INTRODUCCIÓN

Se han utilizado huevos fecundados para cultivar virus durante más de 15 años. El cultivo
de virus gripal en huevo embrionado fue empleado por primera vez por Burnet en 1935,
demostrando que el embrión de pollo es un medio muy sensible para el aislamiento de estos
virus, siendo además un medio estéril y poco costoso. Ha sido posible cultivar virus de
diversos grupos en varias cavidades del huevo fecundado, o en el propio embrión en
desarrollo.
También se emplearon huevos de pato y de ganso para cultivar ciertos virus, pues estos
animales tienen un periodo de incubación más prolongado que el pollo; pero como regla,
sigue usándose huevo de gallina de 6 a 8 días de incubación aproximadamente (a veces se
usa huevos de más tiempo de incubación).
Los virus sólo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión; por consiguiente,
se deben inyectar en la región apropiada, P. ej. los mixovirus crecen bien en la membrana
corioalantoidea, en tanto que el virus de la parotiditis prefiere la cavidad alantoidea. La
infección puede producir una lesión tisular local conocida como pústula, cuyo aspecto, a
menudo, es característico del virus.
El método exacto de inoculación y la edad del embrión que se emplea, dependen del virus
problema. P. ej. para aislar en forma primaria el virus de la influenza a partir de material
recogido de la garganta, suele inocularse este en la cavidad amniótica de embriones de 7 a 8
días; pero el virus se duplica fácilmente en la membrana alantoidea de embriones de 12 a
13 días, después de varias resiembras (“adaptación”) en el amnios. Los focos más utilizados
para la inoculación, a parte de las cavidades amniótica y alantoidea, son la membrana
corioalantoidea y el saco vitelino. Algunas veces, puede inyectarse directamente el virus en
el embrión en desarrollo, recurriendo a la inoculación intravenosa, intraperitoneal o
intracerebral. Una vez que se duplicó el virus dentro de las células de las membranas o del
embrión, puede liberarse a los líquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una buena
fuente de virus. P. ej. el virus de la influenza, que se duplica en el sistema respiratorio del
embrión y en las células de la membrana amniótica, pasa al líquido amniótico, que luego
puede recogerse con una jeringa y aguja. En cambio, otros virus, como p.ej. los de la
viruela y el herpes, que se duplican en la membrana corioalantoidea, siguen unidos a las
células en las lesiones o “pústulas” que se forman sobre dicha membrana. Al moler y
deshacer en una solución salina isotónica las membranas, logran liberarse estos virus.
En consecuencia, el crecimiento de un virus en un embrión de pollo puede provocar la
muerte del embrión (p.ej. virus de la encefalitis), producir pústulas o placas sobre la
membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, vacuna), desarrollar hemaglutininas en
los líquidos o tejidos embrionarios (p.ej. influenza) o desarrollar virus infectante (p.ej.
poliovirus tipo 2).
OBJETIVOS
- Conocer y describir los métodos de cultivo para diagnostico viral.
- Realizar el método de cultivo, en huevos embrionados, como el diagnostico
viral.
MARCO TEÓRICO:
DIAGNOSTICO VIRAL:
- Cultivos celulares (tejidos).
- Inoculación en huevos embrionados.
- Inoculación en animales de laboratorio.

a. Membrana Carioalantoidea.
b. Cavidad alantoidea.
c. Saco vitelino.
d. Cavidad Amniotica.
e. Via endovenosa.
Nombre de la via Sigla Aguja Dosis Edad del
embrión
a. Membrana CA 23 G x ½¨ 0.1 – 0.2 ml 10 – 14 días
Coriolantoidea.
b. Cavidad CAL 23 G x ½¨ 0.1 – 0.2 ml 10 – 14 días
Alantoidea.
c. Saco SV 21 G x ½¨ 0.1 – 0.2 ml 6 – 9 días
Vitelino.
d. Cavidad CAM 21 G x ½¨ 0.1 – 0.2 ml 10 – 14 días
Amniótica.
e. Endovenosa EV 25 G x ½¨ 0.05 ml 6 – 10
días

REVISION BIBLIOGRFICA
- Cultivos celulares
El cultivo celular es el proceso mediante el que células, ya sean células procariotas o
eucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la práctica el término "cultivo
celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de células aisladas de eucariotas
pluricelulares, especialmente células animales. El desarrollo histórico y metodológico del
cultivo celular está íntimamente ligado a los péptidos cultivares del cultivo de tejidos y el
cultivo de órganos.
El cultivo de células animales empezó a ser una técnica rutinaria de laboratorio durante los
años 50, pero el concepto de mantener líneas de células vivas separadas del tejido de origen
fue descubierto en el siglo XIX.
 - Inoculación en huevos embrionados

Se seleccionan huevos de planteles libre de infecciones virales, observándolos en un

ovoscopio o con iluminación adecuada. De acuerdo al agente viral que se sospecha, será la
vía de inoculación y, por ende, la edad del embrión a utilizar.

- Vías de Inoculación:

a. Cavidad Amniótica: El material inoculado ingresará en el embrión vía bucal y

respiratoria, pudiéndose multiplicar en cualquier tejido de éste. El embrión debe ser de
10-14 días de edad. Se desinfecta el extremo del huevo que posee la cámara de aire y
allí se perforará con un trócar o taladro adecuado. Con una aguja de 4,5 cm. de largo,
orientada hacia la sombra del embrión se inocula 0,1-0,2 ml de material. Sellar el
orificio con parafina fundida u otro sellador no tóxico.

b. Membrana corioalantoidea: Usada para virus que producen placas, lesiones

herpéticas o tipo pox. Los embriones deben ser de 10-12 días de edad. Se marca el
punto de inoculación en el costado del huevo donde se observa buena irrigación de la
membrana. Como es necesario hacer caer la membrana para obtener una buena
superficie, se desinfecta el extremo del huevo que posee la cámara de aire y el punto de
inoculación. Con sumo cuidado se perfora la cáscara y la membrana de la misma en el
punto de inoculación y se hace un orificio en la cámara de aire por donde se succiona
con una perilla de goma para que se produzca una falsa cámara de aire. Allí se
depositará el inóculo de 0,1 - 0,2 ml con jeringa y aguja de tuberculina. Sellar los
orificios con parafina fundida u otro sellador no tóxico.

c. Cavidad alantoidea: El virus se difundirá en el fluido e infectará las células

ectodérmicas de la membrana. Se utilizan embriones de 10-11 días de edad,
Observándose el ovoscopio, se marca en el extremo de la cámara de aire, el punto de
inoculación que debe ser opuesto a la ubicación del embrión y con pocos vasos
sanguíneos. Se desinfecta y se perfora la cáscara en dicho punto, inoculando (0,1-
0,2 ml) con una aguja de 1,5 cm de largo que se introduce paralela a la pared del
huevo. Se sella con parafina fundida u otro sellador no tóxico.

d. Saco vitelino: Se emplean embriones de 8-12 días de edad con gran saco vitelino, Se
desinfecta el extremo de la cámara de aire y se perfora la cáscara. Con una aguja en
línea recta (0,1 - 0,2 ml.). Se sella con parafina líquida u otro sellador no tóxico.

f. Endovenosa: Se emplean embriones de 8-12 días de edad. Observándose al ovoscopio

se selecciona una vena de buen grosor y que se dirija hacia el embrión. Se dibuja en la
cáscara su ubicación. Usando un taladro adecuado se marca un rectángulo, enmarcando
la vena y que sólo interese la cáscara, sin romper la membrana que se encuentra por
debajo de ésta. Se desinfecta la zona y con una aguja bien fina se inocula (debe
 observarse cómo el inóculo al diluir la sangre circula por la vena). Se sella con parafina
fundida u otro sellador no tóxico.

- Inoculación en animales de laboratorio.

Se inocula animales de laboratorios (ratones, conejos, cobayos, etc.) susceptibles a la

infección por el agente viral cuya presencia se sospecha. Este se multiplicará en el
hospedador experimental con la producción de diferente sintomatología, hasta en
algunos casos puede causarle la muerte.
Es un método sencillo, sensible y rápido, aunque son pocos los virus animales de
nuestro interés que poseen huéspedes de laboratorio susceptibles. No obstante,
constituye una importante técnica en la identificación y caracterización de agentes
(diagnóstico diferencial).

- Inoculación de Ratón Lactante

a. Vía Intracerebral: El punto de inoculación es la intersección de dos líneas una que va

desde el ojo a la oreja y la otra perpendicular a esta línea y cortándole por el centro. Se
utiliza aguja y jeringa de tuberculina con dosis menor a 0,02 ml.

b. Vía Intramuscular: Se realiza la inoculación en la masa muscular del miembro

posterior, aspirando previamente para asegurarse de no estar en vena. Se utiliza aguja y
jeringa similar al anterior.

c. Vía intraperitoneal: Sujetando el animal por la piel de la nuca con el índice y pulgar y
con el resto de los dedos por los miembros posteriores y cola, se lo presenta de cúbito
dorsal para inocularlo en un punto del lado derecho y centro del abdomen. Se utiliza
aguja y jeringa de tuberculina.
MATERIALES
- Material Biológico: huevo embrionado.
- Lata de atún. - Lápiz.
- Parafina. - Alcohol.
- Alcohol yodado. - Algodón.
- Aguja. - Pirex.
PROCEDIMIENTO
1. Observar al ovoscopio.
2. Marcar punto de inoculación.
3. Desinfectar con alcohol yodado.
4. Perforar la cámara de aire.
5. Inoculación vía CA (membrana corioalantoidea), 0.1 ml.
a. Virus de la viruela aviar.
b. Poxvirus.
c. Poxviridae.
6. Sellar con parafina.
7. Inocular 37°C x 3 días.
- Volteo diario.
- Humedad.
8. Refrigerar doce horas antes de la cosecha.
9. Cosecha. Lesiones producidas.
RESULTADOS
 - El feto del pato murió, por el proceso de congelación.
- Se observaron las diferentes partes del huevo, como el saco vitelino, la membrana
carioalantoidea, cavidad alantoidea, cavidad amniótica.
- Se observó edema, áreas de hemorragia y pústulas en la membrana corioalantoidea.
CONCLUSIONES
- Se conocieron los métodos de cultivo para diagnóstico viral.
- Se realizó el método de cultivo, en huevos embrionados.
BIBLIOGRAFIA
- 75th. Annual Meeting U.S. Animal Health Association, 1971
Edwin H. Lennette, Nathalie J. Schmidt. "Diagnostic Procedures for Viral and
Rickettsial Disease". Third Edition.
http://www.veterinaria.org/revistas/vetenfinf/vet_enf_inf_tripod/vetenfinftripodcomar/
2aisvir.htm
- Romulo Aycachi Inga el Oct 16, 2008. Es.scribd.com
https://es.scribd.com/doc/6851738/Virologia-Practica-05-Inoculacion-de-virus-en-
huevos-embrionados
- http://www.ehu.eus/biofisica/pdf/cultivo_celular.pdf