 .
Es bien sabido que los compuestos fenólicos pertenecen a los componentes bioactivos de los productos
vegetales y tienen buenas actividades que promueven la salud [26,27] . Se observó que los contenidos
fenólicos totales de-ciones frac F3 y F4 fueron mucho más altos que los de F1, F2 y F5 (p <0,05). El
contenido fenólico total en el ajo negro se incrementó en alrededor de cuatro a 10 veces en comparación
con la de ajo fresco, y se informó de que los derivados del ácido hidroxicinámico se encontró que eran
los principales ácidos fenólicos de ajo en diferentes etapas de tratamiento [28] .
 Tabla 1 e contenido fenólico total en acetato de ajo negro

extractos de acetato y fracciones individuales de ajo negro

(F1 e F5) (media ± SD, n ¼ 3).

Muestras Equivalentes de ácido gálico

(mg / g)
Ajo negro extractos de acetato de etilo 13,5 ± 0,12 una
F1 1.0 ± 0.03 c
F2 1,1 ± 0,04 c
F3 4,5 ± 0,09 b
F4 4,3 ± 0,08 b
F5 1,2 ± 0,04 c

Medio que no comparten una letra en cada línea de medida

dentro cada equivalente de ácido gálico son significativamente diferentes
(p <0,05).
SD ¼ desviación estándar.

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3.2. Actividad de eliminación de radicales DPPH

Debido a su electrón impar, DPPH mostró una fuerte absorción a 517 nm (color púrpura). DPPH tasas
de barrido de radicales de la extracción de acetato de etilo ajo negro, así como los de todos los cinco
fracciones, eran dependientes de la dosis ( Figura 1 ). La tasa de depuración de radicales DPPH más alta
fue mostrada por F3 y F4, seguida por F5. Las fracciones F3 y F4 tienen una tasa de eliminación de
radicales DPPH de aproximadamente 30% a una concentración de 30 m g / ml, cerca de 5 m g / ml de
ascórbico o ácido gálico. A una concentración de 100 m g / ml, F3 y F4 representan el 70% de la tasa de
eliminación de radicales DPPH. La tasa de eliminación de radicales DPPH más bajo fue mostrado por
F1 a una concentración de 100 m g / ml, que es solamente 20,2%. Curiosamente, las fracciones F3 y F4
también tuvieron mayores contenidos fenólicos; los contenidos fenólicos de F2 estaban en el centro,
pero los de F1 y F5 eran más bajo ( Tabla 1 ). Existe una estrecha relación entre el contenido fenólico
total y la velocidad de eliminación del radical DPPH. De acuerdo con el contenido fenólico total y la
actividad antioxidante de diferentes fracciones, las fracciones F3 y F4, que tienen el mayor contenido
fenólico total y la actividad antioxidante, se analizaron por HPLC y se prepararon por HPLC semiprep.
La composición única se aisló a partir de F3 y F4, que tendrían actividades antioxidantes. Los
experimentos mostraron que la multi-composición puede desempeñar un papel dominante en la actividad
antioxidante.

3.3. Análisis y purificación por HPLC mediante HPLC semiprep

Como se indica en el cromatograma de HPLC usando una columna de fase inversa C-18, se detectaron
10 picos separados por etilo extractos ace-Tate de ajo negro ( Figura 2 A). Se detectaron otros cuatro
picos para F3 ( Figura 2 B) en las mismas condiciones, que corresponden a 2, 5, 6, y 7 en la Figura 2 A.
Tres picos se detectaron más lejos para F4 ( Figura 2 C) que corresponde a 8, 9, y 10 en la Figura 2 A.
en total, siete componentes individuales (Compo-nentes 2, 5, 6, 7, 8, 9, y 10) fueron separados de ajo
negro después de ser purificado a través de la columna de gel de sílice y se
Figura 1 e DPPH actividad de eliminación de radicales de extractos de ajo negro y fracciones de ajo
negro individuales (F1 e F5). Se utilizaron ácido ascórbico y ácido gálico como controles positivos. Los
medios que no comparten una letra con la misma medida de concentración dentro de cada uno de los
diferentes materiales (EAE, F1, F2, F3, F4, F5, AA y GA) son significativamente diferentes

(p <0,05). Ácido ascórbico ¼ AA; DPPH ¼ 2,2-difenil-2-picrilhidrazil; Extractos EAE ¼ acetato de

etilo; GA ¼ ácido gálico.

semiprep-HPLC. Los siete sustancias individuales obtenidos se analizaron adicionalmente por HPLC,
como se demuestra en la Figura 3 . Siete sustancias individuales se obtuvieron mediante semiprep-
HPLC, a continuación, se analizaron y se identificaron mediante cromatografía líquida / espectrometría
de masa de las estructuras de los siete individuales compo-nentes, y 1 H RMN y 13 C RMN
espectrometría. El trabajo antes mencionado proporcionaría una base teórica para la función y
mecanismo del ajo negro. Por lo tanto, es científicamente vital examinar las características y mecánica
del ajo, y controlar el proceso de dorado de manera eficiente, que no sólo puede acortar el tiempo de
procesamiento y reducir el consumo de energía, sino también puede promover la generación del ajo
negro funcional componentes y garantía de productos de ajo.

3.4. Elucidación de estructura de compuestos por HPLC acoplado con análisis de detección de
matriz de diodos y espectrometría de RMN

HPLC acoplada con detección de matriz de diodos (HPLC e DAD) anal-Ysis de los compuestos
aislados demostró su alto pu-dad, y se identificaron por comparación de sus espectros de UV y tiempos
de retención de HPLC (t R) con los de patrones de referencia, y cuando sea posible, por espectrometría de
masas ( Tabla 2 ), métodos químicos, así como la espectrometría de RMN ( Tablas 3 y 4 ); sus
estructuras químicas se muestran en La Figura 4 . Se obtuvieron siete sustancias funcionales a partir de
extractos crudos de ajo negro por separación de columna de gel de sílice y HPLC semiprepuesto.

Compuesto 2 era un líquido transparente de color amarillo claro, que fue identificado directamente como
ácido DL-láctico por comparación de T R y los espectros de UV con los de los estándares, y también se
confirmó mediante ESI e MS espectros. El ácido láctico debe ser formado por la fermentación del ajo
negro en condiciones calurosas y húmedas, y la acidez láctica única mejoró el sabor del ajo negro. En
nuestro estudio anterior, se encontró que el ajo negro contenía muchos ácidos orgánicos que ocurren en
la naturaleza. El ácido láctico es el ácido orgánico principal en el ajo negro, según lo encontrado por el
análisis líquido, por lo tanto, el ácido láctico puede ser responsable del sabor único del ajo negro.
Además, el ácido láctico es también un fuerte anti-oxidante, lo que podría haber contribuido a la fuerte
capacidad de Antioxi-dant de ajo negro [29] .

El compuesto 5 se polvo incoloro o blanco, que fue identificado directamente como 5-

hidroximetilfurfural (5-HMF) por comparación de T R y los espectros de UV con los de los estándares y
se confirmó mediante ESI e MS espectros. Como producto intermedio de la reacción de Maillard, la
presencia de 5-HMF en ajo negro también confirmó que la reacción de Maillard efectivamente tuvo
lugar durante la formación de ajo negro, y que la reacción se produjo en un ambiente ácido, cuando el
pH 7. Amadori reordenamiento productos formados principalmente furfural (cuando el azúcar es una
pentosa) o HMF (cuando el azúcar es una hexosa) por 1,2 enolización. Una extensa investigación
informó que 5-HMF tiene actividad antioxidante, función anti-isquémica y otros efectos beneficiosos
sobre el cuerpo humano. Se ha demostrado tener el potencial anti-inflamatoria en factor de necrosis
tumoral a las células -stimu-lated humanos endoteliales de vena umbilical (HUVEC) [30] . Además, el
5-HMF es beneficioso para la eficacia de la medicina tradicional china. Sin embargo, 5-HMF es
probablemente un ingrediente activo que no se ha entendido en la medicina china.

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La Figura 2 e HPLC cromatograma de (A) el extracto de acetato de etilo, (B) F3, y (C) F4 detectó a 254
nm. HPLC ¼ cromatografía líquida de alto rendimiento.

También se confirmó que el proceso de fermentación del ajo negro era similar al proceso de elaboración
de la cerveza de la medicina china, que también formaba parte de los efectos farmacológicos del ajo
negro.

Compuesto 6 era polvo blanco, la estructura ( Figura 4 ) de los cuales fue asignado como uridina basado
en su H RMN 1 y 13 de datos C RMN ( Tabla 3 ), que también fue confirmado por la comparación con
los datos de la literatura [31,32] . La uridina es un fármaco que constituye componentes de ácido
nucleico en células animales; también puede mejorar los niveles de anticuerpos del cuerpo 's. La
combinación de uridina e inosina puede promover el metabolismo miocárdico; acelerar la biosíntesis de
las proteínas y los ácidos nucleicos y la producción de energía; y promover y mejorar el metabolismo de
las células cerebrales. El aislamiento de este producto del ajo negro sentaría las bases para la elaboración
adicional de otras funciones del ajo negro.

Compuesto 7 era polvo blanco, cuya estructura ( Figura 4 fue asignado) como adenosina, sobre la base
de su RMN de 1H y 13 de datos C RMN ( Tabla 3 ) y la comparación con los datos de la literatura [33,34]
. Adenosina también se separó de otras hierbas, que tienen diversos efectos fisiológicos en el sistema
cardiovascular y muchos otros sistemas del cuerpo. La separación exitosa tendría potencial para la
elaboración adicional de otros efectos del ajo negro.

Compuesto 8 era polvo blanco, cuya estructura ( Figura 4 fue asignado) como (1S, 3S) ácido carbolina-
3-carboxílico b -1-metil-1,2,3,4-tetrahidro-, sobre la base de su H RMN 1 y 13 de datos C RMN ( Tabla
4 ) y comparación con los datos de la literatura [35 e 37] .

Compuesto 9 era polvo blanco, cuya estructura ( Figura 4 fue asignado) como (1R, 3S) -1-metil-1,2,3,4-
tetrahidro- ácido carbolina-3-carboxílico b, basada en su 1 MARIDO

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La Figura 3 e HPLC cromatograma de siete compuestos individuales purificados a partir de F3 y F4 por
semiprep-HPLC de ajo negro detectado a 254 nm. HPLC ¼ cromatografía líquida de alto rendimiento.

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Tabla 2 e Análisis de los compuestos por HPLC ae DAD e ESI e MS y espectros de RMN.
Compuesto T R (min) UV máx. (Nm) MW ESI MS e þ (m / z) ESI MS e e (m / z
2 7.504 200 90,08 89,0247 (M e H)
5 13.824 280 126,11 127.0379 (H M þ)
6 14.046 210.268 244,20 267,0 (M þ NA)
7 15.367 200.260 267,24 268,1 (H M þ)
8 19.785 200.260 230 231,1 (H M þ) 229.0989 (M e H)
9 21.247 200.260 230 231,1 (H M þ) 229.0989 (M e H)
10 22,902 200.260 109,13 110.0576 (H M þ)
DAD detección ¼ de matriz de diodos; ESI ¼ de ionización por electrospray; H ¼ de hidrógeno; HPLC ¼ cromatografía
líquida de alto rendimiento; MS masa ¼ espectrometría; MTCC ¼ 1-metil-1,2,3,4-tetrahidro- b ácido carbolina-3-
carboxílico; MW ¼ de peso molecular; Natrium NA ¼; RMN ¼ nuclear
resonancia magnetica.
un
identificaron por comparación con patrones de referencia.
b
Identificado por MS y espectros de RMN.

Tabla 3 e 1 H RMN y 13 datos de los espectros de RMN C de los compuestos 6 y 7 en DMSO.

1 H valores de desplazamiento químico (ppm) 13 valores de despl

(p
Compuesto 6 Compuesto 7 Compuesto 6 Co
8.1
2 33 (1H, S) 152.813 15
4 149.486 16
5 119.780 10
6 7.892 (1H, J ¼ 7,8 H Z) 156.596 14
(1H, d, J ¼ 5,4 Hz)
7 5.900 5,915 88
8.3
8 51 (1H, S) 140.340 70
9
5.8
10 69 (1H, d) 88.334 73
4.6
11 01 (1H, J ¼ 6 Hz) 73.893 85
12 4.356 71.078 61
4.1
13 44 (1H, J ¼ 3 Hz) 4.241 86.328
14 3.925 62.107
7,3
NH 2 50 (2H, s)

DMSO ¼ sulfóxido de dimetilo; RMN ¼ de resonancia magnética nuclear.

Tabla 4 e 1 H RMN y 13 datos de los espectros de RMN C de los compuestos 8 y 9 en DMSO.

1H valores de desplazamiento químico (ppm) Valores de desplazamiento químic

Compuesto 8 Compuesto 9 Compuesto 8 C
10 1.498 1.377 19.164 21
4 2,605, 2,996 2.834.2.638 25.111 25
1 4.298 4,290 49.382 46
3 3.364 3.374 58,773 53
4a 107.830 10
8 7.300 7.246 111,469 11
5 7.384 7.338 118.125 11
6 6,952 6.913 118.865 11
7 7,029 6.983 121.077 12
4b 127.085 12
9a 135.874 13
8a 136.601 13
11 173.152 17
9 10.944 10.725

DMSO ¼ sulfóxido de dimetilo; RMN ¼ de resonancia magnética nuclear.

Los datos de RMN y 13C-RMN ( Tabla 4 ) y comparación con los datos de la literatura [35 e 37] .

Los compuestos 8 y 9 son isómeros de alcaloides de carbolina, y su camino de reacción también se ha

deducido claramente. Estas

dos sustancias han sido aislados de ajo negro en un estudio anterior [19] ; se encontró que tales
alcaloides tenían una fuerte capacidad antioxidante, por lo que harían una fuerte contribución a la
actividad antioxidante del ajo negro.

journaloffoodanddruga nálisis 2 5 (2 0 1 7) 3 4 0 e 3 4 9
Figura 4 e estructuras químicas de los compuestos 2, 5, 6, 7, 8, 9, y 10 de ajo negro: DL-ácido láctico
(2), 5-hidroximetil-2-furfural (5), adenosina (6), uridina (7), (1S, 3S) b ácido carbolina-3-carboxílico -1-
metil-1,2,3,4-tetrahidro- (8), (1R, 3S) -1-metil-1,2, ácido 3,4-tetrahidro- b carbolina-3-carboxílico (9), y
2-acetilpirrol (10).
Compuesto 10 era polvo incoloro o blanco, que fue identificado directamente como 2-acetilpirrol por
comparación de T R y los espectros de UV con los de los estándares, y se confirmó mediante ESI e MS
espectros. El compuesto 2-acetilpirrol es una importante sustancia aromatizante de la reacción de
Maillard y el ingrediente principal del sabor ajo negro por su agradable fragancia.

Para investigar las composiciones del ajo negro, muchos esfuerzos han sido realizados por
investigadores de todo el mundo. Wang et al

[38] estudiado los cambios de los nutrientes en el ajo durante la reacción de Maillard: el contenido de
azúcares reductores fue 214,9 mg / g, contenido de ácido total 2,14%, contenido total de fenol 5,4 mg /
g, y el contenido de 5-HMF 2.729,12 m g / g. Liang et al [39] han informado de un análisis completo
basado en la RMN de ajo crudo y ajo negro

348 journaloffoodanddruga nálisis 2 5 (2 0 1 7) 3 4 0 e 3 4 9

para determinar los cambios de composición resultantes del tratamiento térmico. Encontraron que 38
componentes fueron alterados por el tratamiento térmico del ajo crudo. Zhang et al [40] utilizó la
extracción de iones de destilación simultánea para extraer las sustancias volátiles en ajo latente y ajo
negro; 50 tipos de compuestos químicos en ajo negro fueron detectados por cromatografía de gases (GC)
y MS, 28 de los cuales están presentes en cantidades relativamente altas. Los principales compuestos
extraídos son 3-vinil-1,2-dithiacyclohex-5-eno, disulfuro de dialilo, tiofeno-2-ethyltetrahydro, y 2-vinil-
1,2-N, N -dimetil 0. Los com-libras 5-HMF, (1S, 3S) -1-metil-1,2,3,4-tetrahidro- ácido b -carbo-line-3-
carboxílico, y (1R, 3S) -1-metil- 1,2,3,4-tetrahidro- ácido carbolina-3-carboxílico b han sido reportados
en estudios previos [35 e 39] . Sin embargo, los monómeros de otras tres sustancias con importantes
funciones diferentes, como la adenosina, la uridina y el 2-acetilpirrol, fueron aislados e identificados en
ajo negro.

3.5. Actividad CAA de compuestos de ajo negro

Se seleccionaron los extractos de uridina, adenosina, carbolina, 5-HMF y acetato de etilo para verificar
la calidad del antioxidante celular. Los resultados mostraron que todos los compuestos tenían altas
propiedades antioxidantes, y cuanto mayor sea la concentración, mayor es la capacidad antioxidante (
Figura 5 ). Se encontró que todos los compuestos a una concentración de 500 m g / ml mostraron la más
alta inhibición de la proliferación de las células HepG2, en más de un 60%. Los resultados de la
actividad antioxidante celular fueron consistentes con los de la propiedad antioxidante en experimentos
in vitro.

4 Conclusión
Se ha demostrado que extractos de ajo negro demuestran actividades de eliminación radical de DPPH.
Entre las cinco fracciones de ajo negro extraídas por cloroformo y metanol mezcladas en diferentes
proporciones, F3 y F4 mostraron las actividades antioxidantes más fuertes en un sistema DPPH. Siete
sustancias se purificaron y se separaron por semiprep-HPLC, HPLC e DAD e ESI e MS, 1 H

Figura 5 E La actividad CAA de compuestos de ajo negro. CAA ¼ actividad antioxidante celular; 5-
HMF ¼ 5-hidroximetil-furfural.

RMN, y 13 C RMN espectrometría de F3 y F4, especialmente, adenosina, uridina, y 2-acetylpy-prrole

fueron identificados primero en ajo negro, a excepción de 5-HMF, (1S, 3S) -1-metil-1,2 , b ácido 3,4-
tetrahidro- carbolina-3-carboxílico, y (1R, 3S) -1-

metil-1,2,3,4-tetrahidro- b ácido carbolina-3-carboxílico. Generalmente, toda la función del ajo negro

sería un efecto sinergístico de todos los componentes.

Conflictos de interés
Todos los autores no declaran ningún conflicto de intereses.

Expresiones de gratitud
Este proyecto fue apoyado por la Fundación de Investigación de Beneficios Públicos, Departamento de
Agricultura de China (201303079); la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31371816);
y la Public Benefit Research Foundation, Departamento de Agricultura de China (201503142).

referencias

[1] Kodera Y, Suzuki A, Imada O, Kasuga S, Sumioka I, Kanezawa A, Ono K. Físico, químico y biológico
propiedades de la S-alilcisteína, un aminoácido derivado de ajo. J Agric Food Chem 2002; 50: 622 e 32 .

[2] Gonzalez RE, Burba JL, Camargo AB. Un indicador fisiológico para estimar el contenido de alicina en
el ajo durante el almacenamiento. J Comida Biochem 2013; 37: 449 e 55 .

[3] Banerjee SK, Mukherjee PK, Maulik SK. El ajo como antioxidante: lo bueno, lo malo y lo feo.
Phytother Res 2003; 17: 97 e 106 .

[4] Queiroz YS, Ishimoto EY, Bastos DHM, Sampaio GR,

Torres EAFS. Ajo (Allium sativum L.) y ajo listo para comer productos: actividad antioxidante in vitro. Food
Chem 2009; 115: 371 e 4 .

[5] Jang EK, Seo JH, Lee SP. Actividad fisiológica y efectos antioxidantes de ajo negro envejecido (Allium
sativum L.) extraer. Corea J Food Sci Technol 2008; 40: 443 E 8 .
[6] Al-Qattan K, Thomson M., Ali M. Ajo (Allium sativum) y el jengibre (Zingiber officinale) atenúa la
nefropatía estructural progresión en ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina. e-spen 2008; 3: e62 e 71
.

[7] Eidi A, Eidi M, Esmaeili E. Efecto antidiabético del ajo (Allium sativum L.) en pacientes diabéticos
normales y con estreptozotocina ratas Phytomedicine 2006; 13: 624 e 9 .

[8] Wang D, Feng YH, J Liu, Yan JZ, Wang MR, Sasaki JI, Lu CL. Los extractos de ajo negro mejoran el
sistema inmunológico. Medicina Arom Plant Sci Biotech 2010; 4: 37 e 40 .

[9] Seo YJ, Gweon OC, Im J, Lee YM, Kang MJ, Kim JI. Efecto de ajo y ajo negro envejecido sobre
hiperglucemia y dislipidemia en modelo animal de diabetes mellitus tipo 2. J Food Sci Nutr 2009; 14: 1 e 7 .

[10] Kim I, Kim JY, Hwang YJ, Hwang KA, OM AS, Kim JH, Cho KJ. Los efectos beneficiosos del
extracto de ajo negro envejecido sobre la obesidad y la hiperlipidemia en ratas alimentadas con una dieta rica
en grasas. J Med Plantas Res 2011; 5: 3159 e 68 .

[11] Dillon SA, Burmi RS, Lowe GM, Billington D, Rahman K. Propiedades antioxidantes del extracto de
ajo envejecido: un estudio in vitro

journaloffoodanddruga nálisis 2 5 (2 0 1 7) 3 4 0 e 3 4 9

incorporando lipoproteína de baja densidad humana. Vida s 2003; 72: 1583 e 94 .

[12] Lee YM, Gweon OC, Seo YJ, Im J, Kang MJ, Kim MJ, Kim JI. Efecto antioxidante del ajo y el ajo
negro envejecido en animales modelo de diabetes mellitus tipo 2. Nutr Res Pract 2009; 3: 156 e 61 .

[13] Li N, Lu X, Pei H, Qiao X. Efecto de la congelación de tratamiento previo sobre el tiempo de

procesamiento y la calidad de ajo negro. J Proceso Food Eng 2014; 38: 329 e 35 .

[14] Sato E, Kohno M, Hamano H, Niwano Y. Aumento anti- potencia oxidativa de ajo por espontánea a
corto plazo de fermentación. Planta de Alimentos Hum Nutr 2006; 61: 157 e 60 .

[15] Kao FJ, Chiu YS, Chiang WD. Efecto de la cocción de agua sobre la capacidad antioxidante de los
vegetales ricos en carotenoides en Taiwán. J Food Drogas Anal 2014; 22: 202 e 9 .

[dieciséis] Medina MAT, Pérez -Aparicio J, Moreno-Rojas R, Merina- Amo T. evolución de algunos
fisicoquímicas y antioxidantes propiedades de toda ajo negro Bulbos y dientes peladas. Food Chem 2016;
199: 135 e 9 .

[17] Choi ES, Cha SA, Lee YS. Fisicoquímicas y antioxidantes propiedades del ajo negro. Moléculas 2014;
19: 16 811 e 23 .

[18] Sato E, Kohno M, Niwano Y. Aumento del nivel de tetrahidro- b - carbolina en ajo fermentado a corto
plazo. Planta de Alimentos Hum Nutr 2006; 61: 175 E 8 .
[19] Ichikawa M, Yoshida J, Ide N, Sasaoka T, Yamaguchi H, Ono K. tetrahidro- b derivados de carbolina
en ajo envejecido mostrar las propiedades antioxidantes del extracto. J Nutr 2006; 136: 726S e 31S .

[20] Zhu QY, Hackman RM, Ensunsa JL, Holt RR, Keen CL. Actividades antioxidantes de té oolong. J
Agric Food Chem 2002; 50: 6929 e 34 .

[21] Sharma K, Ko EY, Assefa AD, Ha S, SH Nilo, Lee et, Parque SW. Los estudios dependientes de la
temperatura sobre los fenoles totales, flavonoides, antioxidantes, las actividades y el contenido de azúcar en
seis variedades de cebolla. J Food Drogas Anal 2015; 23: 243 e 52 .

[22] Xu QP, Tao WY, Ao ZH. La actividad antioxidante de vinagre melanoidinas. Food Chem 2007; 102:
841 e 9 .

[23] Yokozawa T, Dong E, Natagawa T, Kashiwagi H, Nakagawa H, Takeuchi S, Chung HY. In vitro y en
estudios in vivo sobre la actividad de los radicales de captación de té. J Agric Food Chem 1998; 46: 2143 e
50 .

[24] Bae SE, Cho SY, Won YD, Lee SH, Parque HJ. A comparativo estudio de los diferentes métodos
analíticos para el análisis de s- cisteína de alilo en ajo negro por HPLC. LWT Food Sci Technol 2012; 46: 532
e5.

[25] Wang HY, Qian H, Yao WR. Melanoidinas producidos por la reacción de Maillard: estructura y
actividad biológica. Food Chem 2011; 128: 573 e 84 .

[26] Liao DY, Chai YC, Wang SH, Chen CW, Tsai MS. Antioxidantes actividades y contenido de
flavonoides y ácidos fenólicos de

Talinum triangulare extractos y sus inmunomoduladores efectos. J Food Drogas Anal 2015; 23: 294 e 302 .

[27] Denardin CC, Hirsch GE, da Rocha RF. Capacidad antioxidante y compuestos bioactivos de cuatro
frutas nativas brasileñas. J Alimentos Drogas Anal 2015; 23: 387 e 98 .

[28] Kim JS, Kang DO, Gweon OC. Comparación de los ácidos fenólicos y flavonoides en ajo negro a
diferentes procesamiento térmico pasos. J Funct Alimentos 2013; 51: 80 e 6 .

[29] Groussard C, Morel I, Chevanne M, Monnier M, Cillard J, Delamarche A. barrido de radicales libres y
antioxidantes efectos de ión lactato: un estudio in vitro. J Appl Physiol 2000; 89: 169 e 75 .

[30] Kim Hong Kong, Choi YW, Lee ES, Parque JK, Kim SG. 5- hidroximetilfurfural de extracto de ajo
negro evita TNF una adhesión celular monocítica inducida a HUVECs por supresión de la adhesión celular
expresión de la molécula-1 vascular, la generación de especies reactivas de oxígeno y NF- k B activación.
Phytother Res 2011; 25: 965 e 74 .

[31] Hu XY, Dou DQ, Pei YP, Fu WW. Componentes químicos de las raíces de Ranunculus ternatus
Thunb. J Chin Pharm Sci 2006; 15: 127 .

[32] Canción Y, Chen GT, Sun BH, Huang J, Li X, Wu LJ. Químicos constituyentes de la parte soluble en
agua de Mentha spicata L. J Shenyang Pharm Univ 2008; 9: 008 .

[33] El XJ, Qiu F, Yao XS. Los componentes activos de investigación de Gualou Xiebai tang ( Ⅳ ):
compuestos que contienen nitrógeno y otros. Nat Prod Res Dev 2003; 15: 9 e 11 .

[34] Okuyama T, Fujita K, Shibata S, Hoson M, Kawada T, Masaki M, Yamate Efectos N. de

medicamentos chinos “ Xiebai ” y “ Dasuan ” sobre la agregación de plaquetas humanas (Allium bakeri, A.
sativum). Planta Med 1989; 55: 242 e 4 .

[35] Ichikawa M, Ryu K, Yoshida J, Ide N, Yoshida S, Yoshida T, Sumi SI. Efectos antioxidantes de
tetrahidro- b carbolina derivados identificados en el extracto de ajo envejecido. Biofactors 2008; 16: 57 e 72 .

[36] Ide N, Lau BHS. Extracto de ajo envejecido atenúa intracelular estrés oxidativo. Phytomedicine 1999;
6: 125 e 31 .

[37] Bosin TR, Krogh S, Mais D. Identificación y cuantificación de 1,2,3,4-tetrahidro- b 3 carbolina-

carboxílico y clorhidrato de 1- metil-1,2,3,4-tetrahidro- b -carboline- ácido 3-carboxílico en cerveza. J Agric
Food Chem 1986; 34: 843 e 7 .

[38] Wang WD, Wang Y, Wang C, Sun YE, Gao MX. Efecto de la reacción de Maillard en nutrientes y
actividad antioxidante de ajo. Food Sci Technol 2013; 4: 011 .

[39] Liang T, Wei F, Lu Y, Kodani Y, Nakada M. Comprehensive análisis de RMN de los cambios de
composición de ajo negro durante el procesamiento térmico. J Agric Food Chem 2015; 63: 683 e 91 .

[40] Zhang ZY, Yang XJ, Zhang JS, Zhang WY. Identificación de compuestos volátiles en ajo negro
fermentado por GC e MS. Condimento de China 2012; 7: 74 e 6 .