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UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS- ESPE

CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA


INGENIERIA EN BIOTECNOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA II

Integrante: Sasha Sigüenza Tarea N°: 07


Fecha: 27-12-2017 NRC: 3085

Tema: Investigación sobre los métodos de recuento bacterianos aplicados a análisis de alimentos y de
agua.

En el análisis de alimentos y agua para poder determinar la existencia, tipo y número de microorganismos
se debe seguir métodos, sin embargo ninguno puede determinar con exactitud el microorganismo que existe
en determinado alimento o agua. Existen cuatro métodos básicos para conocer el número total de
microorganismos:
1) Recuento en placa: determina el número de células viables o unidades formadoras de colinas en
un alimento o extracto de agua.
2) Método del número más probable: en gérmenes como cálculo estadístico del número de células
viables.
3) Técnica de reducción de colorantes: cálculo de número de células viables con capacidad
reductora.
4) Recuento microscópico directo: tanto para células viables como para las no viables.
Los recuentos de microorganismos se basan en el número de colonias formadoras que crecen en placas
previamente inoculadas en condiciones ambientales determinadas. Los microorganismos tienen un amplio
rango de temperatura para que se desarrollen, clasificándoles en psicrotofos, mesófilos y termófilos. En el
caso del grupo de microorganismos mesófilos en el que se incluye bacterias, mohos y levaduras, se debe
estimar la microflora total sin especificar el tipo de microorganismo, el recuento de mesófilos nos indica
las condiciones de salubridad de algunos alimentos.
Métodos normalizados
ISO 4833 y AF V 08-01 - Método de recuento de colonias a 30ºC-
Método de basa en la siembra profunda en un medio de cultivo, vertido en placas Petri con una
Aerobios cantidad determinada de muestra o con una cantidad de suspensión madre. El recuentro podrá ser
mesófilos realizado utilizando un sembrador espiral y a incubación a 30ºC durante 72 horas, as distintas
diluciones. A partir del número de colonias obtenidas, calcular el número de microrganismos por
mililitro o por gramo de muestra.
ISO 7954 y NF V 08-059 - Técnica de enumeración de las colonias a 25ºC-
Siembra a profundidad en un medio selectivo, en dos placas Petri, con una cantidad determinada o
Mohos y
suspensión madre. En las mismas condiciones sembrar las diluciones decimales, incubar las placas
levaduras
en aerobiosis a 25ºC, durante 3,4 o 5 días. Calculo del número de levaduras y mohos por mililitro
o por gramo de muestra a partir del número de colonias obtenidas en las placas escogidas.
ISO 7402 y NF V 08-054 – Técnica del NMP y método de recuento de colonias-
En el caso de enterobacterias es necesario el uso de los métodos de recuento, el primero recomienda
Enterobacterias utilizar muestras sospechosas, estas muestras deben ser sembradas en tres tubos de medio de doble
concentración, una cantidad de la muestra problema o suspensión madre. Después en las mismas
condiciones se siembra tres tubos con medio de concentración simple con la primera dilución
decimal obtenida a partir de la muestra problema. Los tubos se incuban a 35ºC o 37ºC durante 24
horas, a partir de los resultados se calcula el número de enterobacterias por mililitro o por gramo
de muestra mediante la tabla NMP.

El segundo método se basa en la siembra en profundidad con medio agar biliado cristal violeta
glucosa, placas Petri con una cantidad de muestra o suspensión madre. En las mismas condiciones
siembra las diluciones decimales obtenidas de cada muestra, incuba a 35ºC o 37ºC durante 24 horas
y luego realizar el conteo por mililitro o gramo de muestra.
ISO 4831 y NF V 08-054 - Enumeración de coliformes mediante el recuento de colonias a 30º C
Se basa en la siembra de tres tubos de medio de enriquecimiento selectivo de doble concentración
con una cantidad determinada de la muestra o una cantidad determinada de la suspensión madre.
A continuación, se siembran tres tubos de medio de enriquecimiento selectivo de concentración
simple con una cantidad determinada de la muestra. Después y en las mismas condiciones, se
siembran tres tubos con medio de enriquecimiento selectivo de concentración simple con una
Coliformes cantidad determinada de la primera dilución decimal obtenida a partir de la muestra problema. Los
Totales tubos se incuban a 30, 35 ó 37º C durante 24 horas para los de doble concentración, y 24 – 48 horas
los de concentración simple. A partir de cada tubo incubado que presenta desprendimiento de gas
en la campana se inocula con asa un tubo con medio de confirmación (BGBL). La reacción es
positiva cuando se produce desprendimiento de gas recogido en la campana de Duirham, como
consecuencia de la fermentación de la lactosa en presencia de sales biliares. Se realizan las lecturas
a las 24 – 48 horas. A partir del número de tubos positivos confirmados se calcula el número más
probable de coliformes por mililitro o por gramo de muestra de ensayo.
ISO 4831 y NF V 08-054
Se basa en la siembra en profundidad con el medio agar PTX o PTG, en una placa de Petri con una
Escherichia cantidad determinada de la muestra problema. En las mismas condiciones, siembra de diluciones
coli decimales obtenidas de la muestra o de la suspensión madre. Incubación de las placas a 44º C
durante 18 – 24 horas. Cálculo del número de Escherichia coli por mililitro o por gramo de muestra
a partir del número de colonias características obtenidas en las placas de Petri.
ISO 6888 y NF V 08-057-1 - Técnica de confirmación de las colonias-
Se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo sólido selectivo, repartido en placas de
Petri, con una cantidad determinada de la muestra problema o la suspensión madre para otros
Staphylococcus
productos. Incubación de las placas a 37º C durante 24 – 48 horas. Cálculo del número de
Aureus
estefilococoscogulasa positivos por mililitro o por gramo de muestra a partir del número de
colonias características y/o no características obtenidas en las placas escogidas a los órdenes de
dilución que dan un resultado significativo, y confirmadas mediante la prueba de la coagulasa.
ISO 6579 y NF V 08-052 - Método de rutina para la investigación de Salmonella
Se basa en cuatro etapas sucesivas: 1) Preenriquecimiento en medio no selectivo: Siembra de la
muestra en agua de peptona tamponada e incubación a 37º C durante 16 – 20 horas. 2)
Enriquecimiento en medios selectivos líquidos: Con el cultivo del preenriquecimiento siembra
en caldo verde malaquita con cloruro de magnesio e incubación a 42º C 24 horas, y en caldo
Salmonela
selenito cistina e incubación a 37º C 18 – 24 horas. 3) Aislamiento e identificación: A partir de
los cultivos anteriores se siembra en un medio sólido selectivo a elección. Se incuba a 37º C 24
horas y si es necesario 48 horas y se examinan las características de las colonias. 4) Confirmación:
Resiembra de las presuntas colonias de Salmonella y confirmación en los medios de ensayos
bioquímicos y serológicos apropiados.

A parte de todos estos métodos anteriormente detallados, actualmente se están utilizando métodos rápidos
y automatizados para la microbiología alimentaria, tales como:
 Sistemas miniaturizados y Kits de Diagnóstico: Entre los sistemas miniaturizados de
identificación microbiana disponibles en la actualidad, basados en el metabolismo de sustratos
específicos por parte de los microorganismos y su detección mediante diversos sistemas
indicadores, destacan los siguientes: tarjetas desechables para la identificación sencilla de colonias
sospechosas mediante pruebas bioquímicas rápidas, galerías que permiten la identificación de más
de 800 especies de bacterias y levaduras (API, bioMérieux); tubos de plástico con compartimentos
que contienen agar con distintos sustratos y con una aguja en su interior que posibilita la inoculación
del tubo de forma rápida y sencilla a partir de una única colonia.
 Métodos inmunológicos: se basan en la reacción específica entre un antígeno y un anticuerpo
policlonal o monoclonal. En microbiología de los alimentos, el método inmunológico más
empleado para la detección de microorganismos o sus toxinas es el ensayo ELISA. En ocasiones,
se utiliza la técnica de separación inmunomagnética (SIM), que emplea partículas magnéticas
recubiertas de anticuerpos específicos, para concentrar el antígeno de interés como etapa previa a
la realización del ELISA.
Para laboratorios con un volumen moderado de muestras a analizar existen kits de diagnóstico
basados en el principio de la inmunocromatografía de flujo lateral caracterizados por ser rápidos,
sencillos y no requerir instrumentación especial. Otro tipo de ensayos inmunológicos rápidos y
listos para usar son los basados en la inmunodifusión en un vial de agar para la detección rápida de
serovares mótiles de Salmonella.
 Métodos genéticos: En los últimos años es cada vez más frecuente en los laboratorios de
microbiología de los alimentos el empleo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para
amplificar el ADN de los microorganismos diana y disponer así de una cantidad suficiente que
permita su detección.

Bibliografía:
o Fung, D.Y.C. (2002). Rapid Methods and Automation in Microbiology. Comprehensive Reviews
in Food Science and Food Safety, 1: 3
o Fung, D. Y. C., L. K. Thompson, B. A. CrozierDodson y C. L. Kastner (2000). Hands-free “Popup”
adhesive type method for microbial sampling of meat surfaces. Journal of Rapid Methods and
Automation in Microbiology, 8(3): 209-217.
o Mac Faddin, Jean F. 2003. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia
clínica. 3ª edición. Médica Panamericana, Argentina. QR67 M3318 2003
o Prescott Lansing M., Harley John P. and Klein Donald A. 2005. Microbiology. 6th edition.
McGraw-Hill. USA. QR41.2 P74 2005

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