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modelado por homología y las relaciones filogenéticas de las catalasas de un patógeno oportunista Rhizopus
oryzae

Beáta Linka un , Gerda Szakonyi un , Tamás Petkovits do , László Nagy G. do , Tamás Papp do , Csaba Vágvölgyi do ,
Sándor Benyhe segundo , Ferenc Ötvös segundo , •
un Instituto de Análisis de Productos Farmacéuticos, Facultad de Farmacia, Universidad de Szeged H-6720 Szeged, Somogyi u. 4, Hungría
segundo Instituto de Bioquímica, Centro de Investigaciones Biológicas, Academia Húngara de Ciencias, H-6701 Szeged, PO Box 521, Hungría
do Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias e Informática, Universidad de Szeged, H-6726 Szeged, 52 Közép fasor, Hungría

artículo info abstracto

Historia del artículo: Objetivos: A homologymodelingmethodology se desarrolló y se utilizó para obtener las estructuras 3D para cuatro catalasas putativos de Rhizopus
Recibido el 29 de febrero de 2012 de oryzae con el fin de evaluar su funcionalidad.
aceptar 15 de junio de 2012 métodos principales: modelos de homología se construyeron utilizando diferentes estrategias de modelado utilizando compuestos no proteicos como restricciones

estéricas, una restricción de simetría para forzar cadenas idénticas y un algoritmo de modelado de bucle adicional. valores de solapamiento estructurales por ciento (SO)
palabras clave:
se calcularon para cada modelo - par plantilla para calificar los modelos de homología.
catalasa
Homología estructura de
Llave fi hallazgos: La comparación de las diferentes estrategias de modelado por el SO valores revelaron que la calidad de los modelos, es decir, la
modelado en 3D

R. oryzae
similitud a la plantilla se incrementó en gran medida en la presencia de los grupos prostéticos, modelando múltiples cadenas de proteínas juntos, la

Las relaciones filogenéticas aplicación de cadenas simétricas y la aplicación de modelado de bucle adicional. Para obtener los mejores modelos de homología obtenidos de esta
manera, los valores de SO expresan relaciones evolutivas similares entre las proteínas modeladas y las plantillas que se establecieron previamente por
análisis filogenético. En tres de los cuatro catalasas de R. oryzae los modelos de calidad más alto, el centro activo, es decir, la molécula de hemo y los
aminoácidos circundantes mostraron una disposición espacial idéntica a la observada experimentalmente en otros catalasas. La proteína restante se
falta un fragmento largo 11 residuo y se ha mutado residuos dentro del centro activo.

signi fi cado: Mejores homologymodels pueden ser elegidos por obtainedwith plantillas relación filogenética, aunque la construcción de un modelo
preciso necesita limitaciones estructurales también. El cálculo de la superposición estructural entre los modelos y las plantillas también pueden ayudar
a fi ND las plantillas apropiadas.
© 2012 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.

Introducción
Rhizopus oryzae, un miembro de los Zygomycetes clase, es el principal agente causal de la
zigomicosis que es una infección invasiva, que evoluciona rápidamente y, a menudo fatal en
pacientes que tienen una condición de salud fuertemente inmunocomprometidos. Estas infecciones
oportunistas, principalmente rinocerebral hongos son de creciente interés clínico debido a la alta tasa
de mortalidad (75 - 90%) ( Ribes et al., 2000; Eucker et al., 2001 ). Las formas terapéuticas son
dos subgrupos por el análisis filogenético nombradas como catalasas-subunidad pequeña y
estrechas incluyendo un diagnóstico precoz seguido de tratamiento quirúrgico y antifúngica agresivo ( Hemashettar
et al., 2011 ). Por otra parte, estos hongos tienen una resistencia intrínseca contra los agentes
antifúngicos disponibles recientemente. células de neutrófilos desempeñan un papel importante entre
los mecanismos de defensa contra las infecciones fúngicas invasivas por matar efectivamente las
hifas con peróxido de hidrógeno ( Kolotila y Diamond, 1990 ). Por lo tanto, la producción de catalasa
microbiana contra peróxido de hidrógeno del huésped puede ser considerado como una
posible factor de virulencia en pacientes con una función de los neutrófilos deteriorado ( Shibuya et
al., 2006 ). En consecuencia, en un futuro tratamiento curativo la funcionalidad de las catalasas de R.
oryzae También pueden ser dirigidos lo que plantea la necesidad de su investigación detallada.
La familia de catalasas se divide en grupos de hemo y no hemo catalasas. Además de la
catalasa bifuncional - peroxidasas las catalasas monofuncionales constituyen el mayor groupwithin la
familia catalasa hemo ( Bernroitner et al., 2009 ). Las catalasas monofuncionales se clasifican fi ed en
catalasas a gran subunidades con una masa molecular de 55 y 69 kDa y de 75 a 84 kDa,
respectivamente. Las enzimas de pequeña subunidad han asociado heme b y algunos de ellos tienen
NADPH. Las enzimas a gran subunidad caracterizado hasta ahora han asociados heme d y ninguno
tienen NADPH ( Klotz y Loewen, 2003 ). La mayoría de catalasas son activo en forma
homotetramérica. Ex análisis filogenéticos de los genes de catalasa revelaron la existencia de tres
subtipos principales que fueron segregados temprano en la evolución de esta familia de genes a
través de al menos dos eventos geneduplication ( Zamocky et al., 2008; Klotz y Loewen, 2003 ).
catalasas bacterianas se encuentran en los tres grupos distintos. Clade 1 y 3 contienen

• Autor correspondiente. Tel .: +36 62599635; Fax: +36 62433506.

Dirección de correo electrónico: otvos@brc.hu (F. Ötvös).

0024-3205 / $ - see front matter © 2012 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados. doi: 10.1016 /
j.lfs.2012.06.016
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secuencias exclusivamente pequeña subunidad procariotas, mientras clado 2 contiene secuencias
exclusivamente grandes subunidad ( Klotz et al., 1997 ). Los dos subgrupos de los-subunidad pequeña
catalasas están situados en el árbol filogenético distintamente, es decir, en clade 1 y 3. Las catalasas
fúngicas se encuentran en clade 2 y 3. Los análisis filogenéticos sugieren una secuencia de proteínas
altamente conservadas de catalasas que resultan en muy conservadas estructuras 3D también. Las
catalasas grandes subunidad tienen un 50 - 70 residuo largo N-terminal y una larga extensión de
aproximadamente 150 residuos C-terminal en comparación con los de pequeño subunidad los
preservando la estructura terciaria de montaje común en todas las catalasas monofuncionales. El
centro catalítico y sus alrededores están muy conservadas ( Zamocky y Koller, 1999 ).
A falta de estructuras experimentales, nuestro objetivo fue construir modelos 3D precisas de las
cuatro hipotéticas de catalasas R. oryzae por modelado por homología con el fin de ganar la
penetración en su centro catalítico y para fi aminoácidos ND como posibles dianas para más diseño
de fármacos. Para mejorar la eficiencia del modelo, un EF fi ciente homologymodeling strategywas
desarrollado.
materiales y métodos
El análisis de secuencias
Se obtuvieron las secuencias de aminoácidos putativas escanear el
R. oryzae base de datos del genoma ( Rhizopus oryzae Proyecto de Secuenciación del Instituto
Broad de Harvard y el MIT, 2004 , http://www.broadinstitute.org/ anotación / genoma /
rhizopus_oryzae / MultiHome.html ) Para catalasas. Una anotado y se encontraron tres secuencias de
catalasa putativos. Para caracterizar la proteína propuesto y para predecir el péptido señal, el
programas ProtParam ( Gasteiger et al., 2005 ) Y SignalP ( Bendtsen et al., 2004 ) Se utilizaron,
respectivamente. búsqueda de dominio y la predicción se realizaron utilizando el programa Motif
Scan (MyHits) ( Pagni et al., 2007 ). Para los análisis filogenéticos, secuencias de aminoácidos de 36
catalasas monofuncionales (Apéndice 5) fueron descargados de GenBank; la secuencia de datos en
bruto de Zygomycetes hipotético proteínas se obtuvieron de las bases de datos de secuencia del
genoma de R. oryzae, Mucor circinelloides ( Instituto Conjunto del Genoma del Departamento de
Energía; M. circinelloides
v1.0 CBS277.49; http://genome.jgi-psf.org/Mucci1/Mucci1.home.html ) y Phycomyces blakesleeanus ( DoE los métodos son como sigue: Homología de modelado de una sola cadena (monómero) de las
Joint Genome Institute P. blakesleeanus v1.1; http://genome.jgi-psf.org/Phybl1/Phybl1.home. html ). El
sequenceswere de aminoácidos alineados utilizando el algoritmo Probalign ( Roshan y Livesay, 2006 )
Con la configuración predeterminada. Las alineaciones resultantes se utilizaron para inferir árboles
utilizando el algoritmo bayesiano MCMC implementado en los MrBayes paquete de programa 3.2.1 ( Ronquist
y Huelsenbeck, 2003 ) Se ejecute como una versión independiente en Windows®. Mejor fi t modelos
de sustitución se estimaron por el método MCMC Reversible-Jump; Cadenas de Markov se llevaron a
cabo para fi cinco millones de generaciones de muestreo cada generación 100a. los fi primeros 30.000
árboles fueron descartados como burn-in, y los árboles restantes se utilizaron para calcular un árbol
de consenso gobierno de la mayoría del 50%; Bayesianos posteriores probabilidades (BPP)
≥ 0,95 se consideraron signi fi hipocresía. Los miembros de la Reversible-Jump análisis MCMC
seleccionan el modelo WAG implementado en MrBayes como la mejor fi t modelo a los datos, con una
probabilidad posterior de 1,00.
modelado de homología
Homología de modelado combina herramientas de química computacional y la bioinformática para
calcular atómica-resolución del modelo de la proteína diana a partir de su secuencia de aminoácidos y
una o estructuras tridimensionales más experimentales de proteínas homólogas relacionadas, es decir,
las plantillas. Homología de modelado consta de los siguientes pasos: (i) selección de la plantilla por
una búsqueda de base de datos, (ii) la alineación de secuencias entre las proteínas diana y de la
plantilla, (iii) la construcción de modelos y re fi namiento, y (iv) la evaluación del modelo ( Liu et al., 2011 ).
Debido a la realización secuencial de las etapas i - iv cualquier error se propaga a los pasos posteriores
decrecientes themodel precisión. Los errores de alineación son irrecuperables, por lo tanto, tanto fi Nding
la plantilla adecuada y hacer una buena alineación necesitan una atención especial.
modelado por homología se realizó mediante el paquete de programas 9v8 MODELADOR) ( Š Ali
y Blundell, 1993 ) Se ejecuta bajo las distribuciones de Linux Kubuntu 11.4 y Mandriva 2011).
Themodel algoritmo de construcción de Modeller incluye una alineación de la secuencia automática
followedbymodeling la columna vertebral, cadenas laterales anddisul fi de bonos conformidadconlos
con la alineación de secuencias y otras restricciones relacionadas con potencial estadístico
incrustados en el programa. Por último, MODELADOR fi acabados las estructuras de modelos por un
modelado molecular de recocido corto simulado utilizando la fuerza molecular CHARMM22 fi ELD ( http://salilab.org/mo
9v7 / manual / node442.html ). Las características adicionales de Modeller se utilizaron como sigue: el
uso de múltiples cadenas y varias plantillas; implicación del componente no proteico utilizado como
restricción cuerpo rígido (heme b o d, dependiendo de lo que la plantilla contenida, véase el Apéndice
1); restricción de simetría es decir, forzando geometría idéntica para cada cadena; la aplicación de la “ dopehr_loopmo
” módulo en lugar del más rápido “ allhmodel ” módulo para mejorar la Florida regiones de bucle
flexibles; y la calificación de los modelos por los valores de solapamiento por ciento estructural (SO),
utilizando el “ iterative_structural_align ” módulo con el fin de seleccionar las plantillas más adecuadas
para el modelado Multitemplate. En la preparación del AP plantilla fi les para el modelado de la
homotetrámeros “ MakeMultimer.py ”( http: //watcut.uwaterloo. ca / cgi-bin / makemultimer ) Programa
pitón se utilizó para restaurar la homotetrámero simétrica coordenadas en el que sólo la unidad
asimétrica se administró junto con el operador de simetría. La visualización de las estructuras se
llevó a cabo por el paquete de programa de Visual Molecular Dinámica (VMD) ( Humphrey et al., 1996 ).
Por último, la evaluación de la calidad de las estructuras obtenidas mediante el modelado de
homología se realizó por el programa PROCHECK ( Laskowski et al., 1993 ).
Procedimiento para obtener modelos 3D
Figura 1 muestra la relación entre los diferentes métodos de modelado utilizados. La
complejidad de los aumentos themethods fromthe esquina superior izquierda a la esquina inferior
derecha y las flechas apuntan hacia las mejoras esperadas de la calidad del modelo. Los detalles de
catalasas: A
con cada plantilla:
1. modelo más simple obtenida utilizando sólo los átomos de la proteína de la plantilla ( Tabla 3 , Los
apéndices 2 - 4: monómero, única cadena).
2. Mejora modelo usando la molécula de hemo como una restricción (signi fi-
la mejora de los modelos de peralte; Tabla 3 , Los apéndices 2 - 4: monómero, la cadena única +
dobladillo).
3. La mejora adicional mediante la aplicación del módulo de modelado de bucle ( Tabla 3 , Los
apéndices 2 - 4: monómero, la cadena única + dobladillo + modelado circular).
B: Modelización de los tetrámeros con cada plantilla:
1. Modelo de tetrámeros obtenida utilizando sólo los átomos de la proteína de plantillas individuales ( Tabla
3 , Los apéndices 2 - 4: tetrámero, única cadena).
2. Los modelos mejorado usando la molécula de hemo como una restricción (mejora significativa de
los modelos; Tabla 3 , Los apéndices 2 - 4: tetrámero, de cadena única + dobladillo).
3. La mejora adicional mediante la aplicación del módulo de modelado de bucle ( Tabla 3 , Los
apéndices 2 - 4: tetrámero, cadena dobladillo solamente + + modelado circular).
C: El mismo que en B con restricción de simetría adicional para forzar
las cuatro cadenas sean idénticos ( Tabla 3 , Los apéndices 2 - 4: tetrámero + simetría + cadena
única; tetrámero + simetría + cadena única + dobladillo;
tetrámero + simetría + cadena única + dobladillo + bucle
modelado) ( Fig. 6 ).
PCR en tiempo real cuantitativa de análisis (qPCR)
nivel de transcripción de los genes examinados se analizó usando el método de qPCR.
muestras de ARN total fueron puri fi frommycelia ed cultivan
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UN) monómero SEGUNDO) tetrámero DO) tetrámero con

simetría

1. cadena cadena cadena

2. cadena + dobladillo cadena + dobladillo cadena + dobladillo

3. bucle dobladillo + cadena + bucle dobladillo + cadena + bucle dobladillo + cadena +

Figura 1. Las estrategias de modelado utilizadas en la modelación de homología.

en medio YEG con el kit de ARN EZNA Total II (Omega Bio-Tek) según las recomendaciones del
proveedor. En las reacciones de transcripción inversa, el kit RevertAidTMHMinus M-MuLV la
transcriptasa inversa (Fermentas) usando hexámeros aleatorios y oligo (dT) se aplicó 18 cebadores.
qPCR experimentos se realizaron en iQ5 y sistemas de detección de PCR CFX96 en tiempo real
(Bio-Rad) utilizando el IQMR SYBR Green Supermix (Bio-Rad). el ampli fi condiciones de cationes
eran como sigue: una etapa de desnaturalización inicial de 3 min a 95 ° C fue seguido por 39 ciclos
de 15-s de desnaturalización (95 ° C) y 30-s de recocido (60 ° C) y 15-s de extensión (72 ° DO).
Secuencias de cebadores directos y cebadores inversos fueron como sigue:
qcat1F (5 '- acc ctg ata ctc acc gtc atc gtc-3 ') y qcat1R (5 '- cgc tga tga tta gag aca cgg cac-3 '); qcat2F (5 '-
cct gat gga acc tca TCC CGC t-3 ') y qcat2R (5 '- gca acg gcc tta cca gag aca g-3 '); qcat3F (5 '- ctt ttg ttc
gct TCT CTA CCG TCC-3 ') y qcat3R (5 '- ggc atc cag atc cca gtt tcc-3 '); qcat4F (5 '- aca agc ctg aac ctg
ttt ctc cca-3 ') y qcat4R (5 '- agc ttc ttg cca tgt ttg cct ctc-3 '); qRO3G_12558actinF (5 '- gcc att caa gct gtc
ctt tcc-3 ') y qRO3G_12558actinR (5 '- cca TCA cca gag tca aga acg a-3 '). Los datos se normalizaron
usando un (número locus del gen: RO3G_12558) actina-2 de referencia. La cuantificación relativa fi catión
de la expresión génica se calculó utilizando la 2 - ΔΔ Connecticut método ( Livak y Schmittgen, 2001 ).

Figura 2. El árbol filogenético basado en el análisis de Bayes de las secuencias de aminoácidos. El árbol de consenso gobierno de la mayoría del 50% obtenido por análisis de Bayes.
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tabla 1
La información estructural de los cuatro catalasas.

Proteína CAT1 CAT2 CAT3 CAT4

peso molecular calculado (kDa) 54.564 80.130 81.232 79.658

Longitud (residuos) 484 710 718 710
péptido de señal - - 1 - 20 aa -
Posible microcuerpo C-terminal de la señal de orientación 482 - 484 aa - - -
El sitio distal del grupo prostético hemo H54, S93, V95, N127, F132 H72, S111, V113, N145, F150 H90, S129, V131, N-, F- H72, S111, V113, N145, F150
El sitio proximal del grupo prostético hemo Y337, R344 Y359, R366 Y366, R373 Y359, R366
El sitio distal del grupo NADPH H173, R182, H214, H284 H195, R204, H236, H-, H202, R211, H343, H- H195, R204, H236, H-
El sitio proximal del grupo NADPH L421, L-, E- L-, L449, E- L-, L457, E- L-, L449, E-
dominio de tetramerización 1 - 50 aa 1 - 68 aa 21 - 86 aa 1 - 68 aa
clado 3 2 2 2

Fig. 3. Alineación de secuencias múltiples de catalasas típicos y los cuatro R. oryzae catalasas en las áreas de la cara distal y proximal de hemo y NADPH. Los residuos funcionalmente importantes se encuentran en las cajas negras. 118
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Fig. 3 ( continuado).
resultados
La investigación de las relaciones filogenéticas de los genes de catalasa de R. oryzae
Numerosos genes que codifican catalasa enzymeswere identi fi ed, clonado y caracterizado a
partir de diferentes organismos incluyendo varios levadura y patógeno humano fi hongos
filamentosas. Todo el genoma de R. oryzae
fue publicado recientemente ( Rhizopus oryzae Proyecto de Secuenciación del Instituto Broad de
Harvard y el MIT, 2004 , http://www.broadinstitute.org/ anotación / genoma / rhizopus_oryzae /
MultiHome.html ) Y cuatro secuencias de la proteína se encontró que eran homólogos a
monofuncionales catalasas denotados aquí como CAT1, CAT2, CAT3 y CAT4 (RO3G_9804.3 gen
loci correspondientes, RO3G_09026.3, RO3G_09027.3 y RO3G_16995.3, se hace referencia como
CAT1, CAT2, CAT3 y cat4, respectivamente).
Las secuencias de aminoácidos de la catalasas hipotéticas CAT1, CAT2, CAT3 y CAT4 se
sometieron a un análisis filogenético contra la familia catalasa monofuncional fúngica contiene hemo.
Estas catalasas son miembros de clados 2 y 3 de acuerdo con la clasificación fi cación de catalasas
por Klotz et al. (1997) , Klotz y Loewen (2003) ) Y cubrir las enzimas de hongos. De acuerdo con esto,
el análisis filogenético involucrado las secuencias de proteínas de las catalasas de hongos
monofuncionales de la NCBI GenBank y las bases de datos del genoma de M. circinelloides y P.
blakesleeanus. Una de catalasa seligeri Listeria perteneciente a clado 1 se usó como un grupo afuera.
El árbol de consenso resultante se presenta en Figura 2 . La comparación con los árboles filogenéticos
( Klotz et al., 1997; Klotz y Loewen, 2003 ) Muestran que la catalasas hipotéticas de R. oryzae como
era de esperar se encuentra en
119
clados 2 y 3 de catalasas. CAT1 se posiciona en clade 3 y porque este clado implica las enzimas
peroxisomales fúngicas cerca de CAT1 en el árbol ( Mucor circinelloides, blakesleeanus Phycomyces,
Aspergillus fumigatus)
se puede sugerir que CAT1 es una catalasa peroxisomal. CAT2, CAT3 y CAT4 son miembros de la
clade-subunidad grande 2 catalasas en el árbol filogenético (monómeros que van from79 to80 kDa).
CAT2andCAT4 formó un grupo hermano que sugiere que son resultados de un reciente evento de
duplicación de genes.
El análisis de secuencia de las proteínas de catalasa
De acuerdo con su masa molecular (54,5 monómeros kDa) y la localización en el árbol
filogenético, CAT1 es un miembro de las catalasas subunidad pequeña en clade 3. Además, contiene
una secuencia de tripéptido SLA en el extremo C-terminal ( tabla 1 ), Que es característica para la
señal de peroxisomal focalización 1 (PTS1) para la clasificación de las proteínas para el peroxisoma ( Gould
et al., 1988 ). Esto está en un acuerdo con el hecho de que muchas de las pequeñas subunidad
catalasas contienen la señal PTS1 ( Klotz et al., 1997; Klotz y Loewen, 2003 ). Ya que se espera una
común, ca. 70 residuo largo brazo de enhebrado N-terminal se puede encontrar en las cuatro
proteínas ( Liu y Eisenberg, 2002; Putnam et al., 2000 ). Este fragmento termina con un motivo ERIPE
hacia el C-terminal, excepto CAT4 que tiene una GTIPE fragmento. Sólo CAT3 contiene un largo
fragmento de 20 residuos en el extremo N-terminal ( tabla 1 ) Que puede tener un posible papel
extracelular indicado por el programas ProtParam ( Gasteiger et al., 2005 ) Y SignalP ( Bendtsen et al.,
2004 ), Aunque no se especi fi ed. Un ex múltiple
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Tabla 2
Fuente de las catalasas usados ​en la alineación de secuencias múltiples.

Abreviatura Organismo especí fi catión # de Acceso

Bacsu Bacillus subtilis NCBI ID: P26901

Br-peroxa Streptomyces violaceus NCBI ID: P33569
Haein Haemophilus Florida uenzae NCBI ID: P44390
Promi Proteus mirabilis NCBI ID: P42321
Bovin Bos taurus Bovina, hígado NCBI ID: P00432
Aspng Aspergillus niger NCBI ID: P55303
EcoHPII Escherichia coli HPII NCBI ID: P21179
Penja Penicillium janthinellum NCBI ID: P81138
Arath Arabidopsis thaliana NCBI ID: P25819
Sacce_t Saccharomyces cerevisiae T catalasa NCBI ID: P06115
Sacce_a Saccharomyces cerevisiae Una catalasa NCBI ID: P15202
Rorycat1 Rhizopus oryzae CAT1 (catalasa) RO3G_09804.3
Rorycat2 Rhizopus oryzae CAT2 (proteína hipotética) RO3G_09026.3
Rorycat3 Rhizopus oryzae CAT3 (proteína hipotética) RO3G_09027.3
Rorycat4 Rhizopus oryzae CAT4 (proteína hipotética) RO3G_16995.3

alineación de secuencias reveló conserva motivos estructurales en catalasas para coordinar las selección de la plantilla de la base de datos

moléculas hemo y NADPH ( Zamocky y Koller, 1999 ). Basándose en estos resultados se realizó un
alineamiento múltiple de secuencias incluyendo las catalasas de R. oryzae y los de ( Zamocky y
Koller, 1999 ). La presencia o ausencia de los residuos conservados en los lados proximal y distal de
ambos hemo y NADPH se muestra en la Fig. 3
y en Tabla 2 . Los residuos conservados en el lado proximal del anillo de hemo se encontraron en los
cuatro catalasas mientras que un fragmento largo 11 residuo se carece de CAT3 que implica la
posible Asn esencial y Phe en el lado distal. En cuanto a los sitios de unión NADPH, múltiples
aminoácidos faltan en el lado distal y ninguno se pueden encontrar en el lado proximal en las cuatro
proteínas.
Las cuatro secuencias de catalasa supuestos de R. oryzae fueron alineados contra las
secuencias de proteínas en el Protein Data Bank repositorio usando el servidor web del NCBI.
Usando el algoritmo PSI-BLAST con los parámetros de la matriz de sustitución y por defecto
BLOSUM62 43 candidatos fueron recuperados con puntuaciones aceptables. Fuera de estos,
excepto un representante, una serie de mutantes de un solo aminoácido de Escherichia coli
fue abandonado porque el uso de todos ellos no daría lugar a nuevas mejoras en el modelado. Se
utilizó el conjunto resultante de 28 catalasas de especies diferentes para el modelado.
Clasificación de las plantillas mediante el alineamiento estructural

modelado de homología
Las estructuras representativas obtenidos por los diferentes modelado reunieron hods se
muestran para CAT1 como objetivo y la plantilla de la catalasa desde Bos taurus ( AP código 3RGP)
que fue mejor anotó por el PSI-BLAST búsqueda de CAT1. El mismo algorithmswere aplicado para
las otras diana y de la plantilla proteínas también. CAT1 se utilizó para desarrollar la metodología de
modelado porque es el uno corto de los cuatro objetivos ( tabla 1 ) Andmost de las proteínas plantilla
selectedhave un lengthmaking similares themodeling más fácil. Además, este catalasa resultó ser la
Este procedurewas destinados a elegir themost plantillas adecuadas para ser utilizadas en el fi De
cadena nalmulti-Multitemplate homologymodeling de los homotetrámeros. modelos de homología de
la cadena monomérica de la diana se construyeron con cada plantilla y las plantillas eran
estructuralmente alignedwith los correspondingmodels. Los SO valores calculados expresan howwell
el objetivo puede bemodeledwith las diferentes plantillas andwill ser utilizado para clasificar tanto los
modelos y la idoneidad de las plantillas para el modelado de la diana.
La comparación de las diferentes estrategias de modelado

más activa en todas las etapas del ciclo de vida de R. oryzae En experimentos preliminares se Homología de modelado cuando se utiliza sólo las cadenas de proteínas de las plantillas dio
muestran en la qPCR Fig. 4 . como resultado en muchos modelos de baja calidad de acuerdo con el así valores ( Tabla 3 , Los
apéndices 2 - 4). La participación de los anillos hemo, como restricciones físicamente bien
establecidos, dio lugar a un gran

Fig. 4. Niveles relativos de expresión de los cuatro genes de catalasa obtenidos por qPCR.
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Tabla 3
solapamiento estructural por ciento entre los modelos de homología y las plantillas.

AP ID Longitud monómero tetrámero Tetrámero + simetría

(aa)
única + Dobladillo + bucle única + Dobladillo + bucle única + Dobladillo + bucle

cadena modelado cadena modelado cadena modelado

Bos taurus ( ganado) Purwar et al. (2011) . 1 3RGP 499 91.73 98.34 98.96 98.96 98.96 98.96 98.96 98.96 98.96
_UN

Bos taurus ( ganado) Fita y Rossmann (1985) . 2 7CAT 506 90.49 98.14 98.76 98.44 98,76 98,76 98.76 98,76 98,76
_UN

Bos taurus ( ganado) Foroughi et al. (2011) . 3 3NWL 527 92.56 97.75 98.96 98.96 98.96 98.96 98.96 98.96 98.96
_UN

eritrocitos humanos Putnam et al. (2000) . 4 1DGH 498 93.38 98.55 98.76 98.655 98,65 98.655 98.65 98.65 98.65
_UN

eritrocitos humanos Putnam et al. (2000) . 5 1DGG 497 93.38 98,76 98,76 98.76 98,76 98,76 98.76 98,76 98,76
_UN

eritrocitos humanos Ko et al. (2000) . 6 1QQW 527 91.73 98.76 98.96 99.01 99.01 99.01 99.01 99.01 99.01
_UN

eritrocitos humanos Putnam et al. (2000) . 7 1DGH 498 93.38 98.55 98.76 98.65 98.65 98.65 98.65 98.65 98.65
_SEGUNDO

Enterococcus. faecalis Frankenberg et al. 8 1SI8 484 94.93 99,78 99,78 99.78 99,78 99,78 99.78 99,78 99,78
(2002) . _UN

Pichia angusta Penya-Soler et al. 9 2XQ1 509 92.56 96.69 98.14 98.24 98.08 98.038 98.29 91.21 93.43
(2011) . _UN

Helicobacter pylori Loewen et al. (2004) . 10 1QWL 505 91.73 95.24 99.79 99.79 99,79 99,79 99.79 99,79 99,79
_UN

Helicobacter pylori Loewen et al. (2004) 11 2A9E 505 91.11 93.59 98.96 98.96 98.96 98.96 98.96 98.96 98.96
_UN

Proteus mirabilis Andreoletti et al. (2003) . 12 1H6N 484 91.78 100 100 100 100 100 100 100 100
_UN

Proteus mirabilis Andreoletti et al. (2003) . 13 1m85 484 92.42 100 100 100 100 100 100 100 100
_UN

Vibrio salmonicida Riise et al. (2007) . 14 2ISA 483 91.47 99.16 99.58 99.58 99.58 99.58 99.58 99.58 99.58
_UN

Proteus mirabilis Andreoletti et al. (2003) . 15 1E93 484 92.42 100 100 100 100 100 100 100 100
_UN

Proteus mirabilis Andreoletti et al. (2009) . dieciséis 3HB6 484 92.64 99.15 100 100 100 100 100 100 100
_UN

Proteus mirabilis Andreoletti et al. (2001) . 17 1H7K 483 92.21 99.15 99.78 99.78 99,78 99,78 99.78 99,78 99,78
_UN

Saccharomyces Mâţea et al. (1999b) . 18 1A4E 488 97.72 97,52 98,76 98.76 98.65 98.76 98.70 98,76 98,76
cerevisiae _UN

oxidotolerans Hara et al. (2007) . 19 2J2M 491 91.66 99,37 99,79 99.79 99,79 99,79 99.79 99,79 99,79
Exiguobacterium _UN

Pseudomonas syringae Carpena et al. (2003) . 20 1M7S 484 91.94 97.1 98.14 97.925 97.925 97,92 98.03 98.08 97.92
_UN

Micrococcus luteus Murshudov et al. (2002) . 21 1GWh 503 91.11 96.9 99.17 99.38 99,38 99,23 99.38 99.38 99.17
_UN

Micrococcus luteus Murshudov et al. (1992) . 22 1HBZ 498 90.9 94.42 99.17 99,32 99,32 99,17 99.38 99.38 99.17
_UN

Micrococcus luteus Murshudov et al. (2002) . 23 1GWF 503 89.25 90.7 98.14 98.34 98,34 98,445 98.34 98.34 98.39
_UN

Escherichia coli K-12 Jha et al. (2011) . 24 3P9S 753 - - - - - - - - -

_UN

Escherichia coli K-12 Jha et al. (2011) . 25 3P9R 754 - - - - - - - - -

_UN

Escherichia coli Mâţea et al. (1999a) . 26 1QF7 753 - - - - - - - - -

_UN

Escherichia coli K-12 Jha et al. (2011) . 27 3P9P 753 - - - - - - - - -

_UN

Escherichia coli Bravo et al. (1995) . 28 1IPH 753 75.61 75.58 84.25 75.56 80.625 86,36 77.99 78.81 86.62
_UN

Escherichia coli Mâţea et al. (1999a) . 29 1CF9 753 - - - - - - - - -

_UN

Escherichia coli Chelikani et al. (2003) . 30 1P81 753 - - - - - - - - -

_UN

Escherichia coli Chelikani et al. (2003) . 31 1QWS 753 - - - - - - - - -

_UN

Escherichia coli Melik-Adamyan et al. (2001) . 32 1GGK 753 - - - - - - - - -

_UN

Escherichia coli Chelikani et al. (2003) . 33 1P7Z 753 - - - - - - - - -

_UN

Escherichia coli Chelikani et al. (2003) . 34 1P80 753 - - - - - - - - -

_UN

Escherichia coli Melik-Adamyan et al. (2001) . 35 1GG9 753 - - - - - - - - -

_UN

Escherichia coli Melik-Adamyan et al. (2001) . 36 1GGJ 753 - - - - - - - - -

_UN

(Continúa en la siguiente página)

122 B. Linka et al. / Life Sciences 91 (2012) 115 - 126

Tabla 3 ( continuado)

AP ID Longitud monómero tetrámero Tetrámero + simetría

(aa)
única + Dobladillo + bucle única + Dobladillo + bucle única + Dobladillo + bucle

cadena modelado cadena modelado cadena modelado

Escherichia coli Chelikani et al. (2003) . 37 1P7Y 753 - - - - - - - - -

_UN

Escherichia coli K-12 Jha et al. (2011) . 38 3P9Q 753 - - - - - - - - -

_UN

Escherichia coli Melik-Adamyan et al. (2001) . 39 1GGH 753 - - - - - - - - -

_UN

Neurospora crassa Díaz et al. (2009) . 40 3EJ6 688 81.61 83.88 93.38 88.38 89,92 93,5 89.87 89.66 94.26
_UN

Neurospora crassa Díaz et al. (2004) . 41 1SY7 715 84.5 88.84 94 87.80 89.87 92.198 88.16 89.46 92.76
_UN

Penicillium Borovik et al. (2011) . 42 2XF2 688 80.78 79.13 93.38 91.11 91.11 93.69 91,67 91,67 94,26
janthinellum _UN

Vitale Penicillium Alfonso-Praetor et al. (2007) . 43 2IUF 688 77.89 77.89 92.97 90.38 90.38 93.12 90.07 90.07 94.15
_UN

Plantillas usadas para su posterior modelado homotetrámero de CAT1 están en negrita. La calidad de los modelos de homología clasifica en una
0 - 100 escala por el “ iterative_structural_align ” módulo.
AP: código de la proteína en la base de datos de estructura de proteínas.

monómero: única cadena: modelo de monómero sin hemo, + dobladillo: modelo de monómero en presencia de hemo, + modelado de bucle: modelo de monómero con el modelado de bucle en presencia de hemo.

tetrámero: única cadena: modelo tetrámero sin hemo, + dobladillo: modelo tetrámero en presencia de hemo; + modelado de bucle: modelo tetrámero con el modelado de bucle en presencia de hemo.

Tetrámero + simetría: única cadena: modelo tetrámero con restricción de simetría y sin hemo, + dobladillo: modelo tetrámero con restricción de simetría en la presencia de hemo;
+ modelado de bucle: modelo tetrámero con restricción de simetría y el modelado de bucle en presencia de hemo.

la mejora de los modelos. Es importante tener en cuenta que la presencia de hemo no sólo mejoró la orden de las plantillas no cambia más. La calidad de los modelos obtenidos por los diferentes
alineación estructural entre el modelo y su plantilla sino que también cambió el orden de rango entre métodos de modelado se caracteriza por los valores de SO y se resume en Tabla 3 . La evolución de
las plantillas para la especi fi objetivo c. Los modelos se han mejorado aún más mediante la la calidad del modelo correspondiente a las estrategias de modelado se muestra en la Fig. 5 A. La
realización de modelado bucle también, aunque el rango estructura obtenida utilizando sólo la proteína

Fig. 5. A: modelo de homología de CAT1 sin hemo (plantilla está en rojo); B: modelo de homología de CAT1 con heteroátomos (hemo) (plantilla está en rojo); C: modelo de homología por el modelado de bucle en presencia de hemo (plantilla
está en rojo); modelo de homología de CAT1 usando 1IPH plantilla, un residuo 200 ya la catalasa de: D E. coli.
 B. Linka et al. / Life Sciences 91 (2012) 115 - 126 123

Tabla 4 plantillas 1m85 y 3HB6 ( Proteus mirabilis) con un valor de 100. El orden de las plantillas por la
Las plantillas seleccionadas por BLAST y por alineación estructural.
búsqueda BLAST y la alineación estructural sólo era idéntico para CAT3. Dado que el objetivo del

R. oryzae Longitud BLAST Resultado Longitud AP-ID Selección por alineación Longitud estudio es la obtención de las estructuras 3D de las catalasas de R. oryzae, el modelado de
(aa) estructural
(Automóvil club británico) (aa) homología de los homotetrámeros se realizó con las plantillas clasificados más alto por la alineación
proteína
organismos AP-ID estructural preliminar de los modelos de homología utilizando los monómeros. Fig. 5 D muestra el
modelo de homología de CAT1 basado en 1IPH, un 200 residuo plantilla más largo ( E. coli). Aunque
CAT1 484 Bos taurus 3RGP 499 Helicobacter 1QWL 505
pylori
los dominios altamente conservados son fi TTED bastante bien, el uso de proteínas con una cadena

Proteus 1H6N 484 tal ya resultó en modelos con una precisión disminuido.
mirabilis
CAT2 710 Escherichia 3P9S 753 Neurospora 3EJ6 688
coli K-12 crassa
Para obtener la forma de homotetrámero funcional de las catalasas las cuatro cadenas deben
Penicillium 2XF2 688
janthinellum ser modelados juntos. Modelando el homotetrámero de CAT1 por el uso de una única plantilla
CAT3 718 Penicillium 2XF2 688 Vitale 2IUF 688 (3RGP) sin la asunción de cadenas idénticas resultó en ligeramente diferente geometría de las
janthinellum Penicillium cadenas como se ve en Fig. 6 A. La aplicación de la restricción de simetría (uniformidad de las
Penicillium 2XF2 688
cadenas) resultó en una estructura ordenada ligeramente mejor ( Fig. 6 SEGUNDO). En ambos casos,
janthinellum
las moléculas heme se incluyeron en todas las unidades de monómero y se aplicó el algoritmo de
CAT4 710 Escherichia 3P9S 753 Neurospora 3EJ6 688
coli K-12 crassa modelado bucle. Los modelos homotetrámero obtenidos con el valor de SO más alto, con y sin la
Micrococcus 1GWF 503 restricción de simetría se muestran en la Higos. 6 D y C, respectivamente. Como era de esperar, la
luteus
aplicación simetría con el modelado de bucle y la presencia de hemo resultaron en un modelo mejor.

cadena de la plantilla tiene grandes fragmentos que no se solapan con la plantilla. Sin embargo, en
presencia de hemo incluso más lejos, las partes exteriores de la cadena de proteína alineados
mucho mejor con la plantilla ( Fig. 5 SEGUNDO). Usando el algoritmo de modelado de bucle en
presencia de hemo resultó en una mejora adicional en la alineación estructural ( Fig. 5 DO). Los
modelos están disponibles bajo petición. De acuerdo con esta medida es decir, los valores de SO de
alineación estructural, el modelado de homología resultó en un orden de rango diferente de las
plantillas para CAT1, CAT2 y CAT4 en comparación con la obtenida por la búsqueda PSI-BLAST
similitud de secuencia ( Tabla 4 ). Por ejemplo, el 3RGP plantilla ( Bos taurus) era el más marcado por
BLAST para CAT1 tiempo, después de loopmodeling, la homologymodel se le dio un valor de 97.33,
por detrás
Los modelos de homología de la otra R. oryzae catalasas, CAT2, CAT3 y CAT4 obtenida por las
mismas estrategias fueron generalmente clasificados por menores lo que los valores en comparación
con los de CAT1. modelado bucle adicional generalmente resultó en modelos más débiles donde las
plantillas eran más cortos. Esto es posiblemente la consecuencia de la 200 - 220 residuo de cadenas
más cortas de las plantillas debido a lo cual se modelaron largas cadenas de la diana sin los
correspondientes fragmentos de la plantilla. Inesperadamente, los modelos tetrámero sin hemo
obtuvieron más alto para los valores que los modelos de monómero. La presencia de hemo y la
restricción de simetría, sin embargo, mejoró la calidad de los modelos de forma similar al caso de
CAT1. Sólo tres plantillas (3EJ6, 1HBZ,

Fig. 6. A: modelo de homología de tetrámero CAT1 usando 3RGP plantilla sin restricción de simetría; B: modelo de homología de tetrámero CAT1 usando 3RGP plantilla con restricción de simetría; C: modelo de homología de tetrámero CAT1
usando 9 plantillas sin restricción de simetría; D: modelo de homología de tetrámero CAT1 usando 9 plantillas en presencia de hemo con restricción de simetría y el modelado de bucle.
124 B. Linka et al. / Life Sciences 91 (2012) 115 - 126

1GWF) dio como resultado mejoras análogas de los modelos que utilizan las diferentes estrategias
de modelado tal como se obtiene para los modelos de CAT1. Se puede explicarse con la longitud
similar de los objetivos y las plantillas: las longitudes de CAT2, CAT3 y CAT4 son entre 710 y 718
mientras que la mayoría de las plantillas están en el rango de 477 a 503, esperar 3EJ6, 1HBZ y
1GWF para tener una longitud entre 689 y 736. En el opuesto CAT1 caso modelado, donde estaba la
proteína fi tted con plantillas más largas, una incompatibilidad similar que no se ha experimentado.
y cuatro residuos hidrófobos de todo el borde paralelo del anillo de hemo (Asn, Phe, Phe andMet).
CAT1have una disposición equivalente de los residuos de que la encontrada en 3RGP ( Higos. 7 B y
A, respectivamente). CAT2 y CAT4 tienen una Leu en lugar de Met ( Higos. 7 C y E, respectivamente).
En CAT3 la Asn y cuanto más cerca Phe están ausentes debido a la falta de largo fragmento de 11
residuos de estar presente en otros catalasas y hay un Asp en lugar de Met ( Fig. 7 RE). La distancia
entre el ε - N átomo del distal Su y el átomo de Fe de hemo se reprodujo en las mejores ratedmodels
en

Las partes más importantes de los archivos 3D son los centros activos, es decir, el entorno Fig. 7 con error aceptable. Los valores obtenidos en angstroms para CAT1, CAT2, CAT3, CAT4 y las
inmediato de la molécula de hemo que se muestra en plantillas correspondientes, 3EJ6, 1m85, 2IUF, 3EJ6 fueron 4,77, 4,92, 4,87, 4,67 y 4,83, 4,79, 4,40,
Fig. 7 . Estos aminoácidos son thedistal Su y theproximal Tyr coordinar el ión Fe, un intercalante Arg 4,79, respectivamente. Esta distancia en 3RGP es 4,66 Å.
entre los grupos carboxilo del hemo

Fig. 7. El centro activo de las catalasas. UN: B. taurus ( PDB ID: 3RGP), B: R. oryzae CAT1, C: R. oryzae CAT2, D: R. oryzae CAT3, E: R. oryzae CAT4.
 B. Linka et al. / Life Sciences 91 (2012) 115 - 126
PCR en tiempo real cuantitativa de análisis (qPCR)
La expresión de los cuatro genes de catalasa de R. oryzae se investigó en diferentes ciclos de
vida. El gen de la actina se utilizó como internas niveles estándar y de expresión de los cuatro genes
de catalasa en un momento en el cultivo de 4 h se utilizaron como controles biológicos. Las muestras
de ARN se extrajeron a los 4 y 7 h después de la inoculación cuando sporangiospores comenzaron a
germinar y hifas comenzaron a crecer, respectivamente. Más muestras fueron tomadas en 1, 2 y 3
días de vida. Cat1 fue la más alta gen actividad en todas las muestras. A las 7 h CAT2 fue inducida y
en las muestras posteriores también se observó la expresión de cat4. El nivel más alto de
transcripción se observó para los tres genes en los 3 días de tiempo de vida. La actividad de
transcripción de cat1 fue de aproximadamente 2.5 y
3,5 veces mayor que la de CAT2 y cat4, respectivamente. El gen cat3 no mostró una significación fi nivel
de expresión no puede en ningún ciclo de vida investigados ( Fig. 4 ).
Discusión
Las 28 estructuras experimentales catalasa se obtuvieron mediante un PSI-BLAST búsqueda de
la base de datos NCBI y se utilizan para el modelado de homología de las catalasas de R. oryzae y
desarrollar un ef fi metodología de modelado ciente también. Las proteínas diana se modelaron con
diferentes métodos de modelado que implican el modelado de bucle y limitaciones estructuralmente
importantes, como el heme cofactor, la simetría de las cadenas. En lugar de la comparación visual de
la calidad de los modelos se midió por el porcentaje superposición de valores estructurales. En el
caso de monómeros presencia de hemo causó una gran mejora en la calidad de los modelos y una
re mayor fi nement fue observado por modelado bucle si la plantilla tenía una cadena igual o más
proteínas. Si las plantillas eran más cortos que el objetivo es decir, una gran subunidad catalasa fue
modelada con una pequeña subunidad uno, la calidad de los modelos eran obviamente peor y el
modelado de bucle se redujo aún más la calidad del modelo. los Florida fragmentos Anking sin las
partes correspondientes de la plantilla no se modelaron correctamente, aunque la parte de la
subunidad pequeña altamente conservada se modeló bastante bien. En el último caso, sin embargo,
se observó una mejora inesperada cuando se modelaron los tetrámeros, en presencia de todas las
opciones de cuatro cadenas de proteínas, hemo y la simetría. Esto implica la suposición de que las
múltiples cadenas de proteínas en el modelado tetrámero pueden considerarse restricciones
adicionales para ayudar al empaquetamiento de las cadenas mutuamente y se espera mejorar la
calidad del modelo en especial junto con la restricción de simetría. De acuerdo con la suposición
anterior el mejor algoritmo de modelado implica múltiples cadenas (tetrámero), cofactor (heme),
opción simetría y el modelado de bucle y la calidad de los modelos obtenidos de esta manera fue
evaluado por el así valores.
El alineamiento estructural de proteínas de diferentes especies es una herramienta cada vez
más importante en la biología estructural para establecer relaciones evolutivas y / o funcionales ( Wilson
et al., 2009; Madhusudhan et al., 2009 ). Nuestra estrategia de modelado de homología se asemeja a
este procedimiento en el que las catalasas de R. oryzae se modelaron usando una serie de plantillas
y luego el mejor modelo fue seleccionado por la medida cuantitativa de la alineación estructural del
par de cada modelo con la plantilla correspondiente. Suponiendo que la adecuación de la plantilla
para modelar la proteína puede ser dependiente de la distancia evolutiva entre ellos, el mejor modelo
de homología puede ser construido por la plantilla más relacionados. En otras palabras, las
relaciones evolutivas también pueden ser acordada entre las proteínas modeladas y las plantillas
utilizando el SO valores similares al caso de la alineación estructural de estructuras experimentales.
CAT1 de R. oryzae
es el miembro de clado 3 en el árbol filogenético de las catalasas de hongos y es una posible
catalasa peroxisomal. Los genes CAT2, CAT3 y CAT4 pertenecen al clado 2 y que están cerca unos
de otros dentro del árbol.
Usando al SO valores por encima de 99%, la clasificación fi cación de las proteínas
correspondientes por la alineación estructural de la homología
125
modelos con las plantillas condujeron a resultados similares ( Tabla 4 ). Las estructuras 3D obtenidos
para CAT1 muestran la mayor similitud a las catalasas bacterianas pequeña subunidad. CAT2, CAT3
y CAT4 mostró mayor similitud a las catalasas de hongos a gran subunidades. Además, CAT2 y
CAT4 mostraron una disminución de algo similitud con las catalasas bacterianas pequeña subunidad
contrarias a CAT3 que está de acuerdo con el hecho de que CAT2 y CAT4 se observan en los
brazos hermanas del árbol filogenético separado de CAT3 indicando su origen común. CAT3
pertenece a las catalasas grandes subunidad con un valor de SO de 97% en relación con catalasas
de dos especies de Penicillium y una Neurospora. La alta similitud de la R. oryzae catalasas a los
bacterianas está en armonía con la proposición de Klotz et al. ( Klotz et al., 1997; Klotz y Loewen,
2003 ) Suponiendo una transferencia lateral de genes de procariotas a eucariotas, basado en un
análisis filogenético de las catalasas de procariotas y eucariotas. Esto también es apoyado por el
resultado de la PSI-BLAST búsqueda que encontró CAT1 más similares a las catalasas de los livings
de orden superior. El orden de rango diferente de las plantillas obtenidas por el modelado de
homología puede ser la consecuencia del hecho de que las estructuras de las proteínas son por lo
general más conservadas de las secuencias de aminoácidos que es necesario para preservar la
funcionalidad. Vale la pena señalar, sin embargo, que CAT2 y CAT4 mostraron mayor similitud con
las pequeñas subunidad catalasas bacterianas que a los grandes los hongos en un método de
modelado tetrámero sin simetría, mientras que CAT3 todavía se parecía a las catalasas
fúngicas-subunidad grande como puede verse en Apéndices 2 - 4. (Sin la opción simetría los modelos
basados ​en plantillas cortos y más largos fueron comparables debido a la evitación de la desventaja
de modelado bucle observado para el / los casos objetivo a largo corto plantilla.)
Para investigar los centros activos de los cuatro R. oryzae catalasas, se seleccionaron aquellos
modelos que poseía los más altos SO valores. El núcleo de los monómeros, es decir, el centro activo
muestra una disposición de 3D típico, extremadamente bien conservada de los aminoácidos que es
apoyado por el hecho de que el valor de SO de los modelos de CAT2, CAT3 y CAT4 estaban cerca
de 100%, incluso cuando las plantillas eran más de 200 residuos más corto (Apéndices 2 - 4). Las
variaciones en los aminoácidos conservados del centro activo pueden estar relacionados con los
resultados de experimentos de qPCR de los genes de catalasa de R. oryzae
donde estaba cat3 la menos un activo ( Fig. 4 ). En comparación con la catalasa de B. taurus ( PDB
código 3RGP) CAT1 tiene aminoácidos idénticos, en CAT2 y CAT4 sólo hay una mutación Met-Leu
mientras CAT3 carece de dos aminoácidos, además de la mutación Met-Asp. NADPH se sabe que
tiene un efecto protector prevención de la degradación oxidativa de las catalasas y además lo
esencial suyo, un Met cerca del centro activo también juega un papel importante en el mantenimiento
de la funcionalidad catalasa ( Andreoletti et al., 2009 ). Según nuestros resultados ninguno de los
cuatro
R. oryzae catalasas se supone que obligar a la NADPH incluyendo CAT1, aunque es una pequeña
subunidad de la catalasa. Sólo CAT1 tiene un Met en el centro activo, CAT2 y CAT4, las otras dos
enzimas activas no. La falta del cofactor NADPH protectora y Met en dos de los tres catalasas
activos puede ofrecer objetivos en un futuro diseño de fármacos.
Conclusión
La calidad de los modelos de homología se han mejorado en gran medida mediante la
aplicación de restricciones para las cadenas de proteínas, tales como cofactores, múltiples cadenas,
simetría para obtener cadenas idénticas y por modelado de bucle adicional. La superposición
estructural máxima entre el modelo y la plantilla se observó con las plantillas filogenéticamente más
cercanos. De acuerdo con esto, los modelos más precisos se pueden construir con plantillas
seleccionadas por relaciones filogenéticas que por un PSI-BLAST búsqueda. Las relaciones
filogenéticas toman en vigor cuando todas las restricciones posibles se aplicaron en el algoritmo de
modelado. Sin embargo, no sólo el modelo de máxima precisión se puede lograr de esta manera,
pero los modelos resultantes pueden volver a sus parientes filogenéticos más cercanos también. En
consecuencia, se obtuvieron modelos precisos para la R. oryzae catalasas que representan el centro
catalítico altamente conservado excepto
126 B. Linka et al. / Life Sciences 91 (2012) 115 - 126
CAT3 que tiene un fragmento que falta y múltiples mutaciones en los aminoácidos esenciales que
pueden estar relacionados con la baja expresión de CAT3.
Los datos complementarios a este artículo se pueden encontrar en línea en http: //
dx.doi.org/10.1016/j.lfs.2012.06.016 .
Estafa Florida TIC de la declaración de interés
El contenido del manuscrito tiene sin aire Florida igir intereses con financiación de cualesquiera personas o
instituciones.
Expresiones de gratitud
Este trabajo fue apoyado por becas de la Ciencia de Hungría fi C Fondo de Investigación (OTKA
CK78566), la Ciencia húngaro fi Fondo de Investigación C y el Nacional de fi ce de Investigación y
Tecnología (OTKA CK80188) y El Nacional de Innovación fi ce ERC_HU_09 3D_TRPV1. El trabajo
también fue apoyado por el Proyecto denominado "TÁMOP-4.2.1 / B-09/1 / KONV2010-0005 -
Creación del Centro de Excelencia en laUniversidad de Szeged" apoyado por la Unión Europea y la
cooperación fi financiado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional.
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