B) Purificación de Proteínas

z Electroforésis de Proteínas
z Electroforésis en Gel de Poliacrilamida
z SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate – PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis)
z SDS interrumpe interacciones no covalentes entre
polipéptidos, SDS-PAGE nos da las masas moleculares de
las subunidades de proteínas multisubunidades.
z La posibilidad que subunidades estén unidas por puentes
disulfuro puede ser probado mediante la preparación de
muestras en la presencia y ausencia de agentes reductores,
tales como 2-mercaptoetanol = β-mercaptoetanol (HS-CH2-
CH2-OH), el cual rompe estos enlaces.
z Electroforésis Capilar (Capillary Electrophoresis; CE)
z Electroforésis en gel requiere de hasta varias horas y es difícil de
cuantizar y automatizar.
http://www.ceandcec.com/cetheory.htm
B) Purificación de Proteínas
z Electroforésis de Proteínas
z Electroforésis Capilar (Capillary Electrophoresis; CE)
z Electroforesis capilar (CE) supera grandemente estas
desventajas. Una técnica en la cual la electroforesis es llevada a
cabo en tubos capilares muy delgados (20 – 75 µm en diámetro
interno).
z Tales capilares estrechos disipan rápidamente el calor y así
permite el uso de campos eléctricos muy altos, lo cual reduce el
tiempo de separación a unos pocos minutos. Usa cantidades
pequeñas de muestras.
z Ultracentrifugación
z Si un envase de tierra y agua se agita y se deja reposar, la tierra
se sedimentará rápidamente en el fondo debido a la influencia
de la gravedad de la tierra.
B) Purificación de Proteínas
z Ultracentrifugación
z Macromoléculas en solución, las cuales experimentan el
mismo campo gravitacional, no exhiben ninguna
sedimentación perceptible porque su movimiento termal al azar
las mantiene distribuidas uniformemente a través de la
solución.
z Sólo cuando se someten a enormes aceleraciones las moléculas
comienzan a sedimentarse como lo hacen los granos de arena.
z Ultracentrífuga (desarrollada alrededor de 1923 por el
bioquímico sueco Svedverg) puede lograr velocidades
rotacionales tan altas como 80,000 rpm para generar campos
centrifúgales en exceso de 600,000 x g.
z La tasa a la cual una partícula sedimenta en la ultracentrífuga
se relaciona a su masa (la densidad de la solución y la forma de
la partícula también afecta la tasa de sedimentación).
B) Purificación de Proteínas
z Ultracentrifugación
z El coeficiente de sedimentación de una proteína (s, velocidad
de sedimentación por unidad de fuerza centrífuga) es
usualmente expresado en unidades de 10-13 s, los cuales son
conocidos como suedbergs (s).
z En ultracentrifugación preparativa, sedimentación es llevada a
cabo en una solución de una sustancia inerte en la cual la [] y
por ende la densidad de la solución aumenta de la cima al
fondo del tubo de centrifugación.
z El uso de tales gradientes de densidad mejora el poder de
resolución de la ultracentrífuga.
z En ultracentrifugación por zona, una solución macromolecular
es aplicada en la cima de un gradiente de densidad preformado,
usualmente hecho con sucrosa.
B) Purificación de Proteínas
z Ultracentrifugación
z Durante centrifugación, cada especie de macromolécula se
mueve a través del gradiente a una tasa determinada
grandemente por su coeficiente de sedimentación y por lo
tanto viaja como una zona que puede ser separada de otras
zonas (Figura 5-12).
z Después de centrifugación los tubos son perforados para
colectar fracciones con las macromoléculas separadas.
z En centrifugación por equilibrio de gradiente de densidad, la
muestra se disuelve en una solución relativamente concentrada
de una sustancia densa y de difusión rápida tal como CsCl
(Cloruro de Cesio).
z Bajo el gran campo gravitacional producido, el CsCl forma un
gradiente de densidad. Los componentes de la muestra forman
bandas en posiciones donde sus densidades son iguales a la de
la solución y las bandas pueden ser separadas.
 Figura 5.12 – Zonal Centrifugation

Voet D., Voet J. G., & Pratt C. W; Fundamentals of Biochemistry; 1st Ed; John Wiley & Sons, Inc; U.S.A; 1999; p.
Nelson D. L. & Cox M. M; Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd Ed; Worth Publishers ; U.S.A; 2000; p. 133
C) Secuenciación de Proteínas
z Importancia de la secuenciación
z 1) Conocer la secuencia de amino ácidos de una proteína
es un pre-requisito para determinar su estructura 3D y es
esencial para entender su mecanismo macromolecular de
acción.
z 2) Comparación de secuencias entre proteínas análogas de
diferentes especies produce conocimiento profundo en
función de proteínas y revela relaciones evolucionarias
entre las proteínas y los organismos que las producen.
z 3) Muchas enfermedades heredadas son causadas por
mutaciones que conducen a un ∆ de amino ácido en una
proteína. Secuencias de análisis de amino ácidos pueden
asistir en el desarrollo de pruebas diagnósticas y terapias
efectivas.
C) Secuenciación de Proteínas
z Método de Sanger
z La proteína debe ser fragmentada lo suficientemente
pequeño para ser secuenciadas individualmente.
z La estructura primaria de la proteína intacta es entonces
reconstruida de las secuencias de los fragmentos que se
solapan.
z Pasos preliminares
z Análisis de grupo terminal revela el número de diferentes
tipos de subunidades
z Cada cadena polipeptídica (si no está bloqueada

químicamente) tiene un residuo N-terminal y un C-

terminal.
z Identificar estos grupos terminales puede establecer el

número de polipéptidos químicamente distintos en

una proteína.
C) Secuenciación de Proteínas
z Pasos preliminares
z Análisis de grupo terminal revela el número de diferentes
tipos de subunidades
z Ejemplo: Insulina tiene cantidades iguales de los
residuos N-terminal Gly y Phe, lo cual indica que esta
posee igual número de 2 cadenas polipeptídicas no
idénticas.
z Métodos para determinar el N-terminal
z 1) El compuesto fluorescente Dansyl Chloride

reacciona con aminas primarias para producir

polipéptidos dansilados (Figura 5-13).
z Hidrólisis ácida libera el residuo N-terminal
modificado, el cual es separado cromatográficamente
e identificado por su fluorescencia amarilla intensa.
Nelson D. L. & Cox M. M; Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd Ed; Worth Publishers ; U.S.A; 2000; p. 142
 Figura 5-13. Reacción Dansyl Chloride
N(CH 3)2 R1 O R2 O R3 O
Dansyl + H2N CH C NH CH C NH CH C …
Chloride - Polipéptido
OH
O S O
Cl HCl

N(CH3)2

SO2 R1 O R2 O R3 O
NH CH C NH CH C NH CH C …

Polipéptido Dansyl
Figura 5-13. Reacción Dansyl Chloride
N(CH3)2

Polipéptido Dansyl

SO2 R1 O R2 O R3 O
NH CH C NH CH C NH CH C …
N(CH3)2
H 2O
+
H

SO2 R1 O R2 O R3 O
NH CH C OH + H3N CH C OH + H3N CH C OH + …
Amino Amino Acidos Libres
Acido
Dansyl
Continuación
C) Secuenciación de Proteínas
z Pasos preliminares
z Métodos para determinar el N-terminal
z 2) El residuo N-terminal puede también ser
identificado llevando a cabo el primer paso de la
degradación Edman (Sección 5-3C).
z Método para determinar el C-terminal
z No hay un procedimiento químico confiable para

identificar el residuo C-terminal de un polipéptido.

z Sin embargo, esto puede a menudo ser hecho usando

Carboxipeptidasas, enzimas que catalizan la

excisión hidrolítica del residuo C-terminal de un
polipéptido.
z El amino ácido liberado puede ser aislado e

identificado.
 Carboxipeptidasa
R2 O R1 O R0 O
… NH CH C NH CH C NH CH C O
-

H2O
Carboxipeptidasa

R2 O R1 O R0 O
… NH CH C NH CH C O
-
+ H 3 N CH C O
-
C) Secuenciación de Proteínas
z Pasos preliminares
z Aminopeptidasas: Similarmente cortan los residuos N-
terminales de polipéptidos.
z Aminopeptidasas y Carboxipeptidasas son llamadas
colectivamente como exopeptidasas.

Carboxipeptidasa Selectividad en su diana

No corta C-terminal de Arg o Lys

A
o residuos cerca de Pro.
Hidroliza el C-terminal de
residuos de Arg y Lys pero
B
solamente si estos no están
precedidos por Pro.
C) Secuenciación de Proteínas
z Pasos preliminares
z Tales especificidades requiere que los resultados de
análisis de grupos terminales sean tratados con
precaución.
z Puentes disulfuro entre y dentro de porlipéptidos son
cortados
z Puentes disulfuro entre residuos de Cys deben ser

cortados para separar cadenas polipeptídicas (si ellas

están unidas por disulfuro) y para asegurar que
cadenas polipeptídicas son completamente lineales
(residuos en polipéptidos son “anudados” con
puentes disulfuro pueden no ser accecibles a todas las
enzimas y reactivos usados para secuenciación).
z Puentes disulfuro pueden ser cortados oxidativamente

por ácido perfórmico o reducido por mercaptans.

Rompimiento de Puentes Disulfuro en Proteínas

Nelson D. L. & Cox M. M; Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd Ed; Worth Publishers ; U.S.A; 2000; p. 143
C) Secuenciación de Proteínas
z Pasos preliminares
z Puentes disulfuro entre y dentro de porlipéptidos son
cortados
z Mercaptans son compuestos que contiene grupos –

SH.
z Oxidación por ácido perfórmico (iniciado por

Sanger): Convierte todas los residuos Cys, si está

unido por puentes S-S o no, a residuos de ácido
cisteico.
z Desventaja: También oxida residuos de Met y

destruye parcialmente la cadena lateral indol de Trp.