CLASIFICACIÓN GENERAL

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

CLASIFICACIÓN GENERAL INTRODUCCIÓN

Fase móvil • Líquido (solvente)

Fase 
• Sólido (Soporte) 
estacionaria

Mecanismo  • Disolución, adsorción, por

de Separación  intercambio iónico, etc

• Los componentes a separar deben

Compuestos  ser solubles en la fase móvil.

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INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN
Tratamiento de Columna
Bombas de Detector
datos analítica
alta presión Inyector

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1
 INTRODUCCIÓN VENTAJAS
o Rapidez (5-30 min).
o Sensibilidad (ng-pg).
o Aplicación para análisis cuantitativa (precisión, RSD < 1% en área de
pico).
o Aplicable a diferentes tipos de muestras.
 Compuestos grandes (biomoléculas, polímeros y compuestos
iónicos).
 Adecuada para compuestos térmicamente lábiles y no volátiles.
 >100,000 HPLC's son utilizados en el mundo hoy en día.
o Permite análisis multicomponente en matrices complejas.
o Fácil de recuperar la muestra.
o Flexible - amplia gama de columnas, fases móviles, y detectores.
o Totalmente automatizado.
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CLASIFICACIÓN GENERAL CROMATOGRAFÍA DE REPARTO

La cromatografía de líquidos se clasifica según la polaridad
Presión de Fase normal relativa de las dos fases y la preponderancia de los
vapor baja
(NP)
fenómenos de reparto.
De  • Método mas popular.
Termolábiles
reparto • Analitos de peso molecular bajo (PM < 3000).
Fase 
De  reversa (RP) • Polares o no-polares.
adsorción • Columnas con fase estacionaria unida (liquido unido
Iónicos CL químicamente a un soporte de sólido de partículas).
Iónica • 3.4 o 10μm de partículas de sílice hidrolizadas
recubiertas con siloxano.
De alto De 
peso exclusión   Fase normal (NP)
molecular
 Fase reversa (RP)

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CLASIFICACIÓN DE LAS SUSTANCIAS POR  CROMATOGRAFÍA EN FASE NORMAL (NP)
SU POLARIDAD Muestra

Escala de polaridad creciente:

Fase móvil
Hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas < aldehídos < amidas 1. Fase móvil es de naturaleza
(apolar)
< aminas < alcoholes < agua. OH no-polar.
2. Fase estacionaria es de
Fase estacionaria

OH naturaleza polar.
3. Las muestras polares
OH quedan retenidas mas
SiO2
tiempo en la columna.
OH

Muy polar.
OH
Semi-polar.
Apolar.
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2
 CROMATOGRAFÍA EN FASE NORMAL (NP) CROMATOGRAFÍA EN FASE REVERSA (RP)
Muestra

• FM de baja polaridad y FE polar. Me Fase móvil

O- R
(polar) 1. Fase móvil es de naturaleza
• Solutos poco polares eluyen primero. Me polar.
2. Fase estacionaria es de

Fase estacionaria
• Incrementar la polaridad de la FM tienen el  OH
Me naturaleza apolar.
efecto de reducir el tiempo de elución. O- R 3. Las muestras no-polares
SiO2 quedan retenidas mas
• R‐Polar‐ ciano, diol, amino, dimetilamino. Me
OH
tiempo en la columna

• FM‐baja polaridad‐ étil éter, cloroformo,hexano. Me
Muy polar
O- R
Me
Semi-polar
Apolar
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CROMATOGRAFÍA EN FASE REVERSA (RP) CROMATOGRAFÍA EN FASE REVERSA (RP)
o Donde R puede variar, típicamente…. C18, C8, -CH2-C6H5
• Mas ampliamente utilizada.
o -{CH2}3-NH2, -{CH2}5-CN • Solvente de alta polaridad‐solutos de alta polaridad 
eluyen en primero.
• R = mas común‐ C8 (n‐octil) o C18 (n‐octildecil)
• Los grupos están en posición perpendicular a la 
superficie generando una estructura de cepillo o brocha.
• Cuanto mayor es el numero de átomos de carbono en R 
mayor es la eficacia.
• Elución a pH > 7.5 puede ocurrir hidrólisis del siloxano.

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CROMATOGRAFÍA EN FASE REVERSA (RP) INSTRUMENTACIÓN
o Separación basada en la partición del
analito en una fase estacionaria
Soporte Eluente
o Bombas.
hidrofóbica unida a un soporte de sílica
(e.g., C18, C8) o Inyector.
o Utiliza fase móvil polar como mezclas
de metanol, acetonitrilo y agua;
analitos polares eluyen primero o Columna.
mientras los analitos no polares son
retenidos más. o Detector.
o Modo de HPLC más comúnmente  UV/VIS.
utilizado en > 60% en todas las
separaciones de LC.  Arreglo de diodos.
o Para analitos polares (solubles en agua),
medianamente polares y algunos
 Fluorescencia.
analitos no polares.  Índice de Refracción, etc.
o Analitos iónicos pueden ser separados
utilizando reactivos de par iónico.

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 INSTRUMENTACIÓN BOMBAS
o Alcanzar una presión de hasta 7000 psi.
o Flujo constante que sea libre de pulsos (0.1 a 10 mL/min).
o Control y reproducibilidad del flujo (5%).
o Componentes resistentes a la corrosión.
o Que este hecha de un material inerte al eluyente que se va a inyectar.
(Importante: eluyente debe filtrarse y desairarse antes de inyectarse).
Tipos de bombas de HPLC

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BOMBAS BOMBAS
Bombas Recíprocas: Bombas de Desplazamiento:

o Salida libre de pulsos con capacidad

para altas presiones (2940-7000 psi).
o Presenta limitada capacidad para fase
móvil.
o Adecuadas para análisis en columnas
de pequeño calibre.

Desventaja: pulsos del pistón.

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BOMBAS INYECTORES
• Comparación de separaciones usando mezclado con la bomba y o Inyección de la muestra hacia la
premezclado de la fase móvil. columna.
• MeOH/ACN/THF/H2O (44/10/6/40), 1 mL/min, Columna 3x3 C18.
o Durante la inyección, se debe evitar
cambios en el flujo.
o Factor limitante en la precisión de las
medidas por cromatografía de
líquidos.
o Los volúmenes de inyección deben
ser pequeños 0.1-500 L.
o Los bucles de inyección son
intercambiables (5-500 L hasta una
presión de 7000 psi).

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4
 INYECTORES INYECTORES

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FASE MÓVIL FASE MÓVIL
o Se requiere una diferencia de polaridad importante entre la fase móvil y
la fase estacionaria ya que la separación esta basado en la diferencia de
 Disolventes grado cromatográfico. solubilidad entre la fase móvil y la fase estacionaria (partición).
 Libre de partículas.
 Libre de aire disuelto, se elimina por: K = Cs/Cm
 Filtración por vacío.
 Ultrasonido. o Las separaciones de fase reversa se llevan a cabo con una
 Burbujeo con helio. combinación de acetonitrilo (CH3CN), y/o metanol, y agua como fase
móvil.
 No reaccionar con el empaque. o El índice de polaridad (Po) mide la polaridad relativa del solvente. Y se
 No degradar o disolver la fase estacionaria. emplea para identificar y seleccionar las fases móviles:
 De polaridad adecuada para permitir la o >polaridad del solvente > índice de polaridad.
retención de la muestra en la columna. o La optimización del solvente es experimental.
 Baja viscosidad.
 Baja presión de vapor. o La fuerza del eluente (Eo) es un parámetro similar:
 Miscible o >polaridad del solvente > fuerza del eluente.
 Fácil recuperación de la muestra.
 Compatible con el detector. o Es importante que los analitos y las muestras sean compatibles con la
fase móvil y la fase estacionaria.
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FASE MÓVIL FASE MÓVIL

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 FASE MÓVIL FASE MÓVIL
Fuerza de eluyente: Viscosidad de eluyente:

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ELUCIÓN ELUCIÓN
Forma del pico cromatográfico: Curvas de distribución:

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FASE MÓVIL FASE MÓVIL
Relación entre la polaridad y los tiempos de elución en una cromatografía • Elución Isocrática: Separación con disolvente de composición
de fase normal y una fase inversa. constante.

• Elución con Gradiente: Se utilizan dos o tres disolventes de distinta

polaridad y se varía la composición de forma continua o mediante
etapas escalonadas.

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6
 FASE MÓVIL
• Elución Isocrática. • Se lleva a cabo la separación de compuestos
aromáticos incluyendo alcoholes y cetonas.
• Fase móvil: A: buffer de KH2PO4/ B:
acetonitrilo.
FASE MÓVIL
• Elución con Gradiente. • Incrementa la relación de acetonitrilo en la
fase móvil durante el análisis trabaja como el
programa de temperatura en GC.

Diagrama del gradiente segmentado.

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PRECOLUMNAS COLUMNAS
o Es una pequeña columna (0.5-3 cm) que se coloca entre el
sistema de inyección y la columna analítica. o Generalmente son de acero inoxidable y
de componentes de teflón y/o PEEK.
o Composición similar a la columna analítica.
o Se usa para aumentar el tiempo de vida de la columna
analítica removiendo impurezas, materia en suspensión y o El material con el que se empaca la
componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a
columna (fase estacionaria) es una sílica
la fase estacionaria.
microporasa con un diámetro de 2-10 m.
o Se debe reemplazar del sistema con regularidad (cuando se
contamina). o Sílica sin modificar es de naturaleza polar.

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COLUMNAS COLUMNAS
Características de una columna típica de HPLC: Partícula de Sílice.

• 100 - 250 mm longitud x 4.6 mm d.i. Empacada con 5

o 10-m de fase enlazada C18.
• Rango de flujo 1 - 2 mL/min usando fase móvil de
metanol o acetonitrilo en agua.
• Carga de muestra: 1 ng hasta 1 mg.
• Rangos de presión de operación 500 - 2000 psi.
• Tiene 4,000 a 10,000 platos teóricos.
• Tiempo de vida de la columna típico 500 - 2000
inyecciones o 3 - 24 meses.

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 COLUMNAS COLUMNAS
Partícula de Sílice. Monolíticas de Sílice.

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COLUMNAS LONGITUD DE COLUMNA
Diámetro de Columnas. • Eficiencia de la columna (N) es proporcional a L:

• La capacidad de la muestra es proporcional a (dc )2
• El flujo es proporcional a (dc )2
• El límite de detección es inversamente proporcional a (dc )2
H = L/N
• Las columnas pueden ser conectadas juntas para
producir una columna larga con eficiencia alta.
• La presión en la columna es proporcional a L.
• Longitud común de la columna 10 - 25 cm.
• Columnas Fast LC son columnas cortas (3 - 10 cm)
empacadas con partículas pequeñas (i.d. = 3 m).

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LONGITUD DE COLUMNA CUIDADOS DE LA COLUMNA
• Tipo de soporte:
• Silica (o alumina) o Polímero (poliestireno entrecruzado) .
• Rango de pH >2.0 y < 10.0
• Grupos enlazados:
• C18, C8, C4, amino, ciano, fenil. • Incrementos de flujo de 0.1 a 0.5 mL/min.
• dietiletilamina (DEAE), sulfo, amina cuaternaria.
• No golpear la columna.
• Tamaño de partícula (dp): 3-, 5-, 7-, 10- ó 20 m
• La eficiencia es inversamente proporcional a dp • No exponerla a vibraciones.
• La presión de la columna es inversamente proporcional a (dp)2
• No guardarla sin disolvente.
• Tamaño de poro (dpore): 60 - 300 Å
• Materiales de poro ancho (300 Å) son usados para la separación • No dejarla con concentraciones altas de agua
de biomoleculas o polimeros (sólo para las columnas de fase reversa).
• Área superficial: 90 - 400 m2/g
• Un área superficial alta maximiza la interacción del soluto con los
grupos enlazados.

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 GRUPOS ENLAZADOS  GUÍA DE SELECCIÓN 
Fase Reversa • Macromoléculas (PM > 2000)
C18 Octadecil Si- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2-
CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH3 • Polimeros GPC (gel )
C8 Octil Si- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH3
• Biomoléculas (proteins, DNA) SEC, RP, IEC (Ion Exchange )
C4 Butil Si- CH2- CH2- CH2- CH3
• Orgánicos (PM < 2000)
Fase Normal • Polar RP, NP
Si Silica S i - OH
CN Cianopropil Si- CH2- CH2- CH2- CN • Medianamente polar RP
• No-polar RP, NP
Intercambio iónico
• Iones, compuestos ionizables IEC, RP-par-iónico
SP Sulfo propil Si - CH2- CH2- CH2- SO3-
CM Carboximetil Si-CH2-CO2- • Separación de grupos LSC, NP
DEAE Dietilaminoetil Si - CH2-CH2-NH+ (C2H5)2
SAX Trietilaminopropil Si-CH2-CH2-CH-N+(C2H5)3
• Preparativa LSC, GPC, RP

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GUÍA DE SELECCIÓN  GUÍA DE SELECCIÓN 
• C18 - Fase enlazada más común, muy retentivo y estable.
• C18 Monofuncional es tipo cepillo; polifuncional es polimérico.
• C18 de diferentes fabricantes pueden tener características de retención y
selectividad muy diferentes.
• C8 - Preferido para fase móvil con bajo contenido orgánico debido a su mejor
mojabilidad.
• C4 - Frecuentemente preferido para separación de proteínas (C18 para
peptidos)
• CN - Para NP o RP; Usada para o algunas aplicaciones (e.g. antidepresivos).
• Fenil - Para RP separación de compuestos básicos de mediana polaridad
selectividad única para aromáticos.
• Amino - Usado para remplazar sílice en separaciones de NP; análisis de
azucares.

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GUÍA DE SELECCIÓN  DETECTORES

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 DETECTORES DETECTORES
Detector UV-Vis con arreglo de diodos: Detector UV-Vis con arreglo de diodos:
• 190-800 nm.
• Casi universal.
• Concentración a nivel de trazas (ng).
• Características.
• Compatible con gradientes de elución.
 Longitud de onda programable,
capacidad de barrido con paro de • Para compuestos que absorben la radiación ultravioleta o visible.
flujo.
 Fuentes de D2, tungsteno o Xenón;
celda de flujo opcional para
cromatografía microbore y
preparativa.

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DETECTORES DETECTORES
Detector de Fluorescencia: Detector de Fluorescencia:

• Doble haz, Espectrofluoremetro de doble • Selectivo.

monocromador. • Concentración a nivel de trazas (fg).
• Rango de longitud de onda • Compatible con gradientes de elución.
– Excitación 200 - 850 nm • Aromáticos policíclicos.
– Emisión 250- 900 nm
• Alta sensitividad
– 40 fg de antraceno.
• Longitud de onda programable
– Escaneo con paro de flujo.

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DETECTORES
Detector de Índice de Refracción:
• Controlado por microprocesador, detector de
índice de refracción de deflexión diferencial.
• Rango de IR (1.00 - 1.75 RIU)
• Alta sensibilidad.
• Celda de flujo termostatada.
DETECTORES
Detector de Índice de Refracción:
• Universal.
• Trabajo analítico, semipreparativo y preparativo.
• Sensible a cambios de temperatura.
• No es compatible con gradientes de elución.

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 DETECTORES DETECTORES
Detector Electroquímico: Detector Electroquímico:
Intervalos de potencial en los que pueden tener la oxidación o reducción
distintos grupos funcionales orgánicos. En principio las especies que • Selectivo.
contengan estos grupos podrían detectarse por métodos • Concentración a nivel de trazas (fg).
electroanalíticos. La detección electroquímica brinda un detector • No es compatible con gradiente de elución.
“universal” y sensible. • Iones orgánicos e inorgánicos.

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DETECTORES DETECTORES
Detector de Infrarrojo: Detector de Dispersión de Luz:
• Válido para aquellos solutos que
• Barrido de  entre 2.5 y 15 μm. sean claramente menos volátiles
• Cubetas con ventanas de NaCl o CaF2, long. 0.2 y 1.0 mm, volumen que la fase móvil.
1,5 a 10 μL.
• Limitación: baja transparencia de los disolventes (agua, alcoholes). • El eluyente es evaporado con una
corriente de N2 dejando una nube de
• LOD 100 ng. finas partículas sólidas que entran
en la zona de detección.

• Las partículas se detectan por la luz

que procede de un diodo láser y
llega al fotodetector por dispersión.

• Sólo buffers volátiles en la fase

móvil.

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DETECTORES DETECTORES
Detector de Masa: Resumen de Detectores:
• Universal.
• Información estructural.
• Concentración a nivel de trazas (fg).

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 DETECTORES MECANISMOS DE INTERACCIÓN
Resumen de Detectores:

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INTERCAMBIO IÓNICO INTERCAMBIO IÓNICO
PROPIEDAD: Interacciones electrostáticas (carga eléctrica). Moléculas MENOR CARGA (+)  RÁPIDAS
SOPORTE  Resina de micropartículas formadas por
polímeros sintéticos o naturales (dextranos, celulosas, * Son desplazadas más fácilmente por la FM.
agarosa). Las moléculas (-) son rechazadas por la FM
estacionaria y eluidas directamente.
F. ESTACIONARIA  (SÓLIDA) Grupos con cargas iónicas
Fase móvil Moléculas MAYOR CARGA (+)  LENTAS
unidos al soporte.
* Son retenidas por los grupos cargados
Estacionarios

Carga positiva (+)  intercambiadores de aniones (-):

iónicamente de la fase estacionaria.
cromatografía aniónica
Fase

Carga negativa (-)  intercambiadores de cationes (+):

cromatografía catiónica Aplicación q+ Q+
de Muestra
Macropartículas

F. MOVIL  (LÍQUIDA) Solvente que anula la interacción

electrostática.
Elución
2 posibilidades: Gradientes de pH  cambio de carga Cromatografía
de las moléculas de la muestra. Catiónica
Gradientes iónicos (salinos)  competencia
por grupos electrófilos.
69 70

INTERCAMBIO IÓNICO INTERCAMBIO IÓNICO

71 72

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 EXCLUSIÓN MOLECULAR EXCLUSIÓN MOLECULAR
Moléculas GRANDES  RÁPIDAS
PROPIEDAD: Tamaño y Forma.
* Avanzan a mayor velocidad a través de los
SOPORTE  Resina de micropartículas esféricas porosas espacios intersticiales entre las bolas (con FM)
formadas por polímeros hidrofílicos (dextrano, agarosa,  son eluidas antes.
poliacrilamida o mezcla de ellos). Diámetro de poro Fase móvil
determinado. Moléculas PEQUEÑAS  LENTAS

Tamaños de poro  intervalo o rango de fraccionamiento. * Penetran en los pequeños conductos de las
bolas de gel y avanzan a menor velocidad (con
P.e. Sephadex G25: 1000 – 5000 Da Fase fase estacionaria)  son eluidas después.
Sephadex G200: 5000 – 250000 Da Estacionarios Aplicación

Macropartículas
de Muestra
F. ESTACIONARIA  (LÍQUIDA) solvente acuoso (el mismo
que el de la fase móvil) que se encuentra dentro de
micropartículas.
Elución
F. MÓVIL  (LÍQUIDA) solvente acuoso que atraviesa la
columna por los espacios intersticiales (entre las
micropartículas).
73 74

EXCLUSIÓN MOLECULAR EXCLUSIÓN MOLECULAR

75 76

AFINIDAD AFINIDAD
PROPIEDAD: Interacciones específicas entre dos moléculas. Moléculas NO INTERACCIÓN  RÁPIDAS
P.e.: hormona-receptor , proteína-metal o cofactores
como ATP, antígeno-anticuerpo. * No se unen al ligando de la fase estacionaria
 eluyen directamente.
SOPORTE  Matriz de micropartículas hidrofílicas sin carga,
con rigidez, inerte y estable (agarosa, acrílica). Fase móvil Moléculas INTERACCIÓN  LENTAS

F. ESTACIONARIA  (SÓLIDA) Ligandos (grupos * Se unen al ligando de la fase estacionaria.

químicos) específicos (con afinidad por alguna de las Elución específica.
moléculas a aislar) unidos a la matriz.

-- Comerciales: Concavalina A  une glicoproteínas Fase

Proteína A  une IgG (anticuerpos)
Macropartículas

Estacionarios
-- No comerciales: anclaje covalente ligando - matriz
Aplicación
F. MÓVIL  (LÍQUIDA) Solución que anula o disminuye la de Muestra
afinidad con el ligando de la fase estacionaria.
Lavado
-- Solución con el propio ligando  Molécula + ligando libre
Elución
-- Solución con algo que interacciona con el ligando  Molécula específica
77 78
Facultad de Ciencias Químicas Dr. Jorge Luis Guzmán Mar Facultad de Ciencias Químicas Dr. Jorge Luis Guzmán Mar

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 AFINIDAD ADSORCIÓN
• Cromatografía liquido‐sólido.

• FE = sílice o alúmina.

Facultad de Ciencias Químicas
• Selección de la FM:
– Para optimiza k’ y α se varia la composicion de la 
FM‐se utiliza la fuerza del eluyente Єo.
– Se eligen dos solventes compatibles uno con Єo
pequeña y otro con Єo grande. Se varían hasta
obtener una k’ adecuada.
79
Dr. Jorge Luis Guzmán Mar Facultad de Ciencias Químicas Dr. Jorge Luis Guzmán Mar 80

ADSORCIÓN
• Aplicaciones:
– Compuestos no polares con masas < 5000.
– Muestras solubles en disolventes no polares.
EJERCICIOS Y APLICACIONES
– Capaz de diferenciar entre compuestos isómeros.

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Facultad de Ciencias Químicas Dr. Jorge Luis Guzmán Mar 81 Facultad de Ciencias Químicas Dr. Jorge Luis Guzmán Mar

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN LONGITUD DE CADENA
La cromatografía de adsorción es adecuada para separar
moléculas no ionizables (polímeros, proteínas, etc.) e isómeros
de un compuesto.

83 84
Facultad de Ciencias Químicas Dr. Jorge Luis Guzmán Mar

14
 EFECTO DE pH
Se puede evitar la ionización de una molécula usando en la fase
móvil una solución amortiguadora de cierto valor de pH.
EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA
Si se incrementa la FI de la FM se presenta una competencia entre los
iones de la FM y los de las Muestra, por lo que los primeros
desplazaran con mayor facilidad a los últimos disminuyendo sus
tiempos de retención.

85 86

CAMBIO EN LA FASE MÓVIL CAMBIO EN LA FASE MÓVIL

87 88

EJERCICIOS Chemistry - our life, our future

3. Al analizar por CCF (Sílica gel, n‐Hexano/Acetato de etilo 3:2) una
mezcla de las tres sustancias siguientes, se obtuvo los
cromatogramas mostrados.
¿Determinar a cuál sustancia corresponde cada mancha?. ¿Cuál está
en mayor proporción ?

Solvay Conference 1927

89

15