CNPq UFAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
COORDENAÇÃO DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO

CIENTÍFICA – PIBIC CNPq/UFAL/FAPEAL

RELATÓRIO FINAL
(individual e diferenciado para cada bolsista/colaborador)

(2016 – 2017)
TÍTULO DO PROJETO DE PESQUISA:
Produção de Etanol 2G a partir de Materiais Celulósicos: Uma Proposta de
Consolidação do PPG-EQ/UFAL através da cooperação com o PPG-EQ/UFSCar e
PEQ-COPPE/UFRJ
TÍTULO DO PLANO DE TRABALHO
Avaliação da vagem de feijão verde (Vigna unguiculata) na produção
de etanol 2G

NOME DO ORIENTADOR: Renata Maria Rosas Garcia Almeida

NOME DO BOLSISTA/COLABORADOR: Letícia Leite Machado

BOLSISTA CNPQ BOLSISTA FAPEAL

BOLSISTA UFAL X COLABORADOR
NOME DA GRANDE ÁREA DO CONHECIMENTO (CNPq): Engenharias
NOME DA SUB-ÁREA DO CONHECIMENTO (CNPq): Processos industriais de engenharia
química

Projeto Financiado: SIM X NÃO

Caso afirmativo citar órgão financiador dos recursos: CNPQ

Maceió - AL, 07 / 08 / 2017.

1
 RESUMO

A produção de energia limpa tem recebido um particular interesse de pesquisadores devido

ao impacto negativo dos combustíveis fósseis no meio ambiente, bem como a crescente
preocupação com as questões geopolíticas do petróleo em todo o mundo. As pesquisas
atuais mostram como tecnologia alternativa a produção de etanol de segunda geração a
partir de materiais lignocelulósicos. Os materiais lignocelulósicos são compostos
basicamente de celulose, hemicelulose e lignina. Esses três componentes são determinantes
para a produção do bioetanol, uma vez que a quebra dos carboidratos presentes na matriz
lignocelulósica resulta na produção de açúcares, que podem, com o auxílio de leveduras,
ser convertidos em etanol. Nesse contexto, o presente trabalho objetivou estudar o potencial
da Vigna unguiculata para a produção do etanol de segunda geração. Foi realizado o pré-
tratamento ácido da matéria prima variando-se a carga de sólidos (10%-20%) e o tempo de
residência no reator (15min-30min). Para escolha dos melhores parâmetros para o pré-
tratamento foi realizada a quantificação de glicose no licor. A hidrólise enzimática foi
realizada de acordo com um delineamento composto central rotacional (DCCR), variando-
se a temperatura (37°C-50°C) e a carga de sólidos (10%-15%), considerando que esses são
os principais fatores que afetam a produção e a taxa inicial de hidrólise enzimática da
celulose. A variável resposta avaliada foi a concentração de glicose obtida no hidrolisado.
Para a etapa de fermentação foi utilizado a levedura comercial liofilizada fermix, na
temperatura de 32°C em shaker sob agitação de 100 rpm. Após a destilação do licor
fermentado foi possível obter uma concentração de etanol média de 6,66 g/L.

Palavras-chave: Biomassa; etanol lignocelulósico; fermentação.

2
 INTRODUÇÃO e OBJETIVOS

A participação dos biocombustíveis na matriz energética mundial ainda é

relativamente restrita, mas os investimentos nessa área estão acontecendo de forma
expressiva nos últimos anos, devido a questão ambiental. A cada dia, os países reforçam
suas políticas energéticas visando uma maior participação das fontes renováveis em sua
matriz. Entre essas fontes renováveis, destaca-se o etanol.
Em relação a produção de etanol, o Brasil encontra-se em uma posição altamente
favorável por apresentar em sua agricultura uma imensa diversidade de matérias-primas,
graças a sua extensão territorial. Atualmente a matriz energética brasileira já é um exemplo
de sustentabilidade, utilizando cerca de 43,5% de fontes renováveis contra 13,5% da média
mundial. (Balanço energético nacional, 2016).
O etanol pode ser de primeira geração, quando produzido diretamente a partir de
fontes ricas em sacarose ou de segunda geração, quando produzido a partir de resíduos
agroindustriais são ditos materiais lignocelulósicos, pois possuem lignina em sua
composição, que protege a celulose e a hemicelulose, impedindo a realização direta da
fermentação. O etanol produzido a partir destas matérias é denominado etanol
lignocelulósico. (TAMANINI, 2004).
No presente trabalho utilizou-se como matéria prima para a produção do etanol a
casca da Vigna unguiculata. Conhecida popularmente como feijão caupi, feijão miúdo,
feijão de corda, feijão-fradinho e feijão maçácar, a casca residual atualmente é aproveitado
na alimentação de ruminantes, associado a alimentos de melhor valor nutritivo.
(RODRIGUES FILHO; CAMARÃO; LOURENÇO JÚNIOR, 1993).
Avaliou-se a produção do etanol de segunda geração através das etapas de
caracterização da biomassa para a quantificação dos seus principais constituintes, pré-
tratamento ácido para deslignificação da matéria-prima, hidrólise enzimática para a quebra
dos polissacarídeos em açúcares fermentescíveis e por fim a fermentação, etapa onde
ocorre a conversão dos açúcares em etanol.

3
 METODOLOGIA

A amostra, obtida de uma feira ao ar livre na cidade de Maceió, devidamente seca e

higienizada com solução de água sanitária a 100 ppm foi caracterizada segundo
metodologia proposta por Gouveia et. al. (2009). Pesou-se 1g da amostra seca, que foi
tratada com 10 mL de H2SO4 72% (m/v) durante 7 minutos, sob vigorosa agitação em
banho termostático a 45°C. Após os 7 minutos a reação foi interrompida com adição de 50
mL de água destilada e a amostra foi transferida para erlenmeyer de 500 mL,
acrescentando-se 225 mL de água destilada. Para hidrólise completa, o erlenmeyer foi
levado a autoclave por 30 min a 120°C. Posteriormente, os erlenmeyer foram resfriados a
temperatura ambiente e a mistura reacional foi filtrada para balão volumétrico de 500 mL.
Determinação de lignina Insolúvel
O material insolúvel retido no papel de filtro foi lavado com 1500 mL de água
destilada e seco em estufa a 100°C. A porcentagem da lignina insolúvel em meio ácido foi
calculada em relação à massa de material lignocelulósico seco, descontando-se as cinzas
presentes no material, segundo Equação 1, onde Lki = lignina insolúvel, Mk = massa de
lignina insolúvel seca, Mc = massa de cinzas e Ma = massa da amostra seca.
(1)

Determinação de fibras
As fibras foram determinadas pelo método de Hennemberg (1864). A amostra foi
desengordurada com solução álcool-éter 1:1. Filtrou-se em papel de filtro e deixou-se o
resíduo exposto ao ar para evaporação dos solventes orgânicos. Pesou-se em um becker de
200 mL cerca de 1g da amostra e adicionou-se 50 mL de H2 SO4 1,25%. Deixou-se em
ebulição por 30 minutos, completando com água destilada o volume perdido por
evaporação. Filtrou-se em papel de filtro, lavando o material com 25mL de água destilada a
100ºC. Transferiu-se o material retido no papel de filtro para um Becker de 200mL e
repetiu-se o procedimento realizado com ácido desta vez utilizando-se NaOH 1,25%,
filtrou-se em papel de filtro previamente tarado e lavou-se com 100 mL de água destilada a
100ºC. As amostras foram secas em estufa a 100ºC por 2 horas. Pesou-se o papel com
resíduo. As amostras foram levadas à mufla em cadinhos previamente tarados a 550ºC para
determinação da fibra real. A fibra bruta pode ser calculada através da Equação 2 e a fibra
real pode ser calculada através da equação 3, onde Fb= fibra bruta e Fr= fibra real.

4
 (2)

(3)

Determinação de cinzas
Para a determinação das cinzas de lignina, após a determinação da lignina insolúvel,
a amostra junto com o papel de filtro foi transferida para um cadinho previamente tarado. A
amostra foi calcinada a 150°C por 30 min, 250°C por 20 min e mais 120 min a 800 °C,
numa mufla. Para a determinação das cinzas totais, pesou-se 1g da massa seca do material
em cadinho previamente tarado, levou-se à mufla sob as condições acima, onde Mc=massa
de cinzas e Ma= massa da amostra seca. O teor de cinzas foi calculado pela Equação 4.
(4)

Análise de glicose
Utilizou-se o kit enzimático pronto para uso “Glicose Liquiform”. Foi realizado
procedimento do manual, aumentando as quantidades dos reagentes proporcionalmente.
Para as amostras, colocou-se 3 mL do reagente e 0,03 mL das amostras; para o branco,
apenas os 3 mL de reagente; e para o padrão, 3 mL de reagente e 0,03 mL do padrão. As
amostras foram agitadas e levadas para banho-maria a 37°C por 10 min. Determinou-se a
absorbância em espectrofotômetro em 505 nm. A concentração de glicose foi determinada,
em mg/dL ou g/L, segundo a Equação 5.

(5)

Ensaios de pré tratamento, hidrólise e fermentação

Inicialmente realizou-se a deslignificação da matéria-prima. O material foi
submetido à pré-tratamento com solução de ácido sulfúrico 1%(m/v) a 120°C. O sólido pré-
tratado foi submetido à hidrólise enzimática (Cellic) em shaker a 50ºC e 150 rpm durante
24 horas. Utilizou-se como mosto fermentativo o líquido proveninente da hidrólise que
ocorreu utilizando-se a levedura Saccharomyces cerevisiae a 32ºC durante 24 horas. Após
esta etapa, o líquido fermentado passou por destilação e posterior análise de etanol.

5
 RESULTADOS E DISCUSSÕES

Caracterização
As quantificações de fibras, lignina e cinzas realizadas durante a etapa de
caracterização da matéria-prima estão dispostas na Tabela 1.

Tabela 1: Caracterização da matéria-pri ma

Constituinte/ Ensaio 1 2 3 Média

Fibra bruta (%) 44 41,9 43,4 43,43

Fibra real (%) 38,2 38,7 38,4 38,43
Lignina insolúvel
38,5 35,6 40,3 38,13
(%)
Cinzas de lignina
2,6 2,3 3 2,63
(%)
Cinzas totais (%) 4,25 3,37 3,5 3,71
Fonte: Autor, 2017.
Conforme-se observa-se na Tabela 1, um elevado teor de lignina insolúvel foi
observado na matéria-prima em questão. A literatura afirma que a presença de lignina é
prejudicial ao processo de produção de etanol, pois forma uma barreira física na estrutura,
impedindo o aproveitamento da celulose, já que dificulta o acesso eficaz das enzimas às
fibras de celulose (RUEGGER, TAUK-TORNISIELO, 2004).

Pré-Tratamento
Para a escolha do melhor pré-tratamento foi realizada análise de glicose. Segundo
Silva (2016) a preservação da fração celulósica é um fator extremamente importante
relacionado à eficiência do pré-tratamento, no que diz respeito à produção de etanol
celulósico. Além da análise de glicose foi calculado o fator de severidade de cada pré-
tratamento, através da equação 6. Esse fator está intimamente relacionado ao rendimento
dos sólidos pré-tratados, o aumento da concentração de glicose e a redução das pentoses
que não são diretamente fermentáveis (Overend, et. al. 1987). Os resultados obtidos
encontram-se na Tabela 2.

6
 )] (6)

Tabela 2: Ensaios de pré-tratamento

Razão
C
Pré- Tempo de m Fator de
glicose
Tratamento residência(min) resíduo/ severidade
(g/L)
V ácido
1 15 1:10 0,74 1,76
2 15 1:20 0,33 1,76
3 22 1:10 0,44 1,93
4 22 1:20 0,24 1,93
5 30 1:10 1,52 2,07
6 30 1:20 0,99 2,07
Fonte: Autor, 2017.

Com base na Tabela 2, o melhor resultado foi obtido para o ensaio 5, visto que
obteve-se a maior concentração de glicose, indicando a conservação da fração celulósica,
extremamente importante para a etapa subsequente de hidrólise. Além disso, o pré-
tratamento 5 apresentou o maior fator de severidade, indicando uma solubilização das
pentoses, que não são interessantes para o processo, já que o microrganismo utilizado, S.
cerevisiae, é capaz apenas de converter as hexoses em etanol.
Hidrólise
Para a realização da hidrólise enzimática foi realizado um planejamento do tipo
DCCR, variando-se a temperatura e a carga de sólidos, considerando que esses são os
principais fatores que afetam a produção e a taxa inicial de hidrólise enzimática da celulose
(Sun & Cheng, 2002). Levando em conta que o processo de hidrólise em questão é
enzimático, utilizou-se pH de 4,8 e leve variação de temperatura, entre 37°C e 50°C. Para a
concentração de substrato variou-se a carga de sólidos entre 10% e 15%. Segundo
(Philippidis et al., 1993) altas concentrações de substrato podem causar inibição pelo
produto formado uma vez que a atividade da celulase é inibida pela celobiose. Como fator
resposta utilizou-se a concentração de glicose no hidrolisado. A matriz do planejamento
juntamente a resposta obtida para cada ensaio bem como a superfície de resposta,
construída com o software STATISTICA® 7.0, encontram-se a seguir.

Tabela 3: Ensaios de hidrólise

Carga
Glicose
Ensaio T(°C) de
(g/L)
sólidos

7
 (%)
1 37,00 10,00 0,86
2 37,00 15,00 0,71
3 50,00 10,00 1,29
4 50,00 15,00 0,9
5 34,31 12,50 0,57
6 52,69 12,50 0,68
7 43,50 8,96 0,7
8 43,50 16,04 0,81
9(C) 43,50 12,50 1,01
10(C) 43,50 12,50 0,98
Fonte: Autor, 2017
Figura 1: Superfície de resposta do processo de hidrólise

Fonte: Autor, 2017.

Levando em consideração a tabela 3 maior concentração de glicose foi obtida sob

temperatura de 50ºC e carga de sólidos de 10%. Observando-se a superfície de resposta, os
maiores valores para a concentração de glicose foram obtidos na região de cor vermelha
intensa, em temperaturas em torno de 50ºC, que é a temperatura ótima da enzima utilizada.

8
Portanto essa foi a hidrólise selecionada para dar continuidade ao processo, realizado em
incubadora shaker a 150 rpm.

Fermentação
Após a hidrólise deu-se início a etapa de fermentação. Com duração de 24 horas, a
fermentação foi realizada em incubadora shaker sob temperatura de 32°C e agitação de 100
rpm, essa etapa foi realizada em triplicata. Passadas as 24 horas, realizou-se a destilação em
mini destilador de álcool e procedeu-se a análise de etanol. A análise de etanol foi realizada
utilizando-se dicromato de potássio e leu-se em espectrofotômetro a 600 nm. Vale salientar
que uma das triplicatas foi perdida em virtude de uma contaminação. A concentração de
etanol média obtida foi de 6,66 g/L.

9
 CONCLUSÕES

Ainda que em concentração pequena, foi possível obter o etanol a partir da casca da
Vigna unguiculata. A pequena concentração se deve à soma de diversos fatores. Já da etapa
de caracterização da matéria-prima, obteve-se um teor de lignina muito elevado e esse
constituinte é responsável por dificultar o acesso das enzimas a fração celulósica da
matéria-prima, impedindo a hidrólise total deste componente na etapa subsequente. De fato,
uma melhora no processo de deslignificação da matéria-prima resultaria numa maior
obtenção de etanol.
Na etapa de pré tratamento, realizado com ácido sulfúrico diluído, apesar de
bastante utilizado, este processo por não ter elevada seletividade pode gerar a ocorrência de
reações indesejadas, produzindo inibidores, como furfural, HMF, ácidos orgânicos e
compostos fenólicos, os quais podem interferir no metabolismo das enzimas e do
microrganismo usado na fermentação
Por fim, durante a etapa de destilação, o microdestilador de ácool utilizado
apresentou alguns problemas, podendo ter ocasionado falhas na separação do etanol que
posteriormente foi quantificado.

1
0
 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

GOUVEIA, E. R., NASCIMENTO, R. T., SOUTO-MAIOR, A. M. Validação de

metodologia para a caracterização química de bagaço de cana-de-açúcar. Química Nova, v.
32, p. 1500-1503, 2009.

OVEREND, R. P., CHORNET, E., GASCOIGNE, J. A. Fractionation of lignocellulosics

by steam-aqueous pretreatments.Philosophical Transactions of the Royal Society of
London. Series A. Mathematical and Physical Sciences.1987.

PHILIPPIDIS, G.P.; SMITH, T.K.; WYMAN, C.E. Study of the enzymatic hydrolysis of
cellulose for production of fuel ethanol by the simultaneous saccharification and
fermentation process. Biot. Bioeng., 41, 846–853, 1993.

RODRIGUES FILHO, J.A.; CAMARÃO, A.P.; LOURENÇO JÚNIOR, J. de B. Avaliação

de subprodutos agroindustriais para a alimentação de ruminantes. Belém: EMBRAPA-
CPATU, 1993.

SILVA, I. F. Potencial do pseudocaule de bananeira (cultivar prata anã) para a produção de

etanol de segunda geração. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Viçosa. Viçosa,
MG. 2016.

STATSOFT, INC. Programa computacional Statistica 7.0. E.A.U. 2004.

SUN, Y.; CHENG, J., Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a
review. Bioresource Technology, Essex, v. 83, p.1-11, 2002.

TAMANINI, C.; HAULY, M. C. O., Resíduos agroindustriais para produção

biotecnológica de xilitol. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 25, n. 4, p. 315-330,
2004.

1
1
PLANO DE TRABALHO INDIVIDUAL E DIFERENCIADO DO BOLSISTA E /OU
COLABORADOR

TÍTULO DO PLANO D E TRABALHO: Avaliação da vagem de feijão verde

(Vigna unguiculata) na produção de etanol 2G

DEFINIÇÃO DOS OBJETIVOS DO TRABALHO DO ESTUDANTE;

O objetivo do colaborador é estudar o processo de deslignificação/destoxificação de
matérias-primas lignocelulósicas e qual a influência destes processos na etapa de hidrólise
enzimática para quebra dos açúcares e no metabolismo de microrganismos fermentadores
de hexoses e de pentoses na produção de produtos de interesse industrial.

CRONOGRAMA DE ATIVIDADES DIMENSIONADO PARA 1 (UM) ANO.

A – Revisão bibliográfica e estudo do projeto;
B – Aprendizagem das metodologias de análises para realização das etapas de pré
tratamento, destoxificação e fermentação;
C – Realização de experimentos para pré-tratamento das matérias-primas lignocelulósicas;
D – Estudo do processo de destoxificação dos resíduos escolhidos;
E – Estudo de fermentações das matérias-primas lignocelulósicas;
F – Encontro de Iniciação Científica da UFAL;
G – Relatório PIBIC.

Meses
ATIVIDADES 2016 2017
AGO SET OUT NOV DEZ JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL

A (Prevista) X X X X X X X X X X X X
A (Realizada) OK OK OK OK OK OK OK
B (prevista) X X X
B (Realizada) OK OK OK
C (Prevista) X X X X
C (Realizada) OK OK OK OK

1
2
D (Prevista) X X X X X
D (Realizada) OK OK OK OK OK
E (Prevista) X X X
E (Realizada) OK OK OK
F (Prevista) X
F (Realizada) OK
G (Prevista) X X
G (Realizada) OK OK

1
3