ELECTROFORESIS

DEFINICION
ES técnica
➢ electroforesis: utilizada para separar partículas
coloidales tales como proteínas o ácidos nucléicos a través una
matriz sólida (gel de agarosa o poliacrilamida) de acuerdo a su
tamaño y carga eléctrica mediante la aplicación de un campo
eléctrico (IUPAC, NHLBI, DOE).
➢ desnaturalización de proteínas: pérdida de las estructuras
nativas (secundaria, terciaria y cuarternaria) de una proteína,
adoptando la estructura primaria únicamente.
➢ enfoque isoeléctrico: técnica en gradiente de pH montada
entre un ánodo y un cátodo, de donde éste último tiene un pH
más alto que el primero.
DEFINICION
ESestándar de peso molecular: fragmentos de ADN
➢ marcador
de peso molecular conocido utilizados para determinar el
tamaño de una molécula de ADN de interés por comparación
después de una electroforesis.
➢ polimerización: acción química por el cual las moléculas de
acrilamida y bisacrilamida forman un entramado a manera de
malla por la acción de catalizadores (TEMED y APS) generando
una sustancia gelatinosa.
Elementos necesarios para una
electroforesis Buffer de
corrimiento

Cámara de
electroforesis

Marcador de PM Buffer de carga
 Elementos necesarios para una electroforesis
Cámara de electroforesis
➢ Permite la generación de un campo eléctrico alrededor Vertical
de un gel en el que se depositan las muestras.
➢ Cuenta con dos polos que se conectan a una fuente
de energía

Horizontal
 Elementos necesarios para una electroforesis

Da soporte para evitar perturbaciones mecánicas durante la
Gel separación.

Agarosa

Poliacrilamid
a
 Elementos necesarios para una electroforesis
Gel de Agarosa
✓ polissacárido extraído de algas marinas
✓ 100 pb a 25 kb.
✓ No es tóxico
✓ Permite realizar el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares variados
✓ Menor poder de resolución que el de los geles de poliacrilamida.
✓ El tamaño de los poros de la matriz del gel depende de la concentración de agarosa utilizada y la
concentración de agarosa es inversamente proporcional al tamaño del poro obtenido.
✓ La concentración de agarosa más utilizada para electroforesis de ácidos nucleicos es de 0.5 a 2%.
TBE
1X
 Elementos necesarios para una electroforesis
Gel de  acrilamida
✓ La acrilamida es un polímero sintético,
termoestable, incoloro y químicamente inerte.
✓ polimerización química de una mezcla de
acrilamida y bisacrilamida.
✓ El tamaño del poro de un gel (acrilamida +
bisacrilamida),  19:1. siempre menores que la de
los geles de agarosa.
✓ Soportar mayores voltajes y es susceptible de
teñirse por varios procedimientos;
✓ La electroforesis con geles de acrilamida siempre
se realiza en cámaras verticales.
✓ un gel superior o concentrador y un gel inferior de
separación o de resolución.
 Elementos necesarios para una electroforesis
Buffer de corrimiento

El buffer de corrimiento es de la misma composición y

pH
que el buffer con el que se prepara el gel de
resolución, ya
sea de agarosa o de acrilamida.
Proporciona el medio para la transmisión de la
corriente eléctrica y mantiene el pH sin variaciones
mientras se realiza el corrimiento.
En el caso de los ácidos nucleicos, pueden
emplearse TBE o TAE como buffer de corrimiento. El
buffer TBE contiene Tris
base, ácido bórico y EDTA, y se maneja a un pH de
7.2. El
buffer TAE contiene Tris base, ácido acético y EDTA,
ajustado a pH 8.5.
El buffer de corrimiento de electroforesis de proteínas
lleva Tris, 25 mM, SDS al 1% y glicina, 192 mM, a un
 Elementos necesarios para una electroforesis
Buffer de carga

✓ Este amortiguador tiene como fin brindar peso, densidad y color

a la muestra, lo que facilita su depósito en el pocillo y evita su
salida del gel; permite, además, monitorear el corrimiento de la
muestra en el gel.
✓ Se emplea en relación 1:3 para ácidos nucleicos o 1:6 para
proteínas, respecto a la cantidad de muestra.
✓ El buffer de carga de ácidos nucleicos contiene Tris, azul de
bromofenol, azul de xileno y glicerol.
✓ Mientras que el buffer de carga para proteínas contiene Tris­HCl,
pH 6.8, ditiotritiol (DTT), SDS, glicerol y azul de bromofenol.
 Elementos necesarios para una electroforesis
Marcador de peso molecular

✓ Los marcadores de peso molecular son una

mezcla de moléculas de DNA o de proteínas de
tamaño conocido que permiten determinar por
comparación el tamaño de las moléculas (ácidos
nucleicos o proteínas) contenidos en las
muestras sometidas a electroforesis
 Elementos necesarios para una electroforesis
Transiluminador ultravioleta

El transiluminador es un aparato que transmite luz

del espectro ultravioleta a través de la muestra, lo
cual excita la molécula cromogénica que emite
energía fluorescente y permite visualizarla.
En general emiten energía a una longitud de onda
a 302 nm, aunque también existen para 254 y 365
nm;
 Procedimiento general de una electroforesis

1. Preparar un gel de agarosa o acrilamida a la

concentración requerida.
2. Mezclar las muestras a analizar con un buffer de
carga adecuado.
3. Cargar las muestras en el gel.
4. Realizar la corrida electroforética al voltaje
pertinente.
5. Visualizar los ácidos nucleicos o las proteínas.
Procedimiento general de una electroforesis

Electroforesis de ácidos
nucleicos
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos ­ REACTIVOS
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos ­ REACTIVOS
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos ­ REACTIVOS

5 mg/mL
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos ­ REACTIVOS
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos – METODOLOGÍA
1. Preparción  del gel de garosa
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos ­ METODOLOGÍA
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos – METODOLOGÍA
2. Mezclar la muestra con el tampón de carga
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos ­ METODOLOGÍA
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos ­ METODOLOGÍA
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos ­ METODOLOGÍA
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos – METODOLOGÍA
3. Cargar la muestra en el gel
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos – METODOLOGÍA
4. Corrido electroforético
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos ­ METODOLOGÍA
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos – METODOLOGÍA
5. Visualización
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos ­ METODOLOGÍA
 FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DEL ADN
Existen diferentes factores que tienen una marcada influencia sobre la distribución de las moléculas
de ADN. Generalmente, estos factores suelen confundir los resultados finales, por lo que se recomienda
al investigador estandarizar algunos parámetros importantes que en la práctica suelen pasar
desapercibidos. Estos factores pueden ser:

Tamaño del ADN
Generalmente la tasa de migración del ADN es inversamente proporcional al
log10 del número de pares de bases que conforman la molécula. Esto significa
que las moléculas de ADN más grandes generalmente migran más lentamente
que las más pequeñas.
 FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DEL ADN

Concentración de la agarosa
Una molécula de ADN migrará y se distribuirá de modo diferente a medida
que varíe la concentración de la matriz de agarosa o poliacrilamida. Este
fenómeno se puede explicar matemáticamente mediante la siguiente fórmula:
log μ = log μo  ­ K rt
Donde log μ es el logaritmo de la movilidad electroforética del ADN, t es la
concentración de la agarosa, μo es la libre movilidad electroforética del ADN y
Kr es el coeficiente de retraso relacionado a las propiedades del gel y del
tamaño y forma de las moléculas que se desplazan.
 FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DEL ADN

Conformación del ADN
Existen moléculas de ADN que a pesar de presentar el mismo peso molecular
adoptan conformaciones estructurales diferentes. Un ejemplo de ello son los
plásmidos que en la mayoría de los casos generan estructuras
superenrrolladas, formas lineales o formas circulares menos enrolladas o
relajadas. En la electroforesis, estos plásmidos migran de manera no uniforme
y se distribuyen en la matriz de agarosa de tal manera que dan la impresión de
tratarse de moléculas de diferente peso molecular. Sin embargo, estas
diferencias pueden ser alteradas variando algunos parámetros físicos como la
fuerza iónica del buffer, el voltaje aplicado o la concentración misma de
agarosa.
 FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DEL ADN

Voltaje aplicado
Este parámetro es muy importante en la electroforesis ya que permite la
movilización de las moléculas de ADN de un polo a otro. Es de resaltar que a
medida que aumenta la fuerza del campo eléctrico (aumento de voltaje), se
incrementa la movilidad de las moléculas de ADN de alto peso molecular pero de
manera indistinta. Ello genera que las moléculas no se separen completamente
unas de otras pese a aumentar la velocidad de la electroforésis. En consecuencia,
se recomienda no aplicar más de 5V/cm para moléculas de ADN mayores de 2 Kb.
 FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DEL ADN

Dirección del campo eléctrico
Durante una electroforesis normal, las moléculas de ADN migrarán a través de una determinada
dirección influenciada por un campo eléctrico. Esta dirección tiene singular repercusión sobre la
tasa de migración de una molécula de ADN. Mientras este factor permanezca constante, la
dirección de la migración del ADN se mantendrá inalterable. Sin embargo, existe la posibilidad de
alterar la dirección del campo eléctrico y con ello es posible cambiar el curso de la migración del
ADN. En ese sentido, si consideramos fraccionar dos grandes moléculas de ADN que miden entre
50 y 100 kb (por ejm. ADN genómico) bajo un campo eléctrico de una sola dirección el resultado
final será la presencia de una sola banda difusa en el que se encuentren ambos fragmentos. Pero,
si realizamos un cambio en la dirección del campo eléctrico, las moléculas más grandes de 100 kb
se autoalinearán, alterarán su migración y se podrán separar en dos fragmentos completamente
distinguibles. Este tipo de electroforesis es conocido como electroforesis de campo pulsado
(PFGE o Pulse Field Gel Electrophoresis), y es bastante usado para la separación de moléculas
de ADN de grandes tamaños (por encima de 100 kb).
FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DEL ADN

Composición de las bases y temperatura
En geles de agarosa, la composición de las bases del ADN y la temperatura no
son factores que influyen sobre la migración del ADN. En ese sentido no existen
diferencias de migración de las moléculas de ADN desde 4° C a 30° C. Sin
embargo, en concentraciones de ADN por debajo del 0,8%, un eventual aumento
de temperatura por encima de 50°C (cambio que puede ocurrir al aumentar el
voltaje de electroforesis o por la alta fuerza iónica del buffer) puede generar la
licuación del gel y en consecuencia la pérdida de la muestra del ADN.
 FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DEL ADN

Presencia de agentes intercalantes
Algunos investigadores prefieren mezclar el ADN con el bromuro de etidio antes de realizar la
electroforesis. Ello genera que el bromuro de etidio se intercale entre las bases del ácido
nucleico produciendo una alteración del peso molecular del ADN y reduciendo su movilidad
durante la electroforesis, en aproximadamente un 15%. Para evitar este problema se
recomienda realizar primero la electroforesis y posteriormente la tinción del gel de agarosa con
bromuro de etidio a fin de evitar distorsiones en la migración del ADN.
 FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DEL ADN

Composición del buffer de electroforesis
La migración del ADN es afectada por la composición y la fuerza iónica del buffer de
electroforesis. En un caso hipotético en que por error se llevase a cabo la electroforesis usando
agua en lugar de buffer, la conductividad eléctrica disminuiría drásticamente por la falta de iones
y, en consecuencia, la migración del ADN sería casi nula. Si la concentración de iones fuera
excesivamente alta, la conductividad eléctrica sería muy eficiente y se generaría un
sobrecalentamiento del buffer. El calor excesivo podría causar la licuación de la agarosa o la
denaturación del ADN.
Actualmente se dispone de distintos buffers para electroforesis de ADN de doble hebra. Los más
usados son el buffer TAE (Tris, ácido acético y EDTA) y el TBE (Tris Borato EDTA). La ventaja
de usar TAE es que es menos costoso y a diferencia del TBE permite que las moléculas de
ADN migren 10% más rápido. El TBE por su parte es un buffer muy eficiente y no se
sobrecalienta fácilmente a grandes voltajes. Por esta razón, este buffer es usado para la
resolución de grandes fragmentos de ADN en matrices poco concentradas.
 Procedimiento general de una electroforesis

Electroforesis de proteínas
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de proteínas ­ REACTIVOS
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos – METODOLOGÍA
1. Preparación del gel de acrilamida

Gel de resolución o separación Gel concentrador o
compactación
➢ 5,3 mL   Agua bidestilada
➢ 2,5 mL Tris­HCl 1,5M pH 8,8 ➢ Agua bidestilada
➢ 2,0 mL Acrilamida/bisacrilamida ➢ Tris­HCl 1,5M pH 6,8
30% v/v ➢ Acrilamida/bisacrilamida 30% v/v
➢ 0,1 mL SDS 10% ➢ SDS 10%
➢ 0,05 mL Persulfato de amonio 10% ➢ Persulfato de amonio 10%
➢ 0,05 mL TEMED ➢ TEMED

Polimerizar a temperatura ambiente durante 30 a 45 minutos
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos – METODOLOGÍA
2. Preparación de la cubeta
 Procedimiento general de una electroforesis
Electroforesis de ácidos nucleicos – METODOLOGÍA
3. Carga de la muestra
Electroforesis de ácidos nucleicos – METODOLOGÍA
3. Corrido electroforético
Electroforesis de ácidos nucleicos – METODOLOGÍA
3. Corrido eectroforético
Electroforesis de ácidos nucleicos – METODOLOGÍA
4. Tinción de la proteína
 FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DE LAS PROTEÍNAS
Los principales factores que afectan la migración de las proteínas durante la electroforesis son las
siguientes:

Fuerza del campo eléctrico (E)
Es la fuerza que determina el movimiento o migración de la proteína a través del campo eléctrico. Su unidad
de medición es voltios/cm y es por esa razón que la tasa de migración de una proteína puede ser alterada
cambiando tanto la distancia comprendida entre los electrodos (cm) como el potencial eléctrico del sistema
(Voltaje). Del mismo modo, los valores de E dependen de la fuerza direccional (Fa) y de la carga neta de la
molécula (Q). Puede ser calculada a través de la siguiente fórmula:

E = Fa/Q
E= v/d
Donde:
Fa = Fuerza direccional.
v = voltios.
d = distancia de los electrodos (en centímetros)
Q = carga en (coulomb)
 FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

Temperatura
Depende básicamente del voltaje de la electroforesis, la concentración de sales (poder de
conductancia) del buffer y del pH. Un aumento en la temperatura del buffer genera el efecto "sonrisa"
o smiling.
 FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

Carga neta de la molécula
La presencia de aminoácidos de diferentes grupos bioquímicos otorga a una determinada
proteína una carga neta totalmente diferente a otra, compuesta por diferentes grupos de
aminoácidos. Debido a que en la electroforesis, las muestras son sometidas a un determinado
campo eléctrico, la migración de las proteínas en el gel dependerá básicamente de su carga y
no de su peso molecular. Para evitar este efecto, es importante igualar la carga neta de todas
las proteínas aprovechando sus propiedades anfotéricas. En ese sentido, el SDS evita el efecto
de diferencias de carga entre las proteínas, a fin de favorecer la separación de ésta únicamente
por su peso molecular.
 FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

Tamaño y forma de la molécula
Las proteínas tienen características moleculares que actúan como factores intrínsecos durante
la electroforesis alterando su migración y generando bandas de diferentes tamaños, que no
necesariamente van acorde al peso molecular real del polipéptido. Ciertas modificaciones
postraduccionales, multimerización y formación de complejos con otro tipo de moléculas
generan modificaciones en el tamaño de la proteína dando pesos moleculares aparentes en el
momento del análisis.
Debido a la dificultad de reconocer la naturaleza bioquímica de una proteína no caracterizada,
previamente deberá estandarizarse diversas condiciones experimentales a fin de optimizar el
análisis de la proteína por electroforesis.
 VARIANTES DE ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
✓ Es un proceso de separación e identificación de proteínas en dos
dimensiones, orientando los frentes de corrida en ángulo recto uno de otro.

✓ En tal sentido, las moléculas primero son separadas por su carga o punto
isoeléctrico (pI) por la técnica de enfoque isoeléctrico o IEF (Isoelectric
Focusing).

✓ Posteriormente, las proteínas son separadas de acuerdo a su tamaño o

peso molecular por electroforesis en SDS PAGE, diferencia de la
electroforesis en una dimensión en el que se puede resolver cerca de 50
bandas, la electroferesis de dos dimensiones permite resolver 2500
manchas de polipéptidos.
 VARIANTES DE ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS DE CAPILAR
Como su nombre lo indica este tipo de electroforesis se lleva a cabo en finos capilares
de sílica
fundida cubierta con poliamida. Los tubos de sílica tienen una longitud de 30 a 100 cm
con un diámetro de 25 a 100 μm y presentan radicales oxidrilo que al disociarse
confieren una carga neta negativa.

El proceso se realiza en condiciones de alto voltaje y de campo eléctrico, donde el calor

generado es eficientemente disipado gracias a la acción de los pequeños capilares. Para
este propósito, el buffer utilizado en el sistema Tris 0,02 M pH = 8,6 pasa por los
capilares removiendo los H+ de los radicales oxidrilos. Con ayuda de corriente eléctrica
se generará un flujo de protones hacia el cátodo, proceso conocido como flujo endo­
osmótico.

En este sistema el tiempo de separación es relativamente corto (5 a 10

minutos), mientras que la eficiencia de separación es muy alta.
➢ Las distintas moléculas de CE permiten separar moléculas de muy diferentes propiedades
físicas (peso molecular, carga, polaridad, etc.)
➢ La técnica CE tiene aplicación en la detección y cuantificación de la mayoría de moléculas
orgánicas e inorgánicas.
Equipo de electroforesis capilar
➢ Capilar de sílice fundida: Las paredes externas del capilar están
recubiertas de una capa de poliimida, para dotarlo de una mayor
resistencia. Dentro del capilar se realiza la separación de los
analitos.
➢ Sistema de refrigeración del capilar: Debido a la resistencia al
movimiento de las cargas se genera una gran cantidad de calor,
que debe disiparse para evitar que el capilar se funda.
➢ Fuente de corriente eléctrica de alto voltaje: 20­30kV 200­250μA
➢ Viales con el electrolito y la muestra: Contienen una disolución
tampón en la que se va a realizar la separación. El sistema mueve
los viales automáticamente y los inserta en los extremos del capilar.
Equipo de electroforesis capilar

➢ Dos electrodos de platino: Cada uno se encuentra en contacto

con un extremo del capilar y sumergido en los recipientes que
contienen el tampón donde se va a realizar la separación.
(cátodo: electrodo negativo; ánodo: electrodo positivo).
➢ Detector: Sistema que registra la propiedad física de los
analitos. El más común es de absorción de radiación UV­VIS.
La representación de la propiedad físico­química medida
(absorbancia), en función del tiempo de migración=
electroforetograma.
➢ Sistema de registro y análisis de señal: La señal del detector
es registrada por un ordenador; que es capaz de generar un
electroforetograma.